一種利用廣宿主自轉(zhuǎn)移降解質(zhì)粒對石油污染土壤進行生物修復的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及屬于分子生物學技術和污染土壤修復技術交叉領域，具體的說是一種 利用廣宿主（Broad host range，BHR)自轉(zhuǎn)移降解質(zhì)粒對石油污染土壤進行生物修復的方 法。
【背景技術】
[0002] 石油是一種含有多種烴類（正烷烴、支鏈烷烴、芳香烴、脂環(huán)烴）及少量其他有機物 (硫化物、氮化物、環(huán)烷酸類等)的復雜混合物，是人類最主要的能源之一。但是，隨著石油開 采和使用量的增加，大量的石油及其加工品進入環(huán)境，其中原油開采和冶煉過程中的工業(yè) 污水排放和溢油泄漏事故是導致土壤石油烴污染的主要原因，不僅破壞了生態(tài)環(huán)境，還可 通過食物鏈的生物富集作用而直接危害人類健康。特別是多環(huán)芳經(jīng)（Polycyclic Aromatic Hydrocarbon，PAHs)，由于其生物可利用度差、半衰期較長，并且大多具有致畸、致癌和致突 變效應，因此成為人類健康的巨大威脅。我國石油工業(yè)發(fā)展迅速，但也隨之帶來嚴重的環(huán)境 污染問題，有近千萬畝的耕地受到不同程度的石油烴污染。
[0003] 環(huán)境中的微生物由于其高度的遺傳多樣性和功能多樣性，在污染物降解過程中發(fā) 揮著重要作用，從實驗室分離高效功能微生物并投加到環(huán)境中加速污染物的代謝是目前主 要采用的微生物修復方式。但由于接種的高效降解菌與土著微生物在營養(yǎng)和空間上的競爭 及環(huán)境中的各種不利條件，往往導致接種的功能微生物很難存活，不能持久發(fā)揮生物修復 作用。這一問題成為制約生物修復技術高效、持久發(fā)揮作用的"瓶頸"。為解決上述"瓶頸" 問題，有學者提出接種攜帶特定降解基因的可移動基因原件，其中包括廣宿主可自轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒（Self-transmissible broad host range plasmids)，接種后，隨著廣宿主代謝質(zhì)粒在環(huán) 境中的水平基因轉(zhuǎn)移，降解基因轉(zhuǎn)移至土著細菌并在其中表達，可使具有競爭性的土著微 生物獲得降解能力，從而持久發(fā)揮降解石油烴的功能。這種由廣宿主質(zhì)粒水平基因轉(zhuǎn)移介 導的生物修復提出了與傳統(tǒng)生物修復技術完全不同的思路和概念，有望成為一種新的污染 物生物修復途徑。
[0004] 水平基因轉(zhuǎn)移是指在差異生物個體之間所進行的水平遺傳物質(zhì)的交流。原核生物 之間的水平基因轉(zhuǎn)移主要有3種機制：轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導和接合轉(zhuǎn)移，其中由廣宿主可自我轉(zhuǎn)移質(zhì) 粒介導的接合轉(zhuǎn)移是最為常見和廣泛的基因水平轉(zhuǎn)移方式。所謂的"廣宿主質(zhì)粒"被定義為 至少能夠在Proteobacteria兩個亞綱（例如β-, Y-)之間互相轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定傳代的質(zhì)粒。 廣宿主質(zhì)粒的結構一般由兩個區(qū)域組成，一個是質(zhì)粒骨架(與質(zhì)粒的復制、穩(wěn)定性和可轉(zhuǎn)移 性有關)，一個是裝配基因（能夠賦予宿主特定的表型，例如抗藥性、金屬抗性、降解污染物 特性等)，這兩個區(qū)域一般形成"嵌合"結構。在污染土壤這一獨特生境中，由廣宿主質(zhì)粒介 導的細菌之間的基因交流在加速污染物代謝和菌群適應污染環(huán)境的過程中發(fā)揮著非常重 要的作用。對于采用廣宿主自轉(zhuǎn)移質(zhì)粒對石油烴污染環(huán)境進行綜合治理，目前尚未見比較 成熟的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供一種利用廣宿主自轉(zhuǎn)移降解質(zhì)粒對石油污染土壤進行生物 修復的方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：
[0007] -種利用廣宿主自轉(zhuǎn)移降解質(zhì)粒對石油污染土壤進行生物修復的方法，將攜帶含 有石油烴降解基因和遺傳選擇標記的廣宿主自轉(zhuǎn)移降解質(zhì)粒的宿主菌接種到待處理的污 染土壤中，并添加營養(yǎng)液，通過微生物間的接合轉(zhuǎn)移作用，使廣宿主自轉(zhuǎn)移質(zhì)粒所攜帶的降 解基因發(fā)揮高效降解作用，進而達到持久修復石油烴污染土壤的目的。
