專利名稱：聚乙烯醇微生物或酶固定化載體的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
有效地應(yīng)用種種天然或合成高分子材料來(lái)包覆微生物完整細(xì)胞的固定化微生物或酶技術(shù)，在八十年代以來(lái)，備受注目。而且已有不少實(shí)際應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的成功例，例如高果糖糖漿，6-APA，L-氨基酸等生化產(chǎn)品的生產(chǎn)。通常使用于固定化載體的代表性高分子材料為聚丙烯酰胺，鹿角藻膠(K-carrageenan)，藻膠鈉及瓊脂等。聚丙烯酰胺較其他高分子價(jià)廉，常被采用。但是，較難制成有利于一般連續(xù)反應(yīng)器的球形顆粒，而且其單體分子及聚合促進(jìn)劑等皆具毒性，不利于微生物活細(xì)胞之固定化操作。鹿角藻膠雖然成形容易、毒性低，但主要缺點(diǎn)是價(jià)格較高。藻膠鈉雖也價(jià)格低廉，容易制成球形，但是，在含有磷酸鹽，鈉及鉀等陽(yáng)離子的反應(yīng)液中，膠體強(qiáng)度相當(dāng)不穩(wěn)定，甚至崩解。另外，瓊脂膠體的機(jī)械強(qiáng)度又嫌太弱，不適合長(zhǎng)期操作。因此，若欲將固定化菌體技術(shù)有效應(yīng)用于生化商品的工業(yè)化制程，尤其是最近備受注目的廢水處理領(lǐng)域，其成功與否之關(guān)鍵，乃在于對(duì)微生物不具毒性，成本低廉及具有強(qiáng)韌機(jī)械強(qiáng)度之載體材料的開(kāi)發(fā)。
聚乙烯醇(PVA)，是由醋酸乙烯單體經(jīng)聚合，醇化而成的水溶性樹(shù)脂。PVA不具毒性甚至對(duì)人體亦公認(rèn)無(wú)害，制形容易，機(jī)械強(qiáng)度高，而且是低價(jià)生產(chǎn)的工業(yè)化高分子原料。因此，非常適合作為固定化菌體的載體。
近年來(lái)，歐美文獻(xiàn)及日本的專利公報(bào)已公布種種有關(guān)利用PVA進(jìn)行微生物固定化之技術(shù)。譬如將PVA水溶液與微生物混合后施以凍結(jié)真空干燥或以冷凍回溫法進(jìn)行凝膠固定(日本專利特開(kāi)昭57-14129，特開(kāi)昭61-139385)。施以紫外線照射，形成光交聯(lián)結(jié)構(gòu)的凝膠方法(日本專利特開(kāi)平1-454372)。另外亦有將PVA水溶液與微生物菌體混合液，置于飽和硼酸水溶液接觸形成架橋結(jié)構(gòu)的凝膠技術(shù)(日本專利特開(kāi)昭61-100193)。上述方法雖可獲得高強(qiáng)度之膠體作為固定化菌體之載體，但卻仍有不少缺點(diǎn)有待改良。在冷凍干燥方法中，須將材料冷凍保持在-30～-80℃的低溫下，而后須干燥脫水至一定的含水率，此種冷凍-解凍-脫水的步驟，不僅費(fèi)時(shí)甚久，而且手續(xù)繁雜，耗費(fèi)能源。光交聯(lián)法則大抵以制成薄膜時(shí)所利用之方法，不利于一般的菌體固定化程序之使用。再者，PVA-硼酸法中，微生物-PVA的混合物則須與硼酸接觸浸漬12-24小時(shí)，方能獲得相當(dāng)強(qiáng)度的膠體，否則膠體脆弱。
總而言之，上述已有技術(shù)的共同缺點(diǎn)有，第一，固定化程序費(fèi)時(shí)長(zhǎng)久，手續(xù)繁雜，需要大型的生產(chǎn)設(shè)備方可生產(chǎn)，導(dǎo)致生產(chǎn)成本的提升，降低生產(chǎn)力。第二，低溫、真空及硼酸皆不甚適合微生物生存之環(huán)境。尤其硼酸更具毒性，長(zhǎng)時(shí)間的制作程序皆可能引起微生物活性的降低。北野清之曾提出利用PVA與微生物菌體混合物，置于硫酸鹽溶液中接觸之方法，企圖改良上述缺點(diǎn)(日本專利特開(kāi)昭64-5490，64-5491)。此方法雖然有效地縮短了固定化程序所需時(shí)間，然而所使用的凝膠溶液濃度相當(dāng)高，須以30%硫酸鈉或70%硫酸銨溶液進(jìn)行，如果此濃度過(guò)低時(shí)顆粒成形不易，強(qiáng)度亦不佳。因此，所需材料成本也較高;而成膠過(guò)程中高鹽類濃度亦對(duì)微生物生化活性甚有不良影響。
本發(fā)明所提出硼酸-磷酸鹽二階段成膠之方法，首先置于3%至飽和濃度的硼酸溶液中短時(shí)間成形，再于3-20%磷酸鹽溶液中強(qiáng)化。成形相當(dāng)容易，且磷酸鹽價(jià)格低廉，亦為微生物能源代謝來(lái)源，不具生物毒性。此外，鹽類使用濃度低，降低成本。而且比硫酸鹽法具有更佳的膠體韌性。
