專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞的定性和定量分析方法及相關(guān)的光學(xué)生物盤(pán)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及生物、化學(xué)、細(xì)胞學(xué)、和診斷測(cè)定，具體說(shuō)，是涉及用光學(xué)生物盤(pán)，對(duì)從血液、血液白血病、淋巴瘤、骨髓、干細(xì)胞取得的細(xì)胞種群進(jìn)行的測(cè)定。更具體說(shuō)，但不是對(duì)本文后面以最佳實(shí)施模式說(shuō)明的特定實(shí)施例的限制，本發(fā)明涉及用光學(xué)生物盤(pán)，檢測(cè)生物抽樣中細(xì)胞分析物的方法和設(shè)備。
背景技術(shù)：
血細(xì)胞計(jì)數(shù)在診斷、治療、以及隨后確定病人健康狀況時(shí)，常常使用。全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(CBC)，是收集測(cè)試物，包括血紅蛋白、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞平均容積、血小板計(jì)數(shù)、和白細(xì)胞計(jì)數(shù)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)是計(jì)算全血每cu.mm.的紅細(xì)胞和白細(xì)胞數(shù)目。
白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC，白細(xì)胞)是在標(biāo)準(zhǔn)血樣中白細(xì)胞的總數(shù)。在正常的健康人中，典型的WBC計(jì)數(shù)是每微升(μL)4000到10800細(xì)胞。諸如鍛練、緊張、和疾病等因素，能影響這些數(shù)值。高的WBC可能表示感染、白血病、或組織損傷。如果它下降至每微升1000細(xì)胞以下，有增加感染的危險(xiǎn)。
白細(xì)胞分類(lèi)測(cè)試，實(shí)質(zhì)上是搜集超出白細(xì)胞計(jì)數(shù)本身可獲得的信息以外的信息。白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)，用于評(píng)價(jià)新的疑似感染或發(fā)燒(即使CBC正常)、疑似與異常有關(guān)的失調(diào)、異常白細(xì)胞計(jì)數(shù)、疑似白血病、其他如嗜曙紅細(xì)胞增多、單核細(xì)胞增多、和嗜堿白細(xì)胞增多等異常。當(dāng)存在嚴(yán)重的白細(xì)胞減少時(shí)，應(yīng)反復(fù)進(jìn)行白細(xì)胞或白細(xì)胞分類(lèi)測(cè)試(如，僅次于藥物療法)。在治療時(shí)，例如化學(xué)療法和放射療法時(shí)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)確定該治療是否除癌細(xì)胞外還排除健康的血細(xì)胞，是十分重要的。
分類(lèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)由可計(jì)算的細(xì)胞計(jì)數(shù)裝置確定。該機(jī)器確定總計(jì)數(shù)和五種主要白細(xì)胞類(lèi)型的百分比。在正常的個(gè)體中，大部分是中性白細(xì)胞(50-60％)，接著是淋巴細(xì)胞(20-40％)，然后是單核細(xì)胞(2-9％)，少量嗜酸性細(xì)胞(1-4％)和嗜堿白細(xì)胞(0.5-2％)。
