厭氧芽孢桿菌ha及其降解氮氧化合物的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一株新菌株--厭氧芽孢桿菌（Anoxybacillus?contaminans）HA及其降解氮氧化合物的應(yīng)用，所述厭氧芽孢桿菌HA保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼：430072，保藏編號(hào)：CCTCC?NO：M2013678，保藏日期2013年12月20日；本發(fā)明提供了一種高效、耐熱能力強(qiáng)的具有FeII(EDTA)-NO還原性能的厭氧芽孢桿菌HA及其降解氮氧化合物的應(yīng)用，該菌株在1d內(nèi)能對(duì)初始濃度為5mmol·L-1的FeII(EDTA)-NO還原率達(dá)到95.3%，該降解菌的發(fā)現(xiàn)對(duì)工業(yè)廢氣中氮氧化物的高效凈化具有重要意義。
【專(zhuān)利說(shuō)明】厭氧芽孢桿菌HA及其降解氮氧化合物的應(yīng)用
[0001](一)【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一株具有Fe11(EDTA)-NO還原性能的厭氧芽孢桿菌HA，及其在生物處理氮氧化物中的應(yīng)用。
[0003](二)【背景技術(shù)】
[0004]氮氧化物(NOx)是礦物燃料燃燒排放的主要污染物之一，其中有95%以上是NO，其余的主要是no2。大量排放具備局部、區(qū)域、全球性污染物性質(zhì)的氮氧化物會(huì)引發(fā)各種環(huán)境問(wèn)題，比如造成光化學(xué)煙霧、產(chǎn)生酸雨和破壞臭氧層等。同時(shí)氮氧化物還會(huì)給人類(lèi)的健康帶來(lái)極大的威脅，是細(xì)顆粒物(PM2.5)的重要組成成分；而且已經(jīng)有很多研究團(tuán)隊(duì)證實(shí)NO和帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病直接相關(guān)。
[0005]隨著我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，對(duì)能源尤其是化石燃料的需求愈發(fā)強(qiáng)烈，從而導(dǎo)致氮氧化物的排放量幾近指數(shù)式的增長(zhǎng)。2011年9月環(huán)境保護(hù)部頒布了《火電廠大氣污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》，氮氧化物的排放濃度限值被統(tǒng)一確定為IOOmg.m-3。
[0006]現(xiàn)有煙氣脫硝技術(shù)中，選擇性催化還原(SCR)和選擇性非催化還原(SNCR)干法脫硝得到一定程度的工業(yè)應(yīng)用，但存在投資運(yùn)行費(fèi)用高、催化劑易失活、氨泄漏等缺點(diǎn)；其它脫硝技術(shù)如等離子體法、氧化法(次氯酸鈉、過(guò)氧化氧等)、吸收法等的可行性和經(jīng)濟(jì)性還有待進(jìn)一步研究。生物凈化法處理煙氣中的氮氧化物相較于傳統(tǒng)的脫硝工藝具有處理效果好、經(jīng)濟(jì)成本低、無(wú)二次污染等優(yōu)勢(shì) ，比如利用微生物的硝化和反硝化過(guò)程以及藻類(lèi)、真菌本身特有的功能等，目前已引起國(guó)內(nèi)外眾多研究者的重視。
[0007]但是利用生物法處理煙氣中的氮氧化物首先解決的是NO的氣液傳質(zhì)問(wèn)題，否則生物處理法難以獲得較高的處理效率。由于絡(luò)合吸收法利用有機(jī)絡(luò)合吸收劑(常使用有機(jī)螯合鐵-乙二胺四乙酸亞鐵，F(xiàn)e11 (EDTA)可以快速地實(shí)現(xiàn)將NO從氣相轉(zhuǎn)移到液相，并且具有吸收速率快、吸收容量大和價(jià)廉易得等優(yōu)點(diǎn)，自從上世紀(jì)80年代以來(lái)這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)取得了極大的發(fā)展。然而，絡(luò)合脫硝過(guò)程產(chǎn)生的吸收產(chǎn)物不再具備相應(yīng)的絡(luò)合吸收NO能力，因此脫硝溶液需再生才能循環(huán)使用。為了實(shí)現(xiàn)吸收液再生，可通過(guò)添加SO廣、Na2S2O4等還原劑，但是成本高且再生速率低而且，還原過(guò)程只是針對(duì)因?yàn)闊煔庵醒鯕獯嬖诙纬傻木邆浣j(luò)合吸收NO能力的Fe111 (EDTA)，對(duì)另外一種吸收產(chǎn)物Fe11 (EDTA) -NO似乎沒(méi)有良好的對(duì)策。
[0008]絡(luò)合吸收結(jié)合生物轉(zhuǎn)化去除NO技術(shù)(chemical absorption combined withbiological reduction, CABR-DeNOx或者BioDeNOx)因?yàn)榭梢钥朔鲜鋈秉c(diǎn)，而且工藝已被證實(shí)具有流程短、投資少、處理效果好、運(yùn)行管理簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。簡(jiǎn)單地講，這一工藝是利用Fe11(EDTA)作為化學(xué)吸收劑進(jìn)行絡(luò)合吸收形成絡(luò)合吸收產(chǎn)物(Fe11 (EDTA) -NO)，進(jìn)而利用微生物的反硝化機(jī)能將吸收產(chǎn)物轉(zhuǎn)換為環(huán)境友好的氮?dú)?N2)。
