專利名稱：從聚酰胺制備物中除去不需要的單酰胺化合物的方法
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及從聚合的酰胺或聚酰胺制備物中除去不需要的單酰胺化合物，如使用能從聚合制備物中除去單體化合物的誘導(dǎo)微生物株的純培養(yǎng)物來(lái)從約2到小于6的pH的聚丙烯酰胺制備物中除去不需要的丙烯酰胺單體的方法。
2.發(fā)明背景腈是可用于合成各種各樣的化合物，包括胺、酰胺、脒、羧酸、酯、醛、酮、亞胺和雜環(huán)的用途極多的化合物。商業(yè)上最重要的腈之一是乙腈，它是一種常用溶劑。其它腈化合物被用作除草劑或用于合成去污劑或防腐劑。另一種商業(yè)上最重要的腈是丙烯腈，它被用來(lái)制造丙烯酰胺、丙烯酸、丙烯酸纖維、共聚物樹(shù)脂和腈橡膠。
一種生產(chǎn)丙烯腈的方法是使用SOHIO/BP過(guò)程，它需要在催化劑存在下，通過(guò)空氣中的氨蒸汽對(duì)丙烯直接進(jìn)行氨氧化反應(yīng)(a/k/a丙烯)(一般見(jiàn)丙烯腈，1979，加工經(jīng)濟(jì)學(xué)計(jì)劃報(bào)告，Stanford Research International，Menlo Park，CA；Weissermel和Arpe，1978，工業(yè)有機(jī)化學(xué)，Verlag Chemie-Weinheim New York，pp.266-270)。這種加工得到的廢液中含有腈的復(fù)雜混合物，包括高濃度的二腈、酰胺和酸。更具體說(shuō)，廢液一般含有乙腈、丙烯腈、琥珀腈和富馬腈等腈和丙烯酰胺。另外，常常存在各種濃度和/或高濃度的氰化物。廢液常含有高濃度和/或各種濃度的硫酸銨。這種有害廢液由于其毒性，不能釋放入環(huán)境，而且在美國(guó)，常通過(guò)注入地下巖層的深井來(lái)埋掉。這種埋藏不能被認(rèn)為是廢液“處理”，而只是類(lèi)似于填埋過(guò)程。
在美國(guó)之外，通過(guò)將廢液稀釋到約250ppm或更低的低總腈濃度，并用常規(guī)通氣生物廢液系統(tǒng)(即活性污水污泥)處理(在潮濕/空氣氧化除去揮發(fā)物，并部分氧化許多有機(jī)組分后)來(lái)“處理”丙烯腈生產(chǎn)中的廢液已是一般慣例。由于下列理由，這種“處理”方法并不適于充分處置腈生產(chǎn)設(shè)備廢液(1)潮濕/空氣氧化導(dǎo)致?lián)]發(fā)性化合物揮發(fā)，產(chǎn)生了空氣污染問(wèn)題；(2)廢液的稀釋需要大型廢水處理設(shè)備來(lái)解決獲得充分“處理”所需的流動(dòng)和長(zhǎng)停留時(shí)間；和(3)潮濕/空氣氧化聯(lián)合活化污水污泥生物處理導(dǎo)致高處理費(fèi)用。在腈生產(chǎn)工業(yè)中對(duì)高效的、成本實(shí)在的、環(huán)境保護(hù)良好的處置腈生產(chǎn)廠廢液的方法，仍有長(zhǎng)期和急切的需要。
早已知道，某些微生物可用于將腈化合物生物轉(zhuǎn)化成其對(duì)應(yīng)的酰胺或酸化合物?？茖W(xué)和專利文獻(xiàn)有許多描述轉(zhuǎn)化腈的微生物在生產(chǎn)具體化學(xué)藥品，如從丙烯腈生產(chǎn)酰胺和丙烯酸或丙烯酸酯中的用途。一般見(jiàn)，Kobayshi等，1992，生物技術(shù)趨勢(shì)，10402-408。已顯示，轉(zhuǎn)化腈的微生物含有包括腈酶(將腈化合物轉(zhuǎn)化成其對(duì)應(yīng)酸化合物)；腈水解酶(將腈化合物轉(zhuǎn)化成其對(duì)應(yīng)酰胺化合物)；和酰胺酶(將酰胺化合物轉(zhuǎn)化成其對(duì)應(yīng)酸化合物)等活性。
然而，對(duì)于本發(fā)明者的知識(shí)，在所有這些使用腈降解微生物的具體化學(xué)生產(chǎn)中，只有一種化合物已被用來(lái)誘導(dǎo)相關(guān)活性和僅轉(zhuǎn)化了一種腈化合物來(lái)生產(chǎn)一種所需具體化合物。
2.1.能利用腈化合物的微生物文獻(xiàn)含有某些參考文獻(xiàn)，它們公開(kāi)了許多可利用腈或酰胺化合物作為碳和/或氮的唯一來(lái)源的微生物。
例如，Asano等，1982，農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，461165-1174描述了一種能用乙腈作為唯一碳和氮來(lái)源生長(zhǎng)的節(jié)桿菌(Arthrobacter)。
Nawaz等，1989，43rdPurdue Ind.Waste Conf.Proc.，pp251-256(Nawaz，1989)，描述了能利用各種腈化合物，包括乙腈，作為碳和能量的唯一來(lái)源的銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的分離。然而，該菌株不能利用其它腈化合物，如丙烯腈、丙烯酰胺、芐腈和丙二腈。
Nawaz等，1992，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，5827-31(Nawaz)，描述了一種在用芐腈馴化后，能降解芐腈和另一種選自丁腈、乙腈、戊二腈、丙腈、琥珀腈和甲基丙烯腈的混合物的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pnoeumonia)NCTR1菌株。和不需要存在芳族腈的目前誘導(dǎo)方法完全相反，Nawaz的微生物需要芐腈來(lái)誘導(dǎo)降解芐腈和另一種腈的混合物的活性。另外，而且更重要的是，為了實(shí)現(xiàn)任何腈混合物的降解，芐腈必須存在。因?yàn)殡嫔a(chǎn)設(shè)備的廢液中不含芐腈，Nawaz公開(kāi)的這種微生物和方法將是完全不實(shí)際的，而且實(shí)際上，對(duì)于處理這種廢液是無(wú)效的。
Chapatwala等，1993，應(yīng)用生物化學(xué)，生物技術(shù)39/40655-666，描述了能利用乙腈作為碳和氮唯一來(lái)源的惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)菌株的分離。然而，沒(méi)有公開(kāi)該菌株對(duì)任何其它含腈化合物的利用。
Narayanasamy等，1990，印度實(shí)驗(yàn)生物學(xué)雜志，28968-971，公開(kāi)了節(jié)桿菌亞種對(duì)丙烯腈、乙腈、丙烯酰胺和乙酰胺的利用。但未指出該菌株能否降解二腈或腈混合物。
O’Grady和Pembroke，1994，生物技術(shù)通信1647-50，描述了土壤桿菌亞種的分離，和該分離菌株利用或分別分裂許多不同腈化合物的能力。但未指出該分離菌株能否利用或分裂腈化合物的混合物。
Martinkova等，1992，F(xiàn)olia Microbiol，37373-376，公開(kāi)了幾種細(xì)菌菌株，包括棒狀桿菌亞種(Corynebacterium sp.)3B株和放射形土壤桿菌8/4/1株(它們能利用乙腈作為碳和氮的唯一來(lái)源)的分離。但未公開(kāi)這些菌株能否利用任何其它腈化合物或腈化合物的混合物。
Nawaz等，1994，應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)，603343-3348，描述了從被除草劑草不綠(alachlor)污染的土壤中分離的一種臨時(shí)命名為紅球菌亞種(Rhodococcussp.)的細(xì)菌。顯示該細(xì)菌能利用丙烯腈作為碳和氮的唯一來(lái)源。
Nawaz等，1993。加拿大微生物雜志，39207-212，描述了一種假單胞菌亞種和嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonas maltophilla)的分離。它們各自都能利用丙烯腈作為碳和氮的唯一來(lái)源。
Armitage等，國(guó)際專利出版物WO 97/06248(1997年2月20日出版)，公開(kāi)了通過(guò)在酰胺或酰胺前體，如腈，或其混合物存在下，在酰胺或酰胺前體形成至少20％摩爾和優(yōu)選基本全部碳的連續(xù)培養(yǎng)、碳有限的條件下，培養(yǎng)合適微生物，來(lái)產(chǎn)生酰胺酶的方法。合適的微生物包括假單胞菌、紅球菌等。還公開(kāi)了通過(guò)在腈或腈前體、或其混合物存在下，在連續(xù)培養(yǎng)、碳有限培養(yǎng)條件下培養(yǎng)微生物，來(lái)產(chǎn)生腈酶的方法。合適的微生物包括諾卡菌，紅球菌亞種，包括紅球菌ATCC 39484等。然后特別用這些誘導(dǎo)的酶來(lái)將腈或酰胺轉(zhuǎn)化成其對(duì)應(yīng)酸。
雖然利用腈化合物的微生物可能能從一種含腈組合物中除去一種腈化合物，但并不期待用這些生物體來(lái)幫助腈生產(chǎn)設(shè)備處置廢液，因?yàn)殡娴睦萌Q于對(duì)一種所用的腈化合物有特異性的腈酶或腈水解酶的表達(dá)。特異性腈酶或腈水解酶的表達(dá)并不能確保該微生物將有能力轉(zhuǎn)化腈生產(chǎn)設(shè)備的廢液中以高濃度存在的腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物。
2.2.包括腈生產(chǎn)廠廢液的腈廢料的處理許多參考文獻(xiàn)描述了曾嘗試提供一種微生物學(xué)方法，來(lái)從腈生產(chǎn)廠廢液的腈廢料中除去腈。
Kato等在美國(guó)專利號(hào)3,940,332(Kato)中描述了采用分離的細(xì)菌菌株深紅紅球菌(Nocardia rubropertincta)ATCC登錄號(hào)21930，聯(lián)合污水處理站的活化污泥來(lái)降解含腈和無(wú)機(jī)氰化物的廢液。Kato還指出該菌株能降解腈，包括乙腈、丙烯腈、丙腈、丁腈、丁烯腈、富馬腈、戊腈、戊二腈和芐腈，雖然未指出這些腈各自的量，或降解腈的條件，或是否可一起降解腈。未指出Kato公開(kāi)的菌株能否降解或去除腈化合物的混合物的毒性。另外，Kato處理的腈廢料是低強(qiáng)度廢料，50-250ppm總腈濃度。另外，本發(fā)明者已測(cè)試了Kato公開(kāi)的菌株，發(fā)現(xiàn)該菌株不能以本發(fā)明方法所達(dá)到的同樣效率從腈混合物中除去乙腈。
Sunarko和Meyer，1989，DECHMA生物技術(shù)會(huì)議，3859-862，公開(kāi)了分枝桿菌UBT5、芽胞桿菌UBT2、棒狀桿菌UBT9和屈撓桿菌UBT4的凍干細(xì)胞(其已通過(guò)使細(xì)胞在2-戊烯腈存在下生長(zhǎng)而被誘導(dǎo))能降解實(shí)驗(yàn)室HPLC柱廢液中發(fā)現(xiàn)的少量乙腈。
Brown等，1980，水研究，14775-778，公開(kāi)了以0.5ppm到5ppm濃度將丙烯酰胺加到環(huán)境的天然和污染水中，導(dǎo)致丙烯酰胺的降解。
Kincannon等，1983，WPCF雜志，55157-163公開(kāi)了一種從城市活性污水處理站分離到的微生物混合物在一個(gè)月的馴化期后，能降解丙烯腈。另外，該作者還顯示了該微生物混合物同樣能降解丙烯醛。
Donberg等，1992，環(huán)境毒物化學(xué)，111583-1594，公開(kāi)了在土壤中發(fā)現(xiàn)的微生物混合物能在有氧條件下降解丙烯腈。一些混合物能在2天內(nèi)降解10-100ppm的丙烯腈。然而，對(duì)于高濃度的丙烯腈(1000ppm)，降解被抑制。作者推測(cè)抑制是由于親代丙烯腈化合物的抑制作用。
Knowles和Wyatt，歐洲專利號(hào)274 856 B1和Wyatt和Knowles，1995，生物降解693-107，描述了用微生物混合物降解腈生產(chǎn)廠(使用丙烯腈生產(chǎn)的BP/SOHIO過(guò)程)廢液的腈和酰胺混合物。使用微生物混合物，而不用純培養(yǎng)物，是Knowles和Wyatt的方法的嚴(yán)重缺點(diǎn)。維持混合培養(yǎng)物是困難的，因?yàn)殡S著反應(yīng)條件的變化，在混合培養(yǎng)物中的某些菌株將在不同生長(zhǎng)時(shí)間占優(yōu)勢(shì)，從而使降解效率下降。