在淋巴細(xì)胞的分類(lèi)中，還有幼淋巴細(xì)胞(lymphocytesa)和細(xì)胞的更多亞類(lèi)。例如，淋巴細(xì)胞可以廣泛地分為T(mén)細(xì)胞(胸腺衍化淋巴細(xì)胞)和B細(xì)胞(囊等同淋巴細(xì)胞)，分別負(fù)責(zé)細(xì)胞中介免疫和體液的免疫。雖然已經(jīng)用形態(tài)學(xué)的特征在淋巴細(xì)胞內(nèi)分類(lèi)，但是，已經(jīng)證明，在區(qū)分淋巴細(xì)胞亞類(lèi)的許多功能中，僅用形態(tài)學(xué)是不夠的。為了區(qū)分具有各種功能的淋巴細(xì)胞，已經(jīng)發(fā)展了各種技術(shù)，包括紅細(xì)胞形成玫瑰花結(jié)分析、免疫熒光顯微鏡分析、酶組織化學(xué)分析、和最近的單克隆抗體分析。T細(xì)胞可以通過(guò)它們表面上包括的兩種糖蛋白表面標(biāo)記物CD4和CD8(CD4+T細(xì)胞和CD8+細(xì)胞)的存在，加以區(qū)別。CD4+T輔助細(xì)胞涉及抗體中介免疫。它們與B細(xì)胞遞呈的抗原結(jié)合。結(jié)果是分泌對(duì)抗抗原物質(zhì)的抗體漿細(xì)胞克隆的發(fā)育。T細(xì)胞對(duì)細(xì)胞中介免疫是必不可少的。CD4+細(xì)胞與抗原遞呈細(xì)胞(APC)，如吞噬細(xì)胞的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞遞呈的抗原結(jié)合。然后，T細(xì)胞釋放把其他細(xì)胞吸引至該區(qū)域的淋巴因子。結(jié)果是炎癥，同時(shí)，細(xì)胞和分子蓄積起來(lái)，試圖把抗原物質(zhì)隔開(kāi)并破壞抗原物質(zhì)。
CD8+，細(xì)胞毒素/抑制因子型細(xì)胞分泌破壞已經(jīng)和它們結(jié)合的細(xì)胞的分子。如果靶細(xì)胞已被病毒感染，這是一種十分有用的功能，因?yàn)樵诩?xì)胞可以釋放新鮮的一批病毒，使其他細(xì)胞感染之前，細(xì)胞通常已被破壞。
HIV和AIDS人類(lèi)免疫缺陷病毒，一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，對(duì)CD4+T細(xì)胞具有高的親和力，因而CD4 T細(xì)胞是該病毒的強(qiáng)勁靶。獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)提供CD4+T細(xì)胞在免疫中鮮明和悲劇性的重要例證。人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)與CD4分子結(jié)合，從而入侵并感染CD4+T細(xì)胞。隨著疾病的進(jìn)展，CD4+T細(xì)胞數(shù)下降至它約每微升(μl)1000的正常范圍以下。一種解釋是，可能病人的CD8+T細(xì)胞不斷努力破壞受感染的CD4+T細(xì)胞。
當(dāng)血液中CD4+T細(xì)胞數(shù)下降至每微升400以下時(shí)，病人建立免疫應(yīng)答的能力急劇下降。病人不但對(duì)入侵身體的病原體變得感受性過(guò)強(qiáng)，而且對(duì)微生物，特別是通常寄居于我們組織內(nèi)不傷害我們的細(xì)菌，也變得過(guò)于敏感。最終病人死于偶然的感染，如念珠菌病、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、肺囊蟲(chóng)隆突(Pneumocystis carinii)、肺炎、弓形體病、結(jié)核病、和其他。
CD4+和CD8+T細(xì)胞數(shù)的估計(jì)，和CD4+/CD8+T細(xì)胞比值，對(duì)評(píng)定患有免疫缺乏疾病的病人的免疫健康是有用的。例如，個(gè)別患有AIDS病的人表明CD4+T細(xì)胞在免疫中的重要性。隨著疾病的進(jìn)展，CD4+T細(xì)胞數(shù)下降至它每μl約1000細(xì)胞的正常范圍以下。隨著病人的CD8+T細(xì)胞破壞受感染的CD4+T細(xì)胞，未感染的CD4+T細(xì)胞可能經(jīng)受脫噬作用。因此，CD4+對(duì)CD8+T的細(xì)胞比值，可以為疾病的進(jìn)程提供一種診斷標(biāo)記。U.S.Public Health Service推薦每3-6個(gè)月監(jiān)控所有受感染人員的CD4+的水平(在美國(guó)，600個(gè)測(cè)試實(shí)驗(yàn)室完成4千萬(wàn)人的測(cè)試)。
