本發(fā)明涉及生物，特別是酶生物。

背景技術(shù)：

1、殺蟲制劑，包括殺蟲劑，是在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中廣泛使用的合成化學(xué)品，以在作物生產(chǎn)和收獲后期間消除害蟲，以便保持作物產(chǎn)量和質(zhì)量。此外，它們用于防止一些類型的干燥食品(例如干魚、牛肉干等)中的昆蟲侵染。這些有害化學(xué)品在農(nóng)業(yè)中的密集使用導(dǎo)致它們在農(nóng)業(yè)土壤和水、作物產(chǎn)品和食物中的污染和積聚，從而對農(nóng)民和消費者的健康造成威脅。長期殺蟲劑通過消耗和積聚對人類有害，即使在低濃度下，因為這些殺蟲劑會引起急性和/或慢性毒性。急性毒性癥狀包括對呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉的刺激。慢性毒性癥狀包括對肝臟、腎臟、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌腺(激素系統(tǒng))的不利影響；可能導(dǎo)致癌癥的遺傳改變和突變；致蟲作用；以及嬰兒和幼孩的停止腦發(fā)育。此外，貿(mào)易伙伴國家對具有過多殺蟲劑殘留的農(nóng)產(chǎn)品的拒絕對出口企業(yè)和相關(guān)出口國家的經(jīng)濟性產(chǎn)生負面影響。

2、農(nóng)藥的分類有幾種標準。農(nóng)藥按其形態(tài)或化合物狀態(tài)可分為[1]8組，如水分散粉劑(wdp)、乳油(ec)、懸浮濃縮劑(sc)[lin等.(2023)微生物，11，364]；[2]根據(jù)作用機制至少分為29組，例如乙酰膽堿酯酶抑制劑，它影響神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致鈉平衡紊亂，并作為氯離子通道阻斷劑[殺蟲劑抗性行動委員會，irac(2023年)：irac-online.org]；以及[3]根據(jù)化學(xué)類型或化學(xué)結(jié)構(gòu)分為四類，即(i)有機磷類，即以磷為主要取代基的化合物；(ii)氨基甲酸酯類，即氨基甲酸的化合物衍生物；(iii)擬除蟲菊酯類，即天然除蟲菊酯的合成衍生物；以及(iv)有機氯類，即至少含有一個碳-氯鍵的化合物[zacharia,j.t.(2011)isbn?978-953-51-5154-8]。由于有機氯對人體的高毒性及其在環(huán)境中的高持久性，大多數(shù)國家都禁用有機氯。

3、有機磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯殺蟲劑廣泛用于農(nóng)業(yè)和住宅環(huán)境。有報告顯示，在新鮮市場和超市的蔬菜和水果隨機樣本中，主要存在有機磷和氨基甲酸酯殘留物，且數(shù)量超過法定限值，包括羽衣甘藍、牽?；╗wanwimolruk等.(2015年)environ?health?prevmed?20(3)，204；wanwimolruk等.(2016年)peerj?4，2432]、山竹[phopin等.(2017年)j?scifood?agric?97，832]和蘑菇[phutphat等.(2016年)]。有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑是乙酰膽堿酯酶的強效抑制劑，乙酰膽堿酯酶是一種水解乙酰膽堿的酶，在人類和哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常運作中發(fā)揮著重要作用。低濃度接觸這些殺蟲劑會導(dǎo)致惡心、頭暈、嘔吐、痙攣、抽搐、呼吸衰竭、交感神經(jīng)過度興奮、骨骼肌肉麻痹或昏迷。如果受試者接觸高濃度的有機磷和氨基甲酸酯而不加處理，可能會在24小時內(nèi)死亡。長期接觸可導(dǎo)致腦癌和白血病。

4、殺蟲劑殘留物在環(huán)境中的存在、持久性和生物累積性不僅對人類和食物鏈中的生物造成嚴重的不利影響，而且對生態(tài)系統(tǒng)也造成嚴重的不利影響。這導(dǎo)致了土壤、水和沉積物的污染。農(nóng)業(yè)地區(qū)的土壤污染會造成土壤貧瘠，對植物的生長發(fā)育和產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響。此外，作物產(chǎn)品受到這些殘留物的污染，特別是濃度超過標準限值，往往會導(dǎo)致這些產(chǎn)品在邊境檢查站被拒收，造成經(jīng)濟損失。

5、目前清洗水果和蔬菜的方法在消除農(nóng)藥的效果上存在差異。泰國農(nóng)業(yè)與合作社部農(nóng)業(yè)司農(nóng)藥處報告稱，用流動水清洗兩分鐘后，水果和蔬菜中的農(nóng)藥殘留量減少了25-39％，加熱清洗減少了48-50％，而在化學(xué)洗滌劑中浸泡10分鐘后，再用流動水清洗，則減少了22-36％[https://shorturl.at/dtjv7]。不過，這些清洗技術(shù)也有一些不足之處。用流動水清洗水果和蔬菜必須持續(xù)很長時間，而且需要大量的水，無法重復(fù)使用。相反，用于清洗水果和蔬菜的化學(xué)品殘留物可能會對消費者造成傷害，或?qū)ι鲜鲛r(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量產(chǎn)生負面影響。例如，特別是在工廠中，接觸化學(xué)清洗產(chǎn)生的高濃度碳酸氫鈉殘留物可能會導(dǎo)致嚴重的頭痛、腹瀉、惡心或嘔吐、煩躁和呼吸受限。吸入高錳酸鉀和氯的蒸氣甚至會刺激工廠操作人員的鼻子、喉嚨和肺部，導(dǎo)致咳嗽和/或呼吸急促，而接觸這些化學(xué)品的殘留物會傷害消化系統(tǒng)，如果接觸到眼睛，可能會導(dǎo)致失明。某些清洗技術(shù)也會降低農(nóng)作物的質(zhì)量。例如，用醋清洗水果和蔬菜會導(dǎo)致水果和蔬菜枯萎，同時還會使農(nóng)產(chǎn)品帶有不良味道和刺激性氣味。此外，在水中加熱、蒸煮或煮沸新鮮水果和蔬菜只會降低它們的營養(yǎng)價值。因此，這種方法不適合出口新鮮作物。

