本申請要求于2014年5月23日提交的基于35U.S.C.§119(e)的美國臨時申請系列號62/002,476的權(quán)益。本發(fā)明的
背景技術(shù)：
：在美國專利和商標(biāo)局中用于改善水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘水質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘水的處理以降低水生牲畜應(yīng)用(waterlivestockapplication)中的有機(jī)廢棄物、氨和疾病壓力。
背景技術(shù)：
水產(chǎn)養(yǎng)殖指的是飼養(yǎng)用作為人類或動物食物來源的水生物種。該技術(shù)對所飼養(yǎng)物種的自然條件施加一些類型的控制以改善總產(chǎn)量。這可以包括物種的人為孵化以增加野生動物的商業(yè)性收獲，孵化和飼養(yǎng)圍塘中的物種，以及孵化和飼養(yǎng)鄰近于海岸線的潮汐排干的封閉區(qū)域中的物種。與該過程相關(guān)的問題包括：污染物從飼養(yǎng)設(shè)施中排出并且將劣化周圍的水質(zhì)；由于在飼養(yǎng)設(shè)施中的水質(zhì)的劣化而損失了產(chǎn)物；以及與飼養(yǎng)設(shè)施中致病微生物相關(guān)的疾病壓力的增加。可以通過檢測或監(jiān)測包括pH、導(dǎo)電性、氨、硝酸鹽、磷酸鹽和堿度的各種參數(shù)鑒定這些問題。導(dǎo)電性是鹽含量的指標(biāo)，大于1200ppm的量將不再被認(rèn)為是新鮮的水；理想的量是700ppm以及300-1200ppm的范圍。氨水平測量對于魚的有效氧的量。高水平的氨阻止氧在魚體內(nèi)從腮至血液的傳遞；然而，其也是它們的代謝廢棄物的產(chǎn)物。盡管來自魚廢棄物的氨通常沒有足夠地濃度以對它們本身有毒，但是由于每個池塘的高濃度的魚，魚養(yǎng)殖者必須緊密地監(jiān)控氨水平。通過池塘中的硝化細(xì)菌消耗氧，其將有毒的氨分解成無毒形式；然而，這種氧的大量使用降低了可用于被魚吸收的氧。氨水平>1ppm被認(rèn)為對魚生命有毒。此外，測驗硝酸鹽水平以測定水中的植物肥料的量。周圍土壤可高度浸出硝酸鹽，并且可能對小孩和孕婦有害。硝酸鹽在胃腸道中變成亞硝酸鹽并與血液攜帶氧的能力相互作用。硝酸鹽的最大污染程度是10ppm。堿度是在不改變pH的情況下池塘或湖泊的中和酸的能力的測量。由于細(xì)菌，堿度將隨著時間降低；然而，理想的水平是100ppm，其中可接受的范圍為50-200ppm。在池塘和湖泊中發(fā)現(xiàn)的磷酸鹽主要來自于人類和動物廢棄物。肥料流出是在高爾夫球場和裝飾性池塘中發(fā)現(xiàn)的磷酸鹽的主要來源。升高的水平導(dǎo)致富營養(yǎng)化的速率增加，反過來增加污泥的產(chǎn)生。中等水平的磷酸鹽可以刺激植物生長，導(dǎo)致藻類生產(chǎn)的增加；>0.1ppm的水平是促進(jìn)植物生長的指標(biāo)并且被認(rèn)為是外部可接受的水平。解決這些問題的現(xiàn)有技術(shù)包括生物修復(fù)(bioremediation)、抗生素和化學(xué)添加劑。典型的生物修復(fù)技術(shù)包括將補(bǔ)充的細(xì)菌施應(yīng)用至水中以增強(qiáng)微生物活性從而改善水質(zhì)。還已知使用硝化細(xì)菌來增強(qiáng)硝化過程，以將有毒的氨轉(zhuǎn)化成無毒的硝酸鹽。添加化學(xué)添加劑以改善水質(zhì)并且通過提供額外的營養(yǎng)素和堿度以幫助微生物的活性。添加抗生素以抑制病原微生物的生長。與現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)的問題包括高成本以及具有非活性補(bǔ)充細(xì)菌的差的水質(zhì)改善性能、由于有機(jī)廢棄物的存在和缺乏硝化細(xì)菌生長位點的低硝化活性、在飼養(yǎng)的水生物種中抗生素的生物累積。