本發(fā)明屬于有機污染物生物修復技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多環(huán)芳烴的降解方法，特別涉及一種黑曲霉真菌對多環(huán)芳烴菲的生物降解方法。

背景技術(shù)：

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbon，PAHs）是環(huán)境中普遍存在的一類由兩個或兩個以上的苯環(huán)結(jié)合在一起的化合物，由于這類化合物具有致畸、致癌、致突變的特性而備受關(guān)注，菲因具有一個“灣”區(qū)（bay region）和一個K區(qū)（kregion），使其成為多環(huán)芳烴的典型代表物，因此以菲作為底物研究有重要意義，多環(huán)芳烴化合物能被單一微生物或微生物群體全部或部分降解，目前已分離出多種具有PAHs降解能力的細菌、真菌和藻類。PAHs能夠長期存在于環(huán)境中的原因主要有：溶解度低，不易被生物所利用；PAHs降解產(chǎn)物的毒性作用；底物的競爭；PAHs濃度太低不至于誘導產(chǎn)生裂解酶。許多環(huán)境因子也可能影響到PAHs的生物降解。因此了解微生物對PAHs的代謝作用，對于有效進行污染環(huán)境的生物修復具有重要作用，菲為三環(huán)多環(huán)芳烴代表物，生物降解是污染環(huán)境中菲去除的主要途徑，菲的降解已有不少報道，但目前已知的菌株對菲的降解速度不甚理想，降解效率低。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于：提供一種黑曲霉真菌對多環(huán)芳烴菲的生物降解方法，該方法是將黑曲霉真菌投放到含有多環(huán)芳烴菲的廢水中，為多環(huán)芳烴的降解提供了一種更有效的方法，該方法降解效率高、降解程度大。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案，包括以下步驟：

1、制備固體生長培養(yǎng)基：將200g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入20g 葡萄糖和20g 瓊脂，用水定容至1000mL，分裝到試管中，112-125℃滅菌20min，制成固體生長培養(yǎng)基（斜面）；

2、制備液體生長培養(yǎng)基：將200g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入20g 葡萄糖，用水定容至1000mL，分裝到250mL錐形瓶中，每瓶40mL，112-125℃滅菌20min，制成液體生長培養(yǎng)基；

3、制備液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基：將100g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入10g 葡萄糖，用水定容至1000mL，分裝到250mL錐形瓶中，每瓶40mL，制成液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基；

4、降解實驗：中科院友情提供的黑曲霉真菌接種到固體生長培養(yǎng)基斜面上，在培養(yǎng)箱中28-30℃培養(yǎng)5-7d，制備斜面菌種；在無菌條件下將斜面菌種接種到液體生長培養(yǎng)基中，放入搖床30℃、150r/min條件下培養(yǎng)24小時，制備黑曲霉降解劑；在液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)至不同pH值，加入不同濃度的菲（微量丙酮助溶）后112-125℃滅菌20min，在無菌條件下將黑曲霉降解劑接種到液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基中，30℃、150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，不同時間后取樣測定；

5、分析測定：用20mL二氯甲烷或乙酸乙酯超聲萃取殘留目標污染物3次，合并提取液，并定容到25 mL容量瓶中，用微量移液管取0.1mL于K.D.濃縮器，氮氣吹干后，再以甲醇定容到1mL，當菲含量很低時，將合并的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干，再以甲醇定容到1mL，移入色譜進樣瓶，用高效液相色譜測定。

所述的不同的pH值分別為3、5、7、9。

所述的不同濃度的菲分別為60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、160μg/mL。

所述的不同時間分別為0d、2d、4d、6d、8d。

所述的高效液相色譜檢測條件：檢測波長：254nm；柱溫：38℃；流動相：乙腈∶水(90∶10)；流速：0.5mL/min；進樣量：20μL。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提高了降解速度和效率，在菲的濃度為100μg/mL、pH為7、培養(yǎng)時間為6d的條件時降解效果最好，降解率達到了85%，本發(fā)明是處理含菲廢水上的一大創(chuàng)新，具有巨大的經(jīng)濟和社會效益。

附圖說明

圖1為本發(fā)明菲初始濃度對降解的影響。

圖2為本發(fā)明pH值對降解的影響。

圖3為本發(fā)明降解時間對降解的影響。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的具體實施方式作詳細說明。

實施例1：菲初始濃度的選擇

1、制備固體生長培養(yǎng)基：將200g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入20g 葡萄糖和20g 瓊脂，用水定容至1000mL，分裝到試管中，112-125℃滅菌20min，制成固體生長培養(yǎng)基（斜面）；

2、制備液體生長培養(yǎng)基：將200g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入20g 葡萄糖，用水定容至1000mL，分裝到250mL錐形瓶中，每瓶40mL，112-125℃滅菌20min，制成液體生長培養(yǎng)基；

3、制備液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基：將100g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入10g 葡萄糖，用水定容至1000mL，分裝到250mL錐形瓶中，每瓶40mL，制成液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基；