[0009](三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明目的是提供一株高效、耐熱能力強(qiáng)的具有Fe11 (EDTA)-NO還原性能的厭氧芽孢桿菌及其用途。
[0011]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0012]本發(fā)明提供一株新菌株一厭氧芽孢桿菌(Anoxybacillus contaminans) HA,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼:430072，保藏編號(hào):CCTCC NO:M2013678，保藏日期 2013 年 12 月 20 日。
[0013]本發(fā)明所述厭氧芽孢桿菌HA菌株的特征為:菌落顏色為白色，菌落呈小型單個(gè)菌落，有芽孢，不透明，表面光滑，邊緣整齊。透射電鏡下觀察該菌體的形態(tài)為桿菌，具有鞭毛，革蘭氏染色陰性，氧化酶陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性。它生長(zhǎng)最適PH值為7.0，最適溫度為55°C。該菌株16S rDNA序列如SEQ ID N0.1所示。
[0014]本發(fā)明還提供所述厭氧芽孢桿菌HA在生物降解氮氧化物中的應(yīng)用。氮氧化物指的是由氮和氧兩種元素組成的化合物。常見(jiàn)的氮氧化物有一氧化氮(NO，無(wú)色)、二氧化氮(NO2，紅棕色)、笑氣(N20)、五氧化二氮(N2O5)等，其中除五氧化二氮常態(tài)下呈固體外，其他氮氧化物常態(tài)下都呈氣態(tài)。作為空氣污染物的氮氧化物(NOx)常指NO和NO2，本發(fā)明中亦是指NO和NO2。具體的，所述菌株用于處理廢氣中氮氧化物以Fe11 (EDTA) -NO形式存在的廢液。
[0015]進(jìn)一步，所述的應(yīng)用為:將厭氧芽孢桿菌HA經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液即含菌懸液接種至Fe11(EDTA)-NO液體選擇培養(yǎng)基中，以Fe11 (EDTA) -NO為唯一氮源，在55~60°C、120~160rpm條件下培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)將Fe11 (EDTA) -NO中NO還原為N2,即實(shí)現(xiàn)氮氧化物的降解；所述Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基的終濃度組成為:氮源4~6mmol.L_\碳源1500~3500mg.L-1，KH2P04500mg.L-1，K2HP04500mg.L-1，MgSO4.7H20100mg.L-1，CaCl2IOOmg.L-1，CuSO4Img.L i, FeSO4Img.L \ MnS045mg.L1, Na2MoO4Img.L \ ZnCl22mg.L \ 溶劑為水，pH值 5.0 ~9.0。
[0016]進(jìn)一步，優(yōu)選所述含菌細(xì)胞懸液的0D_值為0.4~0.6，所述含菌懸液的體積接種
量為1%~4%。
[0017]進(jìn)一步，優(yōu)選所述碳源為乙酸、碳酸氫鈉、乙醇、葡萄糖或乙酸鈉中一種或兩種及以上以任意比例的混合，更優(yōu)選所述碳源為下列之一:①乙酸、②碳酸氫鈉、③乙醇、④葡萄糖或⑤乙酸鈉。
[0018]進(jìn)一步,優(yōu)選碳氮質(zhì)量比為8~18:1,更優(yōu)選所述碳氮質(zhì)量比為15:1,碳源為葡萄糖 3000mg.L I。
[0019]進(jìn)一步，優(yōu)選培養(yǎng)條件為55~60°C、140~160rpm。
[0020]本發(fā)明所述Fe11(EDTA)-NO按如下方法制備:用等摩爾的FeSO4.(NH4)2SO4.6H20和Na2EDTA在驅(qū)氧去離子水中配置成Fe11 (EDTA)溶液，再用lmmol/L的NaOH水溶液將制備好的Fe11 (EDTA)溶液的pH值調(diào)至7.0左右，倒入500mL的吸收瓶中，通入NO氣體進(jìn)行吸收形成Fe11(EDTA)-NO溶液。用氮氧化物分析儀(型號(hào)42i_HL,廠家美國(guó)Thermo公司)進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)NO進(jìn)口濃度與出口濃度相等時(shí)，則吸收飽和，得到pH值為7.0左右的Fe11(EDTA)-NO飽和吸收液。由于Fe11(EDTA)極易被空氣中的氧氣氧化，因此整個(gè)制備過(guò)程中需要在無(wú)氧的條件下進(jìn)行(制備和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中用高純N2做保護(hù)氣)，制備好的Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液需驅(qū)氧密封保存。
[0021]本發(fā)明所述含菌懸液按如下步驟制備:
[0022]1)斜面培養(yǎng):將厭氧芽孢桿菌HA接種至斜面培養(yǎng)基，55°C培養(yǎng)3天，獲得菌體斜面；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖2000mg *L_1, NaNO31000mg +'KH2PO4SOOmg tU1,K2HP04500mg.?Λ MgSO4.7H20100mg.?Λ CaCl2IOOmg.?Λ CuSO4Img.?Λ FeSO4Img.?ΛMnS045mg.L-1, Na2MoO4Img.L-1, ZnCl22mg.I71，溶劑為水，pH 值 7.0,瓊脂 15 ~18g.L-1 (優(yōu)選 18g.L-1)；