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的方法提供了成本有效的途徑以將活性細(xì)菌遞送至在水產(chǎn)養(yǎng)殖設(shè)施中的池塘水(或養(yǎng)殖池)，從而在沒有生物累積的情況下降解有機(jī)廢棄物且抑制致病微生物的生長。本發(fā)明的方法降低在水生牲畜中的疾病壓力，導(dǎo)致了在水產(chǎn)養(yǎng)殖操作中養(yǎng)殖物種的改善的產(chǎn)量。如在本文中公開的作為本方法的部分的硝化增強(qiáng)劑的添加提供了穩(wěn)定的堿度源以及用于硝化細(xì)菌的額外生長位點以促進(jìn)硝化活性和氨還原。本發(fā)明的方法期望地包括使用固體細(xì)菌初始材料，將可選地包括益生菌，最優(yōu)選產(chǎn)生自現(xiàn)場的生物反應(yīng)器的活性細(xì)菌遞送至水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用內(nèi)。例如，在美國專利第6,335,191；7,081,361；7,635,587；8,093,040；和8,551,762號中公開了那些生物反應(yīng)器以及它們的使用方法，通過引證將它們的內(nèi)容合并至本公開中以幫助本發(fā)明的實踐。此外，如在提交于2014年10月27日的美國申請系列號14/524,858中公開的益生菌組合物和遞送體系是優(yōu)選的益生菌組合物和用于該組合物的遞送體系，通過引證將其合并至本文，但是也可以使用其他的益生菌和遞送體系。在將其排出至飼養(yǎng)池內(nèi)之前，可以將從生物反應(yīng)器排出的活性的細(xì)菌繁殖體(vegetativebacteria)直接地供給至飼養(yǎng)池或者可以將其累積且用池塘水或另外相似的合適稀釋液(如來自城市水系統(tǒng)的水)進(jìn)行稀釋。如果生物反應(yīng)器位于飼養(yǎng)池的一定距離處，那么稀釋可以幫助處理溶液從生物反應(yīng)器流至飼養(yǎng)池的遞送。在不需要添加(或減少其的量)在飼養(yǎng)池中使用的化學(xué)處理以及抗生素的情況下，活性細(xì)菌將降解有機(jī)廢棄物且抑制在水產(chǎn)養(yǎng)殖設(shè)施中的水中的致病微生物的生長。本發(fā)明還期望地包括同時期地將至少一種硝化增強(qiáng)劑施加至飼養(yǎng)池。硝化增強(qiáng)劑增加天然發(fā)現(xiàn)于水中的硝化細(xì)菌的活性以降低氨水平。這些硝化劑包含對硝化所必需的增加水的堿度的堿度增強(qiáng)劑(7份堿度對應(yīng)于1份氨)和/或添加用于硝化細(xì)菌生長的表面的表面積改性劑，由于硝化細(xì)菌生長為生物膜且需要它們可以附著的表面。堿度增強(qiáng)劑可以包括，例如，碳酸鈣、石灰質(zhì)海草或其他相似的有效添加劑。可以以高于溶解的量添加這些試劑以在它們緩慢溶解時提供堿度的持續(xù)來源。某些硝化劑，如石灰質(zhì)海草，通過提供堿度和大的表面積的兩者，海草作為堿度增強(qiáng)劑和表面積改性劑的兩者，從而提供用于硝化細(xì)菌生長的生物膜的支撐表面。石灰質(zhì)海草還作為細(xì)菌的微量營養(yǎng)素的來源。其他的硝化增強(qiáng)劑僅作為表面積改性劑，如塑料或金屬片，或者其他相似的有效材料，以在可能發(fā)生的有利反應(yīng)和相互作用的擠出基礎(chǔ)上增加表面積。也可以將僅作為表面積改性劑(且沒有堿度增強(qiáng)物)的一種或多種試劑單獨地或優(yōu)選地與一種或多種堿度增強(qiáng)劑的組合添加至飼養(yǎng)池；然而，僅作為表面積增強(qiáng)物的試劑在飼養(yǎng)池中將不會降解，且將不會與每批的細(xì)菌溶液同時添加。將僅作為表面積改性劑的這些試劑優(yōu)選地僅一次添加至飼養(yǎng)池?；谥芷谛?，如季節(jié)性地(每季一次或每個夏季一次、一年兩次等)或根據(jù)需要，將作為堿度增強(qiáng)劑的試劑與一批細(xì)菌同時添加至飼養(yǎng)池。