本發(fā)明之目的在于提出制作程序簡(jiǎn)單，低成本，且在短時(shí)間內(nèi)即可獲得高耐水性、強(qiáng)韌機(jī)械強(qiáng)度，且具優(yōu)異生化活性的PVA凝膠固定化微生物或酶，并將其廣泛應(yīng)用在廢水處理領(lǐng)域及生化產(chǎn)業(yè)上。
本發(fā)明提供一種聚乙烯醇微生物或酶固定化載體之改良制備方法，包含將聚乙烯醇及微生物或酶所形成之混合物于一濃度為3重量%至飽和的硼酸水溶液中進(jìn)行凝膠化處理而產(chǎn)生一凝膠球體，其改良之處在于該凝膠化處理時(shí)間為10分鐘至2小時(shí)，該凝膠球體接著以3-20重量%磷酸或磷酸鹽水溶液浸漬30分鐘以上使其硬化而獲得聚乙烯醇微生物或酶固定化載體。
本發(fā)明方法之原理與特征在于利用PVA分子中羥基與硼酸分子間的離子架橋作用使之成形;而后，再將此不甚強(qiáng)固的凝膠，浸漬于磷酸或磷酸鹽溶液中，利用PVA與磷酸或磷鹽間的酯化反應(yīng)使膠體硬化，獲得耐水性強(qiáng)，機(jī)械強(qiáng)度高且?guī)缀醪粨p害微生物或酶生化活性的固定化菌體。本發(fā)明的微生物或酶固定化載體的制作流程可用附

圖1表示。
本發(fā)明所使用的PVA，堿化度70%以上，聚合度為1000-3000，而以堿化度95%以上及聚合度1500-2000者較為適宜。聚合度過(guò)低則膠體不穩(wěn)定，過(guò)高則粘度升高不易處理。該P(yáng)VA系以一水溶液形式與該微生物或酶混合，合適之PVA濃度則在10-20重量%。硼酸成形時(shí)間以飽和硼酸水溶液進(jìn)行約15-30分鐘為較佳。
磷酸或磷酸鹽水溶液之較佳濃度為5-15重量%，浸漬時(shí)間約需1-2小時(shí)，即可獲得理想成品。該磷酸鹽水溶液可使用磷酸鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸銨、磷酸氫銨或磷酸二氫銨。
本發(fā)明方法之另一較佳實(shí)施方式為將該硼酸與磷酸或磷酸鹽水溶液混合，而同時(shí)進(jìn)行該凝膠化與硬化，時(shí)間約為30分鐘至3小時(shí)，以1-2小時(shí)為較佳。
本發(fā)明的特征在于首先在硼酸溶液建立膠體基礎(chǔ)構(gòu)架，由于接觸時(shí)間不長(zhǎng)，使硼酸對(duì)微生物或酶可能的傷害減至最低(橋本獎(jiǎng)所提的硼酸法，須接觸15-24小時(shí)，日本專利特開(kāi)昭61-100193)。再者，膠體硬化過(guò)程使用具有緩沖作用的磷酸鹽溶液，而且磷元素亦為微生物能源代謝之必需元素，所以對(duì)微生物而言不但無(wú)害且可能具有活化微生物之功能。
根據(jù)本發(fā)明制備所得的PVA膠體適合使用于酶、工業(yè)微生物、廢水處理微生物菌群及動(dòng)植物細(xì)胞等的包覆固定化技術(shù)。就酶而言，比如淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶等。就微生物而言，酒精發(fā)酵酵母、硝化細(xì)菌、脫硝細(xì)菌以及活性污泥、厭氣消化污泥、甲烷化污泥、脫硝污染等微生物菌群。以上所述皆為本發(fā)明PVA凝膠方法的可行應(yīng)用對(duì)象。
實(shí)施例115重量%的PVA(堿化度99%以上，聚合度2000)水溶液20g，與脫硝污泥的濃縮液(污泥濃度50g/l)20g充分?jǐn)嚢杌旌?脫硝污泥微生物取自實(shí)驗(yàn)室生物脫氮程序中的脫硝槽)。將此PVA-污泥混合物滴入緩慢攪拌的飽和硼酸水溶液中，形成直徑約3mm的圓球膠體，并置于該溶液中20分鐘后，再取出轉(zhuǎn)移至8重量%的磷酸二氫鈉溶液中浸漬40分鐘，最后將膠體顆粒取出水洗。制成的固定化微生物載體20g，與含有硝酸鉀及甲醇為主成份的80ml人工廢水(硝酸氮濃度為100ppm，甲醇350ppm)混合，置于125ml的血清瓶中，在無(wú)氧條件下進(jìn)行批式脫硝。經(jīng)2小時(shí)培養(yǎng)后人工廢水的硝酸氮濃度降為32ppm。