6、除物理和化學(xué)處理外，酶催化的生物反應(yīng)也能有效降解農(nóng)藥。酶是天然的蛋白質(zhì)生物大分子，對人體和環(huán)境無害。因此，殺蟲劑降解酶可用作水果和蔬菜清洗劑的功能成分，以盡量減少收獲前和收獲后水果和蔬菜上的殺蟲劑殘留。此外，它們還可用作生物修復(fù)劑，處理受農(nóng)藥污染的地下水和地表水，以改善飲用水的質(zhì)量。

7、根據(jù)科學(xué)研究，各種微生物酶能夠催化有機磷酸酯、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯殺蟲劑的水解[bhatt等.(2021)j?haz?mat?411(5),125026]。這些酶催化活性在微生物新陳代謝(如細菌中的新陳代謝)中自然發(fā)生，以轉(zhuǎn)化和解毒殺蟲劑分子，并將其代謝為碳和能量來源。盡管如此，這些殺蟲劑降解酶的催化特性和效率各不相同，而且大多數(shù)都是細胞內(nèi)酶，這限制了它們的應(yīng)用。

8、現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)公開了細菌宿主細胞(如大腸桿菌和枯草芽孢桿菌)中的異源基因表達和轉(zhuǎn)化方法[kataoka等.(2011)amb?express?1(1),1；kataoka等.(2013)j?bioscibioeng?115(5),475；mahipant等.(2019)j?gen?appl?microbiol?65,96]。一般來說，重組宿主細胞必須滿足重要的標準，例如以較高或可接受的產(chǎn)量生產(chǎn)感興趣的蛋白質(zhì)或酶，能夠有效分泌蛋白質(zhì)或酶，以及易于操作和維護。

9、本實施方案涉及一種生產(chǎn)重組酶的工藝，每種酶都能水解有機磷酸酯、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯殺蟲劑，及其制劑。它還涉及構(gòu)建質(zhì)粒dna載體，用于在重組宿主細胞(即大腸桿菌菌株bl21(de3))中胞外表達殺蟲劑水解酶，以便將這些酶雞尾酒按所需比例用作配制最終產(chǎn)品的功能成分。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的實施方案涉及一種生產(chǎn)能夠水解每一類有機磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯殺蟲劑的三種重組酶以及含有這些酶的制劑。

2、本發(fā)明實施例提供了重組質(zhì)粒dna載體，其中的蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)已被修飾，以增強重組蛋白分泌到質(zhì)粒周圍空間或培養(yǎng)基中。編碼pelb(酪酸裂解酶b)信號序列的核苷酸序列被刪除，用于圍質(zhì)體定位，并用編碼lamb(麥芽糖孔蛋白或噬菌體lambda受體)信號序列的核苷酸序列取而代之，使重組蛋白的分泌效率更高。

3、本發(fā)明實施例公開了利用上述改良質(zhì)粒dna載體構(gòu)建的三種表達重組蛋白的重組質(zhì)粒dna載體。重組蛋白包括以下幾種：

4、(a)與seq?id?no:1所示的甲基對硫磷水解酶(mph)(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(pdb)id:1p9e)氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重組有機磷酸酯水解酶，其中重組有機磷酸酯水解酶對有機磷酸酯殺蟲劑具有水解活性。

5、(b)與seq?id?no:2所示的l-氨基肽酶-d-ala-酯酶/酰胺酶(芳基酰胺酶)(mah)(pdb?id：1b65)的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重組氨基甲酸酯水解酶，其中重組氨基甲酸酯水解酶對氨基甲酸酯殺蟲劑具有水解活性。

6、(c)與seq?id?no:3所示的擬除蟲菊酯水解羧基酯酶(esta)(pdb?id:4ccy)的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的重組擬除蟲菊酯水解酶，其中重組擬除蟲菊酯水解酶對擬除蟲菊酯殺蟲劑具有水解活性。

7、本實施方案進一步提供了三種重組細菌菌株，使用大腸桿菌菌株bl21(de3)作為宿主細胞，用上述每種重組質(zhì)粒dna載體進行轉(zhuǎn)化。

8、本發(fā)明實施例還公開了上述重組菌株的培養(yǎng)條件，包括培養(yǎng)基組成、誘導(dǎo)條件以及酶收獲和酶活性檢測方法。

9、此外，本發(fā)明實施例提供了一種制劑，包括上述三種重組酶作為其功能成分，用于水解有機磷、氨基甲酸酯和擬除蟲菊酯殺蟲劑。