有許多缺點(diǎn)與上面的參考文獻(xiàn)有關(guān)。例如，上述許多單個(gè)微生物菌株能降解的腈或酰胺化合物的范圍有限。降解/利用腈和酰胺化合物所需的時(shí)間是以天或周計(jì)的。另外，用傳統(tǒng)活性污泥處理的方法具有其自身的缺點(diǎn)，如產(chǎn)生大量最終也需處置的生物物質(zhì)。而且最重要的，使用微生物混合物，而不使用純培養(yǎng)物，使處置非常困難，因?yàn)殡y于維持該混合培養(yǎng)物。由于反應(yīng)條件變化，混合培養(yǎng)物中的某些菌株將在不同的生長(zhǎng)時(shí)間占優(yōu)勢(shì)，從而使混合培養(yǎng)物的特性隨時(shí)間變化，降解效率下降?；旌吓囵B(yǎng)物不容易再生或維持。
2.3.處理聚丙烯酰胺制備物來(lái)除去丙烯酰胺單體許多參考文獻(xiàn)描述了提供微生物方法，來(lái)從聚丙烯酰胺制備物中除去不需要的丙烯酰胺單體。
聚丙烯酰胺聚合物被廣泛用于許多工業(yè)，包括污水處理、造紙、采礦和生物學(xué)和化學(xué)研究中。然而，其應(yīng)用受到限制，而且不能將其用于食料有關(guān)的工業(yè)，因?yàn)樗鼈兺ǔ１晃捶磻?yīng)的丙烯酰胺單體(它是累積性神經(jīng)毒素和致癌原)污染。一種減少未反應(yīng)單體量的方法是“熱處理”方法。然而，該處理增加了制造費(fèi)用，并由于產(chǎn)生不需要的聚合物分枝而降低了聚合物生產(chǎn)的效率。
另一種方法是利用從微生物獲得的酰胺酶。例如，Carver等，歐洲專利出版物EP 272,025 A2和EP 2072,026 A2，描述了用從曾加熱到溫度40℃到80℃的嗜甲基菌亞種(Methylophilis sp.)等生物體獲得的酰胺酶分解聚丙烯酰胺制備物中的丙烯酰胺。然而，Carver等描述的該方法不能在其天然pH值(即約4的天然pH)下，從陽(yáng)離子聚丙烯酰胺制備物中除去丙烯酰胺單體。見(jiàn)EP 272,025 A2的圖6，其清楚的顯示，為了從陽(yáng)離子聚合物中除去丙烯酰胺單體，必須將pH從pH4提高到pH6。
Westgrove等的美國(guó)專利號(hào)4,687,807和4,742,114描述了用于從已形成的丙烯酰胺聚合物中除去不需要的丙烯酰胺單體的酰胺酶油包水乳劑的生產(chǎn)。
Farrar等，歐洲專利出版物EP 329,325 A2描述了獲自表達(dá)酰胺酶的微生物的酰胺酶水凝膠，除去聚丙烯酰胺中的丙烯酰胺單體。Farrar，國(guó)際專利出版物WO 92/05205，描述了通過(guò)將酰胺酶加入用于聚(甲基)丙烯酰胺放熱聚合反應(yīng)的可聚合混合物中，來(lái)減少聚合的(甲基)丙烯酰胺中殘余的(甲基)丙烯酰胺單體。
Armitage等，國(guó)際專利出版物WO 97/06248(1997年2月20出版)，還公開(kāi)了在丙烯酰胺聚合反應(yīng)中或反應(yīng)后，通過(guò)在酰胺或酰胺前體(如腈)，或其混合物存在下，在連續(xù)培養(yǎng)，碳源有限條件下(其中酰胺或酰胺前體形成至少20％摩爾和優(yōu)選基本全部碳源)培養(yǎng)該微生物，而獲得的合適微生物中受誘導(dǎo)的酰胺酶，可將甲基(丙烯酰胺)轉(zhuǎn)化成甲基(丙烯酸)銨。合適的微生物包括假單胞菌、紅球菌等。然而，未提供成功的例子(其中誘導(dǎo)出的酶確實(shí)轉(zhuǎn)化聚丙烯酰胺制備物中的丙烯酰胺單體)，況且，未公開(kāi)其轉(zhuǎn)化反應(yīng)發(fā)生的pH范圍。
本申請(qǐng)中的第2節(jié)或任何一節(jié)引用的參考文獻(xiàn)或鑒定都不能被當(dāng)成是承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
3.發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了從聚酰胺或聚合的酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體，例如，從聚丙烯酰胺制備物中除去丙烯酰胺單體的方法。一示范性方法需要使含有丙烯酰胺單體的聚丙烯酰胺制備物(所述聚丙烯酰胺制備物具有約2到小于6的pH)，與已被多重誘導(dǎo)的微生物菌株的純培養(yǎng)物或粗抽提物接觸充分時(shí)間，通過(guò)將丙烯酰胺轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)丙烯酸來(lái)減少丙烯酰胺單體的量。優(yōu)選的，聚丙烯酰胺制備物具有約2到約5的pH，更優(yōu)選的是約3到約4的pH。還有，聚丙烯酰胺制備物中的丙烯酰胺單體量?jī)?yōu)選被減少至100ppm以下。
可在含有腈化合物或腈和酰胺化合物的混合物的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物菌株的純培養(yǎng)物，來(lái)多重誘導(dǎo)用于從聚丙烯酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體的微生物菌株。另外，可在含有腈化合物或腈和酰胺化合物的混合物，作為唯一碳源和能源和/或氮源的極限培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物菌株的純培養(yǎng)物，來(lái)多重誘導(dǎo)用于從聚丙烯酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體的微生物菌株。該多重誘導(dǎo)方法不需要芳族腈的存在。
在誘導(dǎo)后，可將微生物的純培養(yǎng)物儲(chǔ)藏一段時(shí)間，即，在正常冷藏溫度下，即，約4℃，至少4個(gè)月，在正常冷凍溫度下，即-20℃或更低，或當(dāng)使用凍干或低溫時(shí)貯藏，更長(zhǎng)時(shí)間(年)，而不損失除去酰胺的活性。某些微生物能利用至少一種腈化合物作為碳和能量的唯一來(lái)源。某些微生物能利用至少一種腈或酰胺化合物作為碳和能量和氮的唯一來(lái)源。
根據(jù)本發(fā)明，一旦被誘導(dǎo)，對(duì)于除去酰胺單體，該純微生物培養(yǎng)物不一定必須活躍的分裂增殖，或者即使死亡也可以。這種細(xì)菌生長(zhǎng)與除去酰胺單體的分離使得抑制生長(zhǎng)的條件下也能快速除去不需要的酰胺單體；例如，在腈化合物非常高的濃度下，強(qiáng)堿性或酸性pH，高溫，如55℃等條件下。另外，這種分離(1)意味著由于不需要細(xì)胞生長(zhǎng)來(lái)除去酰胺單體，因此不需大量產(chǎn)生細(xì)胞(生物體)或細(xì)胞生產(chǎn)可最小化。當(dāng)細(xì)胞大量生長(zhǎng)時(shí)，還必須處理因生長(zhǎng)而產(chǎn)生的廢生物物質(zhì)；(2)因?yàn)榧?xì)胞不再生長(zhǎng)，可不規(guī)則的除去不起生長(zhǎng)底物作用的化合物；和(3)該方法導(dǎo)致產(chǎn)生較少的毒性或非毒性中間產(chǎn)物，這種中間產(chǎn)物易于自然降解(在反抗中降解，毒性亦同)3.1.定義如本申請(qǐng)中所用，“腈”化合物將包括含有一個(gè)或多個(gè)腈基團(tuán)，即C≡N基團(tuán)，和除C≡N之外的至少一個(gè)碳原子。如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“腈”包括丙烯醛氰醇等化合物。注意到在反應(yīng)性氰化物存在下的丙烯醛以丙烯醛氰醇的形式存在。腈解毒微生物能將氰醇的腈轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的酸。例如，將丙烯醛氰醇轉(zhuǎn)化成丙烯酸。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“腈”包括但不限于，乙腈、丙烯腈、富馬腈、琥珀腈、丁烯腈、己二腈、芐腈、丁腈、β-丙烯磺酰腈、異戊腈、戊腈、苯基腈、丙烯醛氰醇等。
如本申請(qǐng)所用，“陰離子”聚酰胺制備物是含有一條陰離子主鏈和/或側(cè)鏈基團(tuán)的聚酰胺制備物，并具有凈負(fù)電荷。
如本申請(qǐng)所用，“陽(yáng)離子”聚酰胺制備物是含有一條陽(yáng)離子主鏈和/或側(cè)鏈基團(tuán)的聚酰胺制備物，并具有凈正電荷。
如本申請(qǐng)所用，“非離子”聚酰胺制備物是不含陰離子和/或陽(yáng)離子主鏈和/或側(cè)鏈基團(tuán)，或如果存在一個(gè)或多個(gè)這些基團(tuán)，具有凈中性電荷的聚酰胺制備物。3.2.發(fā)明目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供通過(guò)從pH約2至小于6的聚酰胺制備物中將酰胺單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的酸化合物，除去不需要的酰胺單體的方法。
本發(fā)明的其它目的和/或優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的。
4.發(fā)明詳述本發(fā)明包括通過(guò)使用一種受誘導(dǎo)而能將單酰胺分子轉(zhuǎn)化成酸分子的微生物菌株的純培養(yǎng)物，從pH約2至小于6的聚酰胺或聚合的酰胺制備物中，將酰胺單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的酸化合物，來(lái)除去不需要的酰胺單體的方法。
可使用任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如用氣-液色譜和火焰電離檢測(cè)器(GLC-FID)檢測(cè)酰胺，和用高效液相層析(HPLC)檢測(cè)對(duì)應(yīng)的酸化合物評(píng)估單酰胺化合物的消失，和/或?qū)?yīng)的酸化合物的同時(shí)出現(xiàn)，從而監(jiān)測(cè)單酰胺從制備物中的除去情況。轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的酸導(dǎo)致各原先存在的酰胺基團(tuán)產(chǎn)生可化學(xué)計(jì)量的氨。可用Fawcett和Scott，1960，臨床病理學(xué)，13156-159的技術(shù)測(cè)量氨釋放量，來(lái)監(jiān)測(cè)酰胺化合物轉(zhuǎn)化的程度。如果由于氨或銨鹽的存在，不能測(cè)量氨釋放，那么可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，包括但不限于GLC-FID等來(lái)監(jiān)測(cè)存在的酰胺的濃度。另外，可通過(guò)評(píng)估對(duì)應(yīng)酸化合物的產(chǎn)生(可衍生酸化合物并用GLC-FID檢測(cè)衍生產(chǎn)物來(lái)監(jiān)測(cè))來(lái)測(cè)定酰胺化合物的消失。如果先己烷基化、酯化或甲硅烷基化，可衍生酰胺和酸，用于GLC-FID分析(常見(jiàn)，Supelco層析產(chǎn)物分類(lèi)，1997，653-656頁(yè)(Supelco Inc.，Bellefonte PA))。
然后，如需要，可將酸和其它非聚酰胺化合物進(jìn)一步降解成CO2、H2O和生物物質(zhì)。
為了公開(kāi)內(nèi)容清晰，和不受限制，將本發(fā)明分成下面幾節(jié)予以詳述(1)誘導(dǎo)和鑒定具有去除酰胺能力的微生物菌株的方法；(2)分離的微生物菌株的特征分析；和(3)除去酰胺單體所用的誘導(dǎo)的微生物菌株的應(yīng)用和方法。
