專利名稱：分子微陣列及其制備方法和用途的制作方法
相關(guān)申請(qǐng)的相互參考本專利申請(qǐng)要求的優(yōu)先權(quán)申請(qǐng)是申請(qǐng)日為1999年11月2日、申請(qǐng)?zhí)枮?0/172,243的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)，該申請(qǐng)的公開內(nèi)容在此作為參考全部并入文本。
第二種方法是將分子傳送到固相基片的不連續(xù)位點(diǎn)上并通過共價(jià)或非共價(jià)鍵進(jìn)行固定。在一個(gè)稱作“斑點(diǎn)印跡”的方法中，分子被人為地(諸如利用微量移液管)分配到固相支持體的特定位點(diǎn)上。其后開發(fā)的一些方法具有改進(jìn)的分配效率，例如那些利用真空裝置或大頭針來分配材料的96孔微滴定板形式的方法。然而，這些方法的實(shí)施是費(fèi)力的且相當(dāng)不精確，只適合于形成有限量的具有相對(duì)大斑點(diǎn)的陣列。
最近，業(yè)已開發(fā)出若干自動(dòng)化系統(tǒng)，用以傳送許多少量的樣品，從而形成陣列。(US專利號(hào)5,807,522，Brown 1998)描述了一種通過利用自動(dòng)化分配裝置傳送分子而形成大量的微體積陣列的方法，其中該自動(dòng)化分配裝置能夠在不滲透的固相表面上沉積選擇體積量在0.002至2n1之間的溶液。該方法要求高尖端的機(jī)械工程設(shè)備，而且還不能解決有關(guān)獲得可重復(fù)的、高度均勻陣列方面的許多困難。例如，利用該方法，難以精確控制每個(gè)點(diǎn)上的固定反應(yīng)，從而難以獲得高度重復(fù)的陣列。造成該問題的一個(gè)原因是，難以獲得或制備出在貫穿相對(duì)大的表面上都化學(xué)均一的基片，從而導(dǎo)致表面的不同區(qū)域中的化學(xué)性質(zhì)不一致。另外，因?yàn)槊總€(gè)點(diǎn)上所分配的體積相當(dāng)小，所以難以控制蒸發(fā)，從而影響反應(yīng)物的濃度并進(jìn)而影響反應(yīng)速率。而且，部分由于以上提到的化學(xué)不一致性，因此還難以在整個(gè)表面上保持恒定的溫度。這樣，在表面的不同區(qū)域可發(fā)生不同溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響。
第三種方法，在(US專利號(hào)5,605,662，Heller等人，1997)中有所描述，其包括利用具有多個(gè)電極的程序裝置，每個(gè)電極既可帶正電荷也可帶負(fù)電荷，借此集中了帶相反電荷的分子而排斥了帶相同電荷的分子，從而增大了反應(yīng)效率和特異性。該裝置利用電場將分子傳輸?shù)剿x擇的位點(diǎn)上并使反應(yīng)容易進(jìn)行，而且將測(cè)定和反應(yīng)設(shè)計(jì)為自動(dòng)化運(yùn)行，而無需人工介入。在該方法中，由醛官能團(tuán)標(biāo)記的寡核苷酸被集中在所選擇的位點(diǎn)上并且通過與基片上的氨丙基三羥乙基反應(yīng)而共價(jià)結(jié)合到基片上。然而，該裝置被設(shè)計(jì)成一次形成一個(gè)微陣列，并且更適合于形成具有相對(duì)少量位點(diǎn)的微陣列。而且，該方法不能控制交叉污染的程度，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的背景噪音。上述方法的問題還在于不能提供在基片上獲得均一性的方式，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生偏差。
US專利號(hào)5,900,481涉及包括至少一種與固相支持體共軛結(jié)合并且還與至少一種核酸共軛結(jié)合的玻珠的組合物。
此處提到的所有出版物和專利公開文本全部并入作為本文的參考文獻(xiàn)。
因此，本發(fā)明提供了一種微陣列，其包括(a)一個(gè)基片，其中該基片用以下物質(zhì)衍生化i)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及至少一層包括多個(gè)第二官能團(tuán)的交聯(lián)化合物，或者ii)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及包括多個(gè)第二官能團(tuán)的聚合膜；以及(b)或者i)一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，其中這個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體通過本體與第二官能團(tuán)的偶聯(lián)，而與基片上的一個(gè)不同地址締合，或者ii)一個(gè)微粒群，其中該微粒群偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體，并且該微粒群通過第二官能團(tuán)與微粒的偶聯(lián)，而與基片上的一個(gè)不同地址締合，從而該至少一種感興趣的本體占據(jù)了基片上的一個(gè)不同地址。
本發(fā)明的另一方面是，提供了一種微陣列，該微陣列包括(a)一個(gè)基片；以及(b)一個(gè)微粒群，其中該微粒群與基片上的一個(gè)不同地址締合，并且該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體，該至少一種感興趣的本體選自多肽、碳水化合物、細(xì)胞、激素、配體、氨基酸、類脂、脂肪酸以及小分子；從而該至少一種感興趣的本體占據(jù)了基片上的一個(gè)不同地址。
本發(fā)明的又一方面是，提供了一種微陣列，該微陣列包括(a)一個(gè)基片；以及(b)一個(gè)微粒群，其中每個(gè)微粒的直徑都小于1μm，該微粒群與基片上的一個(gè)不同地址締合，并且該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體，從而該至少一種感興趣的本體占據(jù)了基片上的一個(gè)不同地址。
本發(fā)明的再一方面是，提供了一種由以下方法制備的微陣列(a)提供一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，其中這些本體任意偶聯(lián)到微粒上；(b)提供一個(gè)基片，其中該基片用能夠偶聯(lián)到感興趣的本體或任意微粒上的活性化合物衍生化；(c)使本體群與基片接觸；以及(d)激活基片上所期望的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上的活性化合物，從而使本體群在所期望的位點(diǎn)上被偶聯(lián)到基片上。
本發(fā)明的另一方面是，提供了一種用于構(gòu)建微陣列的方法，其中該方法包括以下步驟(a)提供一個(gè)基片，其中該基片用以下物質(zhì)衍生化i)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及至少一層包括多個(gè)第二官能團(tuán)的交聯(lián)化合物，或者ii)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及包括多個(gè)第二官能團(tuán)的聚合膜；(b)提供或者i)一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，或者ii)一個(gè)微粒群，其中該微粒群偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體；(c)將本體或微粒群定域在基片上的不同地址處；以及(d)被定域的本體或微粒群通過第二官能團(tuán)與感興趣的本體或微粒的偶聯(lián)，從而與基片上的其不同地址締合。
本發(fā)明的另一方面是，提供了一種用于構(gòu)建微陣列的方法，其中該方法包括以下步驟(a)提供一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，其中該本體任意偶聯(lián)到微粒上；(b)提供一個(gè)基片，其中該基片用能夠偶聯(lián)到感興趣本體或任意微粒上的活性化合物衍生化；(c)使本體群與基片接觸；以及(d)激活基片上所期望位點(diǎn)處的活性化合物，從而使本體群在所期望位點(diǎn)處與基片偶聯(lián)。
本發(fā)明的又一方面是，提供了一種制備包括核酸序列的微陣列的方法，該方法包括以下步驟(a)提供包括以下組分的第一微陣列(i)第一基片；(ii)具有至少一種核酸序列的第一群體，其中該至少一種核酸序列在其遠(yuǎn)端包括第一核酸雜交序列，該第一核酸序列任意偶聯(lián)到微粒上，并且核酸序列群與第一基片上的不同地址締合；(b)提供包括以下組分的第二微陣列(i)第二基片；(ii)第二雜交序列群，其中該第二雜交序列與第一雜交序列互補(bǔ)，第二雜交序列群任意偶聯(lián)到微粒上，并且該雜交序列群與第二基片上的不同地址締合；(c)在雜交條件下使第一和第二微陣列互相接觸，從而使第一和第二雜交序列雜交；(d)使所雜交的第一和第二微陣列暴露于核苷酸聚合的條件下，從而將來自第一微陣列的所述至少一種核酸序列用作制備第二微陣列上的互補(bǔ)核酸序列的模板。
本發(fā)明的再一方面是，提供了一種用于在一個(gè)基片上制備微陣列的多個(gè)拷貝的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一微粒群，其中該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體；(b)提供一個(gè)用于微陣列的多個(gè)拷貝的基片；(c)在基片上待制備的每個(gè)微陣列的所期望位點(diǎn)處將微粒群定域到基片上；以及(d)在基片上待制備的每個(gè)微陣列的所期望位點(diǎn)處使微粒群與基片締合。
實(shí)施本發(fā)明的方式定義為了達(dá)到本發(fā)明的目的，術(shù)語“基片”、“支持體”和“表面”在本文中可以互換使用，用于表示在其上有陣列構(gòu)成的材料。
為了達(dá)到本發(fā)明的目的，“地址”是基片上可與其它獨(dú)特部位區(qū)分開的獨(dú)特部位。
正如本文中所用的，“微粒群”是指一個(gè)或多個(gè)微粒。
正如本文中所用的，“具有至少一種感興趣本體的群體”是指一種或多種感興趣的本體。
正如本文中所用的，“感興趣的本體”是指單一種類的分子或細(xì)胞群，例如多核苷酸或多肽?？捎糜诒景l(fā)明的分子種類包括生物或化學(xué)化合物，例如簡單或復(fù)雜的有機(jī)和無機(jī)分子。大量分子都可以是合成的，例如寡聚體(諸如寡肽和寡核苷酸)以及基于核結(jié)構(gòu)合成的有機(jī)化合物。另外，不同的天然源也可以提供用于本發(fā)明的分子，例如植物或動(dòng)物提取物，以及類似物質(zhì)。
術(shù)語“多肽”、“寡肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可以互換，是指任何長度的氨基酸聚合物。該聚合物可以是線性的或分支的，它可以包括修飾氨基酸，并且可以裝配到多于一個(gè)多肽鏈的復(fù)合物中。這些術(shù)語還包含業(yè)已由天然或人工修飾的氨基酸聚合物；例如通過二硫健形成、糖基化、類脂化、乙?；?、磷酸化或者其它任何操作或修飾作用諸如與標(biāo)記組分共軛。在該定義內(nèi)還包括例如含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸(包括諸如非天然的氨基酸等等)類似物的多肽、類似于肽的化合物諸如胨化物，以及本領(lǐng)域內(nèi)公知的其它修飾物。
術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”以及“核酸”在本文中可以互換使用，是指任何長度的核苷酸聚合物。它還包括本領(lǐng)域內(nèi)公知的寡核苷酸類似物和衍生物，例如2’鄰-甲基-核糖核苷酸。
術(shù)語“聚糖”和“碳水化合物”在本文中可以互換使用。
