本發(fā)明涉及有機(jī)污染土壤微生物修復(fù)領(lǐng)域，具體涉及一種促進(jìn)中溫好氧微生物降解(石油污染物)的綜合調(diào)理劑及其制備和使用方法。

背景技術(shù)：

微生物修復(fù)技術(shù)作為一種廉價(jià)環(huán)保型修復(fù)技術(shù)在石油污染土壤修復(fù)過程已得到廣泛應(yīng)用。針對于該技術(shù)修復(fù)效率低、修復(fù)速率慢等缺陷，圍繞生物放大及生物刺激等多種調(diào)控方法已展開研究和嘗試。制約微生物修復(fù)效率的主要因素來源于土壤理化性質(zhì)的動態(tài)變化，隨著修復(fù)過程的持續(xù)，土壤營養(yǎng)物質(zhì)逐漸匱乏。其中，土壤有機(jī)質(zhì)，特別是可溶性有機(jī)碳(DOC)含量不斷減少，土壤內(nèi)C:N:P比例隨著微生物可利用碳源的消耗而失衡，導(dǎo)致微生物生理狀態(tài)逐漸下降，微生物豐度降低，細(xì)胞內(nèi)外的代謝酶活性減弱，從而對石油烴的代謝礦化能力下降，修復(fù)速率減慢。此外，隨著微生物呼吸代謝作用的進(jìn)行，土壤孔隙內(nèi)氧含量逐漸下降，土壤氧化還原電位逐漸降低，從而導(dǎo)致石油烴礦化所需的電子受體不足，微生物降解能力減弱。再有，土壤對石油烴分子的吸附作用是制約其生物可接觸性及生物可利用性的重要因素，由此限制了微生物代謝能力的發(fā)揮。

因此，對于上述的不利因素，已有較多調(diào)節(jié)對策得到嘗試，包括外源碳源的添加，土壤翻耕通氣等多種方法，但過量的易代謝碳源的施用可導(dǎo)致其與石油烴碳代謝的競爭作用的產(chǎn)生，反而阻礙修復(fù)過程，且短時(shí)間內(nèi)的大量外源有機(jī)碳的加入也不利于微生物修復(fù)效率的長時(shí)間維持，而土壤翻耕等操作過程繁瑣費(fèi)時(shí)費(fèi)力，這些潛在的不利因素仍然制約了微生物修復(fù)效率的進(jìn)一步提升。

對此，通過開發(fā)并添加一種具有碳源緩釋及土壤孔隙和營養(yǎng)配比調(diào)節(jié)能力的綜合調(diào)理劑可有效實(shí)現(xiàn)優(yōu)化土壤營養(yǎng)、改善土壤孔隙環(huán)境及污染物接觸效率，從而提高并延長微生物修復(fù)的效率及其高效修復(fù)過程。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種促進(jìn)中溫好氧微生物降解(石油污染物)的綜合調(diào)理劑及其制備和使用方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種促進(jìn)中溫好氧微生物降解的綜合調(diào)理劑，綜合調(diào)理劑為干制劑和濕制劑；其中，干制劑為可溶性有機(jī)碳含量(DOC)比例達(dá)2％～4％(w/w)的碳化的水稻稻殼；加入量為待修復(fù)有機(jī)污染土壤重量的5％～7％(w/w，g/g)，且添加后使待修復(fù)有機(jī)污染土壤孔隙度達(dá)65％～75％；

濕制劑為KNO₃、KH₂PO₄和K₂HPO₄中的一種或幾種的水溶液；添加量為使待修復(fù)有機(jī)污染土壤中非石油來源有機(jī)碳參與的C:N:P比例達(dá)100:5～10:1～2。

通常待修復(fù)土壤的有機(jī)碳由土壤石油污染物來源有機(jī)碳、土壤天然來源有機(jī)碳(SOC)及干制劑添加的外源碳組成。

其中，土壤天然來源有機(jī)碳(SOC)為石油污染土壤總的有機(jī)碳與石油污染物來源有機(jī)碳之差；石油污染物來源有機(jī)碳的用固相萃取法提取后用元素分析儀測定，石油污染土壤總的有機(jī)碳用元素分析儀測定。