如本文中使用的，術(shù)語“同時”旨在表示“在或約”將一批細(xì)菌繁殖體和其他組分或試劑添加至飼養(yǎng)池或其他的生長培養(yǎng)基的時間，其中水產(chǎn)物種在水產(chǎn)養(yǎng)殖設(shè)施中生長。附圖說明在以下附圖中示出了圖表顯示的實驗室研究的結(jié)果：圖1是硝酸鹽水平的圖；圖2是正硝酸鹽水平的圖；圖3是濁度的圖。具體實施方式適合用于本發(fā)明方法的細(xì)菌屬被認(rèn)為是包括以下屬中的一種或多種種類：芽孢桿菌屬(Bacillus)、擬桿菌屬(Bacteriodes)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、明串珠菌屬(Leuconostoc)Lueconostoc、片球菌屬(Pediococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、巨型球菌屬(Megasphaera)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和丙酸桿菌屬(Propionibacterium)?？梢栽诂F(xiàn)場產(chǎn)生的益生菌包括以下中的任何一種或多種：嗜淀粉芽孢桿菌(Bacillusamylophilus)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、棲瘤胃擬桿菌(Bacteriodesruminocola)、棲瘤胃擬桿菌(Bacteriodesruminocola)、豬擬桿菌(Bacterioidessuis)、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、動物雙歧桿菌(Bifidobacteriumanimalis)、兩岐雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacteriuminfantis)、長雙歧桿菌(Bifidobacteriumlongum)、嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacteriumthermophilum)、乳脂腸球菌屬(Enterococcuscremoris)、雙醋酸乳酸腸球菌(Enterococcusdiacetylactis)、屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、中間腸球菌(Enterococcusintermedius)、乳酸腸球菌(Enterococcuslactis)、噬熱腸球菌(Enterococcusthermophiles)、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、纖維二糖乳桿菌(Lactobacilluscellobiosus)、彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbruekii)、香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)、瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、乳酸乳桿菌(Lactobacilluslactis)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdennii)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilacticii)、啤酒片球菌(Pediococcuscerevisiae)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、產(chǎn)丙酸丙酸桿菌(Propionibacteriumacidipropionici)、費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreudenreichii)和謝氏丙酸桿菌(Propionibacteriumshermanii)。