一種不動(dòng)桿菌及其菌劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種不動(dòng)桿菌及其菌劑的制備方法。其技術(shù)方案是：所提供的不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp.）Y3于2013年9月25日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCNO：M2013445。本發(fā)明提供的不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp.）Y3為異養(yǎng)硝化菌，是將不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp.）Y3接種到硝化培養(yǎng)基中發(fā)酵，通過(guò)發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)得到，菌劑制備方法簡(jiǎn)單，易于規(guī)?；a(chǎn)。該菌能在較高濃度含酚工業(yè)廢水環(huán)境中順利進(jìn)行硝化反應(yīng)，并以苯酚為碳源進(jìn)行同時(shí)硝化和反硝化，將氨氮和有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)?，無(wú)亞硝酸鹽氮積累，實(shí)現(xiàn)廢水中的氨氮和苯酚的同時(shí)高效降解，在含酚工業(yè)廢水的生物脫氮處理中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種不動(dòng)桿菌及其菌劑的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物脫氮【技術(shù)領(lǐng)域】。具體涉及一種不動(dòng)桿菌及其菌劑的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，為了提高廢水生物系統(tǒng)的處理能力，通過(guò)向系統(tǒng)中投加高效優(yōu)勢(shì)菌種或通過(guò)基因工程產(chǎn)生的工程菌，即所謂的高效菌技術(shù)(生物強(qiáng)化技術(shù))得到了迅速的發(fā)展，成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
[0003]在國(guó)外特別是發(fā)達(dá)國(guó)家，環(huán)境微生物菌劑更是受到人們的普遍關(guān)注和重視，已成為一種新的發(fā)展趨勢(shì)。丹麥的諾維信、美國(guó)Bioform公司所售的硝化菌均為復(fù)合菌劑，菌劑中含有大量的自養(yǎng)硝化菌，同時(shí)還含有一定數(shù)量的異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌。硝化菌劑目前已經(jīng)形成一定規(guī)模的產(chǎn)業(yè)，并已在發(fā)展中國(guó)家得到應(yīng)用。與自養(yǎng)硝化菌相比，異養(yǎng)硝化細(xì)菌對(duì)培養(yǎng)條件的要求比較寬松，許多異養(yǎng)硝化細(xì)菌在低溫以及高C/Ν條件下仍能夠較好地進(jìn)行硝化作用，適用的溶解氧和PH值范圍也更為寬泛。異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌可以在同一反應(yīng)器中，同時(shí)進(jìn)行硝化和反硝化，有效降低廢水的總氮。含有異養(yǎng)硝化好氧反硝化菌的硝化菌劑，不僅可以提高富含有機(jī)成分廢水的硝化能力，同時(shí)還有較好的總氮脫除能力，從而為滿足更高環(huán)保要求的廢水排放標(biāo)準(zhǔn)提供菌劑保證。
[0004]目前文獻(xiàn)已報(bào)道了幾產(chǎn)喊菌(Alcaligenes /aecaJis)、假單胞菌{Pseudomonassiwizeri)、泛養(yǎng)硫球菌{Jhiosph3er3 pantotropha)具有較好的好氧反硝化能力，但對(duì)含酚廢水中氨氮的降解效率較低，致使難以在焦化、焦油加工等實(shí)際廢水處理中得到應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在解決普通異養(yǎng)硝化菌對(duì)含酚工業(yè)廢水中氨氮降解效率低的問(wèn)題，目的是提供一種不動(dòng)桿菌及其菌劑的制備方法，為焦化和焦油加工等實(shí)際廢水生物脫氮處理提供菌劑。
[0006]本發(fā)明所提供的不動(dòng)桿菌sp.)Y3源于武鋼焦化公司廢水生物處理系統(tǒng)的活性污泥。該菌是以氨氮為氮源，以苯酚和丁二酸鈉為碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，利用硝化培養(yǎng)基進(jìn)行馴化培養(yǎng)，并通過(guò)平板劃線分離純化得到。
[0007]其中，硝化培養(yǎng)基的成分是:丁二酸鈉為9.8g/L，磷酸氫二鈉為7.85g/L，磷酸二氫鉀為1.45g/L，硫酸鎂為0.2g/L，硫酸銨為1.0g/L，硫酸亞鐵為0.01g/L ;硝化培養(yǎng)基的pH值用lmol/L的氫氧化鈉調(diào)至9.0。培養(yǎng)基滅菌條件是:溫度為12廣126°C，時(shí)間為25min。