4.1.誘導(dǎo)和鑒定具有除酰胺能力的微生物菌株的方法通過(guò)在腈化合物的混合物存在下，或腈和酰胺化合物的混合物存在下培育某微生物菌株，可分離并獲得用于從聚酰胺或聚合酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體化合物的微生物菌株。驚人的是已發(fā)現(xiàn)，為了誘導(dǎo)廣譜去除酰胺的能力，即去除各種單酰胺的能力，必須用一種以上腈化合物補(bǔ)充培養(yǎng)基。更具體的說(shuō)，已發(fā)現(xiàn)可使用腈和酰胺化合物的混合物來(lái)誘導(dǎo)微生物除去廣譜單酰胺的能力。多重誘導(dǎo)后，純培養(yǎng)菌株能從聚酰胺或聚合的酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體化合物。所選的受誘導(dǎo)的微生物菌株可選自己知來(lái)源，或可以是新分離的微生物，還可以是嗜熱的或其它嗜極端細(xì)菌，如嗜鹵素菌或嗜酸菌。有利的是，多重誘導(dǎo)方法不需要芳族腈，如芐腈。
已注意到，能被多重誘導(dǎo)而具有去除酰胺單體能力的微生物看來(lái)在含有腈或酰胺作為碳的唯一來(lái)源或作為碳和氮的唯一來(lái)源的培養(yǎng)基中，與在含有易于利用的碳源如糖類(lèi)等的培養(yǎng)基的生長(zhǎng)比較時(shí)，生長(zhǎng)較慢。優(yōu)選的，將可被多重誘導(dǎo)而具有去除酰胺單體能力的微生物菌株培養(yǎng)在含有易于利用的碳源(如葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乙酸酯、苯甲酸酯等)的培養(yǎng)基中。以遞增量或連續(xù)加入碳和氮源，從而使反應(yīng)體系中的碳和氮水平低于1％。以這種方式可迅速和低廉的產(chǎn)生大量細(xì)胞。一旦達(dá)到所需的細(xì)胞量，可根據(jù)在下文4.1.1或4.1.2節(jié)中描述的方法多重誘導(dǎo)該微生物，例如在一個(gè)生產(chǎn)循環(huán)的最后20個(gè)小時(shí)中。
4.1.1.使用腈或腈和酰胺化合物和完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)一種誘導(dǎo)去除酰胺單體能力的方法包括使用補(bǔ)充了腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。更具體的說(shuō)，該方法包括在補(bǔ)充了腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，并收集培養(yǎng)的微生物。當(dāng)在瓊脂平板上培養(yǎng)時(shí)，在腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物存在下，培養(yǎng)該微生物約24到48小時(shí)。當(dāng)在發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，在加入腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物之前，在完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)該微生物1到48+小時(shí)，優(yōu)選1到20小時(shí)，更優(yōu)選16到20小時(shí)；然后在加入腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物4到5個(gè)小時(shí)后收集該微生物。如果需要更大的生物量，可在加入腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物之前，在發(fā)酵罐中更長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)該微生物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，如需要可加入額外的營(yíng)養(yǎng)物來(lái)維持生長(zhǎng)。
在另一個(gè)方法中，在補(bǔ)充了腈化合物的混合物的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)微生物。有用的腈化合物的混合物包括下列約50到約500ppm的乙腈；約50到500ppm的丙烯腈；和約25到約100ppm的琥珀腈?？扇芜x的，可在混合物中加入約1-10ppm的KCN或NaCN。雖然不是要受任何具體機(jī)制的限制，本發(fā)明人相信，誘導(dǎo)過(guò)程中KCN或NaCN的存在使微生物對(duì)無(wú)機(jī)氰化物馴化。另外可任選的，可在混合物中加入約1-25ppm濃度的鈷。還可任選的，可在混合物中加入濃度約1-10克/升的尿素。
優(yōu)選的，用含有濃度各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度各約50ppm的琥珀腈和富馬腈的腈化合物的至少一種的混合物補(bǔ)充完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。更優(yōu)選的，腈混合物含有各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度約50ppm的琥珀腈?？扇芜x的，在培養(yǎng)基中加入濃度各約10ppm的KCN和鈷，和濃度約7克/升的尿素。而更優(yōu)選的，用各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和約50ppm濃度的琥珀腈，各約10ppm的KCN和鈷，和約7g/l的尿素補(bǔ)充完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(它是BACTOTMR2A培養(yǎng)基(Difco，Detriot，Michigan)，或YEMEA培養(yǎng)基、或含有YEMEA各成分的比率，但不含瓊脂的培養(yǎng)基。
在另一種方法中，在補(bǔ)充了腈和酰胺化合物的混合物的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)微生物。有用的腈和酰胺化合物的混合物包括(1)約25到100ppm的琥珀腈，約50到150ppm的乙腈和約50到150ppm的丙烯腈中的至少一種；和(2)約50到500ppm的乙酰胺和約50到500ppm的丙烯酰胺?？扇芜x的，可以約1到10ppm加入KCN或NaCN。也可任選的，以約1到25ppm加入鈷，而且可以約1-10克/升加入尿素。優(yōu)選的，用50ppm琥珀腈和各150ppm的乙酰胺和丙烯酰胺補(bǔ)充完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。
完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基是為微生物提供了所有生長(zhǎng)必需的營(yíng)養(yǎng)物，如碳，和/或氮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。例如，但不是為了限制，含有葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、酪蛋白氨基酸、酵母抽提物、可溶性淀粉和丙酮酸鈉的BACTOTMR2A培養(yǎng)基(Difco，Detroit，Michigan)是一種合適的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。另一種可用于本發(fā)明的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基是YEMEA培養(yǎng)基，它含有葡萄糖、麥芽抽提物和酵母抽提物，而不含瓊脂。另一種用于本發(fā)明的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基是含有葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4、可溶性淀粉和丙酮酸鈉的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基?？墒褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。
在包括3.0和11.0之間的pH，優(yōu)選約6.0和8.0之間；4℃和55℃之間的溫度，優(yōu)選約15℃和37℃之間的條件下培養(yǎng)微生物。另外，溶氧張力應(yīng)在0.1％和100％之間，優(yōu)選4％和80％，更優(yōu)選4％和30％之間。可監(jiān)測(cè)溶氧張力，并以空氣、純氧、過(guò)氧化物、和/或其它能釋放氧的過(guò)氧組合物形式提供氧，而將其維持在所需范圍內(nèi)。
在培養(yǎng)期末，通過(guò)刮、離心、過(guò)濾等，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法收集并濃縮培養(yǎng)的微生物。
在一個(gè)示范性方法中，4℃收集細(xì)胞，將其制備成細(xì)胞濃縮液，然后快速冷凍(干冰和乙酮)，然后儲(chǔ)藏在-20℃或以下?？墒褂美鋬黾?xì)胞濃縮液或然后可將其固定。
一旦根據(jù)上述方法多重誘導(dǎo)，可通過(guò)在培養(yǎng)的微生物中加入一種或多種底物來(lái)穩(wěn)定所收集的微生物的除酰胺單體能力。雖然不是要受任何機(jī)制所限，本發(fā)明人注意到，酰胺酶通常在底物存在時(shí)最穩(wěn)定，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。因此，例如加入酸性化合物，如異丁烯酸，能穩(wěn)定酰胺酶，使其活性能長(zhǎng)期保持。
可將誘導(dǎo)的微生物固定在聚丙烯酰胺或丙烯酰胺塊中，或固定在已與聚乙烯亞胺交聯(lián)的海藻酸鹽中，來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。優(yōu)選固定在與聚乙烯亞胺交聯(lián)的海藻酸鹽中來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞。
4.1.2.使用腈或腈和酰胺化合物和極限培養(yǎng)基的誘導(dǎo)另一種誘導(dǎo)去除酰胺單體能力的方法包括使用補(bǔ)充了腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物的極限培養(yǎng)基。更具體的說(shuō)，該方法包括在補(bǔ)充了腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物的極限培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，并收集培養(yǎng)的微生物。當(dāng)在瓊脂平板上培養(yǎng)時(shí)，將微生物培養(yǎng)約24到48小時(shí)。當(dāng)在發(fā)酵罐中培養(yǎng)時(shí)，在補(bǔ)充了腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物的極限培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物1到48+小時(shí)，優(yōu)選1到20小時(shí)，更優(yōu)選16到23小時(shí)；然后在加入腈化合物的混合物或腈和酰胺化合物的混合物后4到5個(gè)小時(shí)收獲。如果需要更大的生物量，可在發(fā)酵罐中更長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)微生物。
有用的腈化合物的混合物包括約50到約500ppm的乙腈；約50到500ppm的丙烯腈；和約25到約100ppm的琥珀腈?？扇芜x的，可在混合物中加入1-10ppm的KCN或NaCN。還可任選的，可在混合物中加入約1-25ppm濃度的鈷。也可任選的，可在混合物中加入濃度約1-10克/升的尿素。