“A”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)，除非上下文清楚地表示出其它意思。
化學(xué)術(shù)語，除非另外定義，否則就象本領(lǐng)域內(nèi)公知的那樣使用。
一般技術(shù)除非另外指出，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用以下這些領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)照片平版印刷術(shù)bv、微觀流體、有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、寡核苷酸合成與修飾、生物共軛化學(xué)、核酸雜交、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、重組DNA以及本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的相關(guān)技術(shù)。這些技術(shù)在本文所提到的參考文獻(xiàn)中都有所描述并且在文獻(xiàn)中都得到了充分的解釋。關(guān)于分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)，參見例如(Maniatis，T.等人(1982)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港(Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor)；Ausubel，F(xiàn).M.(1987)，分子生物學(xué)最新技術(shù)(Current Protocols inMolecular Biology)，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience；Ausubel，F(xiàn).M.(1989)，分子生物學(xué)簡略方法分子生物學(xué)最新技術(shù)中的方法一覽表(Short Protocols in Molecular BiologyA Compendium ofMethods from Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Pub.Associates和Wiley-Interscience；Sambrook，J.等人(1989)，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港；Innis，M.A.(1990)，PCR方法方法和應(yīng)用指南(PCR ProtocolsA Guide to Methods and Applications)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)；Ausubel，F(xiàn).M.(1992)，分子生物學(xué)簡略方法分子生物學(xué)最新技術(shù)中的方法一覽表，Greene Pub.Associates；Ausubel，F(xiàn).M.(1995)，分子生物學(xué)簡略方法分子生物學(xué)最新技術(shù)中的方法一覽表，Greene Pub.Associates；Innis，M.A.等人(1995)，PCR策略(PCRStrategies)，學(xué)術(shù)出版社；Ausubel，F(xiàn).M.(1999)，分子生物學(xué)簡略方法分子生物學(xué)最新技術(shù)中的方法一覽表，Wiley，以及更新年鑒；Sninsky，J.J.等人(1999)，PCR應(yīng)用用于功能基因組學(xué)的方法(PCR ApplicationsProtocols for Functional Genomics)，學(xué)術(shù)出版社)。關(guān)于DNA合成技術(shù)以及核酸化學(xué)，參見例如(Gait，M.J.(1985)，寡核苷酸合成實(shí)用方法(Oligonucleotide SynthesisA Practical Approach)，IRL出版社；Gait，M.J.(1990)，寡核苷酸合成實(shí)用方法，IRL出版社；Eckstein，F(xiàn).(1991)，寡核苷酸及類似物實(shí)用方法(Oligonucleotides andAnaloguesA Practical Approach)，IRL出版社；Adams，R.L.等人(1992)，核酸生物化學(xué)(The Biochemistry of the Nucleic Acids)，Chapman和Hall；Shabarova，Z.等人(1994)，核酸的高級(jí)有機(jī)化學(xué)(AdvancedOrganic Chemistry of Nucleic Acids)，Weinheim；Blackburn，G.M.等人(1996)，化學(xué)和生物學(xué)中的核酸(Nucleic Acids in Chemistry andBiology)，牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press)；Hermanson，G.T.(1996)，生物連接技術(shù)(Bioconjugate Techniques)，學(xué)術(shù)出版社)。關(guān)于微觀制造，參見例如(Campbell，S.A.(1996)，微電子制作的科學(xué)和工程學(xué)(The Science and Engineering of MicroelectronicFabrication)，牛津大學(xué)出版社，；Zaut，P.V.(1996)，微型微陣列制作半導(dǎo)體加工工藝的使用指南(Micromicroarray FabricationaPractical Guide to Semiconductor Processing)，SemiconductorServices；Madou，M.J.(1997)，微制作基礎(chǔ)(Fundamentals ofMicrofabrication)，CRC出版社；Rai-Choudhury，P.(1997)，微平板印刷術(shù)手冊(cè)，微型機(jī)及微制作微平板印刷術(shù)(Handbook ofMicrolithography，Micromachining，& MicrofabricationMicrolithography))。
微陣列本發(fā)明提供了微陣列，在該微陣列中，不同的化學(xué)、生物和/或細(xì)胞本體與基片表面上的特定地址締合。
因此，本發(fā)明提供了一種微陣列，包括(a)一個(gè)基片，其中該基片用以下物質(zhì)衍生化i)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及至少一層包括多個(gè)第二官能團(tuán)的交聯(lián)化合物，或者ii)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及包括多個(gè)第二官能團(tuán)的聚合膜；以及(b)或者i)一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，其中這個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體通過本體與第二官能團(tuán)的偶聯(lián)，而與基片上的一個(gè)不同地址締合，或者ii)一個(gè)微粒群，其中該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體，并且該微粒群通過第二官能團(tuán)與微粒的偶聯(lián)，而與基片上的一個(gè)不同地址締合，從而該至少一種感興趣的本體占據(jù)了基片上的一個(gè)不同地址。
本發(fā)明的另一方面是，提供了一種微陣列，該微陣列包括(a)一個(gè)基片；以及(b)一個(gè)微粒群，其中該微粒群與基片上的一個(gè)不同地址締合，并且該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體，該至少一種感興趣的本體選自多肽、碳水化合物、細(xì)胞、激素、配體、氨基酸、類脂、脂肪酸以及小分子；從而該至少一種感興趣的本體占據(jù)了基片上的一個(gè)不同地址。
本發(fā)明的又一方面是，提供了一種微陣列，該微陣列包括(a)一個(gè)基片；以及(b)一個(gè)微粒群，其中每個(gè)微粒的直徑都小于1μm，該微粒群與基片上的一個(gè)不同地址締合，并且該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體，從而該至少一種感興趣的本體占據(jù)了基片上的一個(gè)不同地址。
本發(fā)明的再一方面是，提供了一種由以下方法制備的微陣列(a)提供一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，其中這些本體任意偶聯(lián)到微粒上；(b)提供一個(gè)基片，其中該基片用能夠偶聯(lián)到感興趣的本體或任意微粒上的活性化合物衍生化；(c)使本體群與基片接觸；以及(d)激活基片上所期望的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上的活性化合物，從而使本體群在所期望的位點(diǎn)處偶聯(lián)到基片上。
基片能夠用于形成基片的物質(zhì)包括可共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合到微粒上的性質(zhì)或者能夠衍生成具有該性質(zhì)的任何固體材料。用作基片的材料包括但不局限于玻璃、硅石、硅、二氧化硅、塑料、金屬、陶瓷(諸如瓷)，以及天然或合成聚合物例如纖維素、聚氨基葡糖、葡聚糖、聚苯乙烯和尼龍。在本發(fā)明的實(shí)踐中能夠形成固相表面的任何物質(zhì)都適合用作基片。該基片也可包括不同的材料層。
將基片材料形成為適于陣列的特定制造工藝及應(yīng)用的尺寸和形狀。例如，在分析物和試劑之高消耗為可接受的某些分析類型中，在相對(duì)大的基片(例如1cm×1cm或更大)上制備陣列更經(jīng)濟(jì)些，因?yàn)榫哂锌刹捎渺`敏度更小且更經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)系統(tǒng)的輔助優(yōu)點(diǎn)。然而，在許多情況下，只能得到有限量的分析物和/或試劑，從而需要對(duì)這些組分的最小消耗。在這些情況下，較小尺寸的基片和較小的地址是合適的。尤其是，由于地址的尺寸可與單個(gè)微粒的尺寸一樣小(可以在1-2毫微米這一等級(jí)上)，因此在某些情況下可由基片上的地址數(shù)來確定最小的基片面積。
在某些實(shí)施方案中，一個(gè)基片包含高達(dá)108個(gè)地址，在其它實(shí)施方案中可高達(dá)107、106、105、104、103或102個(gè)地址。
一個(gè)地址可假設(shè)成與微粒和地址的締合相符的任何形狀，并且該形狀使得每個(gè)地址上的本體與所有其它地址上的本體區(qū)分開(例如在光學(xué)上)。地址的形狀可以是例如環(huán)形、卵圓形、方形、矩形或者可包括不規(guī)則形狀。
每個(gè)地址的尺寸取決于基片的尺寸、特定基片上的地址數(shù)、可得到的分析物和/或試劑的量、微粒的尺寸以及使用陣列的任何方法所需的溶解程度。尺寸可以在例如1-2毫微米至幾厘米的范圍內(nèi)，但是與陣列的應(yīng)用相符的任何尺寸都是可用的。
地址的空間布置和形狀被設(shè)計(jì)成與微陣列的特定應(yīng)用相符。地址可為密集的，或?yàn)閺V泛分散的，或亞分組為適于特定類型分析所需的模式。