[0008]該菌為革蘭氏陰性，經(jīng)16S rDNA鑒定為不動(dòng)桿菌Ucifle?ο如cter sp.)，編號(hào)為Y3。該菌于2013年9月25日保藏于中國(guó)典型微生物保藏中心(武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為CCTCCN0:M2013445。該菌菌落呈乳白色，圓形，中間凸起，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊。具有同時(shí)硝化和反硝化能力，能以苯酚作為碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。
[0009]該菌較優(yōu)的培養(yǎng)條件是:溫度為30°C，初始pH值為9.0，接種量為3 vol%,搖床轉(zhuǎn)速為150r/min，碳氮質(zhì)量比(C: N)為12: I。
[0010]本發(fā)明還涉及所述不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.) Y3菌劑的制備方法:先向發(fā)酵罐裝入3/4體積的硝化培養(yǎng)基,用蒸汽在線滅菌；再將不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.) Y3接種到硝化培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵條件為:溫度為30°C，pH值為9.0，接種量為3vol%，轉(zhuǎn)速為150r/min，通氣量為0.5 (V/V.min)，發(fā)酵時(shí)間為24h，發(fā)酵過(guò)程中加入0.05 vol%的陶氏消泡劑。
[0011]由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下積極效果:
本發(fā)明提供的不動(dòng)桿菌菌劑不但制備方法簡(jiǎn)單，易于規(guī)?；a(chǎn)，而且降解效率高，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)。所提供的不動(dòng)桿菌sp.) Y3為異養(yǎng)硝化菌,能在大量有機(jī)物存在的條件下順利進(jìn)行硝化反應(yīng)，并能將硝化的產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行反硝化，將氨氮和有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)猓瑹o(wú)亞硝酸鹽氮積累。特別突出的優(yōu)勢(shì)是，該菌能耐受酚濃度高達(dá)1000mg/L的工業(yè)廢水環(huán)境，并以苯酚作為碳源進(jìn)行同時(shí)硝化和反硝化，實(shí)現(xiàn)廢水中的氨氮和苯酚的同時(shí)高效降解，在含酚工業(yè)廢水的生物脫氮處理中展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為本發(fā)明的不動(dòng)桿菌difleioAacier sp.) Y3的菌落圖；
圖2為本發(fā)明的不動(dòng)桿菌sp.) Y3的革蘭氏染色效果圖；
圖3為本發(fā)明的不動(dòng)桿菌(Acinetobacter sp.) Y3的生長(zhǎng)特性曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，并非對(duì)其保護(hù)范圍的限制。
[0014]實(shí)施例1、菌株的分離純化
(I)菌株來(lái)源
菌源采自武鋼焦化公司廢水生物處理系統(tǒng)的活性污泥。
[0015](2)菌株的分離純化
將采集到的活性污泥混勻，取2mL接種于IOOmL已滅菌的LB培養(yǎng)基中，所述LB培養(yǎng)基的成分是:蛋白胨為lwt%，氯化鈉為I wt%，酵母提取物為0.5 wt% ;再置于溫度為30°C和150r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)15h ;然后取5mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至已滅菌的硝化培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)接4次，轉(zhuǎn)接過(guò)程中逐漸增大硫酸銨的濃度，濃度依次為:300mg/L，600mg/L，900mg/L，1200mg/L0馴化期間，同時(shí)向硝化培養(yǎng)基中加入苯酚使得其最終濃度為500mg/L。馴化結(jié)束后，將菌液做梯度稀釋(10_卜10_8)，涂布于固體的硝化培養(yǎng)基上，置于30°C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2天，然后挑取單菌落，平板劃線(重復(fù)2~3次)，得到純化后的菌株，將每株菌試管斜面保存。最后進(jìn)行硝化性能、反硝化性能及苯酚降解性能的測(cè)定，挑選綜合性能最優(yōu)的菌株Y3斜面保種，并保藏于中國(guó)典型微生物保藏中心(武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2013445。