4、降解實驗：中科院友情提供的黑曲霉真菌接種到固體生長培養(yǎng)基斜面上，在培養(yǎng)箱中28-30℃培養(yǎng)5-7d，制備斜面菌種；在無菌條件下將斜面菌種接種到液體生長培養(yǎng)基中，放入搖床30℃、150r/min條件下培養(yǎng)24小時，制備黑曲霉降解劑；在液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH值至7，分別加入60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL、120μg/mL、140μg/mL、160μg/mL菲（微量丙酮助溶）后112-125℃滅菌20min，在無菌條件下將黑曲霉降解劑接種到液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基中，30℃、150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，6d后取樣測定；

5、分析測定：用20mL二氯甲烷或乙酸乙酯超聲萃取殘留目標污染物3次，合并提取液，并定容到25 mL容量瓶中，用微量移液管取0.1mL于K.D.濃縮器，氮氣吹干后，再以甲醇定容到1mL，當菲含量很低時，將合并的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干，再以甲醇定容到1mL，移入色譜進樣瓶，用高效液相色譜測定；

在實驗條件下，當菲的初始濃度過高或過低，均不利于菲及其代謝產(chǎn)物的降解。當菲的初始濃度過高時，菲及其代謝產(chǎn)物對微生物有很高的毒性，降解速率緩慢；當菲的初始濃度過低時，不利于微生物的利用。從圖1可以看出，在此實驗條件下，菲的初始濃度在100 μg/mL時，有利于菲的降解。

實施例2：pH值對降解的影響

1、制備固體生長培養(yǎng)基：將200g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入20g 葡萄糖和20g 瓊脂，用水定容至1000mL，分裝到試管中，112-125℃滅菌20min，制成固體生長培養(yǎng)基（斜面）；

2、制備液體生長培養(yǎng)基：將200g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入20g 葡萄糖，用水定容至1000mL，分裝到250mL錐形瓶中，每瓶40mL，112-125℃滅菌20min，制成液體生長培養(yǎng)基；

3、制備液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基：將100g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入10g 葡萄糖，用水定容至1000mL，分裝到250mL錐形瓶中，每瓶40mL，制成液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基；

4、降解實驗：中科院友情提供的黑曲霉真菌接種到固體生長培養(yǎng)基斜面上，在培養(yǎng)箱中28-30℃培養(yǎng)5-7d，制備斜面菌種；在無菌條件下將斜面菌種接種到液體生長培養(yǎng)基中，放入搖床30℃、150r/min條件下培養(yǎng)24小時，制備黑曲霉降解劑；在液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基中，分別調(diào)節(jié)pH值至3、5、7、9，加入100μg/mL的菲（微量丙酮助溶）后112-125℃滅菌20min，在無菌條件下將黑曲霉降解劑接種到液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基中，30℃、150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，6d后取樣測定；

5、分析測定：用20mL二氯甲烷或乙酸乙酯超聲萃取殘留目標污染物3次，合并提取液，并定容到25 mL容量瓶中，用微量移液管取0.1mL于K.D.濃縮器，氮氣吹干后，再以甲醇定容到1mL，當菲含量很低時，將合并的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干，再以甲醇定容到1mL，移入色譜進樣瓶，用高效液相色譜測定；

從圖2可以看出，隨著pH值的增大，降解率出現(xiàn)先增大后減小的趨勢，pH=7時菲降解效果最好，本實驗均選用pH值等于7。

實施例3：最佳降解時間的確定

1、制備固體生長培養(yǎng)基：將200g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入20g 葡萄糖和20g 瓊脂，用水定容至1000mL，分裝到試管中，112-125℃滅菌20min，制成固體生長培養(yǎng)基（斜面）；

2、制備液體生長培養(yǎng)基：將200g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入20g 葡萄糖，用水定容至1000mL，分裝到250mL錐形瓶中，每瓶40mL，112-125℃滅菌20min，制成液體生長培養(yǎng)基；

3、制備液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基：將100g 去皮馬鈴薯切碎，加入1000mL 水，煮沸30min，雙層紗布過濾并收集濾液，濾液中加入10g 葡萄糖，用水定容至1000mL，分裝到250mL錐形瓶中，每瓶40mL，制成液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基；

4、降解實驗：中科院友情提供的黑曲霉真菌接種到固體生長培養(yǎng)基斜面上，在培養(yǎng)箱中28-30℃培養(yǎng)5-7d，制備斜面菌種；在無菌條件下將斜面菌種接種到液體生長培養(yǎng)基中，放入搖床30℃、150r/min條件下培養(yǎng)24小時，制備黑曲霉降解劑；在液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基中，調(diào)節(jié)pH值至7，加入100μg/mL的菲（微量丙酮助溶）后112-125℃滅菌20min，在無菌條件下將黑曲霉降解劑接種到液體營養(yǎng)限制培養(yǎng)基中，30℃、150r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，不同時間后取樣測定；

5、分析測定：用20mL二氯甲烷或乙酸乙酯超聲萃取殘留目標污染物3次，合并提取液，并定容到25 mL容量瓶中，用微量移液管取0.1mL于K.D.濃縮器，氮氣吹干后，再以甲醇定容到1mL，當菲含量很低時，將合并的提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干，再以甲醇定容到1mL，移入色譜進樣瓶，用高效液相色譜測定；

從圖3可以看出，不同的取樣時間，菲降解率也會有變化，曲線的總體趨勢是隨著時間的增長，菲降解率不斷的增加，當達到6天左右，曲線趨于平穩(wěn)，降解率基本維持不變值為80%。所以取樣的最佳時間為6天。