用于本發(fā)明的方法的令人滿意的細(xì)菌生長和遞送設(shè)備將包括如以上引用的現(xiàn)場的生物反應(yīng)器或者用于細(xì)菌的任何其他相似的有效來源。最優(yōu)選地，現(xiàn)場的生物反應(yīng)器使用固體細(xì)菌初始材料以產(chǎn)生被排出至飼養(yǎng)池中的細(xì)菌溶液，其中該溶液優(yōu)選地具有約1×109-1×1010cfu/mL的細(xì)菌繁殖體物種?？梢蕴峁┒鄠€生物反應(yīng)器以提供大量的細(xì)菌至飼養(yǎng)池，從而提供不同種類的細(xì)菌至飼養(yǎng)池或者以不同的時間或速率，或者圍繞飼養(yǎng)池周邊分隔所排出的細(xì)菌溶液以幫助池塘內(nèi)的細(xì)菌分散。也可以將泵或其他混合設(shè)備添加至飼養(yǎng)池(如果沒有已經(jīng)就位)以幫助細(xì)菌溶液(以及硝化增強(qiáng)劑或表面積增強(qiáng)劑)在整個飼養(yǎng)池內(nèi)的分散。將現(xiàn)場的生物反應(yīng)器優(yōu)選地配置為包含一定量的固體或液體形式的細(xì)菌初始材料且混合有營養(yǎng)素，使得在初始材料需要被補(bǔ)充之前，可以將多批細(xì)菌溶液以周期性間隔在延長的時間的時期內(nèi)排出。例如，生物反應(yīng)器可以保持約37克的含1×108cfu/g的初始材料以排出含約1×1010cfu/mL的細(xì)菌溶液每24小時一次，持續(xù)60天。將營養(yǎng)素和水與初始材料一起添加至生物反應(yīng)器中，以使將被周期性地排出至飼養(yǎng)池的一批細(xì)菌生長。最優(yōu)選地，將無菌的或處理過的水(如來自城市水供給的可飲用的水)的來源用于提供生物反應(yīng)器的水。也可以使用現(xiàn)場的水源，如飼養(yǎng)池，但是已經(jīng)存在于水中的細(xì)菌(甚至來自城市水供給的水中的低水平的細(xì)菌)在生物反應(yīng)器中生長時可以與初始材料中的細(xì)菌競爭，導(dǎo)致了較低cfu/ml批的有利細(xì)菌且導(dǎo)致了有害細(xì)菌的增殖。優(yōu)選的初始材料是分別商售自EcoBionics和FlexFill的FREE-FLOW粒料或FREE-FLOW液體以及BioAmp營養(yǎng)素，但是根據(jù)期望的細(xì)菌種類，也可以使用其他的初始材料。在處理周期的過程內(nèi)，優(yōu)選地每12至36個小時一次且最優(yōu)選地約每24小時一次將細(xì)菌溶液從生物反應(yīng)器或多個生物反應(yīng)器排出至飼養(yǎng)池。最優(yōu)選地，約每24小時一次的給予約3000mL的含約1×1010cfu/mL的細(xì)菌溶液將足以處理含100,000加侖的水的飼養(yǎng)池。本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員將理解，可以使用其他體積的細(xì)菌溶液和給予間隔以處理不同大小的飼養(yǎng)池。利用在整年運行的生物反應(yīng)器，處理周期優(yōu)選地是連續(xù)的(不同于用于維持或補(bǔ)充細(xì)菌初始物和營養(yǎng)素的周期性關(guān)閉)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將理解的是，根據(jù)池塘中的條件、所包括的水產(chǎn)物種、飼養(yǎng)池的溫度及其他因素，可以使用其他的給予間隔和細(xì)菌溶液的量。在生物反應(yīng)器中現(xiàn)場產(chǎn)生的細(xì)菌可以包括一種或多種益生菌。除了在生物反應(yīng)器中現(xiàn)場產(chǎn)生的細(xì)菌之外，可以將在水(最優(yōu)選無菌水)中的包含任何已知的益生菌(如地衣芽孢桿菌、短小芽胞桿菌或枯草芽孢桿菌)的益生菌溶液、適合于動物和水產(chǎn)物種攝取的表面活性劑(如聚山梨酸酯80)、防腐劑(如山梨酸、山梨酸鉀、山梨酸鈉、山梨酸鈣、苯甲酸鈉或苯甲酸)和增稠劑(如瓜爾膠或黃原膠)添加至飼養(yǎng)池。