優(yōu)選的，用含有濃度各約150ppm的乙腈和丙烯腈的至少一種，和濃度各約50ppm的琥珀腈和富馬腈的腈化合物的混合物補(bǔ)充極限培養(yǎng)基。更優(yōu)選的，腈混合物含有各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度約50ppm的琥珀腈?？扇芜x的，在培養(yǎng)基中加入濃度各約10ppm的KCN和鈷，和濃度約7克/升的尿素。
在另一種方法中，在補(bǔ)充了腈和酰胺化合物的混合物的極限培養(yǎng)基中誘導(dǎo)微生物。有用的腈和酰胺化合物的混合物包括(1)約25到100ppm的琥珀腈，約50到150ppm的乙腈和約50到150ppm的丙烯腈中的至少一種；和(2)約50到500ppm的乙酰胺和約50到500ppm的丙烯酰胺。可任選的，可以約1到10ppm加入KCN或NaCN。也可任選的，以約1到25ppm加入鈷，而且可以約1-10克/升加入尿素。優(yōu)選的，用50ppm琥珀腈和各150ppm的乙酰胺和丙烯酰胺補(bǔ)充極限培養(yǎng)基。
極限培養(yǎng)基是營(yíng)養(yǎng)不完全的培養(yǎng)基，它不向微生物提供其生長(zhǎng)所需的有機(jī)碳。因此，必須用微生物能用作碳源和/或能源的化合物補(bǔ)充極限培養(yǎng)基。例如，但不是為了限制，Stanier’s極限培養(yǎng)基(Stanier等，1966，遺傳微生物學(xué)雜志，43159-271)和磷酸緩沖鹽(PBS)是可接受的用于該誘導(dǎo)方法的極限培養(yǎng)基。
在包括3.0和11.0之間的pH，優(yōu)選約6.0和8.0之間；4℃和55℃之間的溫度，優(yōu)選約15℃和37℃之間的條件下培養(yǎng)微生物。另外，溶氧張力應(yīng)在0.1％和100％之間，優(yōu)選4％和80％，更優(yōu)選4％和30％之間?？杀O(jiān)測(cè)溶氧張力，并以空氣、純氧、過(guò)氧化物、和/或其它能釋放氧的過(guò)氧組合物形式提供氧，而維持其在所需范圍內(nèi)。
在培養(yǎng)期末，通過(guò)刮、離心、過(guò)濾等，或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法收集并濃縮培養(yǎng)的微生物。
一旦根據(jù)上述方法多重誘導(dǎo)，可通過(guò)在培養(yǎng)的微生物中加入一種或多種底物來(lái)穩(wěn)定所收集微生物的去除酰胺單體能力。雖然不是要受限于任何機(jī)制，本發(fā)明人注意到，酰胺酶通常在底物存在時(shí)最穩(wěn)定，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。因此，例如加入酸性化合物，如異丁烯酸，能穩(wěn)定酰胺酶，使其活性能長(zhǎng)期保持。
可通過(guò)將誘導(dǎo)的微生物固定在聚丙烯酰胺或丙烯酰胺塊中，或固定在已與聚乙烯亞胺交聯(lián)的海藻酸鹽中，來(lái)實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。優(yōu)選固定在與聚乙烯亞胺交聯(lián)的海藻酸鹽中來(lái)穩(wěn)定細(xì)胞。
4.1.3.有用的微生物的鑒定根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明提供了篩選微生物，來(lái)鑒定和分離可用于從聚酰胺或聚合的酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體化合物的方法。該方法通常需要將測(cè)試微生物暴露于上文4.1.1和4.1.2節(jié)中所述的，用來(lái)多重誘導(dǎo)去除酰胺能力的條件下，然后評(píng)估推測(cè)已受到“誘導(dǎo)”的測(cè)試微生物從聚酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體的能力。
篩選可用于從聚酰胺制備物中除去酰胺單體的微生物的方法包括在補(bǔ)充了腈化合物的第一混合物(見(jiàn)上文4.1.1和4.1.2節(jié))的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基或極限培養(yǎng)基中，在瓊脂平板上，有利生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)測(cè)試的微生物約24到48小時(shí)，來(lái)獲得推定性誘導(dǎo)的微生物；并使所述微生物與含有酰胺單體的聚酰胺制備物接觸，和監(jiān)測(cè)酰胺單體的消失，來(lái)評(píng)估推測(cè)已受到誘導(dǎo)的微生物從聚酰胺制備物中除去酰胺單體的能力，其中制備物中酰胺單體化合物的消失表明，測(cè)試微生物具有從聚酰胺制備物中除去酰胺單體化合物的能力。優(yōu)選的，聚酰胺制備物含有聚丙烯酰胺和單體丙烯酰胺，而所有酰胺單體在約30分鐘內(nèi)消失表明，測(cè)試微生物具有從聚酰胺制備物中除去酰胺單體的能力。最優(yōu)選的，聚酰胺制備物中所有酰胺單體在約10分鐘內(nèi)消失表明該微生物具有所需的能力。如果需要微生物在硫酸銨存在下，具有除去酰胺單體的能力，可在第二混合物中包括約1-8％的硫酸銨。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例，用含有濃度各為150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度各約50ppm的琥珀腈和富馬腈的至少一種的混合物的腈化合物的第一混合物補(bǔ)充完全營(yíng)養(yǎng)或極限培養(yǎng)基。更優(yōu)選的，腈的第一混合物含有各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度約50ppm的琥珀腈?？扇芜x的，在培養(yǎng)基中加入濃度約10ppm的KCN。
根據(jù)該優(yōu)選例的另一個(gè)優(yōu)選模式，用腈和酰胺化合物的第一混合物(見(jiàn)上文4.1.1和4.1.2節(jié))補(bǔ)充完全營(yíng)養(yǎng)或極限培養(yǎng)基。
上文4.1.1和4.1.2節(jié)中描述了有用的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和極限培養(yǎng)基。在包括pH約2.0和11.0之間，優(yōu)選約2.0和小于6.0之間；和約4℃和55℃之間的溫度，優(yōu)選約15℃和37℃之間的條件下培養(yǎng)試驗(yàn)微生物。
可使用Fawcett和Scott，1960，臨床病理學(xué)雜志，13156-159的技術(shù)測(cè)量氨釋放，來(lái)監(jiān)測(cè)除去單酰胺化合物的程度。如果由于存在氨或銨鹽，而不能測(cè)量氨釋放，可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，包括但不限于，GLC-FID等來(lái)監(jiān)測(cè)存在的酰胺濃度。另外，可通過(guò)評(píng)估對(duì)應(yīng)酸化合物的產(chǎn)生((可衍生酸化合物并用GLC-FID檢測(cè)該衍生產(chǎn)物來(lái)監(jiān)測(cè))來(lái)測(cè)定酰胺化合物的消失。如果先己烷基化、酯化或甲硅烷基化，可衍生酰胺和酸，用于GLC-FID分析(常見(jiàn)，Supelco層析產(chǎn)物分類(lèi)，1997，653-656頁(yè)(Supelco Inc.，Bellefonte PA))。
4.2.微生物菌株的特征確定已發(fā)現(xiàn)，下文所述的從已知來(lái)源分離或獲得的微生物菌株，在如上文4.1節(jié)所述多重誘導(dǎo)后，具有使酰胺單體化合物轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的酸化合物，而從聚酰胺制備物中除去酰胺單體化合物的能力。
下文表I和II給出了兩種紅球菌菌株，DAP 96622和DAP 96253(分別衍生自從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD，ATCC登錄號(hào)33278和ATCC登錄號(hào)39484獲得的兩種菌株，已發(fā)現(xiàn)它們?cè)谌缟纤龆嘀卣T導(dǎo)后，具有使酰胺單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)酸化合物，而從聚酰胺制備物中除去酰胺單體的能力)的某些特異性菌株特征。在一個(gè)說(shuō)明性例子中，用各150ppm的丙烯腈、乙腈，和50ppm琥珀腈，用或不用50ppm KCN多重誘導(dǎo)了這兩種紅球菌菌株。
用普通細(xì)菌學(xué)方法手冊(cè)，1981，Philip Gerhardt，編，Am.Soc.Microbiol.，Washington，D.C.中描述的方案進(jìn)行了糖利用試驗(yàn)。通過(guò)將微生物在補(bǔ)充了各150ppm的乙腈和丙烯腈，和50ppm琥珀腈的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，來(lái)誘導(dǎo)菌株后，進(jìn)行了腈利用試驗(yàn)。在補(bǔ)充有特定的試驗(yàn)化合物作為碳和/或能量的唯一來(lái)源的極限培養(yǎng)基上進(jìn)行了實(shí)際利用試驗(yàn)。
表I紫紅紅球菌(Rhodococcus rhodochrous)株DAP 96622差異特征結(jié)果過(guò)氧化氫酶/氧化酶 (+)/(-)檸檬酸利用 (+)三糖鐵瓊脂 無(wú)變化生長(zhǎng)于 5℃ (-)25℃ (+)35℃ (+)45℃ (+)利用 葡萄糖 (+)蔗糖 (+)果糖 (+)乳糖 (+)甘露糖醇 (+)甘露糖 (+)阿拉伯糖 (-)肌醇 (+)，無(wú)氣體鼠李糖 (+)，無(wú)氣體脲酶(-)腈降解 (-)明膠水解(-)抗生素抗性慶大霉素 S紅霉素 S鏈霉素 S妥布拉霉素 S利福霉素 S青霉素 S
四環(huán)素 S對(duì)碳和氮的利用含有腈作為唯一碳和氮源的Stanier’s極限培養(yǎng)基丙烯腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)乙腈 (150ppm/300ppm) (+)/(+)琥珀腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)富馬腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)丙烯腈/乙腈/琥珀腈(各150ppm/300ppm)(+)/(+)丙烯腈/乙腈/富馬腈(各150ppm/300ppm)(+)/(-)丙烯腈/乙腈/琥珀腈/富馬腈 (各150ppm/300ppm)(-)/(-)碳源利用含1g/l硫酸銨的Stanier’s極限培養(yǎng)基P-甲酚(150ppm/300ppm) (+)/(+)甲苯 (150ppm/300ppm) (NT)/(NT)苯乙烯(150ppm/300ppm) (NT)/(NT)甲苯/苯乙烯 (各150ppm/300ppm)(NT)/(NT)乙酸酯(150ppm/300ppm) (+)/(+)丙烯酸酯 (150ppm/300ppm) (+)/(+)琥珀酸酯 (150ppm/300ppm) (+)/(+)富馬酸酯 (150ppm/300ppm) (+)/(+)碳源利用含1g/l硫酸銨和10ppm KCN的Stanier’s極限培養(yǎng)基富馬腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)琥珀腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)碳源利用不含1g/l硫酸銨但含10ppm KCN的Stanier’s極限培養(yǎng)基富馬腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)琥珀腈(150ppm/300ppm) (+)/(+)