在一個(gè)實(shí)施方案中，用官能團(tuán)衍生基片表面，其中所述官能團(tuán)與微?；虮倔w上用于陣列特定地址定域的相匹配官能團(tuán)偶聯(lián)。一對(duì)活性官能團(tuán)可用來使微?；蚋信d趣的本體與基片締合，其中這對(duì)活性官能團(tuán)的一員與其中的另一員形成共價(jià)鍵。在這種情況下，其中一員固定在基片上，而另一員固定在微?；蚋信d趣的本體用于與基片鍵接。合適的活性官能團(tuán)對(duì)的實(shí)例包括但不限于氨基/N-羥基琥珀酰亞胺酯、巰基/馬來酰亞胺基，以及羰基/酰肼。在多種化學(xué)目錄(諸如Pierce Chemical Co.的目錄)中可找到其它實(shí)例。另外，在色譜基質(zhì)的制備中所用的反應(yīng)基團(tuán)對(duì)，尤其是親和色譜中所包括的那些反應(yīng)基團(tuán)對(duì)，以及蛋白質(zhì)與核酸的修飾中所用到的那些反應(yīng)基團(tuán)對(duì)都可用于本發(fā)明。參見例如(Means等人(1971)，蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾(Chemical Modification of Proteins)，Holden-Day；Sundaram，P.V.等人(1978)，親和技術(shù)理論和實(shí)踐(Theory and Practice in AffinityTechniques)，學(xué)術(shù)出版社；Wilchek，M.等人(1984)，親和層析，酶學(xué)方法(Affinity Chromatography，Methods in Enzymology)，學(xué)術(shù)出版社；Hermanson，G.T.等人(1992)，固相化親和配體技術(shù)(ImmobilizedAffinity Ligand Techniques)，學(xué)術(shù)出版社)。
在一些實(shí)施方案中，需要增加基片表面上的官能團(tuán)數(shù)目或可及度，以便使微?；蚋信d趣的本體易于締合并固定到基片上(例如用高密度的官能團(tuán)將微?；蚋信d趣的本體共價(jià)固定到基片上，可導(dǎo)致整個(gè)鍵強(qiáng)度能夠抵擋住多種測(cè)定應(yīng)用所需的工藝中所施加的機(jī)械力)。這一點(diǎn)可通過將含有多個(gè)官能團(tuán)的化合物交聯(lián)到基片表面的官能團(tuán)上而達(dá)到。具有合適的多個(gè)官能團(tuán)的任何化合物都可用作交聯(lián)化合物，以便擴(kuò)大可得到的官能團(tuán)的總數(shù)或者增加官能團(tuán)的可及度。合適的交聯(lián)化合物的非限定性實(shí)例包括例如聚賴氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚氨基葡糖或共聚物(諸如聚絲氨酸-天冬氨酸)等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，該交聯(lián)化合物是聚賴氨酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，用一個(gè)交聯(lián)周期衍生基片。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用兩個(gè)交聯(lián)周期衍生基片。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，用至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)交聯(lián)周期衍生基片。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基片表面可由具有非常高濃度官能團(tuán)的聚合膜制成或涂覆，從而與微?；蚋信d趣的本體具有適當(dāng)?shù)逆I合強(qiáng)度。通過聚合官能團(tuán)(例如環(huán)氧、氨或羰基)的純單體或者聚合不同種單體的混合物，以使官能團(tuán)的總數(shù)較高，而形成這些聚合膜。如果所選擇的基片表面具有低密度的反應(yīng)官能團(tuán)(例如當(dāng)基片是諸如金屬、玻璃、硅石、陶瓷、聚苯乙烯或聚丙烯時(shí))，用復(fù)官能化合物簡單處理基片表面一次(諸如通常用聚賴氨酸處理)并附著微粒是不會(huì)導(dǎo)致整個(gè)鍵強(qiáng)度足以抵擋住大多數(shù)測(cè)定應(yīng)用所需的工藝中所施加的機(jī)械力。為了擴(kuò)大官能團(tuán)的數(shù)目，可應(yīng)用含有多個(gè)官能團(tuán)的交聯(lián)化合物并與之反應(yīng)，重復(fù)所需要的次數(shù)，直至獲得所需密度的反應(yīng)官能團(tuán)。含有多個(gè)官能團(tuán)的這些擴(kuò)增試劑在每個(gè)周期內(nèi)可相同或不同。
當(dāng)由交聯(lián)化合物引入的官能團(tuán)數(shù)超過交聯(lián)反應(yīng)中所消耗的官能團(tuán)數(shù)時(shí)，該過程就擴(kuò)大了基片表面上的官能團(tuán)數(shù)。如果交聯(lián)化合物在基片表面與官能團(tuán)之間提供了更多的空間，那么該過程還能增加官能團(tuán)的可及度。例如，為了增加基片上的氨基數(shù)，可以將合適分子量的聚賴氨酸交聯(lián)到基片上?？梢灾貜?fù)該步驟來交聯(lián)所需層的聚賴氨酸，這樣就擴(kuò)大了氨基數(shù)以及它們與表面的距離。
通過將其它化合物與所需的性質(zhì)結(jié)合可以將其它化學(xué)性質(zhì)賦予基片。例如，利用聚-苯基丙氨酸-賴氨酸比利用聚賴氨酸具有更大的疏水性。關(guān)于親水性，可結(jié)合不同分子量大小的聚乙二醇。有多種保護(hù)基團(tuán)和偶聯(lián)化學(xué)方法能夠用來以受控方式實(shí)現(xiàn)交聯(lián)。用于此目的的技術(shù)和適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基團(tuán)在肽與寡核苷酸合成領(lǐng)域內(nèi)是公知的。參見例如(Bodanszky，M.(1993)，肽化學(xué)實(shí)踐教科書(Peptide ChemistryA Practical Textbook)，Springer-Verlag；Bodanszky，M.(1993)，肽合成原理(Principles ofPeptide Synthesis)，Springer-Verlag；Bodanszky，M.等人(1994)，肽合成實(shí)踐(The Practice of Peptide Synthesis)，Springer-Verlag；Fields，G.B.(1997)，固相肽合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)，學(xué)術(shù)出版社)。例如，可以用叔丁氧基羰基(t-Boc)來保護(hù)聚賴氨酸上的氨基。通過利用碳二亞胺例如N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺或1-乙基-3-[3-二甲基氨丙基]碳二亞胺，并以N-羥基琥珀酰亞胺作為催化劑，可使末端羰基與基片上的原始氨基反應(yīng)并共價(jià)鏈接(參見(Dierks，T.等人(1992)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(bào)(Biochim Biophys Acta)1103(1)13-24；Sehgal，D.等人(1994)，生物化學(xué)年鑒紀(jì)事(Anal Biochem)218(1)87-91))。如果需要的話，通過將保護(hù)反應(yīng)中的少量酐(諸如琥珀酐)與N-(叔丁氧基碳酰氧基)琥珀酰亞胺結(jié)合，可將聚賴氨酸上有限數(shù)目的氨基轉(zhuǎn)換成羰基，從而使聚賴氨酸上的有限數(shù)目的氨基被轉(zhuǎn)換成羰基。由于t-Boc保護(hù)的聚賴氨酸上有多于一個(gè)的羰基，比較容易將聚合物交聯(lián)到基片上的氨基上。以類似方式，可使用聚天冬氨酸和含有多個(gè)羰基的其它聚合物以引入更多的羰基?？梢赃x擇保護(hù)和偶聯(lián)試劑，以便適合特定反應(yīng)的需求。通過控制反應(yīng)物的濃度、pH、溫度等，可控制該交聯(lián)反應(yīng)，以便得到所期望的結(jié)果。
微粒用于形成微粒的物質(zhì)包括能夠被制成粒子的任何固相材料，并且這些材料具有能夠與基片以及與微陣列上待顯示的特定本體結(jié)合的性質(zhì)或者能夠被衍生成具有該性質(zhì)。微?？梢允茄苌囊部梢允欠茄苌摹Ｎ⒘Ｅc基片以及與感興趣本體的結(jié)合可以是共價(jià)的也可以是非共價(jià)的。用于構(gòu)建微粒的材料包括但不限于玻璃、硅石、硅、二氧化硅、塑料、金屬或陶瓷(諸如瓷)，以及天然和合成聚合物例如纖維素、聚氨基葡糖、葡聚糖、聚苯烯和尼龍。在一個(gè)實(shí)施方案中，基片被衍生化，而微粒沒有衍生化。在另一實(shí)施方案中，基片沒有衍生化，而微粒被衍生化。在又一實(shí)施方案中，基片和微粒都被衍生化。
微?？赏ㄟ^商業(yè)途徑購得，例如從Bang Laboratories，Inc.；Seradyn，Inc.；Quantum Dot，Inc.；Biorad和Pharmacia購得，并且可以不同的形狀和尺寸獲得。與預(yù)期使用的陣列相符的任何形狀和/或尺寸都是合適的。球形微粒是最常使用的。在一個(gè)實(shí)施方案中，直徑在約1nm和10mm之間的球形微粒是合適的。在另一實(shí)施方案中，這些微粒的直徑小于1μm。優(yōu)選的微粒具有均一大小。然而，如果使本領(lǐng)域公知的軟件程序用于微粒大小與信號(hào)強(qiáng)度關(guān)系的均一化，那么對(duì)測(cè)定應(yīng)用中產(chǎn)生一致的結(jié)果而言，對(duì)尺寸的均一性并無嚴(yán)格要求。
在一個(gè)實(shí)施方案中，表面上帶有所需本體的微粒在性質(zhì)上是離子的或是磁性的，借此使其易于初始定域到特定地址上(參見下文)。通過例如用正或負(fù)離子基使微粒衍生化，可將離子性質(zhì)賦予微粒。這些離子基的實(shí)例包括但不限于羧基(提供負(fù)電荷)和氨基(提供正電荷)。另外，用于制備離子交換色譜基質(zhì)的工藝過程也可用于制備帶電微粒。參見例如(Kitchener，J.A.(1961)，離子交換樹脂，第一版“小量修改后的再版”(Ion Exchange Resins.lst edition “reprinted with minorammendments”)，Methuen；Placek，C.(1970)，離子交換樹脂，Noyes DataCorp.；Wilson，A.等人(1981)，用于水處理中去除特定金屬的離子交換樹脂的發(fā)展和評(píng)估(Development and evaluation of ion-exchange resinsfor removal of specific metals in water treatment).Morgantown，Water Research Institute，Center for Extension and ContinuingEcucation，West Virginia University；Kunin，R.(1985)，離子交換樹脂，R.E.Krieger Pub.Co.；Kunin，R.(1990)，離子交換樹脂，R.E.Krieger Pub.Co.；關(guān)于離子交換的國際會(huì)議(International Conferenceon Ion Exchange)(1991).離子交換方面的新進(jìn)展材料、基礎(chǔ)及應(yīng)用離子交換的國際會(huì)議學(xué)報(bào)(New Developments in Ion ExchangeMaterials，F(xiàn)undamentals and ApplicationsProceedings of the InternationalConference on Ion Exchange)，ICIE’91；Philipp，W.H.等人(1993).離子交換聚合物和成為發(fā)明家的方法(Ion Exchange Polymers and Methodfor Making Inventors)，國家航空和空間管理局(National Aeronauticsand Space Administration)；Baumgartner，W.等人(1997)，離子交換樹脂，The Freedonia Group Inc.)。在合成某些微粒時(shí)，將離子共聚物并入最初的聚合步驟中(例如由Seradyn，Inc.提供的那些步驟)，借此使微粒帶電。