[0023](2)種子培養(yǎng):從菌體斜面挑取菌落接種至種子培養(yǎng)基，55°C培養(yǎng)I天，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖2000mg.L-1, NaN03200mg.L_S KH2P04500mg.L_SK2HP04500mg.?Λ MgSO4.7H20100mg.?Λ CaCl2IOOmg.?Λ CuSO4Img.?Λ FeSO4Img.?ΛMnS045mg.L1, Na2MoO4Img.L1, ZnCl22mg.L S 溶劑為水，pH 值 7.0 ;
[0024](3)發(fā)酵培養(yǎng):將種子液以體積濃度I~4%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，55°C培養(yǎng)I天，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液即為含菌懸液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖2000mg.L-1，NaNO31000mg.L-1，KH2P04500mg.L-1，K2HP04500mg.L-1，MgSO4.7H20100mg.L-1，CaCl2IOOmg *L \ CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L S Na2MoO4Img mLl, ZnCl22mg *L l,溶劑為水，pH值7.0。
[0025]本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明提供了一株高效、耐熱能力強(qiáng)，且具有Fe11 (EDTA) -NO還原性能的厭氧芽孢桿菌HA及其降解氮氧化合物的應(yīng)用，該菌株在Id內(nèi)能對(duì)初始濃度為5mmol -T1的Fe11 (EDTA)-NO還原率達(dá)到95.3%，該降解菌對(duì)工業(yè)廢氣中氮氧化物的高效凈化具有重要意義。
(四)【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026]圖1為菌株HA的透射電鏡照片(A)和革蘭氏染色照片(B)；
[0027]圖2為菌株HA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖；
[0028]圖3不同pH下菌株HA的Fe11 (EDTA) -NO還原性能比較；
[0029]圖4不同碳源下菌株HA的Fe11 (EDTA) -NO還原性能比較；
[0030]圖5不同C/N下菌株HA的Fe11 (EDTA) -NO還原性能比較；
[0031]圖6不同接種量下菌株HA的Fe11 (EDTA)-NO還原性能比較。
[0032](五)【具體實(shí)施方式】
[0033]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此:
[0034]實(shí)施例1:Anoxybacillus contaminans HA的分離、純化及其鑒定
[0035]1.Anoxybacillus contaminans HA 的分離及純化
[0036]Anoxybacillus contaminans HA是從本課題組BioDeNOx反應(yīng)器污泥中篩選,具體步驟如下:
[0037]基礎(chǔ)培養(yǎng)基，配制方法如下:葡萄糖2000mg.L_S KH2P04500mg.L_SK2HP04500mg.?Λ MgSO4.7H20100mg.?Λ CaCl2IOOmg.?Λ CuSO4Img.?Λ FeSO4Img.?ΛMnS045mg.L \ Na2MoO4Img.L1, ZnCl22mg.L S 溶劑為水，pH7.0,121°C滅菌 20min。
[0038]Fe11 (EDTA) -NO 溶液的制備方法:用等摩爾的 FeSO4.(NH4)2SO4.6H20 和 Na2EDTA在驅(qū)氧去離子水中配置成Fe11 (EDTA)溶液，再用lmmol/L的NaOH水溶液將制備好的Fe11 (EDTA)溶液的pH值調(diào)至7.0左右，倒入500mL的吸收瓶中，通入NO氣體進(jìn)行吸收形成Fe11 (EDTA)-NO溶液。用氮氧化物分析儀(型號(hào)42i_HL，廠家美國(guó)Thermo公司)進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)NO進(jìn)口濃度與出口濃度相等時(shí)，則吸收飽和，得到pH值為7.0左右的Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液。由于Fe11(EDTA)極易被空氣中的氧氣氧化，因此整個(gè)制備過(guò)程中需要在無(wú)氧的條件下進(jìn)行(制備和轉(zhuǎn)移的過(guò)程中用高純N2做保護(hù)氣)，制備好的Fe11(EDTA)-NO飽和吸收液需驅(qū)氧密封保存。
[0039]Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基:基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入5mmol.T1Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液得到液體選擇培養(yǎng)基。由于Fe11 (EDTA) -NO在空氣中容易氧化，且高溫滅菌時(shí)不穩(wěn)定，不適合于制備固體培養(yǎng)基，因此，在制備固體選擇培養(yǎng)基時(shí)加入1000mg.L^1NaNO3為氮源和唯一的電子受體來(lái)替代Fe11 (EDTA)-NO飽和吸收液，同時(shí)加入18gL-1瓊脂。