所述干制劑可溶性有機(jī)碳含量(DOC)比例達(dá)2％～4％(w/w)的碳化的水稻稻殼制備方法為：向待碳化處理稻殼中分批次緩慢加入濃度為40％～50％(w/v)的硫酸，使硫酸與稻殼的添加比例達(dá)到1:2～1:2.5(v/w，mL/g)，待混勻后，放置碳化2～5h使稻殼中可溶性有機(jī)碳含量(DOC)比例達(dá)2％～4％(w/w)，而后采用氨水調(diào)節(jié)稻殼酸堿度至pH達(dá)7.5～8.5，自然風(fēng)干后收集制得干制劑。

所述向待碳化處理稻殼中分批次緩慢加入硫酸時(shí)要不斷的快速攪拌使硫酸與稻殼充分混勻；

所述碳化過程中每隔15～30min攪拌一次稻殼。

一種促進(jìn)中溫好氧微生物降解的綜合調(diào)理劑的制備方法，其特征在于：

1)干制劑的制備：向待碳化處理稻殼中分批次緩慢加入濃度為40％～50％(w/v)的硫酸，使硫酸與稻殼的添加比例達(dá)到1:2～1:2.5(v/w，mL/g)，待混勻后，放置碳化2～5h使稻殼中可溶性有機(jī)碳含量(DOC)比例達(dá)2％～4％(w/w)，而后采用氨水調(diào)節(jié)稻殼酸堿度至pH達(dá)7.5～8.5，自然風(fēng)干后收集制得干制劑；

2)濕制劑的制備：將KNO₃、KH₂PO₄、K₂HPO₄中的一種或幾種經(jīng)水制成水溶液，得濕制劑。

所述調(diào)理機(jī)中干制劑加入量為待修復(fù)有機(jī)污染土壤重量的5％～7％(w/w，g/g)，且添加后使待修復(fù)有機(jī)污染土壤孔隙度達(dá)65％～75％；

濕制劑添加量為使待修復(fù)有機(jī)污染土壤中非石油來源有機(jī)碳參與的C:N:P比例達(dá)100:5～10:1～2。

所述步驟1)向待碳化處理稻殼中分批次緩慢加入硫酸時(shí)要不斷快速攪拌使硫酸與稻殼充分混勻；

所述碳化過程中每隔15～30min攪拌一次稻殼。

一種促進(jìn)中溫好氧微生物降解的綜合調(diào)理劑的使用方法，先將綜合調(diào)理劑中干制劑混入有機(jī)污染土壤中，加入量為待修復(fù)有機(jī)污染土壤重量的5％～7％(w/w，g/g)，且添加后使待修復(fù)有機(jī)污染土壤孔隙度達(dá)65％～75％；而后在補(bǔ)給濕制劑，使待修復(fù)有機(jī)污染土壤中非石油來源有機(jī)碳參與的C:N:P比例達(dá)100:5～10:1～2。

其中，濕制劑的選擇根據(jù)土壤濕度及所需N、P元素的含量要求確定濕制劑中營養(yǎng)鹽的種類以及具體用量。

上述利用本發(fā)明綜合調(diào)理劑促進(jìn)中溫好氧微生物降解(石油污染物)中的中溫好氧微生物為可在30～40℃的好氧條件下進(jìn)行繁殖代謝的微生物，例如蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、缺陷假單胞菌(B.diminuta)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)、諾卡氏菌(Nocardia rhamnosiphila)等。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)及有益效果：

1.本發(fā)明所制備的干制劑由部分碳化稻殼組成，碳化過程由40％～50％濃度的硫酸對稻殼的腐蝕實(shí)現(xiàn)，中濃度硫酸不僅降低了應(yīng)用濃硫酸時(shí)潛在的安全風(fēng)險(xiǎn)，且相對溫和的腐蝕過程有利于對稻殼的適度碳化，從何實(shí)現(xiàn)既破壞稻殼表面蠟質(zhì)層，釋放有機(jī)碳源，又避免因過度碳化而導(dǎo)致稻殼有機(jī)碳的過量消耗。