在另一實(shí)施方案中，借助于偶聯(lián)分子而賦予微粒離子性質(zhì)。例如，包含偶聯(lián)核酸的微粒在中性pH值時(shí)具有凈負(fù)電荷。另外，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，某些蛋白質(zhì)和/或肽可由于它們的氨基酸組成和介質(zhì)的pH值不同而顯示出凈的正或負(fù)電荷。
通過利用顆粒內(nèi)部包埋有或其表面附著有順磁材料的微粒，可獲得磁性質(zhì)。能夠被磁化的任何金屬或物質(zhì)都適合使微粒帶有磁性質(zhì)。具有磁性質(zhì)的微?？山?jīng)商業(yè)途徑購得，例如從Dynal A.S.(Lake Success，紐約和Oslo，挪威)和Seradyn(Indianapolis，IN)購得。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將獨(dú)特的化學(xué)、生物或細(xì)胞本體偶聯(lián)到微粒上。在一實(shí)施方案中，化學(xué)、生物和/或細(xì)胞本體的獨(dú)特組合物被偶聯(lián)到微粒上。在另一實(shí)施方案中，微陣列具有至少兩個(gè)微?；虮倔w群。在另一實(shí)施方案中，微陣列具有至少10個(gè)、至少100個(gè)、至少100個(gè)微?；虮倔w群。以上所描述的使基片官能化，以便結(jié)合微粒的方法也可以用于使微粒官能化，以便偶聯(lián)到基片或所需的本體上，并且為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的技術(shù)。其它實(shí)例在下文中有所描述。
感興趣的本體能夠共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)到微?；蚧系娜魏胃信d趣的生物、化學(xué)和/或細(xì)胞本體都可用于形成本發(fā)明的微陣列。這些本體包括例如生物聚合物、小分子、激素、氨基酸、類脂、配體、脂肪酸、核苷、核苷酸以及核苷酸類似物(例如cAMP和cAMP衍生物)，并且還包括合成及天然分子。它還包括以上這些物質(zhì)的衍生物和類似物。在本發(fā)明的實(shí)踐中，細(xì)胞或組織樣品也可附著到微粒上。這些感興趣的本體無需來自于生物源；例如在本發(fā)明的實(shí)踐中，組合化學(xué)工藝過程的產(chǎn)物可偶聯(lián)到微粒上?；瘜W(xué)、生物和/或細(xì)胞本體可通過共價(jià)或非共價(jià)連接附著到微?；蚧?。在一個(gè)實(shí)施方案中，具有至少一種感興趣本體的群體被直接偶聯(lián)到基片上。在另一實(shí)施方案中，一個(gè)微粒群被偶聯(lián)到基片上，其中該微粒群被偶聯(lián)到至少一種感興趣的本體上。
生物聚合物包括多糖類、多肽類和多核苷酸類。優(yōu)選的生物聚合物是多肽類；更優(yōu)選的是核酸聚合物。核酸聚合物包括但不限于寡核苷酸、多核苷酸、寡核苷酸類似物與多核苷酸類似物、嵌合寡核苷酸與嵌合多核苷酸以及修飾核酸。核酸聚合物可以是單鏈、雙鏈或多鏈的。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該至少一種感興趣的本體選自多肽、碳水化合物、細(xì)胞、激素、配體、氨基酸、類脂、脂肪酸，以及小分子。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，該至少一種感興趣的本體是核酸。在若干單獨(dú)的實(shí)施方案中，該至少一種感興趣的本體是DNA或RNA。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該至少一種感興趣的本體是多肽。
在一實(shí)施方案中，兩種或多種不同類型的化學(xué)、生物和/或細(xì)胞本體存在于一個(gè)微陣列中。例如，許多致癌基因已知可編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，后者通常與調(diào)節(jié)核酸序列和其它調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用。因此，包括寡核苷酸、多肽和小分子的陣列可用于例如篩分與致癌基因相互作用的分子，以便鑒定潛在的治療方案。在另一實(shí)施方案中，一個(gè)地址可包括至少一種多肽和至少一種核酸。
可利用本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法在微粒上直接地化學(xué)合成分子。例如，以下文獻(xiàn)中業(yè)已描述了自動(dòng)化的固相肽合成技術(shù)Stewart，J.M.等人(1984)，固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)，PierceChemical Co.；Grant，G.A.(1992)，合成肽用戶指南(SyntheticPeptidesA User’s Guide)，W.H.Freemen；Bodanszky，M.(1993)，肽合成原理(Principles of Peptide Synthesis)，Springer-Verlag；Bodanszky，M.等人(1994)，肽合成的實(shí)踐(The Practice of PeptideSynthesis)，Springer-Verlag；Fields，G.B.(1997)，固相肽合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)，學(xué)術(shù)出版社；Pennington，M.W.等人(1994)，肽合成方法(Peptide Synthesis Protocols)，Humana Press；Fields，G.B.(1997)，固相肽合成(Solid-Phase Peptide Synthesis)，學(xué)術(shù)出版社。用任一通過商業(yè)途徑購得的DNA合成儀(例如PE Biosystems所提供的DNA合成儀)通過自動(dòng)化的化學(xué)合成工藝，可制備寡核苷酸。用于自動(dòng)寡核苷酸合成的組合物和方法公開在例如(US專利號(hào)4,415,732，Caruthers等人(1983)；US專利號(hào)4,500,707和Caruthers(1985)；US專利號(hào)4,668,777，Caruthers等人(1987))。
在一個(gè)實(shí)施方案中，由組合化學(xué)工藝過程合成的分子集合(即化合物文庫)可以偶聯(lián)到微?；蚧希瑥亩纬捎糜诤Y分分子的微陣列。
在另一實(shí)施方案中，新鮮、冷凍或包埋在石蠟中的組織切片或者從細(xì)胞培養(yǎng)物中收集的細(xì)胞可偶聯(lián)到微?；蚧稀Ｓ帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的流化床方法在微粒內(nèi)部或表面上生長的細(xì)胞也是合適的。采用多種細(xì)胞源和/或生長條件，可構(gòu)建代表多種生物狀態(tài)的微粒集合。例如，采用標(biāo)準(zhǔn)的固定方法、用醇脫水或用交聯(lián)劑處理，可將細(xì)胞固定到微粒上，從而產(chǎn)生具有特定生物狀態(tài)的固定細(xì)胞材料。以下文獻(xiàn)中描述了示范性的固定方法Bancroft，J.D.(1975)，組織化學(xué)技術(shù)(Histochemical Techniques)，Butterworths；Troyer，H.(1980)，組織化學(xué)原理和技術(shù)(Principles and Techniques ofHistochemistry)，Little Brown；Bancroft，J.D.等人(1987)，酶組織化學(xué)(Enzyme Histochemistry)，牛津大學(xué)出版社；Sumner，B.E.H.(1988)，基礎(chǔ)組織化學(xué)(Basic Histochemistry)，Wiley；Lyon，H.(1991).組織化學(xué)中的原理和策略技術(shù)的選擇和了解指南(Theory and Strategyin Histochemistrya Guide to the Selection and Understanding ofTechniques)，Springer-Verlag；Graumenn，W.等人(1992).受體組織化學(xué)(Histochemistry of Receptors)，Gustav Fischer Verlag；Noorden，C.J.等人(1992).酶組織化學(xué)最新方法的實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(EnzymeHistochemistryA Laboratory Manual of Current Methods)，牛津大學(xué)出版社；Kiernan，J.A.(1999).組織學(xué)和組織化學(xué)方法理論和實(shí)踐(Histological and Histochemical MethodsTheory and Practice)，Butterworth Heinemann)。微粒集合(每個(gè)集合含有確定生物狀態(tài)的固定細(xì)胞簇)可以貯藏起來并用于形成如本文所述的微陣列。一個(gè)微粒群足以制成大量的微陣列。以這種方式可避免每次測(cè)定時(shí)對(duì)生長細(xì)胞的需要，并避免了每次重復(fù)細(xì)胞生長的精確生長條件的必要性。取而代之的是，含有從同一條件下衍生的細(xì)胞中取得的細(xì)胞材料的微?？捎糜诖罅坎煌年嚵兄?。而且，使用含有細(xì)胞的微粒可確保在不同測(cè)定中所比較之材料的均一性。
制備微陣列的方法本發(fā)明提供了由所選擇的本體陣列構(gòu)建微陣列的制備方法。在這些和其它方法中，在陣列上待顯示的不同化學(xué)、生物和/或細(xì)胞本體可以首先固定到若干分離開的微粒群體上。然后利用將要描述的幾種方法之一，使微粒與基片上的不同特定地址締合?；蛘呤?，將感興趣的本體直接與基片締合。
本發(fā)明的另一方面是，提供了一種用于構(gòu)建微陣列的方法，其中該方法包括以下步驟(a)提供一個(gè)基片，其中該基片用以下物質(zhì)衍生化i)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及至少一層包括多個(gè)第二官能團(tuán)的交聯(lián)化合物，或者ii)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及包括多個(gè)第二官能團(tuán)的聚合膜；(b)提供或者i)一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，或者ii)一個(gè)微粒群，其中該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體；(c)將本體或微粒群定域在基片上的一個(gè)不同地址處；以及(d)定域的本體或微粒群通過第二官能團(tuán)與感興趣的本體或微粒的偶聯(lián)，而與基片上的它們的不同地址締合。
本發(fā)明的另一方面是，提供了一種用于構(gòu)建微陣列的方法，其中該方法包括以下步驟(a)提供一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，其中該本體任意偶聯(lián)到微粒上；(b)提供一個(gè)基片，其中該基片用能夠偶聯(lián)到感興趣本體或任意微粒上的活性化合物衍生化；(c)使本體群與基片接觸；以及(d)激活基片上所期望位點(diǎn)處的活性化合物，從而使本體群在所期望的位點(diǎn)處與基片偶聯(lián)。