[0040]取BioDeNOx反應(yīng)器中污泥，靜置24h后，濾去上清液，取下層污泥IOmL接種于含IOOmL基礎(chǔ)培養(yǎng)液250mL培養(yǎng)瓶中，55°C，160rpm振蕩培養(yǎng)24h，將菌液離心分離，收集菌體，用無(wú)菌水配制成一定濃度的菌液。將所得到的菌液用Fe11(EDTA)-NO固體選擇培養(yǎng)基經(jīng)多次平板劃線分離純化，得到單菌落即還原菌種，記為菌株HA。
[0041]2.菌株HA的鑒定
[0042]a、菌株HA的生理生化特征
[0043]菌落顏色為白色，菌落呈小型單個(gè)菌落，有芽孢，不透明，表面光滑，邊緣整齊。透射電鏡下觀察該菌體的形態(tài)為桿菌(圖1中A所示)，具有鞭毛，革蘭氏染色陰性(圖1中B所示)，氧化酶陽(yáng)性，接觸酶陽(yáng)性。它生長(zhǎng)最適PH值為7.0，最適溫度為55°C。
[0044]b、菌株HA的16S rRNA序列分析
[0045]通過(guò)16S rRNA序列分析和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定，確定菌株HA為Anoxybacilluscontaminans ο具體步驟如下:
[0046]采用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒(V2.2，上海申能博彩生物科技有限公司)提取和純化菌株HA的DNA，4°C保存。選用細(xì)菌的通用引物F27和1492R對(duì)純化的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列分別為:
[0047]F27:5’ -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’
[0048]1492R:5，-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T_3’
[0049]PCR反應(yīng)體系為(50 μ L):模板DNA1.75 μ L，引物F27和引物R1492各I μ L，MgCl2(25mmol.Ι^)3μ L，Taq 酶(5U.μ L-1)。.25μ L，10XPCR 緩沖液 5 μ L，dNTP (2.5mmol.L-1) 4 μ L，重蒸水 34 μ L。
[0050]PCR反應(yīng)程序設(shè)定為:先94°C預(yù)變性4min ;然后94°C變性lmin，59°C退火lmin，72°C延伸1.5min，循環(huán)35個(gè)周期；然后72°C延伸IOmin ;最后4°C保持lOmin。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序(上海華大基因)，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)序列SEQ ID N0:1所示。
[0051]將HA的16S rDNA序列上傳到Genbank，獲得Genbank的登錄號(hào)KF973318，同時(shí)同Genbank中的基因序列進(jìn)行同源性比較,發(fā)現(xiàn)其屬于Anoxybacillus屬，與Anoxybacilluscontaminans (NR029006.1)同源性最高，達(dá)到95%，圖2為該菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)圖。為了進(jìn)一步確定鑒定結(jié)果的可靠性,經(jīng)過(guò)生理生化實(shí)驗(yàn),最終確定菌株HA屬于Anoxybacilluscontaminans,因此,將該菌株命名為厭氧芽抱桿菌(Anoxybacillus contaminans) HA。
[0052]實(shí)施例2厭氧芽孢桿菌HA發(fā)酵培養(yǎng)液
[0053](I)斜面培養(yǎng)
[0054]將厭氧芽孢桿菌HA接種至斜面培養(yǎng)基，55 °C培養(yǎng)3天，獲得菌體斜面；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖 2000mg.L-1, NaNO31000mg.L-1, KH2P04500mg.L-1,K2HP04500mg.?Λ MgSO4.7H20100mg.?Λ CaCl2IOOmg.?Λ CuSO4Img.?Λ FeSO4Img.?ΛMnS045mg.L-1, Na2MoO4Img.L-1, ZnCl22mg.I71，溶劑為水，pH 值 7.0,瓊脂 18g.L-1。
[0055](2)種子培養(yǎng)
[0056]從菌體斜面挑取菌落接種至種子培養(yǎng)基，55°C培養(yǎng)I天，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖2000mg.L-1， NaN03200mg.L-1， KH2P04500mg.L-1，K2HP04500mg.L-1， MgSO4.7H20100mg.L-1， CaCl2IOOmg.L-1， CuSO4Img.?Λ FeSO4Img.L-1，MnS045mg.L-1， Na2MoO4Img.L-, ZnCl22mg.L-1， 溶劑為水，pH 值 7.0。
[0057](3)發(fā)酵培養(yǎng)