2.本發(fā)明綜合調(diào)理劑中部分碳化過程既利于增加外源碳庫中可溶性有機(jī)碳(DOC)的產(chǎn)生，增加土壤中微生物易于利用的速效碳的含量，又有效提高潛在碳源的儲備。

3.本發(fā)明綜合調(diào)理劑中部分碳化的稻殼還具有更強(qiáng)的吸附能力，不僅同時(shí)吸附石油烴分子和微生物，增強(qiáng)石油烴的生物可接觸性及生物可利用性，又可吸附一定量的微生物易利用碳源，并隨著微生物修復(fù)過程的進(jìn)行再將其緩慢釋放，達(dá)到提供緩釋碳源的目的，以延長微生物的高效代謝過程。

4.本發(fā)明綜合調(diào)理劑中干制劑在土壤中的混入可有效提高石油污染土壤的孔隙度，從而增加了土壤空氣含氧量，保障足量的石油烴分子代謝所需的電子受體，利于中溫好氧微生物降解功能的發(fā)揮。

5.本發(fā)明綜合調(diào)理劑在使用時(shí)先將干制劑施用后補(bǔ)給濕制劑，有效調(diào)節(jié)非石油烴來源碳參與的C:N:P的比例，實(shí)現(xiàn)微生物的營養(yǎng)供給的優(yōu)化。

6.本發(fā)明綜合調(diào)理劑中干制劑pH調(diào)節(jié)至7.5～8.5的偏堿性狀態(tài)，有利于為微生物提供適宜的生存代謝環(huán)境，且偏堿性環(huán)境下有利于增強(qiáng)土壤雙電層厚度，增加zeta電位絕對值，從而利于維持土壤團(tuán)粒的穩(wěn)定性，防止凝聚現(xiàn)象發(fā)生，保持土壤已有孔隙度水平。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的石油烴降解率的曲線，其中，CK為對照，Bio為中溫好氧微生物修復(fù)對照，Bio-R為施加綜合調(diào)理劑的中溫好氧微生物修復(fù)處理。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的石油烴降解速率的曲線，其中，Bio為中溫好氧微生物修復(fù)對照，Bio-R為施加綜合調(diào)理劑的中溫好氧微生物修復(fù)處理，虛線與實(shí)線分別為兩者石油烴降解速率的模擬曲線。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的微生物數(shù)量的曲線，其中，CK為對照，Bio為中溫好氧微生物修復(fù)對照，Bio-R為施加綜合調(diào)理劑的中溫好氧微生物修復(fù)處理。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的脫氫酶活性的曲線，其中，Bio為中溫好氧微生物修復(fù)對照，Bio-R為施加綜合調(diào)理劑的中溫好氧微生物修復(fù)處理。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的勝利油田石油污染土壤中石油烴降解率的曲線，其中，CK為對照，Bio為中溫好氧微生物修復(fù)對照，Bio-R為施加綜合調(diào)理劑的中溫好氧微生物修復(fù)處理。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。

本發(fā)明采用由部分碳化的水稻稻殼組成的干制劑與KNO₃、KH₂PO₄和K₂HPO₄等無機(jī)鹽溶液組成的濕制劑搭配而成，并分別施用。綜合調(diào)理劑的應(yīng)用可增加土壤孔隙度，增強(qiáng)通氣性，提高土壤微生物易利用碳庫容量，同時(shí)以速效碳源及緩釋碳源的方式補(bǔ)充到土壤中，優(yōu)化土壤中C:N:P比例，并利用部分碳化稻殼表面的吸附作用增強(qiáng)微生物與石油烴污染物的接觸性，有利于中溫好氧微生物修復(fù)的高效持續(xù)進(jìn)行。

實(shí)施例1

綜合調(diào)理劑的制備：

1)干制劑的制備：取完整的水稻脫離稻殼18g，在塑料容器內(nèi)加入50％濃度的硫酸45ml，采用少量多次的方法緩慢加入硫酸，每次加入后均快速攪拌稻殼，使硫酸在稻殼內(nèi)均勻分布，待硫酸全部加入后放置4h繼續(xù)碳化，每隔20min攪拌一次，直至稻殼中可溶性有機(jī)碳含量(DOC)比例達(dá)3.1％(w/w)；碳化結(jié)束后采用氨水調(diào)節(jié)稻殼酸堿度至pH達(dá)8.0，自然風(fēng)干后收集制得綜合調(diào)理劑組分中的干制劑。碳化處理結(jié)束后測定稻殼可溶性有機(jī)碳含量(DOC)達(dá)3.1％(w/w，g/g)。