相同的固定化微生物載體進(jìn)行重覆批式脫硝試驗(yàn)，每天更新相同成份的人工廢水，并測(cè)得固定化微生物的脫硝速率，在第七天后達(dá)0.65mgN/g凝膠/h，此后，一直到第30天之連續(xù)操作皆維持于此一速率，生化活性相當(dāng)穩(wěn)定。再者利用橋本獎(jiǎng)(日本專利特開(kāi)昭61-100193)所提方法制備相同污泥含量的固定化菌體，在相同條件下，進(jìn)行與此實(shí)施例同樣之實(shí)驗(yàn)。批式脫硝經(jīng)2小時(shí)培養(yǎng)后，人工廢水的硝酸氮濃度為82ppm，而重覆批式試驗(yàn)須在15天后方達(dá)到0.55mgN/g凝膠/h之脫硝速率，往后持續(xù)操作亦不甚穩(wěn)定。
實(shí)施例220重量%的PVA(堿化度99%以上，聚合度2000)水溶液，與硝化污泥的濃縮液(污泥濃度30g/l)，以1∶1重量比例均勻混合(硝化污泥微生物取自實(shí)驗(yàn)室生物脫氮程序中的硝化槽)。PVA-污泥混合物進(jìn)行與實(shí)施例(1)同樣之微生物固定化程序。
制成之微生物固定化載體(粒徑為3mm)置于操作容積為10l的生物反應(yīng)器中，連續(xù)入流含200ppm氨氮的人工廢水(流入量30l/天)，載體充填率為25%，通氣量20l/分鐘。經(jīng)10天連續(xù)操作后，出流水之氨氮濃度為9ppm，并有92%的氨氮被轉(zhuǎn)換成硝酸氮。
實(shí)施例3以養(yǎng)豬事業(yè)廢水(COD濃度1500-2000ppm，總氮濃度200-300ppm)馴化達(dá)1個(gè)月的活性污泥，經(jīng)離心而得濃縮污泥溶液，以1∶1重量比例混合18重量%PVA(堿化度99%以上，聚合度2000)的水溶液，此均勻混合液滴入含有5重量%硼酸與10重量%磷酸二氫鉀的混合溶液中，浸漬1小時(shí)形成3mm粒徑的圓球膠體顆粒。制成的固定化微生物載體，置于與實(shí)施例(2)同樣的生物反應(yīng)器中，進(jìn)行養(yǎng)豬事業(yè)廢水之處理，反應(yīng)器操作條件與實(shí)施例(2)相同。經(jīng)20天連續(xù)操作后，出流水之COD濃度降至200-300ppm，總氮濃度亦降為120-180ppm。
實(shí)施例420重量%的PVA(堿化度99%以上，聚合度2000)水溶液10g，與啤酒酵母(Saccharomycescerevisia)離心濃縮液(細(xì)胞濃度30g/l)10g充分?jǐn)嚢杌旌?，PVA-酵母菌體混合物進(jìn)行與實(shí)施例(1)同樣之微生物固定化程序。制成的固定化細(xì)胞載體(粒徑為2mm)15g與含有3重量%葡萄糖的培養(yǎng)基150ml混合，置于三角瓶中，于30℃下振蕩培養(yǎng)，經(jīng)8小時(shí)后，培養(yǎng)液之酒精產(chǎn)生濃度為10.2g/l。而以相同的菌體量，于同樣培養(yǎng)條件下進(jìn)行游離細(xì)胞的培養(yǎng)，經(jīng)8小時(shí)后，培養(yǎng)液中之酒精產(chǎn)生濃度為10.6g/l。
實(shí)施例520重量%的PVA(堿化度99%以上，聚合度2000)水溶液10g，與簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)濃縮液(細(xì)胞濃度20g/l)10g充分?jǐn)嚢杌旌希嘶旌衔镞M(jìn)行與實(shí)施例3同樣的微生物固定化程序。制成的固定化微生物載體(粒徑約為2mm)15g與含有0.2g/l皮質(zhì)甾醇的培養(yǎng)基150ml混合，置于容積500ml的三角瓶中振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行類固醇的△1-脫氫生化反應(yīng)，經(jīng)5小時(shí)培養(yǎng)后，有90%的基質(zhì)被轉(zhuǎn)化生成脫氫皮質(zhì)甾醇(prednisolone)。
實(shí)施例615重量%PVA(堿化度99%以上，聚合度2000)水溶液10g，與3g的異淀粉酶發(fā)酵液及2g的β-淀粉酶發(fā)酵液充分混合，并以實(shí)施例(1)同樣的凝膠程序進(jìn)行酶固定化。制成的固定化載體(粒徑約2mm)15g與含有50g/l液化淀粉的基質(zhì)溶液150ml混合，置于容積500ml的三角瓶中振蕩攪拌，進(jìn)行淀粉水解反應(yīng)，于反應(yīng)3小時(shí)后溶液中麥芽糖濃度可達(dá)41g/l，基質(zhì)轉(zhuǎn)換率約為82%。
權(quán)利要求
1.一種聚乙烯醇微生物或酶固定化載體的改良制備方法，包含將聚乙烯醇及微生物或酶所形成的混合物于一濃度為3重量%至飽和的硼酸水溶液中進(jìn)行凝膠化處理而產(chǎn)生一凝膠球體，其特征在于該凝膠化處理時(shí)間為10分鐘至2小時(shí)，該凝膠球體接著以3-20重量%磷酸或磷酸鹽水溶液浸漬30分鐘以上使其硬化而獲得聚乙烯醇微生物固定化載體。