[0058]將種子液以體積濃度1%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，55°C培養(yǎng)I天，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，即含菌細(xì)胞懸液。所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖2000mg.L—1，NaNO31000mg.L-1, KH2P04500mg.L-1, K2HP04500mg.L-1, MgSO4.7H20100mg.L-1,CaCl2IOOmg *L-1 CuSO4Img *L-1, FeSO4Img *L- 1, MnS045mg *L-1， S Na2MoO4Img mLl, ZnCl22mg *L- l,溶劑為水，pH值7.0。
[0059]實(shí)施例3:Anoxybacillus contaminans HA 反硝化性能檢測(cè)
[0060]1.考察不同初始pH條件下厭氧芽孢桿菌HA還原Fe11 (EDTA) -NO的性能
[0061]在不同初始pH下實(shí)施厭氧芽孢桿菌HA還原Fe(II)EDTA-NO的實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)pH在
7.0時(shí)具有較高的反硝化能力，從實(shí)際應(yīng)用角度看，pH=7.0為最佳pH，此時(shí)降解率最高，具體實(shí)施步驟如下:
[0062]以Fe11 (EDTA) -NO為唯一氮源(濃度5mmol.L—1)，按體積濃度1%接種量將OD6tltl為
0.4的含菌懸液(實(shí)施例2方法制備)接種于不同pH值的Fe11(EDTA)-NO液體選擇培養(yǎng)基(pH值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，55°C，160rpm振蕩培養(yǎng)24h，獲得培養(yǎng)液，采用分光光度法測(cè)定Fe11 (EDTA) -NO的濃度，即取3mL培養(yǎng)液作為樣品，先將樣品通過(guò)孔徑為0.22 μ m的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾去除微生物，然后取濾液用紫外分光光度計(jì)測(cè)出其在420nm波長(zhǎng)下的吸光度值。
[0063]Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基終濃度組成為=Fe11 (EDTA) -N05mmol.L—1，葡萄糖2000mg.L-1，KH2P04500mg.L-1，K2HP04500mg.L-1，MgSO4.7H20100mg.L-1，CaCl2IOOmg.L-1，CuSO4Img.L- 1, FeSO4Img.L-1 MnS045mg.L-1 Na2MoO4Img.L-1, ZnCl22mg.L-1, 溶劑為水，pH值 5.0 ~9.0。
[0064]結(jié)果如圖3所示，菌株HA對(duì)弱酸的環(huán)境適應(yīng)性相對(duì)較差，但當(dāng)pH為7.0時(shí)，菌株HA的還原率達(dá)到87%。
[0065]2.考察不同碳源下厭氧芽孢桿菌HA還原Fe11 (EDTA) -NO的性能
[0066]在不同碳源下實(shí)施厭氧芽孢桿菌HA還原Fe (II)EDTA-NO的實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明其最佳碳源為乙酸鈉，具體實(shí)施方案如下:
[0067]分別以Fe11 (EDTA) -NO為唯一氮源(濃度5mmol -L-1),按體積濃度1%接種量將OD6tltl為0.4的含菌懸液(實(shí)施例2方法制備)分別接種于Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基A(碳源為乙酸，C/N質(zhì)量比為10:1)、Fen(EDTA)-NO液體選擇培養(yǎng)基B(碳源為碳酸氫鈉，C/N質(zhì)量比為
10:l)、Fen(EDTA)-N0液體選擇培養(yǎng)基C (碳源為乙醇，C/N質(zhì)量比為10:1 )、Fen (EDTA)-NO液體選擇培養(yǎng)基D (碳源為葡萄糖，C/N質(zhì)量比為10:1)、Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基E(碳源為乙酸鈉，C/N質(zhì)量比為10:1)5種培養(yǎng)基中，55°C，160rpm振蕩培養(yǎng)24h，分別獲得培養(yǎng)液，取各個(gè)培養(yǎng)基培養(yǎng)后獲得的培養(yǎng)液采用分光光度法測(cè)定Fe11(EDTA)-NO的濃度，即取3mL培養(yǎng)液作為樣品，先將培養(yǎng)液通過(guò)孔徑為0.22 μ m的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾去除微生物，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)出其在420nm波長(zhǎng)下的吸光度值。
[0068]碳源為微生物的生長(zhǎng)提供重要的能源，并構(gòu)成微生物的細(xì)胞物質(zhì)。不同的碳源因其結(jié)構(gòu)和分子量不同，對(duì)微生物還原的影響程度也不盡相同。
[0069]結(jié)果如圖4所示。厭氧芽孢桿菌HA對(duì)葡萄糖的降解率相對(duì)高一些，對(duì)乙酸解率最低。研究得出的結(jié)論，所用碳源的化學(xué)結(jié)構(gòu)和分子量對(duì)還原效率的影響是很大的。通常結(jié)構(gòu)越簡(jiǎn)單，分子量越小的碳源越有利于微生物還原的進(jìn)行。