[0008] 所述營養(yǎng)液成分為：(NH4) 2S040. 5g/L，NaNO3O. 5g/L，MgSOJH2OO. 2g/L，KH2PO4L Og/ L 和 NaH2PO4H2O 1.0 g/L ;營養(yǎng)液的添加量為 100-150ml/kg 干土。
[0009] 所述遺傳選擇標記為：抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因（IacZ)或綠色熒光 蛋白基因（gfp)。
[0010] 所述石油烴降解基因為：編碼芳香環(huán)羥化雙加氧酶基因（phdA)、甲苯單加氧酶基 因（touA)、編碼苯雙加氧酶基因（ben)、編碼甲苯雙加氧酶基因（tod)中一種或幾種。
[0011] 所選用廣宿主自轉(zhuǎn)移降解質(zhì)粒，
[0012] 含有石油烴降解基因并帶有用于鑒定接合子的遺傳選擇標記；能夠在變形菌^!- Proteobacteria, β-Proteobacteria, Y-Proteobacteria 不同亞綱之間轉(zhuǎn)移并穩(wěn)定傳代； 同時是基因組大小在50kb以上的嵌合結構，包括質(zhì)粒骨架（與質(zhì)粒的復制、穩(wěn)定性和可轉(zhuǎn) 移性有關）和裝配基因，裝配基因含有與石油烴降解相關的基因。
[0013] 具體是，PS3-2G質(zhì)粒，大小為106kb ;其抗生素標記為抗卡那霉素（KmK)，降解基因 為芳香環(huán)輕化雙加氧酶基因（phdA)、苯雙加氧酶基因（ben)、二甲苯單加氧酶基因（touA)、 水楊酸羥化酶基因（nahG)、鄰苯二酚2, 3-雙加氧酶基因（C230);pS7-2G質(zhì)粒，大小為65kb ; 其遺傳標記為β -半乳糖苷酶基因（lacZ)，降解基因為芳香環(huán)羥化雙加氧酶基因（phdA)、 苯雙加氧酶基因（ben)、二甲苯單加氧酶基因（touA)、水楊酸輕化酶基因（nahG)、鄰苯二酚 2, 3-雙加氧酶基因（C230);pA23-lG質(zhì)粒，大小為72kb ;其抗生素標記為抗卡那霉素（KmK)， 降解基因為芳香環(huán)羥化雙加氧酶基因（phdA)、苯雙加氧酶基因（ben)、二甲苯單加氧酶基 因（touA)、水楊酸羥化酶基因（nahG)、鄰苯二酚2, 3-雙加氧酶基因（C230) ;pW22-3G質(zhì) 粒，大小為77kb ;其遺傳標記為綠色熒光蛋白（gfp)，降解基因為芳香環(huán)羥化雙加氧酶基因 (phdA)、苯雙加氧酶基因（ben)、二甲苯單加氧酶基因（touA)、水楊酸輕化酶基因（nahG)、 鄰苯二酚2, 3-雙加氧酶基因（C230) ;pA15-7G質(zhì)粒，分離自石油污水灌渠底泥，大小為 85kb;其抗生素標記為抗卡那霉素（KmK)，降解基因為苯雙加氧酶基因（ben)、二甲苯單加氧 酶基因（touA)、水楊酸羥化酶基因（nahG)、鄰苯二酚2, 3-雙加氧酶基因（C230) ;pA10-lC 質(zhì)粒，大小為55kb ;其抗生素標記為抗四環(huán)素（TcK)，降解基因為芳香環(huán)羥化雙加氧酶基因 (phdA)、苯雙加氧酶基因（ben)、二甲苯單加氧酶基因（touA)。以上質(zhì)粒DNA均可在中國 科學院沈陽應用生態(tài)研究所菌種保藏中心購得（http://www. iae. ac. cn/2007/0024039. html)，相應編號為 pS3-2G，pS7-2G，pA23-lG，pW22-3G，pA15-7G，pA10-lC。
[0014] 所述宿主菌可選自變形菌a-，β-，Y-Proteobacteria任一亞綱菌株。宿主菌染 色體帶有利福霉素抗性（Rif K)選擇標記。
[0015] 具體宿主菌為：根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens) C58 (利福平抗性） 【W(wǎng)ood DWj Setubal JCj Kaul Rj Monks DE，et al. The genome of the natural genetic engineer Agrobacterium tumefaciens C58. Science，2001，2317-2323】；惡臭假單胞菌 (Pseudomonas putida) UWCl (利福平抗性）【W(wǎng)innie Dejonghe，Johan Goris，Sa'id el Fantroussij Monica HoftejPaul de VosjWilly Verstraetej and Eva M. Top. Effect of Dissemination of2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid(2, 4_D)Degradation Plasmids on2,4_D Degradation and on Bacterial Community Structure in Two Different Soil Horizons. Applied and Enironmental Microbiology，2000, 3297-3304】；鉤蟲貪銅菌 (C