本發(fā)明的另一方面是，提供了一種制備包括核酸序列的微陣列的方法，該方法包括以下步驟(a)提供包括以下組分的第一微陣列(i)第一基片；(ii)具有至少一種核酸序列的第一群體，其中該至少一種核酸序列在其遠(yuǎn)端包括第一核酸雜交序列，該第一核酸序列群任意偶聯(lián)到微粒上，并且該核酸序列群與第一基片上的一個(gè)不同地址締合；(b)提供包括以下組分的第二微陣列(i)第二基片；(ii)一個(gè)第二雜交序列群，其中該第二雜交序列與第一雜交序列互補(bǔ)，第二雜交序列群任意偶聯(lián)到微粒上，并且該雜交序列群與第二基片上的一個(gè)不同地址締合；(c)在雜交條件下使第一和第二微陣列互相接觸，從而使第一和第二雜交序列雜交；(d)使所雜交的第一和第二微陣列暴露于核苷酸聚合的條件下，從而將來自第一微陣列的所述至少一種核酸序列用作制備第二微陣列上的互補(bǔ)核酸序列的模板。
本發(fā)明的另一方面是，提供了一種用于在一個(gè)基片上制備微陣列的多個(gè)拷貝的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一微粒群，其中該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體；(b)提供一個(gè)用于微陣列的多個(gè)拷貝的基片；(c)在基片上待制備的每個(gè)微陣列的所需部位上將微粒群定域到基片上；以及(d)在基片上待制備的每個(gè)微陣列的所需部位上使微粒群與基片締合。
分子或細(xì)胞本體與微粒的偶聯(lián)陣列上待顯示的化學(xué)、生物和/或細(xì)胞本體首先可共價(jià)或非共價(jià)偶聯(lián)到微粒上。偶聯(lián)可以群體的形式進(jìn)行，從而每個(gè)微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體。有許多方法為利用化學(xué)或生物方式將分子或細(xì)胞偶聯(lián)到微粒上(參見上文)。進(jìn)一步的實(shí)例將在下文中描述。
用于將化學(xué)或生物本體偶聯(lián)到微粒上的示范性化學(xué)方法包括巰基與巰基、馬來酰亞胺或碘乙酸根的偶聯(lián)；碳二亞胺催化的氨基與琥珀酰亞胺基酯、醛或羧基的偶聯(lián)；羰基與酰肼基的偶聯(lián)以及由光活性疊氮化物基團(tuán)介導(dǎo)的非特異偶聯(lián)。其它偶聯(lián)方法為本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知?？衫帽绢I(lǐng)域內(nèi)公知的方法使核酸與肽偶聯(lián)。參見例如(Hermanson，G.T.等人(1992).固定親和配體技術(shù)(Immobilized Affinity Ligand Techniques)，學(xué)術(shù)出版社；Shabarov8，Z.等人(1994).高級(jí)核酸有機(jī)化學(xué)(Advanced OrganicChemistry of Nucleic Acids)，Weinheim；Hermanson，G.T.(1996).生物連接技術(shù)(Bioconjugate Techniques)，學(xué)術(shù)出版社)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用硅烷處理微粒表面，以便用反應(yīng)基團(tuán)涂覆粒子表面(Joos，B.等人(1997).分析生物化學(xué)24796-101)。也可以利用疏水作用和物理截留(例如與膜、聚合物的疏水作用或截留在孔內(nèi))。
將分子附著到微粒上的生物方法是基于特定的生物相互作用，這些作用包括但不限于親和素-生物素；蛋白質(zhì)-配體；抗體-抗原；抗體-半抗原、蔗糖-外源凝集素以及互補(bǔ)核酸之間的特異相互作用。通過連接作用和/或核酸聚合技術(shù)也可獲得分子與微粒的共價(jià)或非共價(jià)鍵接。例如，寡核苷酸可連接到微粒上。帶有與將要連接到微粒上的分子序列和微粒上的分子序列都互補(bǔ)的序列的接頭寡核苷酸及多核苷酸可用來將這兩個(gè)序列置于并列位置上，然后由連接酶連接。如果優(yōu)選接頭分子的話，則可用來雜交微粒上和待連接的分子上的兩個(gè)序列，而不是將它們置于并列位置并在兩個(gè)序列之間留下一個(gè)間隙?？捎镁酆厦柑钛a(bǔ)該間隙，然后用連接酶連接這兩條鏈。示范性連接酶包括E.Coli DNA連接酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA連接酶和T4 RNA連接酶。示范性核酸聚合酶包括E.Coli DNA聚合酶I(PolI)、Pol I的Klenow片段、Taq聚合酶、T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、E.ColiRNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶和SP6 RNA聚合酶。其它原核生物與真核生物連接酶、DNA聚合酶及RNA聚合酶都是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的多種反轉(zhuǎn)錄酶可用于本發(fā)明的實(shí)踐中。
對(duì)于通過聚合作用而使單鏈寡核苷酸或多核苷酸與微粒發(fā)生的酶偶聯(lián)，在聚合作用之后必須除去模板。這可通過變性例如用熱、高pH值、有機(jī)溶劑和/或酶變性而完成。如果需要將雙鏈寡核苷酸或多核苷酸偶聯(lián)到微粒上，則不必除去模板。利用本領(lǐng)域公知的并在上文中描述的方法可將其任意偶聯(lián)到微粒上。例如，諸如脂肪族伯氨或者羧基這些官能團(tuán)可以連接到微粒上，或者可引入3’端核糖基，該3’端核糖基在由高碘酸鹽進(jìn)行氧化時(shí)可連接到微粒的氨基上(參見(Hermanson，G.T.等人(1992).固定親和配體技術(shù)(Immobilized Affinity Ligand Techniques)，學(xué)術(shù)出版社)。
微粒與基片之間的連接偶聯(lián)有感興趣本體的微粒與基片締合，以便形成一個(gè)有序的本體陣列。在一實(shí)施方案中，這可通過合成若干個(gè)分開的微粒群而獲得，并且每個(gè)群體具有一個(gè)不同的本體或者所選擇的本體混合物偶聯(lián)在該群體中的微粒上。然后每個(gè)群體與基片上的獨(dú)特地址締合，借此將一個(gè)不同的本體或者所選擇的本體群放在基片的每個(gè)地址上?；蛘呤?，包含偶聯(lián)有不同本體的單一微粒與基片的每個(gè)地址締合。偶聯(lián)有不同本體的、于不同批中合成的微粒混合物可以與一個(gè)地址締合。
此處所描述的用于將微粒定域并締合到基片上的方法還可用于將感興趣的本體偶聯(lián)到基片上。
含有偶聯(lián)分子或細(xì)胞的微?？梢晕⒘５囊后w懸浮液的形式或者作為干粉分送到基片的表面上。一種將微粒定域到地址上的方法利用了地址與微粒之間的離子相互作用。例如，可以將帶電微粒定域在基片上，而將程序電極或電場置于該基片上的每個(gè)地址處。如果一個(gè)特定地址處的電極帶正電荷，并且陣列上所有其它地址處的電極都帶負(fù)電荷，那么帶負(fù)電荷的微粒(例如偶聯(lián)有寡核苷酸的微粒)將附著在含有帶正電電極的地址處，并且被所有其它地址所排斥。關(guān)于將分子定域在陣列上而采用離子性質(zhì)的其它細(xì)節(jié)，參見US專利號(hào)5,605,662。一旦一個(gè)微粒群定域到一個(gè)地址上，就可除去多余的微粒并且被定域微粒可與地址締合(例如通過共價(jià)鍵)；另外，可在不同的地址利用不同微粒群重復(fù)該定域過程。因?yàn)檫@些微粒物理占據(jù)了地址上的空間，所以一旦定域，它們會(huì)阻止其它微粒在該地址處與基片接觸。這樣，在每個(gè)締合周期內(nèi)可進(jìn)行許多次定域循環(huán)，從而使該過程更有效。定域和締合過程的有序重復(fù)使得可利用在每個(gè)獨(dú)特地址定域的一個(gè)不同微粒樣本(借助于其偶聯(lián)的本體而區(qū)分開)構(gòu)成一個(gè)微陣列。
通過利用陣列的磁性質(zhì)(例如磁場)和微粒的磁性質(zhì)也可以實(shí)現(xiàn)將微粒定域到特定的地址上。例如，微?？珊需F芯或者另外被衍生化，從而帶有磁性質(zhì)(參見上文)。基片上的每個(gè)地址都可單獨(dú)用所設(shè)計(jì)的集成電路磁化。例如，每個(gè)地址可含有用電線圍繞的金屬芯；電線中的電流方向?qū)Q定地址的磁極性。然后具有特定磁荷的微粒被定域在具有相反磁荷的地址上。
正如本領(lǐng)域所公知的，利用多種類型的微流技術(shù)可實(shí)現(xiàn)定域。參見例如Service(1998)科學(xué)(Science)282399-401；US專利號(hào)5,885,470以及本文提到的參考文獻(xiàn)；以及US專利號(hào)5,932,315和本文提到的參考文獻(xiàn)。利用微流組裝微陣列的非限定性實(shí)例在下文的實(shí)施例2中有所描述。通常，用于本發(fā)明的裝置可包括多個(gè)微粒貯存器10，110等(
圖1)。每個(gè)貯存器含有一個(gè)微粒群11，111等，每個(gè)微粒帶有一個(gè)不同的本體或本體組。將微粒從貯存器釋放到管道12，112等中，并且沿該管道移動(dòng)到部位13，113等處。在每個(gè)獨(dú)特微粒群之間(即貯存器10與110之間，管道12與112之間，部位13與113之間)，有一個(gè)允許緩沖液通過但將微粒保留在它們各自的貯存器、管道和部位中的隔柵。
微粒單獨(dú)或者作為一組通過微流從部位13沿第二管道14移動(dòng)到部位15，并且從那兒，沿管道16移動(dòng)到部位17。在部位17，一組微粒群(每群帶有獨(dú)特的本體或本體組)被緊密接觸地排成行。然后，排成行的微粒沿管道18移動(dòng)到部位19，排成行的微粒在那兒彼此共價(jià)或非共價(jià)交聯(lián)，從而形成微粒鏈20。同樣可形成其它微粒鏈(120，220等)。適用于微粒交聯(lián)的活性基團(tuán)在上文有關(guān)微粒與基片的鍵接以及分子與微粒的偶聯(lián)的討論中有所描述。例如，微粒可用生物素在其表面衍生化。在部位19，在緩沖液貯存器2中，含有親和素或者帶有兩種或多種親和素的衍生接頭分子的合適緩沖液可用來交聯(lián)微粒。同樣可通過合適緩沖液的使用來啟動(dòng)化學(xué)交聯(lián)，其中所述緩沖液通過影響pH值的改變、影響氧化狀態(tài)或者提供催化劑來起作用。
然后微粒鏈20，120等從部位19，119等移動(dòng)到部位21，121等處。重要的是，以一種能夠使鏈整齊堆積的方式來保持其延伸和取向。這可通過以下方式來獲得即在該區(qū)域上設(shè)計(jì)微型程序電極或磁芯，以便引導(dǎo)微粒串的運(yùn)動(dòng)以一種有序的方式排成行并堆積。
最后，微粒鏈20，120等從部位21，121等移動(dòng)并沉積在基片50的表面上，從而產(chǎn)生一個(gè)地址陣列，其中每個(gè)地址包含一個(gè)不同的本體或本體組。
該過程可如所期望的那樣重復(fù)，每次都導(dǎo)致一個(gè)新的微粒陣列沉積在基片上。
在一個(gè)獨(dú)立的實(shí)施方案中，可以在含有偶聯(lián)分子的微粒之間散布沒有攜帶欲顯示的本體的“空”微粒，借此起到間隔區(qū)的作用。這樣具有提供一個(gè)物理屏障的優(yōu)點(diǎn)，從而使得地址之間的交叉污染最小化。
用于定域微粒的其它方法包括例如斑點(diǎn)印跡法和自動(dòng)分配法(如上文所述)，諸如在US專利號(hào)5,807,522中有所描述。