[0070]Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基A終濃度組成:Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液5mmol.L ^ 乙酸 1750mg.L1, KH2P04500mg.L1, K2HP04500mg.L1, MgSO4.7H20100mg.L1,CaCl2IOOmg *L S CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L S MnS045mg *L」，Na2MoO4Img *L \ ZnCl22mg *L S溶劑為水，pH值為7.0 ;
[0071 ] Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基B終濃度組成:Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液5mmol *L \ 碳酸氧納 4900mg *L SKH2PO4SOOmg *L SK2HPO4SOOmg *L 1,MgSO4 *7H20100mg *L SCaCl2IOOmg *L \ CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L S Na2MoO4Img mLl, ZnCl22mg *L l,溶劑為水，pH值為7.0 ;
[0072]Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基C終濃度組成:Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液5mmol.L \ 乙醇 1342mg.L1,葡萄糖 2000mg.L1, KH2P04500mg.L1, K2HP04500mg.L1,MgSO4.7H20100mg mL1, CaCl2IOOmg.L \ CuSO4Img mL1, FeSO4Img mL1, MnS045mg mL1,Na2MoO4Img.?Λ ZnCl22mg.?Λ 溶劑為水，pH 值為 7.0 ；
[0073]Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基D終濃度組成:Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液5mmol.L1,葡萄糖 1925mg.L1, KH2P04500mg.L1, K2HP04500mg.L1, MgSO4.7H20100mg mLl,CaCl2IOOmg *L l, CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L l, Na2MoO4Img mLl, ZnCl22mg *L l,溶劑為水，pH值為7.0 ;
[0074]Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基E終濃度組成:Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液5mmol.?Λ 乙酸鈉 2IOOmg.?Λ KH2P04500mg.L^jK2HPO4SOOmg.?Λ MgSO4.7H20100mg.?ΛCaCl2IOOmg *L ι, CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L l, Na2MoO4Img mLl, ZnCl22mg *L l,溶劑為水，pH值為7.0 ;
[0075]3.考察不同C/N質(zhì)量比下厭氧芽孢桿菌HA還原Fe11 (EDTA) -NO的性能
[0076]在不同C/N質(zhì)量比下實(shí)施厭氧芽孢桿菌HA的反硝化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其最佳C/N質(zhì)量比為15 具體實(shí)施方案如下:
[0077]分別以Fe11 (EDTA) -NO為唯一氮源(濃度5mmol噸―1)，按體積濃度1%接種量將OD6tltl為0.4的含菌懸液(實(shí)施例2方法制備)分別接種于Fe11(EDTA)-NO液體選擇培養(yǎng)基A1 (C/N質(zhì)量比為8:1)、？611出0了么)-勵(lì)液體選擇培養(yǎng)基81 (C/N質(zhì)量比為10:l)、Fen(EDTA)-N0液體選擇培養(yǎng)基C1 (C/N質(zhì)量比為13:1)、Fe11 (EDTA)-NO液體選擇培養(yǎng)基D1 (C/N質(zhì)量比為15:l)、Feπ(EDTA)-NO液體選擇培養(yǎng)基E1 (C/N質(zhì)量比為18:1 )5種培養(yǎng)基中，55°C，120rpm振蕩培養(yǎng)24h，獲得培養(yǎng)液，采用分光光度法測(cè)定Fe11 (EDTA) -NO的濃度，取3mL培養(yǎng)液作為樣品，先將培養(yǎng)液通過(guò)孔徑為0.22 μ m的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾去除微生物，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)出其在420nm波長(zhǎng)下的吸光度值。
[0078]結(jié)果如圖5所示:當(dāng)葡萄糖小于3000mg.L-1時(shí)，由于碳源對(duì)菌體的生長(zhǎng)和還原效率起著重要的作用，碳源不足，就沒(méi)有足夠的電子流來(lái)提供足夠的能源以供菌體生長(zhǎng)，所以菌株HA的還原率隨著C/N質(zhì)量比的增加而緩慢的增加，隨著碳源量的繼續(xù)增加，由于提供的碳源遠(yuǎn)高于菌體需求，碳源已是非限制性因素，菌體的生長(zhǎng)和代謝活性處于穩(wěn)定階段，但相對(duì)來(lái)說(shuō)菌體的生長(zhǎng)速率大于代謝速率，更多的氮源被用于生長(zhǎng)，代謝活動(dòng)相對(duì)受到抑制，所以菌株HA的還原率減小。