在提交于2014年10月27日的美國申請系列號14/524,858中公開了這類益生菌組合物以及用于那些組合物的遞送方法，通過引證將其結(jié)合至本文中。優(yōu)選同時添加一種或多種硝化增強(qiáng)劑與排出至飼養(yǎng)池的至少一種劑量(或批)的細(xì)菌溶液?？梢灾芷谛缘兀缂竟?jié)性地或根據(jù)需要并且不與每種劑量的細(xì)菌一起添加包括碳酸鈣或石灰質(zhì)海草的堿度增強(qiáng)劑?？梢砸愿哂谌芙獾牧刻砑釉撛噭┮栽谒鼈兙徛芙鈺r提供堿度的持續(xù)來源。緩慢溶解的堿度增強(qiáng)劑，如石灰質(zhì)海草，還作用為表面積改性劑，以提供用于硝化細(xì)菌生長的生物膜的支撐表面，并且它們還幫助營養(yǎng)素的遞送。此外，可以根據(jù)需要將僅用作表面積改性劑的試劑(如金屬或塑料的片)與一批或一劑量的細(xì)菌溶液和一種或多種堿度增強(qiáng)劑一起添加至飼養(yǎng)池以降低氮或磷，但是優(yōu)選地僅添加一次且不與每種劑量的細(xì)菌溶液一起添加。這些表面增強(qiáng)劑相似地提供用于所添加的細(xì)菌生長的生物膜的支撐表面，其幫助有利細(xì)菌更快的發(fā)展。最優(yōu)選地，每7.5百萬加侖的飼養(yǎng)池添加約100磅的這種硝化增強(qiáng)劑，并且對于其他的飼養(yǎng)池體積該量可以是依比例的。用于硝化增強(qiáng)劑的優(yōu)選的分散方法可以包括使用至飼養(yǎng)池中的水的自動化設(shè)備或手動應(yīng)用。用于播撒或另外地分散至少一種以小球、粒料或粒料的形式的硝化增強(qiáng)劑的自動化或手動操作的設(shè)備是商業(yè)可獲得的，并且對本領(lǐng)域的技術(shù)人員是熟知的。此外，可以使用自分散添加劑體系和方法將這些硝化增強(qiáng)劑分散于池塘中，其使用在提交于2015年4月17日的美國專利申請系列號14/689,790中所描述的水溶性封裝中的泡騰材料以及處理劑，通過引證將其結(jié)合于此。用于本發(fā)明的方法的合適的應(yīng)用包括，例如且不限于各種類型的水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用，如孵化場、池塘和潮汐流動水產(chǎn)養(yǎng)殖。優(yōu)選現(xiàn)場生長的細(xì)菌繁殖體與至少一種硝化增強(qiáng)助劑如碳酸鈣、石灰質(zhì)海草或?qū)τ谒a(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用中使用的水的成本有效處理相似有效的另一種材料組合使用，以解決有機(jī)廢棄物、氨和致病微生物以及常規(guī)的水質(zhì)問題。通過添加石灰質(zhì)海草或其他塑料或金屬片、粒料或片段(增加在其上可以發(fā)生相互相用或反應(yīng)的可獲得的表面積)，認(rèn)為進(jìn)一步地增強(qiáng)了用于實現(xiàn)這些目標(biāo)的目的方法的有效性。進(jìn)行實驗室研究以評估將有利細(xì)菌和硝化增強(qiáng)劑添加至池塘水的利益。研究的一個目的是評估所添加的細(xì)菌(可商購自EcoBionics的池塘共混物)對藻類生產(chǎn)抑制或除草的功效。本研究使用六個2L的燒杯，各自填充有1.5L的取自存在有藻類的所建立的魚塘的水源水。每個燒杯還包含一只來自源塘的金魚，氣泡石、光源交替地開啟12小時然后關(guān)閉12小時，且覆蓋表面玻璃以減少蒸發(fā)的損失。使用37g的PondPlus粒料，在BIO-AmpTM生物反應(yīng)器中生產(chǎn)池塘共混物細(xì)菌溶液(pondblendbacteriasolution)。在生物反應(yīng)器中24小時的生長周期之后，獲得細(xì)菌溶液的等分部分且稀釋以保持3L池塘共混物:579024加侖的池塘水的比值，然而，實地所采用的優(yōu)選的比值是3L的池塘共混物:100,000加侖的池塘水?；谠摫戎?，將約0.4μL的池塘共混物細(xì)菌溶液添加至具有1.5L的魚塘水的特定的燒杯?；趦艋乃俾?