微粒在定域到一個(gè)特定地址上之后，可通過共價(jià)或非共價(jià)鍵與該地址締合。利用諸如生物素與親和素、配體與受體、抗原與抗體之間的結(jié)合作用或者核酸與互補(bǔ)序列之間的雜交作用可實(shí)現(xiàn)非共價(jià)鍵接。利用化學(xué)或酶方法可形成共價(jià)鍵接。通過利用特定的活性基團(tuán)對(duì)可在地址與微粒之間形成共價(jià)鍵(如上文所述)，并且這對(duì)活性基團(tuán)中的一員在地址上，而另一員在微粒上。因此活性基團(tuán)可附著在基片表面和微粒上(如上文所述)。通過采用上述的聚合酶或連接酶的分子生物學(xué)技術(shù)，能夠在基片與微粒之間形成共價(jià)或非共價(jià)鍵。利用附著在微粒和基片上的核酸分子的自由端上的互補(bǔ)序列，可通過雜交形成該鍵接。利用連接或聚合技術(shù)可延伸雜交序列，以便加強(qiáng)鍵合強(qiáng)度。通過利用諸如補(bǔ)骨脂素這些交聯(lián)兩條鏈的試劑(Kornhauser，A.等人(1982).科學(xué)217733)可以使雜交核酸的非共價(jià)鍵轉(zhuǎn)換成共價(jià)鍵。
在任意次的定域循環(huán)之后可實(shí)現(xiàn)微粒與基片的締合。這樣，在一個(gè)微粒群定域到一個(gè)獨(dú)特地址上之后，再發(fā)生締合，或者在許多不同的微粒群定域之后(每個(gè)群體在一個(gè)獨(dú)特的地址上)，再同時(shí)締合所有群體。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，采用一個(gè)包括若干孔的掩模和一個(gè)活性基團(tuán)用來將感興趣的分子或細(xì)胞本體(任意偶聯(lián)到微粒上)連接到基片上，其中所述孔與特定微粒群的預(yù)定部位對(duì)應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該活性基團(tuán)包括光活性基團(tuán)。在另一實(shí)施方案中，該活性基團(tuán)可包括熱活性粘合劑。在若干獨(dú)立的實(shí)施方案中，還可用光纖或微鏡代替本發(fā)明方法中的掩模，以分離用于活化之基片的特定區(qū)域。
例如，單獨(dú)的微粒群可與獨(dú)特的感興趣的化學(xué)、生物和/或細(xì)胞本體偶聯(lián)(如上文所述)。用高密度的光活性基團(tuán)使玻璃或硅石板或片衍生化(如上文所述)。例如可在Pierce目錄中找到合適的光活性基團(tuán)。或者是，用聚合膜涂覆板或片，其中所述聚合膜含有高密度的適宜官能團(tuán)諸如氨基、羧基或環(huán)氧基，其可在進(jìn)一步擴(kuò)增和衍生化后使用或無需進(jìn)一步擴(kuò)增和衍生化而使用。在選擇所用的聚合膜時(shí)，一個(gè)要考慮的因素是，避免使用那些在與光活性基團(tuán)相同的波長處吸收能量的基團(tuán)。為賦予其它特性(諸如親水性、疏水性、正或負(fù)電荷)而作的修飾為本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知，并且在所提到的參考文獻(xiàn)中有所描述(參見上文)。
將微粒(或感興趣的本體)置于適當(dāng)衍生化的表面上。在板或片的一側(cè)，優(yōu)選地在沒有放置微粒的薄片的那一側(cè)，施加一個(gè)掩模，該掩模具有與一個(gè)特定微粒群的預(yù)定部位對(duì)應(yīng)的若干孔。通過掩模傳送適當(dāng)波長的電磁輻射，來激活光活性基團(tuán)，由此啟動(dòng)了偶聯(lián)反應(yīng)，從而使微粒結(jié)合到板上。采用不同掩模和不同微粒群的進(jìn)一步光活性循環(huán)可用來形成偶聯(lián)到不同地址的不同本體群陣列。
還可以用熱活性粘合劑來代替光活性基團(tuán)。適宜的熱活性粘合劑的非限定性實(shí)例及其使用方法在諸如以下文獻(xiàn)中有所描述Bonner，R.F.等人(1997)科學(xué)，278(5342)1481-1483頁，Emmert-Buck，M.等人(1996)科學(xué)，275(5289)998-1001。例如，單獨(dú)的微粒群可與如上所述的獨(dú)特的感興趣化學(xué)、生物和/或細(xì)胞本體偶聯(lián)。利用能夠偶聯(lián)到微粒上的熱活性粘合劑可使玻璃或硅石板或片衍生化。然后將微粒放在被適當(dāng)衍生化的表面上。在板或片的一側(cè)，施加一個(gè)掩模，該掩模具有與一個(gè)特定微粒群的預(yù)定部位對(duì)應(yīng)的若干孔。通過掩膜照射適當(dāng)波長的光線來激活熱活性基團(tuán)，由此啟動(dòng)偶聯(lián)反應(yīng)，從而使微粒結(jié)合到板上。采用不同掩模和不同微粒群的進(jìn)一步粘合循環(huán)可用來形成偶聯(lián)到不同地址的不同本體群陣列。
在這些實(shí)例中，微粒群與基片上特定地址的締合是由掩模上的孔位置決定的。在激活活性基團(tuán)之前，對(duì)微粒群在特定地址的定域幾乎沒有什么要求。然而，如果需要的話可以采用具有順磁性質(zhì)或凈電荷的微粒，并且在微粒光活性偶聯(lián)到板或片上之前施加磁場或電場來增強(qiáng)或控制與板或片締合的微粒密度。在這種情況下，可在整個(gè)板的表面均勻施加磁場或電場，而無需為各個(gè)地址提供特性。在締合步驟之后，可回收沒有結(jié)合上的微粒。板或片被處理干凈并準(zhǔn)備用于采用一個(gè)不同微粒群和掩模的第二輪反應(yīng)，其中掩?？芍笇?dǎo)微粒締合在第二組位置上。
還可在單個(gè)基片上形成包括微粒的多個(gè)微陣列。本文所公開的任何方法都可用于本發(fā)明的工藝過程中。作為一個(gè)非限定性實(shí)例，可以構(gòu)建包括若干孔的一個(gè)掩模并使之與基片接觸，其中所述孔與單個(gè)基片上待制備的每個(gè)陣列的預(yù)定部位相對(duì)應(yīng)。微粒群與基片接觸，并用合適波長的光激活基片上的預(yù)定部位，由此將微粒同時(shí)偶聯(lián)到每個(gè)陣列的預(yù)定部位上。以這種方式，可在板或片上形成大量的陣列并且隨后任意地切成單獨(dú)的微陣列。
包括核酸序列陣列的微陣列可被用作形成其它微陣列的模板，其中新的微陣列包括模板微陣列的互補(bǔ)序列(如下所述)。帶有多個(gè)不同的單鏈核酸序列(任意偶聯(lián)到微粒上)的模板微陣列締合在不同的地址處。在每個(gè)序列的遠(yuǎn)端(即離基片最遠(yuǎn)的端部)存在一個(gè)短的共同序列。第二陣列構(gòu)建為含有一個(gè)與每個(gè)不同地址處的共同序列互補(bǔ)的序列。該共同序列優(yōu)選為至少5個(gè)核苷酸的長度。在另一實(shí)施方案中，該共同序列至少為10個(gè)核苷酸的長度。
在共同序列與其互補(bǔ)序列之間易于進(jìn)行雜交的離子和緩沖液條件下，將這兩個(gè)陣列彼此接觸放置。對(duì)于每個(gè)地址，這些共同序列可相同或不同，只要第二陣列上存在合適的互補(bǔ)序列即可。如果需要的話，可在雜交序列與基片之間插入多種間隔區(qū)(諸如核苷酸均聚物和/或聚乙二醇接頭)，以利于互補(bǔ)序列間的相互作用。優(yōu)選的是，各個(gè)地址相對(duì)離得較遠(yuǎn)，以便使交叉污染最小。
共同序列與其互補(bǔ)序列雜交之后，這些陣列(仍處于鄰近位置)被置于易于進(jìn)行核苷酸聚合的條件下，例如在適當(dāng)?shù)膒H、離子強(qiáng)度和陽離子濃度的條件下供給DNA聚合酶以及脫氧核苷三磷酸鹽基片，這為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知。
聚合作用產(chǎn)生了一個(gè)與存在于模板微陣列上的序列相互補(bǔ)之拷貝的有序微陣列。將這兩個(gè)微陣列上的核酸序列解鏈，以產(chǎn)生模板微陣列和新的互補(bǔ)微陣列。可以重復(fù)這個(gè)過程，從而產(chǎn)生特定微陣列的多個(gè)拷貝。在一些情況下，以這種方式產(chǎn)生微陣列更經(jīng)濟(jì)些。
利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多方法中的任一種可以將許多分離的、可區(qū)分的不同地址放置在基片上。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的，這些方法包括例如顯微機(jī)械加工、微平板印刷術(shù)、電子束平板印刷術(shù)、離子束平板印刷術(shù)和分子束外延。
在一些情況下，需要微陣列上包括一個(gè)定向標(biāo)記。這可通過將一個(gè)或幾個(gè)含有易識(shí)別信號(hào)(諸如發(fā)色團(tuán)或熒光團(tuán))的微粒放在基片的一個(gè)或多個(gè)特定部位上而獲得。為了使定向標(biāo)記與基片上的其它地址區(qū)分開，可使其具有例如不同的形狀或顏色或者是顏色和/或形狀的不同組合。
優(yōu)點(diǎn)首先將感興趣的分子偶聯(lián)到微粒上、然后用這些微粒形成陣列，這樣做有幾個(gè)顯著優(yōu)點(diǎn)。
第一，本發(fā)明的方法包括將分子鏈接到微粒上的初始步驟。這樣做具有獲得更加的可重復(fù)陣列的優(yōu)點(diǎn)。由于分子在微粒上的固定是在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行的，因此所得到的分子與每個(gè)微粒的鏈接與同一容器中分子與任何其它微粒的鏈接都非常相似。在將這些微粒用于陣列之前可對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制測(cè)試。反之，當(dāng)必須對(duì)每個(gè)獨(dú)立的地址單獨(dú)進(jìn)行分子締合(固定)時(shí)，則難以獲得均勻性。相反，微粒與基片的鏈接可通過多個(gè)鍵形成。所有這些都要求，這些多個(gè)鍵的組合強(qiáng)度在一個(gè)閾值之上，該閾值足以通過預(yù)定應(yīng)用所要求的條件保持微粒就位。該鍵強(qiáng)度可大大過剩且不影響陣列的均勻性，因?yàn)榫鶆蛐允怯杀倔w與微粒偶聯(lián)的均勻性決定的。與感興趣的本體直接鏈接到基片上時(shí)的情形相比，各個(gè)地址間基片表面差異不再是本發(fā)明的關(guān)鍵問題。例如，利用直接鍵接，偶聯(lián)到基片上的本體量與每個(gè)地址的反應(yīng)性成比例。任何差異都可影響到地址和微陣列的不一致性。
第二，關(guān)于基片的鍵接性質(zhì)，某些已有方法受到限制。例如，正如諸如US專利號(hào)5,605,662所公開的利用電場對(duì)分子進(jìn)行分布和定域，使分子直接并發(fā)共價(jià)鍵接到基片上，這樣嚴(yán)重限制了對(duì)分子與基片的締合所進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)的選擇。交聯(lián)反應(yīng)必須在電場下進(jìn)行。該反應(yīng)必須既不干擾電場，也不被電場干擾，也不能影響到電解或者對(duì)電解敏感。還有對(duì)反應(yīng)時(shí)間的實(shí)際限制。電場的延期應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致電解的累積問題，而電解能夠損壞包括在陣列中的感興趣的本體。因?yàn)橹付ㄒㄔ陉嚵兄械姆肿踊蚣?xì)胞本體可具有非常多變的化學(xué)性質(zhì)，所以在整個(gè)締合(固定)過程中保持其化學(xué)完整性對(duì)于陣列功能來說是非常重要的。例如，寡核苷酸堿基必須能夠雜交到分析物上，以用作有效的探針，并且雜交能力取決于堿基上的官能團(tuán)的保留值。蛋白質(zhì)甚至比核酸對(duì)化學(xué)操作更敏感。本發(fā)明通過將締合過程分成兩個(gè)步驟(首先，將感興趣的本體鏈接到微粒上，然后利用微粒形成陣列)，可使微粒與基片的締合以及分子與微粒的偶聯(lián)條件的選擇范圍更寬。交聯(lián)反應(yīng)條件的廣泛應(yīng)用使設(shè)計(jì)更佳的締合條件并獲得預(yù)期的最終結(jié)果(例如合適的密度、分子化學(xué)完整性的保持、所需的鏈接基團(tuán)等)變?yōu)榭赡堋Ｔ摲椒ㄟ€克服了有關(guān)使用自動(dòng)化學(xué)分配器的限制，從而可以將少量物質(zhì)分配到每個(gè)地址上，這是由于在蒸發(fā)強(qiáng)烈改變反應(yīng)條件之前分配必須在短時(shí)間內(nèi)完成。