[0079]Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基A1終濃度組成:Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液5mmol.L1,葡萄糖 1500mg.L1, KH2P04500mg.L1, K2HP04500mg.L1, MgSO4.7H20100mg mLl,CaCl2IOOmg *L l, CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L l, Na2MoO4Img mLl, ZnCl22mg *L l,溶劑為水，pH值為7.0 ;[0080]Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基B1終濃度組成:Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液5mmol.L1,葡萄糖 2000mg.L1, KH2P04500mg.L1, K2HP04500mg.L1, MgSO4.7H20100mg mLl,CaCl2IOOmg *L l, CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L l, Na2MoO4Img mLl, ZnCl22mg *L l,溶劑為水，pH值為7.0 ;
[0081 ] Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基C1終濃度組成:Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液5mmol.L1,葡萄糖 2500mg.L1, KH2P04500mg.L1, K2HP04500mg.L1, MgSO4.7H20100mg mLl,CaCl2IOOmg *L l, CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L l, Na2MoO4Img mLl, ZnCl22mg *L l,溶劑為水，pH值為7.0 ;
[0082]Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基D1終濃度組成:Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液5mmol.L1,葡萄糖 3000mg.L1, KH2P04500mg.L1, K2HP04500mg.L1, MgSO4.7H20100mg mLl,CaCl2IOOmg *L l, CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L l, Na2MoO4Img mLl, ZnCl22mg *L l,溶劑為水，pH值為7.0 ;
[0083]Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基E1終濃度組成:Fe11 (EDTA) -NO飽和吸收液5mmol.L1,葡萄糖 3500mg.L1, KH2P04500mg.L1, K2HP04500mg.L1, MgSO4.7H20100mg mLl,CaCl2IOOmg *L l, CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L l, Na2MoO4Img mLl, ZnCl22mg *L l,溶劑為水，pH值為7.0。
[0084]4.考察不同接種量下厭氧芽孢桿菌HA還原Fe11 (EDTA) -NO的性能
[0085]在不同接種量下實(shí)施厭氧芽孢桿菌HA的還原Fe (II)EDTA-NO的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其最佳接種量為1.5% (v/v)，具體實(shí)施方案如下:
[0086]分別以Fe11 (EDTA) -NO 為唯一氮源(濃度 5mmol 噸4)，按(1%、2%、2.5%、3%、4%5 個(gè)接種量梯度)將0D_為0.4的含菌懸液(實(shí)施例2方法制備)接種于Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基中，550C，160rpm振蕩培養(yǎng)24h，獲得培養(yǎng)液，采用分光光度法測(cè)定Fe11 (EDTA) -NO的濃度，取3mL培養(yǎng)液作為樣品，先將培養(yǎng)液通過(guò)孔徑為0.22 μ m的細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾去除微生物，然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)出其在420nm波長(zhǎng)下的吸光度值。
[0087]Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基終濃度組成=Fe11 (EDTA) -N05mmo I.L4，葡萄糖2000mg.L-1，KH2P04500mg.L-1，K2HP04500mg.L-1，MgSO4.7H20100mg.L-1，CaCl2IOOmg.L-1，CuSO4Img.L i, FeSO4Img.L \ MnS045mg.L S Na2MoO4Img.L \ ZnCl22mg.L \ 溶劑為水，pH值為7.0。