2.一種聚乙烯醇微生物或酶固定化載體的改良制備方法，包含將聚乙烯醇及微生物或酶所形成的混合物于一濃度為3重量%至飽和硼酸水溶液中進(jìn)行凝膠化處理而產(chǎn)生一凝膠球體，其特征在于該硼酸水溶液中含有3-20重量%磷酸或磷酸鹽而硬化該凝膠球體，并且該凝膠化及硬化處理同時(shí)進(jìn)行的時(shí)間為30分鐘至3小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該硼酸水溶液為飽和硼酸水溶液，且該凝膠化處理時(shí)間為15至30分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中該磷酸或磷酸鹽水溶液的濃度為5-15重量%，且浸漬該凝膠球體的時(shí)間為1-2小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中該硼酸水溶液含有飽和的硼酸及5-15重量%的磷酸或磷酸鹽。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中該凝膠化及硬化同時(shí)進(jìn)行的時(shí)間為1-2小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該磷酸或磷酸鹽水溶液選自磷酸鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鈉、磷酸鉀、磷酸氫鉀、磷酸二氫鉀、磷酸銨、磷酸氫銨、磷酸二氫銨及磷酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該聚乙烯醇系以-10-20重量%水溶液形式與該微生物混合，且該聚乙烯醇具有聚合度1000-3000及堿化度70-98+%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中該聚乙烯醇的聚合度為1500-2000及堿化度為95-98+%。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該聚乙烯醇水溶液與微生物或酶水溶液的混合重量比例為1∶2至2∶1。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該微生物為細(xì)菌、菌類、藻類、原生動(dòng)物或它們的混合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該微生物為活性污泥微生物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中該活性污泥微生物為農(nóng)業(yè)或工業(yè)廢水馴化的活性污泥微生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中微生物為啤酒酵母(Saccharomyces cerevisia)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該微生物為簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobacter simplex)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中該酶為淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶或葡萄糖異構(gòu)酶。
全文摘要
將微生物或酶與1—20重量％的PVA(堿化度70％以上，聚合度1000—3000)溶液混合后，置于飽和硼酸溶液中，短時(shí)間內(nèi)使其形成球體，隨即將該球體與磷酸鹽溶液(＞5重量％)接觸，使其充分硬化，而制成微生物或酶固定化載體。并將制得之固定化載體，使用于去除廢水中無(wú)機(jī)氮及有機(jī)碳，以及生化產(chǎn)品之生產(chǎn)程序中。
文檔編號(hào)C02F3/12GK1076488SQ9210187
公開(kāi)日1993年9月22日 申請(qǐng)日期1992年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1992年3月17日
發(fā)明者陳國(guó)誠(chéng), 林瑩峰 申請(qǐng)人:陳國(guó)誠(chéng)