2)濕制劑的制備：擇根據(jù)土壤濕度及所需N、P元素的含量要求確定濕制劑中營養(yǎng)鹽的種類以及具體用量，使待修復(fù)有機(jī)污染土壤中非石油來源有機(jī)碳參與的C:N:P比例達(dá)100:5～10:1～2；具體濕制劑為含9.7％(w/v，g/mL)KNO₃，0.87％(w/v，g/mL)KH₂PO₄，1.39％(w/v，g/mL)K₂HPO₄的水溶液；取50ml。

利用上述獲得綜合調(diào)理劑對吉林油田石油污染土壤的中溫好氧微生物修復(fù)的調(diào)節(jié)。

試驗(yàn)所用污染土壤來自吉林油田石油污染現(xiàn)場土壤，經(jīng)去除肉眼可見草根雜質(zhì)后，室內(nèi)自然風(fēng)干并過2mm篩子，將制備好的干制劑(部分碳化稻殼)全部加入300g石油污染土壤中，施用比例達(dá)6％(w/w，g/g)，再次攪拌混合均勻，使土壤孔隙度達(dá)75％。將施加干制劑混合均勻后的土壤內(nèi)加入全部50mL濕制劑，再次攪拌混合均勻，完成綜合調(diào)理劑的施用。此時(shí)土壤內(nèi)的C:N:P比例為100:5:1。土壤混合均勻后經(jīng)采用固相萃取法測定初始石油烴含量為2％(w/w，g/g)。

試驗(yàn)分為3個處理，即自然降解對照(CK)、中溫好氧微生物修復(fù)對照(Bio)及綜合調(diào)理劑施用的中溫好氧微生物修復(fù)(Bio-R)，每個處理供試的石油污染土壤質(zhì)量為300g。本實(shí)施例將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、缺陷假單胞菌(B.diminuta)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)和諾卡氏菌(Nocardia rhamnosiphila)菌株培養(yǎng)液按體積比為1:1:1：1的比例混合作為中溫好氧微生物的菌懸液。

在Bio及加入綜合調(diào)理劑的Bio-R兩個處理土壤中分別加入100mL和50mL的石油降解功能菌群懸液(微生物數(shù)量相同)，使土壤內(nèi)微生物豐度達(dá)5.6×10⁸copies/g干土。三組處理均在28±2℃下進(jìn)行降解試驗(yàn)，試驗(yàn)共進(jìn)行56d，每7d取樣一次，而后通過固相萃取法測定石油降解率、石油降解速率、微生物數(shù)量及脫氫酶活性。

試驗(yàn)結(jié)果表明：

土壤綜合調(diào)理劑的施用顯著提高微生物修復(fù)的整體效率，石油烴降解率具有起點(diǎn)高、持久性強(qiáng)的特點(diǎn)(圖1)，整體降解率在處理56d后達(dá)到41.7±0.2％，較Bio處理提高15.29％。擬合石油烴降解速率曲線分析表明(圖2)，Bio-R處理在前28天呈現(xiàn)勻速的線性降解過程，而Bio處理僅在前21d具有勻速降解特征，且線性降解階段的石油烴降解速率較Bio-R低0.08g/Kg·d^-1。由此可見，土壤綜合調(diào)理劑的施用顯著提高了石油烴的降解速率。各處理的微生物豐度(圖3)及脫氫酶活性(圖4)分析表明，土壤綜合調(diào)理劑的添加有效保持了微生物的生物量并一定程度促進(jìn)了脫氫酶活性的提高及保持活性高水平的持久性，處理初期的高活性源于速效碳的能量供給作用，而高水平維持的持久性則來源于綜合調(diào)理劑中緩釋碳源的釋放，有利于微生物修復(fù)石油烴污染土壤功能的強(qiáng)化。