[0016]實(shí)施例2、菌株的鑒定 (O菌株的形態(tài)學(xué)觀察
將菌株Y3培養(yǎng)液梯度稀釋后，均勻涂布于固體硝化培養(yǎng)基上面，置于30°c恒溫箱培養(yǎng)22h，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，該菌菌落呈乳白色，圓形，中間凸起，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊。挑取菌落少許，經(jīng)革蘭氏染色之后，在光學(xué)顯微鏡的油鏡下觀察，結(jié)果如圖2所示，能夠清楚看到保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2013445的菌株單個(gè)菌為短桿狀，呈紅色，為革蘭氏陰性菌。
[0017](2)菌株的 16S rDNA 鑒定
用DNA提取試劑盒提取菌株Y3的基因組DNA，然后進(jìn)行16S rDNA基因克隆、測(cè)序，其16SrDNA序列見序列表。之后在GenBank中進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，與其序列相似度達(dá)到99%的均為JcifleioAacier sp。結(jié)合菌株Y3的特性，將其歸屬為不動(dòng)桿菌sp)。
[0018]實(shí)施例3、不動(dòng)桿菌difleioAacier sp.) Y3菌劑的制備
配制3L的硝化培養(yǎng)基，加入到5L的發(fā)酵罐中，并加入1.5mL的陶氏消泡劑，然后置于高壓蒸汽滅菌鍋中，在121°C下濕熱滅菌25min，待滅菌的培養(yǎng)基冷卻后，將不動(dòng)桿菌
{Acinetobacter sp.) Y3 以 3vol% 的量接種到硝化培養(yǎng)基，在 30°C > 150r/min 和 0.5(V/V.min)通氣量的條件下發(fā)酵培養(yǎng)，24h后停止發(fā)酵，并加入25vol%的甘油作為保護(hù)劑后，進(jìn)行低溫保藏。
[0019]實(shí)施例4、不動(dòng)桿菌sp.) Y3的生長(zhǎng)及其對(duì)氨氮和苯酹的降解 將不動(dòng)桿菌{Acinetobacter sp.) Y3菌株接種于無(wú)菌、含氨氮為212mg/L和苯酹
為200mg/L的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，在30°C和150r/min的條件下培養(yǎng)，測(cè)定菌體的菌密度(0D_)、氨氮、硝酸鹽氮、亞硝酸鹽氮和苯酚的濃度，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明:初始濃度為212mg/L的氨氮經(jīng)過(guò)24h被完全降解，期間并未檢測(cè)到亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮，菌體的生長(zhǎng)與氨氮的降解趨勢(shì)基本同步，苯酚經(jīng)過(guò)20h被完全降解，該菌株對(duì)氨氮和苯酚具有很好的降解效果，并展現(xiàn)出良好的同時(shí)硝化和反硝化能力。
[0020]上述【具體實(shí)施方式】為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的。
【權(quán)利要求】
1.一種不動(dòng)桿菌，其特征在于該不動(dòng)桿菌sp.)的編號(hào)為Y3,保藏于中國(guó)典型微生物保藏中心，保藏日期為2013年9月25日，保藏編號(hào)為CCTCC N0:M2013445。
2.如權(quán)利I所述不動(dòng)桿菌菌劑的制備方法，其特征在于將所述不動(dòng)桿菌{Acinetobacter sp.)Y3接種到硝化培養(yǎng)基中發(fā)酵，發(fā)酵條件是:溫度為30°C，pH值為9.0，接種量為3vol%，轉(zhuǎn)速為150r/min，通氣量為0.5 (V/V.π?η)，發(fā)酵時(shí)間為24h，發(fā)酵過(guò)程中加入0.05 vol%的陶氏消泡劑。
3.如權(quán)利2所述不動(dòng)桿菌菌劑的制備方法，其特征在于所述的硝化培養(yǎng)基的成分是:丁二酸鈉為9.8g/L,磷酸氫二鈉為7.85g/L,磷酸二氫鉀為1.45g/L,硫酸鎂為0.2g/L,硫酸銨為1.0 g/L，硫酸亞鐵為0.01g/L ;硝化培養(yǎng)基的pH值用lmol/L的氫氧化鈉調(diào)至9.0。
【文檔編號(hào)】C02F101/38GK103756947SQ201410052917
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年2月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月17日
【發(fā)明者】顏家保, 許龍龍, 楊洋, 余永登, 張 浩, 武文麗, 陳佩, 陳冬冬 申請(qǐng)人:武漢科技大學(xué)