表II紅球菌亞種菌株DAP 96253差異特征結(jié)果過(guò)氧化氫酶/氧化酶 (+)/(-)檸檬酸利用 (+)三糖鐵瓊脂 無(wú)變化生長(zhǎng)于 5℃ (-)25℃(+)35℃(+)45℃(+)利用 葡萄糖 (+)蔗糖(+)果糖(+)乳糖(+)甘露糖醇(+)甘露糖 (+)阿拉伯糖(-)肌醇(+)，無(wú)氣體鼠李糖 (+)，無(wú)氣體脲酶 (-)腈降解 (-)明膠水解 (-)抗生素抗性慶大霉素I*紅霉素 S鏈霉素 S妥布拉霉素 S利福霉素S青霉素 S
四環(huán)素 S*I表示在敏感和抗性“之間”對(duì)碳和氮的利用含有腈作為唯一碳和氮源的Stanier’s極限培養(yǎng)基丙烯腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)乙腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)琥珀腈 (150ppm/300ppm)(+)/(-)富馬腈 (150ppm/300ppm)(+)/(-)丙烯腈/乙腈/琥珀腈 (各150ppm/300ppm) (+)/(+)丙烯腈/乙腈/富馬腈 (各150ppm/300ppm) (-)/(-)丙烯腈/乙腈/琥珀腈/富馬腈(各150ppm/300ppm) (-)/(-)碳源利用含1g/l硫酸銨的Stanier’s極限培養(yǎng)基P-甲酚 (150ppm/300ppm)(+)/(+)甲苯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)苯乙烯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)甲苯/苯乙烯 (各150ppm/300ppm) (+)/(+)乙酸酯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)丙烯酸酯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)琥珀酸酯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)富馬酸酯 (150ppm/300ppm)(+)/(+)碳源利用含1g/l硫酸銨和10ppm KCN的Stanier’s極限培養(yǎng)基富馬腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)琥珀腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)碳源利用不含1g/l硫酸銨但含10ppm KCN的Stanier’s極限培養(yǎng)基富馬腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)琥珀腈 (150ppm/300ppm)(+)/(+)
已發(fā)現(xiàn)下文表中給出特征的下列微生物菌株，在如上所述多重誘導(dǎo)后，具有使酰胺單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)酸化合物，而從聚酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體的能力。在WO96/18724中描述了這些微生物的分離。簡(jiǎn)單說(shuō)，在同一工業(yè)區(qū)的污染土壤中分別培養(yǎng)了200種以上純微生物分離物。將所有這些純分離物合并，并與含有芳族、硝基芳族、鹵素-芳族、脂肪族和鹵素-脂肪族化合物混合物的污泥/廢料一起有氧培養(yǎng)。從培養(yǎng)材料中收集微生物的混合培養(yǎng)物，并維持在BACTOTMR2A培養(yǎng)基(Difco，Detroit，Michigan)上。
稱為DAP-2的混合培養(yǎng)物(已保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，指定ATCC登錄號(hào)55644)，能有氧降解至少下列化合物或其混合物中的一種苯、甲苯、二甲苯、乙苯、萘、氯苯、苯酚、甲酚、硝基苯、苯胺、蒽、二甲基苯酚、苯乙烯、鹵素萘、2-，3-或4-氯甲苯、2-，3-或4-氯苯甲酸酯、1，3-二氯苯甲酸酯、1，2-，1，3-或1，4-二硝基苯、1-氯-2-硝基苯、1-氯-4-硝基苯、1-或2-甲基萘、芘、苊、熒蒽、菲、苯并-(b)-熒蒽、二香豆酮、_、鄰苯二酚、m-甲苯酸、乙酸肉桂酯、香草醛、反-肉桂醛、均三甲苯、水楊酸酯、密胺、氰尿酸、δ-(-)-苧烯、十六烷、甲醛和三氯甲烷。
在補(bǔ)充了各150ppm的硝基苯、萘和甲苯的BACTOTMR2A培養(yǎng)基上通過(guò)分離單菌落，從稱為DAP2的混合培養(yǎng)物中分離并確定了下列純培養(yǎng)物的特征。
微生物DAP 623DAP623是一種革蘭氏陰性可運(yùn)動(dòng)性桿菌，通常是小的單桿菌，雖然可見(jiàn)一些成對(duì)。染色可以是不均勻的，有一些絮狀物形成。菌落在BACTOTMR2A培養(yǎng)基上呈白色至奶油色。另外，該生物體能利用下列物質(zhì)均三甲苯、乳酸、琥珀酸、苧烯、m-甲苯酸、氯苯、水楊酸酯、2-，3-和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來(lái)源。DAP 623保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，指定了ATCC登錄號(hào)55722，并進(jìn)一步如表III所示確定了特征。
表IIIDAP R23差異特征結(jié)果過(guò)氧化氫酶/氧化酶(+)/(-)檸檬酸利用 (+)三糖鐵瓊脂 來(lái)自葡萄糖的酸生長(zhǎng)于 15℃ (-)25℃ (+)35℃ (+)41℃ (+)利用 葡萄糖(+)果糖 (+)乳糖 (-)甘露糖醇 (+)甘露糖(+)2-甲基萘 (-)α-酮戊二酸 (+)谷氨酸酯 (+)乙醇 (-)十六烷(-)NO3-NO2(+)精氨酸脫羧酶 (+)賴氨酸脫羧酶 (+)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶 (+)明膠水解 (+)脲酶 (+)抗生素抗性HgCl2(-)氨芐青霉素R卡那霉素 (-)四環(huán)素R壯觀霉素 R
鏈霉素 (-)微生物DAR 626DAP 626是一種革蘭氏可變桿菌，其尺寸可變，以單個(gè)或成對(duì)出現(xiàn)。可見(jiàn)在鞭毛平板上生長(zhǎng)，表明其鞭毛運(yùn)動(dòng)性。另外，該微生物體能利用下列物質(zhì)均三甲苯、乳酸、琥珀酸、苧烯、乙酸肉桂酯、鄰苯二酚、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來(lái)源。DAP 626保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，指定了ATCC登錄號(hào)55723，并如表4中所示，進(jìn)一步確定了特征。
表IVDAP 626差異特征結(jié)果過(guò)氧化氫酶/氧化酶 (+)/(+)檸檬酸利用 (-)三糖鐵瓊脂 產(chǎn)生H2S生長(zhǎng)于 15℃(+)25℃(+)35℃(+)41℃(+)利用 葡萄糖 (-)果糖(+)乳糖(-)甘露糖醇(+)甘露糖 (-)2-甲基萘(-)α-酮戊二酸 (+)谷氨酸酯(+)乙醇(+)十六烷 (+)NO3-NO2(-)精氨酸脫羧酶 (-)賴氨酸脫羧酶 (-)鳥(niǎo)氨酸(-)明膠水解 (-)脲酶 (+)抗生素抗性HgCl2(-)氨芐青霉素 R卡那霉素 (-)壯觀霉素 R鏈霉素 (-)微生物DAP 629DAP 629是小型革蘭氏陰性可運(yùn)動(dòng)性桿菌，幾乎是球桿菌。當(dāng)在BACTOTMR2瓊脂上生長(zhǎng)時(shí)，菌落呈帶微弱熒光的白色。另外，該微生物體能利用下列物質(zhì)熒蒽、均三甲苯、乳酸、琥珀酸、苧烯、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來(lái)源。DAP 629保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，指定了ATCC登錄號(hào)55726，并如表V中所示，進(jìn)一步確定了特征。
表VDAP 629差異特征結(jié)果過(guò)氧化氫酶/氧化酶 (+)/(+)檸檬酸利用 (-)三糖鐵瓊脂 無(wú)發(fā)酵生長(zhǎng)于 15℃ (+)25℃ (+)35℃ (+)41℃ (-)利用 葡萄糖(+)
果糖(-)乳糖(-)甘露糖醇(-)甘露糖 (-)2-甲基萘(-)α-酮戊二酸 (+)谷氨酸酯(+)乙醇(-)十六烷 (-)NO3-NO2(+)精氨酸脫羧酶(-)賴氨酸脫羧酶(+)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(-)明膠水解(+)脲酶(-)抗生素抗性HgCl2(-)氨芐青霉素 R卡那霉素(-)四環(huán)素 (-)壯觀霉素(-)鏈霉素 (-)微生物DAP 632DAP 632是革蘭氏可變可運(yùn)動(dòng)性細(xì)長(zhǎng)桿菌，可見(jiàn)單個(gè)或成對(duì)。當(dāng)在BACTOTMR2瓊脂上生長(zhǎng)時(shí)，菌落呈微黃色至奶油色。另外，該微生物體能利用下列物質(zhì)熒蒽、苊、均三甲苯、乳酸、苧烯、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來(lái)源。DAP 632保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，指定了ATCC登錄號(hào)55727，并如表VI中所示，進(jìn)一步確定了特征。
表VIDAP 632差異特征結(jié)果過(guò)氧化氫酶/氧化酶 (+)/(-)檸檬酸利用 (+)三糖鐵瓊脂 無(wú)發(fā)酵生長(zhǎng)于 15℃ (+)25℃ (+)35℃ (+)41℃ (+)利用 葡萄糖 (-)果糖 (-)乳糖 (-)甘露糖醇 (-)甘露糖 (-)2-甲基萘 (-)α-酮戊二酸 (-)谷氨酸酯 (+)乙醇 (-)十六烷 (-)NO3-NO2(-)精氨酸脫羧酶(-)賴氨酸脫羧酶(-)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶(-)明膠水解(+)脲酶(+)抗生素抗性HgCl2R氨芐青霉素 R
卡那霉素 R四環(huán)素 R壯觀霉素 R鏈霉素 R微生物DAP 115DAP 115是革蘭氏陰性可運(yùn)動(dòng)性桿菌，可見(jiàn)單個(gè)或成對(duì)。可觀察到在鞭毛平板上生長(zhǎng)，表明其鞭毛運(yùn)動(dòng)性。當(dāng)在BACTOTMR2瓊脂上生長(zhǎng)時(shí)，菌落呈白色，但在營(yíng)養(yǎng)肉湯中生長(zhǎng)時(shí)呈黃色。另外，該微生物體能利用下列物質(zhì)苯并-(b)-熒蒽、熒蒽、二香豆酮、苊、水楊酸酯、乳酸、琥珀酸、乙醛酸、均三甲苯、香草醛、苧烯、乙酸肉桂酸、鄰苯二酚、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來(lái)源。DAP 115保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，指定了ATCC登錄號(hào)55724，并如表VII中所示，進(jìn)一步確定了特征。
表VIIDAP 115差異特征結(jié)果過(guò)氧化氫酶/氧化酶 (+)/(+)檸檬酸利用(+)三糖鐵瓊脂產(chǎn)生H2S，從葡萄糖產(chǎn)生酸和氣體生長(zhǎng)于15℃ (+/-)25℃ (+)35℃ (+)41℃ (+)利用 葡萄糖(+)果糖 (+)乳糖 (-)甘露糖醇 (+)甘露糖(+)