，根據(jù)制造商的說明，將石灰質(zhì)海草添加至特定的燒杯；這等同于0.045g的石灰質(zhì)海草/1.5L的水。將等量的碳酸鈣添加至一些燒杯。在每個燒杯中的添加劑如下：表1燒杯1僅0.4μL的池塘共混物和1.5L的水源水燒杯2僅0.045g的石灰質(zhì)海草和1.5L的水源水燒杯30.4μL的池塘共混物、0.045g的石灰質(zhì)海草和1.5L的水源水燒杯4僅0.045g的碳酸鈣和1.5L的水源水燒杯50.4μL的池塘共混物、0.045g的碳酸鈣和1.5L的水源水燒杯6作為陰性對照且僅包含1.5L的水源水根據(jù)將在實地被使用的一種優(yōu)選的劑量方案處理每個測試燒杯。將具有池塘共混物的燒杯1、3和5每周一次的處理(給予)有另外的0.4μL的池塘共混物。根據(jù)飼養(yǎng)池條件，可以在實地使用其他的給予方案。僅在本研究開始時將石灰質(zhì)海草和碳酸鈣添加一次，然而，可以在實地使用另外的劑量。每個燒杯取出一個預(yù)處理的樣品(在添加池塘共混物細(xì)菌溶液、石灰質(zhì)海草或碳酸鈣添之前)，并且進(jìn)行分析以獲得用于與后處理結(jié)果比較的基線。使用200-300mL的來自每個燒杯的樣品，每周進(jìn)行化學(xué)分析一次。這些每周的測量包括分析pH、導(dǎo)電性、硝酸鹽、正磷酸鹽、總堿度和氨水平。每月檢查濁度一次，并且進(jìn)行拍照以評價藻類生長和總澄清度的變化。持續(xù)處理和分析燒杯總共三個月；再次重復(fù)(mirror)實地研究的長度。使用Excel2003，使用95％置信水平比較預(yù)處理比后處理數(shù)量的兩樣本的雙側(cè)t檢驗，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用在方法中存在差異的擇一假設(shè)(alternativehypothesis)，兩樣本的雙側(cè)t檢驗測試了在預(yù)處理和后處理的平均值中無差異的零假設(shè)(nullhypothesis)。HO＝μ預(yù)處理＝μ后處理HA＝μ預(yù)處理≠μ后處理基線讀數(shù)表明在所有燒杯中升高的磷酸鹽水平，超過表示促進(jìn)藻類生長的水平的40倍。所有其他測量均在可接受的范圍內(nèi)。表2-用于硝酸鹽和磷酸鹽的來自兩樣本T-檢驗的結(jié)果*表示顯著的結(jié)果僅含有細(xì)菌共混物粒料的測試燒杯在三個月的研究期間沒有示出統(tǒng)計學(xué)上顯著的變化。磷酸鹽水平在兩周后下降，但在一個月內(nèi)恢復(fù)到預(yù)處理水平。硝酸鹽水平與磷酸鹽水平相似。在所有的測試燒杯中，僅燒杯1具有類似于陰性對照的硝酸鹽和磷酸鹽水平。這表明當(dāng)單獨使用細(xì)菌時對池塘健康的主要化學(xué)指示物的影響最小。含有石灰質(zhì)海草的兩個燒杯在預(yù)處理期間比后處理平均值示出了統(tǒng)計學(xué)上顯著的變化。分別地，在燒杯2和3中，硝酸鹽水平顯著地下降79％和76％，具有0.01和0.04的p值。在燒杯2中磷酸鹽水平也顯著地下降74％，具有0.02的p值。含有石灰質(zhì)海草和粒料的燒杯顯示出磷酸鹽降低66％，然而，該值不顯著(參見表2)。重要的是要注意，這種統(tǒng)計學(xué)顯著性的缺乏可能受制于本研究的低樣本量限制。本研究沒有測試樣品中病原菌的變化，但添加池塘共混物細(xì)菌溶液將被預(yù)期為通過競爭而減少這些數(shù)量。另外，應(yīng)相信，因為細(xì)菌溶液中的細(xì)菌可以與已經(jīng)存在于飼養(yǎng)池中的硝化細(xì)菌協(xié)同作用，并且細(xì)菌溶液中所添加的細(xì)菌可以幫助消耗水中的廢棄物以降低氨水平，所以根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式將來自生物發(fā)生器的細(xì)菌溶液添加至實際飼養(yǎng)池中將比實驗室研究獲得更好的結(jié)果。與石灰質(zhì)海草燒杯相似，在預(yù)處理期間比后處理平均值中含有碳酸鈣的兩個燒杯顯示出了顯著的差異。在燒杯4中，硝酸鹽水平下降77％，具有0.03的p值。