[0088]結(jié)果如圖6所示，數(shù)據(jù)表明，當(dāng)接種量大于1%時(shí)，由于剛開(kāi)始時(shí)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足，接種量多少直接影響到底物降解，還原率率隨著接種量的增加而緩慢上升，當(dāng)接種量為2.5%時(shí)，還原率分別達(dá)到95.5%，而隨著接種量的繼續(xù)增加 ，在降解菌之間形成了對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，因此還原率出現(xiàn)減小的現(xiàn)象。由圖可知，菌株HA的最佳接種量為2.5%左右。
【權(quán)利要求】
1.厭氧芽孢桿菌(AnoxybaciIIuscontaminans)HA,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼:430072，保藏編號(hào):CCTCC NO:M2013678，保藏日期2013年12月20日。
2.—種權(quán)利要求1所述厭氧芽孢桿菌HA在生物降解氮氧化物中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為:將厭氧芽孢桿菌HA經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的發(fā)酵液即含菌懸液接種至Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基中，以Fe11 (EDTA) -NO為唯一氮源，在50~60°C、120~160rpm條件下培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)將Fe11 (EDTA) -NO中NO還原為N2 ；所述Fe11 (EDTA) -NO液體選擇培養(yǎng)基的終濃度組成為:氮源4~6mmol.L_\碳源1500~3500mg.L-1，KH2P04500mg.L-1，K2HP04500mg.L-1，MgSO4.7H20100mg.L-1，CaCl2IOOmg.L-1，CuSO4Img.L i, FeSO4Img.L \ MnS045mg.L S Na2MoO4Img.L \ ZnCl22mg.L \ 溶劑為水，pH值 5.0 ~9.0。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述含菌細(xì)胞懸液的OD6tltl值為0.4~0.6，含菌懸液體積接種量為1%~4%。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述碳源為乙酸、碳酸氫鈉、乙醇、葡萄糖或乙酸鈉。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述碳氮質(zhì)量比為8~18:1。
7.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述碳氮質(zhì)量比為15:1，碳源為葡萄糖3000mg.L-1
8.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述含菌懸液按如下步驟制備: (1)斜面培養(yǎng):將厭氧芽孢桿菌HA接種至斜面培養(yǎng)基，55°C培養(yǎng)3天，獲得斜面菌體；所述斜面培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖2000mg.L_\ NaNO31000mg.L_S KH2P04500mg.L_SK2HP04500mg.?Λ MgSO4.7H20100mg.?Λ CaCl2IOOmg.?Λ CuSO4Img.?Λ FeSO4Img.?ΛMnS045mg.L-1, Na2MoO4Img.L-1, ZnCl22mg.I71，溶劑為水，pH 值 7.0,瓊脂 18g.L-1 ； (2)種子培養(yǎng):從斜面菌體挑取菌落接種至種子培養(yǎng)基，55°C培養(yǎng)I天，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖2000mg.L_\ NaN03200mg.L_S KH2P04500mg.L_SK2HP04500mg.?Λ MgSO4.7H20100mg.?Λ CaCl2IOOmg.?Λ CuSO4Img.?Λ FeSO4Img.?ΛMnS045mg.L1, Na2MoO4Img.L1, ZnCl22mg.L S 溶劑為水，pH 值 7.0 ; (3)發(fā)酵培養(yǎng):將種子液以體積濃度I~4%的接種量接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，55°C培養(yǎng)I天,獲得發(fā)酵培養(yǎng)液，即為含菌懸液；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成為:葡萄糖2000mg.L-1，NaNO31000mg.L-1，KH2P04500mg.L-1，K2HP04500mg.L-1，MgSO4.7H20100mg.L-1，CaCl2IOOmg *L \ CuSO4Img *L \ FeSO4Img *L 1, MnS045mg *L S Na2MoO4Img mLl, ZnCl22mg *L l,溶劑為水，pH值7.0。
【文檔編號(hào)】C02F3/34GK103881949SQ201410107118
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年3月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月21日
【發(fā)明者】陳浚, 郝紅紅, 張慧慧, 王磊, 李彥, 程鰲, 陳建孟 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)