2-甲基萘 (+)α-酮戊二酸 (+)谷氨酸酯 (+)乙醇 (-)十六烷 (+)NO3-NO2(+)精氨酸脫羧酶 (-)賴氨酸脫羧酶 (-)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶 (+)明膠水解 (+)脲酶 (+)抗生素抗性HgCl2R氨芐青霉素 R卡那霉素R四環(huán)素 R壯觀霉素R鏈霉素 R微生物DAP 120DAP 120是革蘭氏陰性可運(yùn)動(dòng)性桿菌?？捎^察到在鞭毛平板上生長(zhǎng)，表明其鞭毛運(yùn)動(dòng)性。另外，該微生物體能利用下列物質(zhì)_、芘、乳酸、琥珀酸、乙醛酸、水楊酸酯、均三甲苯、香草醛、苧烯、乙酸肉桂酸、鄰苯二酚、m-甲苯酸、氯苯、2-，3-，和4-氯甲苯、2-，3-和4-氯苯甲酸、和1，3-二氯苯作為碳和能量的唯一來(lái)源。DAP 120保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，指定了ATCC登錄號(hào)55725，并如表VIII中所示，進(jìn)一步確定了特征。
表VIIIDAP 120差異特征結(jié)果過(guò)氧化氫酶/氧化酶 (+)/(+)檸檬酸利用 (+)三糖鐵瓊脂 產(chǎn)生H2S生長(zhǎng)于 15℃(+)25℃(+)35℃(+)41℃(+)利用 葡萄糖 (+)果糖(+)乳糖(-)甘露糖醇(+)甘露糖 (-)2-甲基萘(+)α-酮戊二酸 (+)谷氨酸酯(+)乙醇(-)十六烷 (+)NO3-NO2(+)精氨酸脫羧酶 (-)賴氨酸脫羧酶 (-)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶 (-)明膠水解 (+)脲酶 (+)抗生素抗性HgCl2R氨芐青霉素 R卡那霉素R四環(huán)素 R壯觀霉素(-)鏈霉素 (-)
下文表IX顯示了從稱為DAP 2的混合培養(yǎng)物中分離出來(lái)的，上文確定特征的純培養(yǎng)物能在補(bǔ)充了各150ppm的乙腈和丙烯腈的Stanier’s極限培養(yǎng)基上單獨(dú)生長(zhǎng)。培養(yǎng)物在25-27℃生長(zhǎng)，14天后測(cè)定菌落大小。數(shù)值代表各次測(cè)定中5個(gè)重復(fù)菌落的平均值。
表IX乙腈和丙烯腈的利用培養(yǎng)物生長(zhǎng)*菌落大小DAP 626 +++5.3mmDAP 115 +++6.3mmDAP 632 +++6.2mmDAP 623 +++5.0mmDAP 120 +/++aaDAP 629 +++5.3mm*生長(zhǎng)記分為++++繁茂，+++好，++良，+中等，+/-稀少，-無(wú)生長(zhǎng)a菌株DAP 120的生長(zhǎng)非常薄，但擴(kuò)散迅速，因此，不可能精確定量測(cè)定。
如表IX中所示，該菌株能利用乙腈和丙烯腈作為碳和氮的唯一來(lái)源。
4.3.用微生物從聚酰胺制備物中除去酰胺單體化合物的應(yīng)用和方法根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，提供了一種通過(guò)使酰胺單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的單體酸化合物(該酸化合物易于通過(guò)任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)分離方法從制備物中除去)，除去聚酰胺或聚合的酰胺制備物(該酰胺制備物中含有不需要或不想要的酰胺單體)中的酰胺單體的方法。例如，可將丙烯酰胺轉(zhuǎn)化成丙烯酸而作為銨鹽輕易除去。
該方法包括使含有不需要的酰胺單體化合物的聚酰胺或聚合的酰胺制備物，與如4.1.1和4.1.2節(jié)中所述多重誘導(dǎo)的有用微生物菌株的純培養(yǎng)物接觸足夠的時(shí)間，來(lái)將酰胺單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的酸。該方法對(duì)純化聚酰胺或聚合的酰胺制備物，如含有丙烯酰胺的聚丙烯酰胺制備物或共聚物特別有用。可根據(jù)本發(fā)明的該實(shí)施例處理任何含有不需要單體的聚酰胺或聚合的酰胺制備物，包括pH約2到小于6，優(yōu)選pH約3到約5，更優(yōu)選的pH約3到約4的陽(yáng)離子、陰離子和非離子聚酰胺制備物。有利的，可在pH小于約6.0，優(yōu)選pH約2到4，和最優(yōu)選pH約3到約4下處理含有酰胺單體的陽(yáng)離子聚酰胺或聚合酰胺，從而使陽(yáng)離子側(cè)鏈基團(tuán)在除去不需要的單體之前，不像pH被調(diào)整到約6或以上時(shí)那樣喪失其官能性。
受誘導(dǎo)的微生物菌株可以是正在生長(zhǎng)(即，正在活躍分裂)或正在休眠(即，不活躍分裂)或死亡的。當(dāng)方法需要使用活躍生長(zhǎng)的微生物培養(yǎng)物時(shí)，與聚酰胺或聚合的酰胺制備物接觸的條件應(yīng)能支持細(xì)菌生長(zhǎng)。這些條件包括例如，pH在2.0和11.0之間，優(yōu)選在約2.0和小于6.0之間；溫度在4℃和55℃之間，優(yōu)選在約15℃和37℃之間；溶氧張力飽和度在0.1％和100％之間，優(yōu)選在約4％和80％之間，更優(yōu)選在4％和40％之間，其中，可使用含氧或釋氧組合物來(lái)補(bǔ)充氧。含氧或釋氧組合物可以是空氣、純氧、過(guò)氧化氫、或其它能釋放氧的過(guò)氧化合物或其混合物。另外，可攪拌或不攪拌培養(yǎng)液，視溶氧張力為正或?yàn)樨?fù)。
當(dāng)方法需要使用不活躍分裂的微生物培養(yǎng)物時(shí)，與含有不需要酰胺單體的聚酰胺制備物接觸的條件應(yīng)能支持除酰胺(酶)的活性。例如，將溫度保持在約0℃和65℃之間，優(yōu)選約4℃和55℃之間。pH可以是堿性或酸性，而且最佳保持在約pH2到小于6的范圍內(nèi)。該具體實(shí)施例是可能的，因?yàn)轷０穯误w的除去不是生長(zhǎng)依賴性的，即，一旦誘導(dǎo)了除去酰胺的活性，不再需要微生物生長(zhǎng)來(lái)除去酰胺單體?？稍趨捬鯒l件下進(jìn)行該具體方式。
可將微生物的純培養(yǎng)物包裹或固定，而不是自由泳動(dòng)，以便于收集和重新使用。在一個(gè)優(yōu)選例中，將該微生物固定。可通過(guò)吸附、靜電結(jié)合、共價(jià)結(jié)合等，將純培養(yǎng)物固定在固相載體上以幫助從反應(yīng)混合物中回收微生物。合適的固相載體包括但不限于顆粒狀活性炭，灰泥、木材剩余產(chǎn)物(如木塊、熔核、鍘碎托板或樹(shù)木)，氧化鋁、釕、氧化鐵、離子交換樹(shù)脂(如AmberliteTMIRA-93或IRA-96(Rohm&Haas)，DowexTM(Dow Chemical Co，Inc.)，DEAE纖維素、DEAE-SEPHADEXTM(Pharmacia，Inc.)、陶瓷珠、交聯(lián)聚丙烯酰胺珠或塊或其它凝膠形式、海藻酸珠、κ-角叉菜膠塊以及由于其固有的磁性能從水溶液中被回收的固體顆粒。海藻酸珠可以是Ca++海藻酸珠或硬化的海藻酸珠。κ-角叉菜膠塊可以是硬化的κ-角叉菜膠塊。作為一個(gè)說(shuō)明性例子，可將海藻酸鈉溶液和氯化鈣與受誘導(dǎo)的微生物的純培養(yǎng)物混合，使微生物被固定在海藻酸珠中。在優(yōu)選例中，將受誘導(dǎo)的微生物固定在已用聚乙烯亞胺交聯(lián)的海藻酸珠中，或固定在聚丙烯酰胺型的聚合物中。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例，從聚酰胺或聚合的酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體的方法包括使按照本發(fā)明多重誘導(dǎo)的，有用的微生物菌株的純培養(yǎng)物的抽提物，與含有不需要的酰胺單體的聚酰胺或聚合酰胺制備物接觸足夠時(shí)間，來(lái)將酰胺單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的酸。優(yōu)選的，該抽提物是一種微生物的粗抽提物。制備微生物的抽提物可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，包括但不限于下列方法通過(guò)超聲、碾壓、使用弗氏壓碎器等，來(lái)打碎受誘導(dǎo)的微生物的純培養(yǎng)物樣品中的細(xì)胞，產(chǎn)生細(xì)胞裂解液。過(guò)濾或離心裂解液，以除去細(xì)胞碎片和未裂解的細(xì)胞，得到粗抽提物。也可如上所述象完整細(xì)胞那樣，固定裂解物，或用固定酶所用的已知技術(shù)固定。
在如上所述本發(fā)明應(yīng)用的具體說(shuō)明性實(shí)施例中，使用了該除去方法來(lái)將聚丙烯酰胺制備物中不需要的丙烯酰胺單體轉(zhuǎn)化成丙烯酸。使本文所述經(jīng)多重誘導(dǎo)和固定的有用微生物菌株的純培養(yǎng)物或抽提物，與含有不需要的丙烯酰胺單體的聚丙烯酰胺制備物(所述制備物具有約2到小于6的pH)接觸足夠時(shí)間，來(lái)減少聚丙烯酰胺制備物中的丙烯酰胺單體量至100ppm以下。另外，使本文所述經(jīng)多重誘導(dǎo)和固定的有用微生物菌株的純培養(yǎng)物或抽提物，在約2到小于6的pH下，同時(shí)與丙烯酰胺單體制備物和聚合劑(導(dǎo)致酰胺單體聚合成聚丙烯酰胺的試劑)接觸，從而使剩余的丙烯酰胺單體(在聚合反應(yīng)后)轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的丙烯酸。這些聚合劑包括但不限于過(guò)硫酸鹽、硫酸鹽、溴酸鹽、鹽酸鹽、過(guò)氧化物或其混合物等試劑。聚丙烯酰胺制備物中丙烯酰胺單體的濃度可高達(dá)100,000ppm，而且通常在不足10,000ppm到約40,000ppm，用本發(fā)明的方法，可將丙烯酰胺單體的水平降低到1000ppm以下，優(yōu)選降到100ppm以下。
優(yōu)選抽提物是一種微生物菌株的粗抽提物。本申請(qǐng)上文中描述了制備微生物菌株抽提物的方法。優(yōu)選使用上文4.2節(jié)所述，受誘導(dǎo)的微生物的純培養(yǎng)物或抽提物。另外，使用了4.1.3節(jié)中所述篩選方法鑒定的，能從聚丙烯酰胺制備物中除去酰胺單體化合物的微生物的純培養(yǎng)物或抽提物。任選的，可用本領(lǐng)域已知的酶純化方法，如離子交換柱層析，在接觸前進(jìn)一步純化該粗抽提物。
在一個(gè)優(yōu)選例中，固定了微生物菌株或其抽提物。在本申請(qǐng)上文中描述了固定微生物菌株或其抽提物的方法。更優(yōu)選的，將誘導(dǎo)的微生物或其抽提物固定在聚乙烯亞胺交聯(lián)的海藻酸珠中，或固定在聚丙烯酰胺型聚合物或DowexTM(DowChemical Co.，Inc.)，一種離子交換樹(shù)脂上。另外，在另一個(gè)實(shí)施例中，將微生物或其抽提物固定在材料的平坦表面上。使聚酰胺(如聚丙烯酰胺制備物)通過(guò)具有固定化微生物或其抽提物的平坦表面。在一個(gè)實(shí)施例中，聚酰胺制備物是水相制備物。在一個(gè)說(shuō)明性實(shí)施例中，平坦表面是材料的一薄板形式，或一系列薄板，在其上固定了誘導(dǎo)的微生物或抽提物。在一實(shí)施例中，通過(guò)簡(jiǎn)單的使新制備物從平坦表面流過(guò)，可輕易的重新使用固定的多重誘導(dǎo)的微生物或抽提物，而且不需要從聚酰胺產(chǎn)物中回收多重誘導(dǎo)的微生物或其抽提物。固定化能最大限度的保持和重新使用微生物或其抽提物，來(lái)除去更多單體，從而減少了使用的微生物或其抽提物的量，從而降低了成本。另外，混合對(duì)賦予額外能量的需要和對(duì)聚酰胺制備物中微生物或其抽提物的量的需要降至最小。還有，通過(guò)接觸酰胺單體制備物和聚合劑以及交聯(lián)劑來(lái)固定微生物或其抽提物，從而使微生物或其抽提物固定在所得到的聚酰胺制備物中，而除去其中剩余的酰胺單體。