然而，含有碳酸鈣和細(xì)菌粒料的燒杯5示出了磷酸鹽水平顯著降低72％，p值為0.02(參見表2)。碳酸鈣可以是水產(chǎn)養(yǎng)殖處理中石灰質(zhì)海草的合適替代品。含有石灰質(zhì)海草或碳酸鈣的燒杯勝過不含有石灰質(zhì)海草或碳酸鈣的那些。含有細(xì)菌共混物粒料和碳酸鈣的燒杯5具有顯著較低的磷酸鹽水平的后處理平均值以及對pH最小的影響。然而，燒杯2和5在磷酸鹽水平方面具有統(tǒng)計學(xué)顯著的下降。在整個本研究中所檢測的濁度顯示出在所有測試的燒杯中連續(xù)降低。當(dāng)將預(yù)處理圖片與后處理圖片比較時，在所有燒杯中藻類的存在增加，然而，到第二個月，在兩個燒杯中存在藻類死亡的跡象。含有碳酸鈣的的燒杯4和燒杯6(對照)均呈現(xiàn)出黃色，這表明死亡的藻類系統(tǒng)。盡管存在氣泡石，由于水中的氧耗盡，藻類死亡是在初始藻類繁殖之后經(jīng)歷的常見問題。由于藻類死亡，硝酸鹽水平顯著地增加。在本月預(yù)處理之前的硝酸鹽水平增加明顯，在燒杯4和6中分別地增加14％和38％。到最后一個月，盡管系統(tǒng)仍然是深綠色、黃色的，但是燒杯4中的硝酸鹽水平恢復(fù)且下降。在燒杯6中，硝酸鹽繼續(xù)增加至6倍的污染水平。還在各種池塘中進(jìn)行了重點在于改善常規(guī)池塘健康和澄清度同時減少污泥的現(xiàn)場研究。雖然這項研究不是水產(chǎn)養(yǎng)殖特定的(由于研究中的池塘是觀賞或娛樂性的，而不是用于飼養(yǎng)和收獲水生物種)，但是在添加細(xì)菌和硝化增強(qiáng)劑方面，它提供了一些有用的信息。該研究包括在德克薩斯州的歐文市(Irving,Texas)內(nèi)和周圍的五個池塘；將池塘確定為范圍從23,400ft3至720,131ft3的池塘1-5。這項研究的長度是七個月。每周一至兩次，從每個池塘取出200-300mL的表面水樣品。分析這些樣品的pH、堿度、硝酸鹽、磷酸鹽、氨、導(dǎo)電性、濁度和大腸桿菌種(E.colispp)的濃度。使用HachDR890比色計進(jìn)行磷酸鹽、氨和濁度分析。使用用于大腸桿菌生長的專門培養(yǎng)基(3MPetrifilm6404)在35℃溫育48小時進(jìn)行測定大腸桿菌。對于污泥深度、澄清度和溶解氧(DO)，對每個池塘每月取樣一次。由小船在兩至四個GPS坐標(biāo)標(biāo)志的位置處量獲取這些測量以獲得代表性樣品。使用污泥采樣器(sludgejudge)以英寸測量污泥深度；將每個GPS位置取樣三至四次，取平均值。使用具有HachHQ30d儀的HachLDO探針，從底層且再次在表面的18”處以ppm測量溶解氧。使用西奇盤(SecchiDisk)以％/英尺測定澄清度，其給出了經(jīng)驗測量值。此外，在每個池塘的兩至四個位置處每月拍照一次，再次通過GPS坐標(biāo)標(biāo)記，以給出總體表面條件的顧客觀點(patronpoint-of-view)。在每個位置處安裝BioAMPTM750氣候控制的生物反應(yīng)器，用于每天現(xiàn)場給予細(xì)菌的專門化的池塘共混物。使用改良的FREE-FLOWTM配方將芽孢桿菌種孢子制粒；將粒料進(jìn)料至生長容器中，其中它們在最佳條件下生長24小時，然后直接分散至池塘中。由于次氯酸鈉(漂白劑)被認(rèn)為對地表水(surfacewater)有毒并且不被歐文市使用，因此必須由標(biāo)準(zhǔn)方案對BioAMP750的維護(hù)進(jìn)行修改。為了獲得與標(biāo)準(zhǔn)漂白處理相似的增白效果，使用155g的碳酸氫鈉(小蘇打)以除去過量的生物膜且清理生長容器。除了每月的維護(hù)之外，還監(jiān)測生物發(fā)生器的任何故障以及盡管環(huán)境溫度超過100°F但仍保持程序化溫度的能力。陪同細(xì)菌處理的是，還將石灰質(zhì)海草應(yīng)用于每個池塘。所給予的石灰質(zhì)海草的量取決于以100lbs與1,000,000ft3的比值的水的體積。使用如在美國專利申請系列號14/689,790中描述的含泡騰劑伴侶(effervescentcouple)和石灰質(zhì)海草的水溶性包給予石灰質(zhì)海草。