第三，通過微粒將本體傳送到基片上的方法提供了以下選擇，即可利用直接在微粒上衍生的官能團(tuán)進(jìn)行微粒與基片的締合(固定)。用于締合的官能團(tuán)不必是在陣列中待顯示的本體的一部分。這意味著，生物聚合物例如無需擁有用于同基片締合的官能團(tuán)。取而代之的是，這樣的本體例如可通過非共價(jià)相互作用(諸如疏水作用)固定到微粒上，或者本體被物理截留在微粒中。這又提供了保持待顯示的本體化學(xué)完整性的較好機(jī)會(huì)。它還提供了用于微粒與基片締合的化學(xué)類型選擇的較大靈活性。例如，用于微?；|(zhì)和基片的官能團(tuán)比可用于感興趣本體的官能團(tuán)具有更大的化學(xué)活性。它還提供了設(shè)計(jì)和形成具有更適合于選擇應(yīng)用的化學(xué)性質(zhì)的微粒和基片的機(jī)會(huì)。
第四，利用所施加的電場使微粒定域到其對(duì)應(yīng)地址處的微粒上的電荷無需施加到在陣列上待顯示的本體上(即不必使例如生物聚合物帶電)。用適當(dāng)?shù)碾姾墒刮⒘Ｖ苯友苌?。?dāng)構(gòu)成陣列的本體不帶凈電荷時(shí)這一點(diǎn)尤其重要。
第五，本發(fā)明使得在陣列組裝過程中由指定給其他地址的本體對(duì)微陣列上特定地址的污染問題最小化。當(dāng)通過將溶液中的分子引入到基片表面來合成陣列時(shí)，這是個(gè)難以控制的問題，因?yàn)榉肿釉谟邢薜目赡苄韵驴煞翘禺惤Y(jié)合到非指定的地址上。在重復(fù)的結(jié)合循環(huán)之后既使非常低水平的非特異結(jié)合都能導(dǎo)致高程度的交叉污染。例如，在200個(gè)定域循環(huán)之后，每個(gè)循環(huán)0.5％的非特異結(jié)合速率都將導(dǎo)致地址的明顯污染。大量污染物在每個(gè)部位的存在可引起非特異信號(hào)，導(dǎo)致高背景噪音。因?yàn)樵诙ㄓ蛑笪⒘颖菊紦?jù)了明確的物理空間，所以本發(fā)明使得由于非特異結(jié)合而造成的交叉污染問題最小化。一旦一個(gè)空間(諸如一個(gè)地址)被占據(jù)，其他粒子就無法占據(jù)同一空間，借此限制了非指定微粒污染特定地址的能力。而且，與分子相比，從基片表面上較容易洗去非特異締合的微粒。與小分子、甚至與諸如核酸或蛋白質(zhì)這些大分子相比，微粒的剪切質(zhì)量更大。粘合這種微粒與粘合小分子或大分子相比，前者要求的基片與微粒之間的結(jié)合強(qiáng)度要大得多。因此，非特異結(jié)合的問題被最小化了。
第六，不象由被顯示的本體直接化學(xué)合成到微陣列上而制備的微陣列，指定在陣列上顯示的這些分子可被純化，從而確保它們?cè)谂悸?lián)到微粒上之前具有適宜的純度。
應(yīng)用本發(fā)明的微陣列例如可用于診斷、法醫(yī)學(xué)、藥物的發(fā)現(xiàn)與開發(fā)、分子生物學(xué)分析(諸如基于陣列的核苷酸序列分析和基于陣列的基因表達(dá)分析)、蛋白質(zhì)的性質(zhì)和功能的分析、藥物基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和其他生物與化學(xué)分析。
實(shí)施例1利用掩蔽和光活性方法制備微陣列利用自動(dòng)固相合成或者通過利用含有伯脂肪氨基的引物對(duì)之一進(jìn)行PCR來制備含有伯脂肪氨基的DNA獨(dú)立群體。然后用分離合適分子量的Centricon(Amicon)過濾器純化DNA。利用碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺將帶有氨基的純化cDNA鏈接到羧基化的微粒(諸如由Seradyn或BangLaboratories提供)上。用高密度的光活性基團(tuán)使玻璃或硅石片衍生化(如下所述)。用3-氨丙基三甲氧基硅烷溶液處理薄片，可使基片上帶有氨基(Joos，B.等人(1997).分析生物化學(xué)24796-101)。通過與修飾的聚賴氨酸進(jìn)行交聯(lián)可擴(kuò)增氨基的數(shù)目(如下所述)。首先用有限量的琥珀酐修飾聚賴氨酸，從而將小部分氨基轉(zhuǎn)換成羧基。剩余的大部分氨基通過與N-(叔丁氧基羰基氧)琥珀酰亞胺反應(yīng)而被保護(hù)起來。通過采用碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的碳二亞胺化學(xué)反應(yīng)，而將修飾的聚賴氨酸鏈接到基片上。修飾的聚賴氨酸被鏈接到基片上之后，用酸除去保護(hù)基團(tuán)，以便暴露氨基。重復(fù)該步驟，以便將氨官能團(tuán)的數(shù)目擴(kuò)增到所需密度(如上文所述)。在所需的密度水平，這些氨基通過與N-5-疊氮基-2-硝基苯甲酰氧基琥珀酰亞胺(Pierce Chemical Company)反應(yīng)而被轉(zhuǎn)化成光活性基團(tuán)。任何殘余的氨基通過與琥珀酐反應(yīng)而被轉(zhuǎn)化成羧基，從而賦予負(fù)電荷，以減少微粒與基片之間的非特異性作用。
將一微粒群放在被適當(dāng)衍生化的表面上。在與微粒接觸的那一側(cè)相反的薄片的那一側(cè)，施加一個(gè)掩模，該掩模具有用于微粒群預(yù)期位點(diǎn)處若干孔。通過掩模傳遞適當(dāng)波長的電磁輻射來激活光活性基團(tuán)，由此啟動(dòng)了偶聯(lián)反應(yīng)，從而將微粒結(jié)合到基片上。用不同的掩模重復(fù)該過程，從而使其他微粒群與基片上所預(yù)期的部位締合。
實(shí)施例2利用微流方法制備微陣列本發(fā)明的示范性裝置(圖1)包括多個(gè)微粒貯存器10，110等。每個(gè)貯存器含有一個(gè)微粒群(在其表面用生物素衍生化)11，111等，而每個(gè)微粒群帶有獨(dú)一類型的本體。微粒從貯存器中被釋放到管道12，112等中，并沿管道移動(dòng)到部位13，113等。每個(gè)獨(dú)特的微粒群之間(即貯存器10與110之間，管道12與112之間，以及部位13與113之間)是允許緩沖液(例如水)通過但將微粒保留在它們各自的貯存器、管道和部位中的隔柵。
利用微流將一微粒群(單獨(dú)地或作為一組)從例如部位13沿第二管道14移動(dòng)到部位15，并且從那兒，沿管道16移動(dòng)到部位17。在部位17，該微粒群緊密接觸排成行。然后排成行的微粒沿管道18移動(dòng)到部位19，排成行的微粒于此處共價(jià)或非共價(jià)彼此交聯(lián)，從而形成微粒鏈20。同樣，其他微粒鏈120，220等形成并移動(dòng)到部位119，219等。在部位19，119等，在緩沖液貯存器2內(nèi)，用含有親和素的緩沖液交聯(lián)微粒。
然后微粒鏈20，120等從部位19，119等遷移到部位21，121等。重要的是，以一種能夠使鏈整齊堆積的方式來保持鏈的延伸和定向。這可通過以下方式來獲得即在該區(qū)域上設(shè)計(jì)微型程序電極或磁芯，以引導(dǎo)這些微粒鏈的運(yùn)動(dòng)，使它們與其他微粒鏈以一種有序的方式排列并堆積，從而在部位21，121等形成一個(gè)陣列。
最后，微粒鏈20，120等從部位21，121等移動(dòng)并沉積到基片50的表面上，從而產(chǎn)生一個(gè)地址陣列。其中每個(gè)地址都包括一個(gè)不同的本體。實(shí)施例3利用一個(gè)微陣列作為制備其他微陣列的模板包括一個(gè)核酸序列陣列的微陣列可用作制備其他微陣列的模板(如下所述)。
如下制備模板微陣列將多個(gè)獨(dú)特的核酸序列結(jié)合到微粒上，并將微粒結(jié)合到基片上，從而每個(gè)獨(dú)特的核酸序列都占據(jù)了基片上的一個(gè)獨(dú)特地址。核酸的3’端被偶聯(lián)到微粒上，而5’端遠(yuǎn)離微粒。在每個(gè)核酸序列的遠(yuǎn)端(即距離微粒最遠(yuǎn)的那一端)存在一個(gè)短的共同單鏈核酸序列，且其5’端遠(yuǎn)離微粒。
如下制備用于新陣列的基片與共同序列互補(bǔ)的核酸序列被結(jié)合到微粒上，其中所述互補(bǔ)的核酸序列具有偶聯(lián)到微粒上的5’端，還有3’遠(yuǎn)端。這些微粒結(jié)合到第二基片上的不同地址處。
在共同序列與它們的互補(bǔ)序列之間易于進(jìn)行雜交的離子和緩沖液條件下，將這兩個(gè)陣列彼此接觸放置。
共同序列與其互補(bǔ)序列間雜交之后，這些陣列(仍處于鄰近位置)被置于易于進(jìn)行核苷酸聚合的條件下，通過在適當(dāng)?shù)膒H、離子強(qiáng)度和陽離子濃度的條件下供給DNA聚合酶以及脫氧核苷三磷酸鹽基片，而進(jìn)行核苷酸的聚合反應(yīng)(正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的)。然后這兩個(gè)陣列在本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的適當(dāng)條件下解鏈，從而將這兩個(gè)微陣列分開，每個(gè)微陣列都含有單鏈核酸。
基于模板微陣列上的核酸序列通過聚合作用，在第二微陣列上產(chǎn)生了一個(gè)有序的新核酸序列陣列。這產(chǎn)生了一個(gè)與模板微陣列上的序列互補(bǔ)的核酸序列微陣列，其中新的核酸序列在5’端與共同序列的互補(bǔ)序列相連。
為了清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，業(yè)已借助于闡述和實(shí)施例更詳細(xì)地描述了上述發(fā)明，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解可在不脫離本發(fā)明精髓的基礎(chǔ)上，進(jìn)行多種改變和改進(jìn)。因此上述描述和實(shí)施例并不是對(duì)本發(fā)明范圍的限制。
權(quán)利要求
1.一種微陣列，其包括(a)一個(gè)基片，其中該基片用以下物質(zhì)衍生化i)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及至少一層包括多個(gè)第二官能團(tuán)的交聯(lián)化合物，或者ii)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及包括多個(gè)第二官能團(tuán)的聚合膜；以及(b)或者i)一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，其中這個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體通過本體與第二官能團(tuán)的偶聯(lián)，而與基片上的一個(gè)不同地址締合，或者ii)一個(gè)微粒群，其中該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體，并且該微粒群通過第二官能團(tuán)與微粒的偶聯(lián)，而與基片上的一個(gè)不同地址締合，從而該至少一種感興趣的本體占據(jù)了基片上的一個(gè)不同地址。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微陣列，其中該微陣列包括多個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體或者微粒群。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體選自于核酸、多肽、碳水化合物、細(xì)胞、激素、配體、氨基酸、類脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體是核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體是多肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體是細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體是組合化學(xué)工藝過程的產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微陣列，其中多于一種類型的本體占據(jù)了基片上的一個(gè)不同的地址。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的微陣列，其中每個(gè)地址包含至少一種多肽和至少一種核酸。