另外，在聚丙烯酰胺制備物的制造中，也可能存在不需要的剩余單體腈化合物，除存在的剩余酰胺單體化合物外，上文詳述的除去方法也可使這些腈單體化合物轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的酸化合物，從而易于以其鹽形式被除去。
根據(jù)本發(fā)明可使用任何能使誘導(dǎo)的微生物菌株和含有聚酰胺和單酰胺的化合物接觸的方法。這些接觸方法包括但不限于在密封容器或器皿中接觸，或與含有誘導(dǎo)的菌株的裝置接觸等。
本發(fā)明的方法還可包括通過(guò)用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法，如用帶有火焰電離探頭的氣—液色譜(GLC-FID)檢測(cè)酰胺，和高效液相層析(HPLC)檢測(cè)對(duì)應(yīng)酸化合物，來(lái)評(píng)估單酰胺化合物的消失和/或?qū)?yīng)酸化合物的同時(shí)出現(xiàn)，監(jiān)測(cè)單酰胺化合物轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的酸化合物。轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的酸導(dǎo)致各原先存在的酰胺基團(tuán)產(chǎn)生可化學(xué)計(jì)量的氨。可用Fawcett和Scott，1960，臨床病理學(xué)，13156-159的技術(shù)測(cè)量銨釋放量，來(lái)監(jiān)測(cè)酰胺化合物轉(zhuǎn)化的程度。如果由于氨或銨鹽的存在，不能測(cè)量氨釋放，那么可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，包括但不限于GLC-FID等來(lái)監(jiān)測(cè)存在的酰胺的濃度。另外，可通過(guò)評(píng)估對(duì)應(yīng)酸化合物的產(chǎn)生(可衍生酸化合物并用GLC-FID檢測(cè)該衍生產(chǎn)物來(lái)監(jiān)測(cè))來(lái)測(cè)定酰胺化合物的消失。如果先己烷基化、酯化或甲硅烷基化，可衍生酰胺和酸，用于GLC-FID分析(一般見(jiàn)，Supelco層析產(chǎn)物分類(lèi)，1997，653-656頁(yè)(Supelco Inc.，Bellefonte PA))。
含有不需要的酰胺單體的聚酰胺或聚合酰胺制備物可以是固體、液體、和/或氣體形式。當(dāng)聚酰胺制備物是氣體和/或液體形式時(shí)，可以將其吸附到材料，如固體上。
可通過(guò)例如，賦予機(jī)械能量，如攪拌；賦予聲學(xué)能量，如在液體中設(shè)置持續(xù)聲波；或賦予電場(chǎng)或靜電場(chǎng)來(lái)賦予能量。
可在不同時(shí)間點(diǎn)采樣并通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，如GLC-FID等測(cè)量酰胺單體或聚酰胺或聚合的酰胺化合物的濃度。
4.3.1.操作方式可以各種方式，包括分批方式，依次分批方式，或半連續(xù)方式，和用生物濾膜流通方式，來(lái)實(shí)施從聚酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體化合物的方法。
在所有操作方式中，可定時(shí)取出樣品內(nèi)容物，來(lái)監(jiān)測(cè)感興趣化合物的除去情況。另外，攪動(dòng)和/或混合反應(yīng)內(nèi)容物可導(dǎo)致發(fā)泡。就此而言，可加入抗發(fā)泡劑來(lái)防止發(fā)泡。合適的抗發(fā)泡劑包括含有抗發(fā)泡乳劑(如，DowANTIFOAM-A_；基于硅的抗發(fā)泡劑)的硅。
4.3.1.1.分批方式操作分批方式操作需要將含有不需要的酰胺單體化合物的液體置于一容器(如生物反應(yīng)器)中，用4.1節(jié)中所述誘導(dǎo)的微生物接種，培養(yǎng)混合物以培養(yǎng)能除去不需要的酰胺單體化合物的微生物。在預(yù)定時(shí)間后，停止培育，取出內(nèi)容物，如果存在固體，可通過(guò)過(guò)濾將其從液體中分離出來(lái)。然后可從固相和液相中取出樣品并用GLC-FID測(cè)試，來(lái)評(píng)估單酰胺化合物的水平，并確定單酰胺化合物已被除去。隨后對(duì)反應(yīng)物固體進(jìn)行脫水，并進(jìn)一步加工成填埋廢渣或可作為接種的細(xì)菌菌種，用于下一批方式。在分批方式中，重新以約2％-40％重量或體積，優(yōu)選約5％-20％加入脫水固體殘余物?？蓪⒖諝饣蜓鯕獗萌敕磻?yīng)物中，并機(jī)械攪動(dòng)生物反應(yīng)器中的內(nèi)容物。
4.3.1.2.依次分批方式操作與分批方式相同操作依次分批方式，除了在培育期結(jié)束后將反應(yīng)物沉降一段時(shí)間，通常約15分鐘，并除去反應(yīng)內(nèi)容物頂部的60％-95％，剩下底部沉降的固體(如存在)，作為下一批中和液體的接種物。優(yōu)選除去70％和90％之間的內(nèi)容物。依次分批方式是除去含有不需要酰胺單體的液體的一種優(yōu)選實(shí)施方案，因?yàn)闇p少了滯后或馴化期，在反應(yīng)物中保留了高水平的生物物質(zhì)，更好的容納了廢料進(jìn)樣組合物中的變化性，大大減少了生物處理后剩余的殘余固體。
4.3.1.3.半—連續(xù)/連續(xù)方式半—連續(xù)/連續(xù)方式與分批和依次分批方式相似。然而，不在預(yù)定時(shí)間后停止培育，而是將含有不需要酰胺單體的新鮮液體以一段給定時(shí)間內(nèi)的固定量泵入生物反應(yīng)器，而將處理后的液體從生物反應(yīng)器中抽出。這提供了不需要停止除去過(guò)程的連續(xù)液體處理。
4.3.2.生物濾膜可用生物濾膜來(lái)從廢料如空氣、水蒸氣、煙霧、和水或水溶液中的聚酰胺或聚合酰胺制備物中除去酰胺單體化合物。例如，如果存在揮發(fā)性酰胺單體，可從發(fā)現(xiàn)它們的固體或水溶液中除去該揮發(fā)物，并以將揮發(fā)物捕獲在生物濾膜中的方式來(lái)實(shí)施這些步驟。一旦揮發(fā)物被捕獲，可將其與多重誘導(dǎo)的微生物菌株的純培養(yǎng)物或抽提物接觸，來(lái)除去單酰胺化合物?？捎媒?jīng)典型生物濾膜，其中使含有聚酰胺制備物(含不需要的酰胺單體)的空氣通過(guò)生物濾膜裝置?？捎娩噶鞔采餅V膜，其中使含有不需要的酰胺單體的空氣和水相聚酰胺溶液通過(guò)生物濾膜裝置。
生物濾膜可包括具有上述方法誘導(dǎo)的微生物的純培養(yǎng)物或其抽提物，固定于固相載體上的裝置。微生物可以是正在活躍分裂或不活躍分裂的。該微生物也可在與生物濾膜結(jié)合前已凍干。合適的固相載體包括但不限于顆粒狀活性碳、灰泥、木材剩余產(chǎn)物(如木塊、熔核、鍘碎托板或樹(shù)木)，氧化鋁、釕、氧化鐵、離子交換樹(shù)脂(如AmberliteTMIRA-93或IRA-96(Rohm&Haas)，DowexTM(Dow Chemical Co，Inc.)，DEAE纖維素、DEAE-SEPHADEXTM(Pharmacia，Inc.)、陶瓷珠、聚丙烯酰胺珠、海藻酸珠、κ-角叉菜膠塊以及由于其固有的磁性能從水溶液中回收的固體顆粒。優(yōu)選的固相載體是聚乙烯亞胺交聯(lián)的海藻酸珠。另外，可將微生物或其抽提物固定在材料的平坦表面上。生物濾膜裝置可具有流入和流出口，從而使要處理的材料可流過(guò)該裝置。優(yōu)選的，粘著在固相載體上的微生物選自具有ATCC登錄號(hào)55899，55898，55722，55723，55726，55727，55724，和55725的微生物，它們已如上文所述受過(guò)誘導(dǎo)。
在一方法中，可采用此生物濾膜，此法包括使含有聚酰胺或聚合酰胺制備物和不需要的酰胺單體化合物的廢液，流過(guò)含有上述誘導(dǎo)的微生物的純培養(yǎng)物，或其抽提物(固定在固相載體上的)的裝置的生物濾膜。該方法還可包括監(jiān)測(cè)廢液，來(lái)確定確實(shí)已除去了酰胺單體化合物。優(yōu)選的粘著在固相載體上的微生物選自具有ATCC登錄號(hào)55899，55898，55722，55723，55726，55727，55724和55725的微生物，其已如上所述受過(guò)誘導(dǎo)。
僅為了說(shuō)明，而不是為了在任何方面限制本發(fā)明的范圍，給出了下列實(shí)施例。
5.實(shí)施例完整細(xì)胞在聚丙烯酰胺中的固定將紅球菌菌株DAP 96253的完整細(xì)胞固定在聚丙烯酰胺中，將細(xì)胞錨定在穩(wěn)定的基質(zhì)中。另外，聚丙烯酰胺提供了機(jī)械完整性和強(qiáng)度，這導(dǎo)致將細(xì)胞更有效的保持在反應(yīng)容器中，并能穩(wěn)定細(xì)胞中的酰胺酶活性。
將10克DAP96253多重誘導(dǎo)的細(xì)胞(濕重)懸浮在40毫升蒸餾水中。將這40毫升細(xì)胞加到含有4.5克丙烯酰胺和0.5克N-，N-亞甲基雙丙烯酰胺的蒸餾水中。在該80毫升溶液中，加入5毫升α-二甲基氨基丙腈和10毫升2.5％的過(guò)硫酸鉀溶液，猛烈攪拌得到的混合物，然后將其置于冰上。在溶液聚合后，將聚合溶液切成小塊，用蒸餾水洗滌，除去任何未聚合的單體。
6.從陽(yáng)離子聚丙稀酰胺制備物中除去污染的丙烯酰胺單體6.1固定化抽提物的使用在一系列實(shí)驗(yàn)中，將如上文4.1節(jié)所述，在補(bǔ)充了150ppm的丙烯腈，150ppm的乙腈和50ppm的琥珀腈的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)細(xì)胞，獲得多重誘導(dǎo)的DAP96253細(xì)胞的粗抽提物，將其固定在DOWEXTM離子交換樹(shù)脂(Dow Chemical Co.，Inc.)上。直接將固定化的抽提物加到pH約3.5的商品陽(yáng)離子聚丙烯酰胺制備物中。將制備物和固定化抽提物25℃-27℃混合2小時(shí)，來(lái)進(jìn)行該反應(yīng)。
2小時(shí)后，陽(yáng)離子聚丙烯酰胺制備物中的剩余丙烯酰胺單體濃度降低了約50％到60％。
在另一系列實(shí)驗(yàn)中，如下獲得了多重誘導(dǎo)的DAP 96253細(xì)胞的細(xì)胞粗抽提物。如上文4.1節(jié)所述，在補(bǔ)充了150ppm乙腈、150ppm的丙烯腈和50ppm的琥珀腈的完全營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中多重誘導(dǎo)細(xì)胞。收獲細(xì)胞，洗滌并重懸浮在磷酸緩沖鹽中。裂解多重誘導(dǎo)的細(xì)胞，如4.1節(jié)中所述，獲得了該細(xì)胞的粗抽提物。
如下將粗抽提物固定在DOWEXTM離子交換樹(shù)脂(Dow Chemical Co.，Inc.)上。用50％乙醇預(yù)洗1克DOWEXTMWR2陰離子樹(shù)脂，然后與150微克的粗抽提物接觸，使其反應(yīng)并洗滌兩次。評(píng)估固定化粗抽提物在pH7，30℃將丙烯酰胺轉(zhuǎn)化成丙烯酸的能力，測(cè)定了固定化粗抽提物的酰胺酶活性。該固定化抽提物顯示了20單位/克的酰胺酶活性(1單位等于在pH7，30℃每分鐘轉(zhuǎn)化1微摩爾丙烯酰胺)。
直接在兩種不同的商品陽(yáng)離子聚丙烯酰胺制備物(Cytec Industries，Stamford，CT)(各具有小于4的pH，并具有剩余濃度為1000-1100ppm的單丙烯酰胺)中加入約0.5克固定化抽提物(10.3單位)。將制備物與固定化抽提物混合進(jìn)行反應(yīng)，并在各時(shí)間點(diǎn)取樣，用氣—液色譜測(cè)定丙烯酰胺濃度。
360分鐘內(nèi)，第一陽(yáng)離子聚丙烯酰胺制備物中的剩余丙烯酰胺單體濃度降到了1ppm以下。在第二制備物中，360分鐘內(nèi)，丙烯酰胺單體的濃度降到了約400ppm。
在另一系列實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)該具體抽提物未固定時(shí)，該具體抽提物在pH小于4時(shí)，不顯示具有除去單酰胺的活性。