將每個研究池塘每日給予相同量的細(xì)菌(30萬億CFU)。相關(guān)矩陣顯示出污泥深度與給予速率逆相關(guān)。兩個較小的池塘在污泥水平和澄清度上具有最大的所觀察的降低，且分別地，細(xì)菌的最高日劑量是2×107CFU/L和7×106CFU/L。不管大小怎樣，所觀察的澄清度在所有池塘上示出了積極的效果。對于本研究的三個最小的池塘中，澄清度約是100％。相反地，在本研究結(jié)束時，兩個最大的池塘僅實現(xiàn)了20％的澄清度。使用單側(cè)的兩樣本t-檢驗以評價在處理之后污泥水平是否顯著地降低。0.006的p值發(fā)現(xiàn)了31％的統(tǒng)計上顯著的平均降低。H0:μ預(yù)處理＝μ后處理，HA:μ預(yù)處理>μ后處理。這種所觀察的平均降低等于平均3英寸的污泥層的降低。此外，當(dāng)與預(yù)處理比較時(參見表3)，本研究的每個池塘經(jīng)歷污泥水平的降低。表3-池塘的PO4、NO3和污泥的變化池塘％ΔPO4％ΔNO3％Δ污泥1-19-71-452-77-100-183-400-164-70-100-375-480-43平均值-52-91-31觀察到的大腸桿菌種變化的平均值降低了59％。重要的是要注意，全范圍包括145％的增加至100％的降低。這樣寬的范圍加上小的樣品量使得難以確定對大腸桿菌種濃度的處理的有效性。五個研究池塘中的三個經(jīng)歷了大腸桿菌種濃度的增加；然而，看出另外兩個池塘急劇降低；然而，增加被認(rèn)為是雨水徑流入池塘的結(jié)果。將預(yù)處理和后處理水平比較，檢測了本處理對磷酸鹽濃度的總體效果。發(fā)現(xiàn)該數(shù)據(jù)是非參數(shù)的，并且使用單側(cè)的曼-惠特尼檢驗(one-sidedMann-Whitneytest)以確定磷酸鹽濃度是否在處理之后顯著的降低。H0:μ預(yù)處理＝μ后處理，HA:μ預(yù)處理>μ后處理。所獲得的0.0000的p值表示在處理之后磷酸鹽水平的總體52％的降低是統(tǒng)計上顯著的。池塘的磷酸鹽水平的變化的詳細(xì)檢測還示出了有意義的降低?？闯雒總€處理的池塘在磷酸鹽濃度上在19％至77％范圍內(nèi)降低(參見表3)。平均52％的降低與在本研究的第I期所觀察的降低57％相似。這表示細(xì)菌劑量頻率的增加可能不與磷酸鹽濃度的降低相關(guān)聯(lián)。此外，在應(yīng)用石灰質(zhì)海草之后，直接地觀察到磷酸鹽水平的明顯降低。在春季給予第一次劑量，在夏季給予第二次，之后磷酸鹽水平在6月開始升高。對于磷酸鹽濃度的控制，非化學(xué)的、環(huán)境友好屬性的粉末產(chǎn)物提供了有希望的效果。相似地，使用單側(cè)的曼-惠特尼檢驗檢測硝酸鹽水平以評價硝酸鹽濃度是否在處理之后顯著的降低。H0:μ預(yù)處理＝μ后處理，HA:μ預(yù)處理>μ后處理。利用0.0000的p值，測定到91％的濃度降低是統(tǒng)計上顯著的(參見表3)。為此，基線硝酸鹽濃度低于建議水平，因此沒有預(yù)料到減少，更不用說91％的統(tǒng)計上顯著的減少。此外，第4個月，具有可檢測的硝酸鹽的每個所研究池塘顯著降低至低于0.01ppm的檢測極限。相比于在階段I中觀察到的減少(～69％)，這是巨大的改善，并且表示增加細(xì)菌給予的頻率對這些濃度具有直接的影響。總體上，這項研究表明，如通過化學(xué)指標(biāo)和污泥水平的降低所測量的，使用細(xì)菌和石灰質(zhì)海草的增強(qiáng)處理增加了池塘健康。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在閱讀本說明書后還將理解，可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行對益生菌組合物以及用于遞送益生菌組合物的方法和系統(tǒng)的修改和改變，并且其旨在本文中所公開的本發(fā)明的范圍僅受限于由發(fā)明人合法授權(quán)的所附權(quán)利要求的最寬解釋。當(dāng)前第1頁1 2 3