10.一種微陣列，其包括(a)一個(gè)基片；以及(b)一個(gè)微粒群，其中該微粒群與基片上的一個(gè)不同地址締合，并且該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體，該至少一種感興趣的本體選自多肽、碳水化合物、細(xì)胞、激素、配體、氨基酸、類脂、脂肪酸以及小分子；從而該至少一種感興趣的本體占據(jù)了基片上的一個(gè)不同地址。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的微陣列，其中該微陣列包含多個(gè)的微粒群。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體是多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體是細(xì)胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體是組合化學(xué)工藝過程的產(chǎn)物。
15.一種微陣列，其包括(a)一個(gè)基片；以及(b)一個(gè)微粒群，其中每個(gè)微粒的直徑都小于1μm，該微粒群與基片上的一個(gè)不同地址締合，并且該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體，從而該至少一種感興趣的本體占據(jù)了基片上的一個(gè)不同地址。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的微陣列，其中該微陣列包括多個(gè)的微粒群。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體選自核酸、多肽、碳水化合物、細(xì)胞、激素、配體、氨基酸、類脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體是核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體是多肽。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體是細(xì)胞。
21.一種微陣列，由以下方法制備(a)提供一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，其中這些本體任意偶聯(lián)到微粒上；(b)提供一個(gè)基片，其中該基片用能夠偶聯(lián)到感興趣的本體或任意微粒上的活性化合物衍生化；(c)使本體群與基片接觸；以及(d)激活基片上預(yù)期位點(diǎn)處的活性化合物，從而使本體群在預(yù)期位點(diǎn)上被偶聯(lián)到基片上。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微陣列，其中包括多個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微陣列，其中該活性化合物由電磁輻射激活。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微陣列，其中預(yù)期部位由包括至少一個(gè)孔的掩模分離，其中所述孔與用于本體群的預(yù)期部位相對(duì)應(yīng)。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微陣列，其中預(yù)期部位由光纖束分離。
26.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微陣列，其中預(yù)期部位由微鏡分離。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微陣列，其中本體與微粒偶聯(lián)，并且基片用能夠與微粒偶聯(lián)的活性化合物衍生化。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微陣列，其中活性化合物為光活性化合物。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微陣列，其中該活性化合物是熱活性粘合劑。
30.根據(jù)權(quán)利要求21所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體選自核酸、多肽、碳水化合物、細(xì)胞、激素、配體、氨基酸、類脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。
31.一種用于構(gòu)建微陣列的方法，其中該方法包括以下步驟(a)提供一個(gè)基片，其中該基片用以下物質(zhì)衍生化i)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及至少一層包括多個(gè)第二官能團(tuán)的交聯(lián)化合物，或者ii)包括第一官能團(tuán)的第一化合物，以及包括多個(gè)第二官能團(tuán)的聚合膜；(b)提供或者i)一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，或者ii)提供一個(gè)微粒群，其中該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體；(c)將本體或微粒群定域在基片上的不同地址處；以及(d)被定域的本體或微粒群通過第二官能團(tuán)與感興趣的本體或微粒的偶聯(lián)，而與基片上的其不同地址締合。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的微陣列，其中該至少一種感興趣的本體選自核酸、多肽、碳水化合物、細(xì)胞、激素、配體、氨基酸、類脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。
33.一種用于構(gòu)建微陣列的方法，其中該方法包括以下步驟(a)提供一個(gè)具有至少一種感興趣本體的群體，其中該本體任意偶聯(lián)到微粒上；(b)提供一個(gè)基片，其中該基片用能夠偶聯(lián)到感興趣本體或任意微粒上的活性化合物衍生化；(c)使本體群與基片接觸；以及(d)激活基片上預(yù)期位點(diǎn)處的活性化合物，從而使本體群在預(yù)期位點(diǎn)處與基片偶聯(lián)。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其包含多于一個(gè)的具有至少一種感興趣本體的群體。
35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中活性化合物由電磁輻射激活。
36.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中預(yù)期部位由包括至少一個(gè)孔的掩模分離，該孔與用于本體群的預(yù)期部位相對(duì)應(yīng)。
37.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中預(yù)期部位由光纖束分離。
38.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中預(yù)期部位由微鏡分離。
39.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中該活性化合物是光活性化合物。
40.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中該活性化合物是熱活性粘合劑。
41.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中該至少一種感興趣的本體選自核酸、多肽、碳水化合物、細(xì)胞、激素、配體、氨基酸、類脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。
42.一種制備包括核酸序列的微陣列的方法，該方法包括以下步驟(a)提供包括以下組分的第一微陣列(i)第一基片；(ii)具有至少一種核酸序列的第一群體，其中該至少一種核酸序列在其遠(yuǎn)端包括第一核酸雜交序列，該第一核酸序列任意偶聯(lián)到微粒上，并且核酸序列群與第一基片上的一個(gè)不同地址締合；(b)提供包括以下組分的第二微陣列(i)第二基片；(ii)第二雜交序列群，其中該第二雜交序列與第一雜交序列互補(bǔ)，第二雜交序列群被任意偶聯(lián)到微粒上，并且該雜交序列群與第二基片上的一個(gè)不同地址締合；(c)在雜交條件下使第一和第二微陣列互相接觸，從而使第一和第二雜交序列雜交；(d)使所雜交的第一和第二微陣列暴露于核苷酸聚合的條件下，從而將所述的來自第一微陣列之至少一種核酸序列用作制備第二微陣列上的互補(bǔ)核酸序列的模板。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中第一和第二雜交序列具有至少5個(gè)核苷酸的長度。
44.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中至少一種核酸序列是DNA序列。
45.根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中至少一種核酸序列是RNA序列。
46.一種用于在一個(gè)基片上制備微陣列的多個(gè)拷貝的方法，該方法包括以下步驟(a)提供一微粒群，其中該微粒群上偶聯(lián)有至少一種感興趣的本體；(b)提供一個(gè)用于微陣列的多個(gè)拷貝的基片；(c)在基片上待制備的每個(gè)微陣列的所需位點(diǎn)上將微粒群定域到基片上；以及(d)在基片上待制備的每個(gè)微陣列的所需位點(diǎn)上使微粒群與基片締合。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中微粒通過光活化與基片締合。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中微粒通過熱活性粘合劑與基片締合。
49.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中微粒通過自動(dòng)分配定域到預(yù)期部位上。
50.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中微粒通過微流定域到預(yù)期部位上。
51.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中微粒通過電場定域到預(yù)期部位上。
52.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中微粒通過磁場定域到預(yù)期部位上。
53.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中該至少一種感興趣的本體選自核酸、多肽、碳水化合物、細(xì)胞、激素、配體、氨基酸、類脂、脂肪酸、小分子、核苷以及核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含地址已知的微粒的微陣列，其中微粒與感興趣的化學(xué)、生物和/或細(xì)胞本體偶聯(lián)。本發(fā)明還提供了用于制備微陣列的方法。
文檔編號(hào)B01J19/00GK1402796SQ00816508
公開日2003年3月12日 申請(qǐng)日期2000年11月2日 優(yōu)先權(quán)日1999年11月2日
發(fā)明者胡元徽 申請(qǐng)人:胡元徽