6.2固定化微生物的使用將如上文13節(jié)中所述獲得的多重誘導(dǎo)的細(xì)胞DAP 96253固定在DOWEXTM離子交換樹(shù)脂(Dow Chemical Co.，Inc.)上。將固定化細(xì)胞直接加到商品陽(yáng)離子聚丙烯酰胺制備物中，其pH為約3.5。將制備物與固定化細(xì)胞在環(huán)境溫度(如25-27℃)下混合足夠時(shí)間(如2小時(shí))，進(jìn)行反應(yīng)，并監(jiān)測(cè)酰胺單體的濃度。
7.微生物保藏1996年12月10日，將下列菌種保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，(ATCC)，Rockvill，MD，并指定了登錄號(hào)微生物ATCC登錄號(hào)紅球菌亞種DAP 96253 55899紫紅紅球菌DAP 96622 558981995年11月30日，將下列菌種保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，(ATCC)，Rockvill，MD，并指定了登錄號(hào)微生物ATCC登錄號(hào)DAP 623 55722DAP 626 55723DAP 629 55726DAP 632 55727DAP 115 55724DAP 120 55725本文描述的和要求權(quán)利的本發(fā)明范圍不受本文公開(kāi)的具體實(shí)施例的限制，因?yàn)檫@些實(shí)施例只是本發(fā)明幾個(gè)方面的說(shuō)明。任何等價(jià)實(shí)施例都將在本發(fā)明的范圍內(nèi)。事實(shí)上，除本文顯示和描述的例子以外，對(duì)本發(fā)明的各種修改從前面的描述來(lái)看，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。這些修改也將落在權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本文引用了一些文獻(xiàn)，在此全部引入以供參考。
國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT//
PCT/RO/134表(1981年1月)國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT//PCT/RO/134表(續(xù))美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心10801 University Blvd.Manassas，VA 20110-2209美國(guó)登錄號(hào)保藏日期55723 1995年11月28日55724 1995年11月28日55725 1995年11月28日55726 1995年11月28日55727 1995年11月28日55898 1996年12月11日55899 1996年12月11日
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)將酰胺單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的酸，而從含有所述單體的聚酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體的方法，其特征在于，該方法包括使多重誘導(dǎo)的微生物的純培養(yǎng)物或抽提物與含有酰胺單體的聚酰胺制備物接觸足夠時(shí)間，將κ-酰胺單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的酸，所述聚酰胺制備物具有約2到小于6的pH。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述純培養(yǎng)物或抽提物被包裹或固定。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述純培養(yǎng)物或抽提物被固定在選自顆粒狀活性炭、木片、氧化鋁、釕、氧化鐵、陶瓷珠、海藻酸珠、κ-角叉菜膠塊和離子交換樹(shù)脂的固相載體上。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)物或抽提物被固定在平坦表面上。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚酰胺制備物是聚丙烯酰胺制備物。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物選自具有美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心登錄號(hào)55899、55898、55722、55723、55726、55727、55724和55725的微生物，而且所述微生物已被多重誘導(dǎo)。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)一種方法，所述方法包含在補(bǔ)充了含有濃度各為約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度各為約50ppm的琥珀腈和富馬腈的至少一種的腈化合物的混合物的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所述微生物的純培養(yǎng)物，來(lái)獲得多重誘導(dǎo)的微生物。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和約50ppm的琥珀腈的腈化合物的混合物。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還補(bǔ)充有約1-10ppm的KCN或NaCN。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)一種方法，該方法包含在補(bǔ)充了含有(a)約50ppm的琥珀腈、約150ppm的乙腈和約150ppm的丙烯腈的至少一種和(b)各150ppm的乙酰胺和丙烯酰胺的，腈和酰胺化合物的混合物的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所述微生物的純培養(yǎng)物，獲得多重誘導(dǎo)的微生物。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有約50ppm的琥珀腈和約150ppm的乙酰胺和約150ppm丙烯酰胺的腈和酰胺化合物的混合物。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還補(bǔ)充有約1-10ppm的KCN或NaCN。
13.一種通過(guò)將酰胺單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)酸，從含有所述單體的聚酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體的方法，其特征在于，該方法包括在約2到小于6的pH下，使多重誘導(dǎo)的微生物的純培養(yǎng)物或抽提物，與酰胺單體和聚合劑接觸。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述純培養(yǎng)物或抽提物是被包裹或固定的。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述純培養(yǎng)物或抽提物被固定在選自顆粒狀活性炭、木片、氧化鋁、釕、氧化鐵、陶瓷珠、海藻酸珠、κ-角叉菜膠塊和離子交換樹(shù)脂的固相載體上。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)物或抽提物被固定在平坦表面上。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述酰胺單體是丙烯酰胺。
18.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述微生物選自具有美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心登錄號(hào)55899、55898、55722、55723、55726、55727、55724和55725的微生物，而且所述微生物已被多重誘導(dǎo)。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，通過(guò)一種方法，該方法包括在補(bǔ)充了含有濃度各為約150ppm的乙腈和丙烯腈，和濃度各為約50ppm的琥珀腈和富馬腈的至少一種的腈化合物的混合物的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所述微生物的純培養(yǎng)物，來(lái)獲得多重誘導(dǎo)的微生物。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有各約150ppm的乙腈和丙烯腈，和約50ppm的琥珀腈的腈化合物的混合物。
21.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還補(bǔ)充有約1-10ppm的KCN或NaCN。
22.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，通過(guò)一種方法，該方法包括在補(bǔ)充了含有(a)約50ppm的琥珀腈、約150ppm的乙腈和約150ppm的丙烯腈的至少一種和(b)各150ppm的乙酰胺和丙烯酰胺的，腈和酰胺化合物的混合物的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所述微生物的純培養(yǎng)物，獲得多重誘導(dǎo)的微生物。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有約50ppm的琥珀腈和約150ppm的乙酰胺和約150ppm丙烯酰胺的腈和酰胺化合物的混合物。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還補(bǔ)充有約1-10ppm的KCN或NaCN。
25.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺制備物含有濃度約1,000-40,000ppm的丙烯酰胺單體。
26.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺制備物還含有不需要的腈單體，而且通過(guò)將單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)酸除去了所述腈單體。
27.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺制備物還含有不需要的腈單體，而且通過(guò)將單體轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)酸除去了所述腈單體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了在約2到約6的pH下,通過(guò)使用能將酰胺分子轉(zhuǎn)化成酸分子的誘導(dǎo)的微生物菌株的純培養(yǎng)物,將酰胺單體化合物轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)酸化合物,而從聚酰胺或聚合酰胺制備物中除去不需要的酰胺單體化合物的方法。
文檔編號(hào)C02F3/12GK1307595SQ99807801
公開(kāi)日2001年8月8日 申請(qǐng)日期1999年6月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月25日
發(fā)明者G·E·皮爾斯 申請(qǐng)人:Cytec技術(shù)有限公司