實(shí)施例2

對于綜合調(diào)理劑煩請?jiān)俳o出幾個制備實(shí)施例，根據(jù)權(quán)利要求給出的范圍，進(jìn)行增加。

勝利油田石油污染土壤的中溫好氧微生物修復(fù)

綜合調(diào)理劑的制備：

1)干制劑的制備：取完整的水稻脫離稻殼20g，在塑料容器內(nèi)加入50％濃度的硫酸50ml，采用少量多次的方法緩慢加入硫酸，每次加入后均快速攪拌稻殼，使硫酸在稻殼內(nèi)均勻分布，待硫酸全部加入后放置5h繼續(xù)碳化，每隔30min攪拌一次，直至稻殼中可溶性有機(jī)碳含量(DOC)比例達(dá)3.5％(w/w)；碳化結(jié)束后采用氨水調(diào)節(jié)稻殼酸堿度至pH達(dá)7.8，自然風(fēng)干后收集制得綜合調(diào)理劑組分中的干制劑。碳化處理結(jié)束后測定稻殼可溶性有機(jī)碳含量(DOC)達(dá)3.5％(w/w，g/g)。

2)濕制劑的制備：擇根據(jù)土壤濕度及所需N、P元素的含量要求確定濕制劑中營養(yǎng)鹽的種類以及具體用量，使待修復(fù)有機(jī)污染土壤中非石油來源有機(jī)碳參與的C:N:P比例達(dá)100:5～10:1～2；具體濕制劑為含9.5％(w/v，g/mL)KNO₃，0.89％(w/v，g/mL)KH₂PO₄，1.42％(w/v，g/mL)K₂HPO₄的水溶液；取55ml。

利用上述獲得綜合調(diào)理劑對勝利油田石油污染土壤進(jìn)行中溫好氧微生物修復(fù)的調(diào)節(jié)。

試驗(yàn)所用污染土壤來自勝利油田石油污染現(xiàn)場土壤，經(jīng)去除肉眼可見草根雜質(zhì)后，室內(nèi)自然風(fēng)干并過2mm篩子，將制備好的干制劑(部分碳化稻殼)全部加入320g石油污染土壤中，施用比例達(dá)7％(w/w，g/g)，再次攪拌混合均勻，使土壤孔隙度達(dá)73％。將施加干制劑混合均勻后的土壤內(nèi)加入全部55mL濕制劑，再次攪拌混合均勻，完成綜合調(diào)理劑的施用。此時(shí)土壤內(nèi)的C:N:P比例為100:6:1.5。土壤混合均勻后經(jīng)固相萃取法測定初始石油烴含量為2.9％(w/w，g/g)。

試驗(yàn)分為3個處理，即自然降解對照(CK)、中溫好氧微生物修復(fù)對照(Bio)及綜合調(diào)理劑施用的中溫好氧微生物修復(fù)(Bio-R)，每個處理供試的石油污染土壤質(zhì)量為320g。

本實(shí)施例將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、缺陷假單胞菌(B.diminuta)、鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)三種菌株培養(yǎng)液按體積比為1:1:1的比例混合作為中溫好氧微生物的菌懸液。

在Bio及加入綜合調(diào)理劑的Bio-R兩個處理土壤中分別加入110mL和55mL的石油降解功能菌群懸液(微生物數(shù)量相同)，使土壤內(nèi)微生物豐度達(dá)9.6×10⁷copies/g干土。三組處理均在29±2℃下進(jìn)行降解試驗(yàn)，試驗(yàn)共進(jìn)行60d，每10d取樣一次，而后通過固相萃取法測定石油降解率。

試驗(yàn)結(jié)果表明：

土壤綜合調(diào)理劑的施用顯著促進(jìn)了微生物修復(fù)的整體效率，石油烴降解率在處理60d后達(dá)到42.5±0.6％，較Bio處理提高18.6％(圖5)。由此表明，綜合調(diào)理劑有效改善了土壤孔隙度、土壤有效碳源及C:N:P的營養(yǎng)比例，利于微生物對石油污染物的代謝。