除CD4和CD8之外，還有許多其他細(xì)胞的表面抗原(如CD3、CD16、CD19、CD45、CD56)可以用來(lái)識(shí)別淋巴細(xì)胞的亞類(lèi)。用抗體技術(shù)檢測(cè)這些細(xì)胞表面抗原的能力，為診斷病理學(xué)添加新的方向，同時(shí)有各種技術(shù)可用來(lái)研究血淋巴(hemotolymphoid)失調(diào)的免疫表型(immunophenotypes)(如AIDS、白血病、和淋巴癌)。常規(guī)的微量免疫測(cè)定，如放射免疫測(cè)定(RIA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、熒光免疫測(cè)定(FIA)使用同位素、酶、或熒光物質(zhì)，檢測(cè)相應(yīng)分析物的存在或不存在。
治療AIDS有許多治療方法。下面的方法由方法本身或與其他方法組合，成功地用于治療該疾病。
1.核苷同型物逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(Nucleoside analog reversetranscriptase inhibitors)(NUKES)，第一種阻斷逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄的抗HIV藥物，它通過(guò)提供中斷該過(guò)程的“誘導(dǎo)物”積木塊，阻斷從RNA合成病毒的DNA需要的逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄(藥物如Zidovudine Retrovir AZT、Didanosine Videx、Zalcitabine Hivid、dideoxycytidine、StavudineZerit、Lamivudine Epivir、Zidovudine/Lamivudine Combivir、Abacavir Ziagen、Zidovudine/Lamivudine/Abacavir)。
2.非核苷同型物逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(Non-nucleoside analogreverse transcriptase inhibitors)(NNRTI或NON-NUKES)，它通過(guò)與逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄酶的結(jié)合，限制其活性，中斷逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄(藥物如Nevirapine Viramune、Delavirdine Rescriptor、Efavirenz Sustiva)。
3.蛋白酶抑制劑，阻斷蛋白酶的作用，該蛋白酶是一種酶，它把HIV蛋白鏈切斷成組裝病毒新基因副本必需的特定的蛋白(藥物如Saquinavir Invirase、Ritonavir Norvir、Indinavir Crixivan、NelfinavirViracept、Saquinavi Fortovase、Amprenavir Agenerase、SaquinavirInvirase等等)。
4.整合酶抑制劑，阻斷整合酶的作用，整合酶是一種酶，它把病毒DNA插入受感染細(xì)胞的DNA鏈。還沒(méi)有整合酶抑制劑已經(jīng)被批準(zhǔn)(Zintevir尚在人體試驗(yàn)的第一階段)。
5.附著并融合的抑制劑，阻止HIV病毒附著在細(xì)胞上。還沒(méi)有融合抑制劑已經(jīng)被批準(zhǔn)(AMD-3100，Pentafusided，T 1249，PRO 452，和SC351125，尚在試驗(yàn)的第一和第二階段)。
6.抵抗意義的藥物，存在部分HIV遺傳碼的“鏡像”，它鎖定病毒，阻止病毒發(fā)生作用。一種抵抗意義的藥物，是由Enzo研發(fā)的HGTV43，尚在試驗(yàn)的第一階段。
7.免疫刺激劑，利用人體化學(xué)信使刺激免疫應(yīng)答。白細(xì)胞介素2(II-2，Aldesleukin、Proleukin、和Multikine，以及滅活病毒制劑HIV-1 Immunogen正處在試驗(yàn)的第3階段)。
白血病白血病是一種源于骨髓細(xì)胞的惡性疾病。它的特征是發(fā)育中的骨髓細(xì)胞不受控制地生長(zhǎng)。白血病主要分為骨髓內(nèi)生成的或淋巴細(xì)胞生成的兩種，每一種都可以是急性的或慢性的。急性白血病發(fā)展很快，且一般還使沒(méi)有充分發(fā)育的細(xì)胞病變。這些未成熟的細(xì)胞因此不能充分施行它們的正常功能。另一方面，慢性白血病發(fā)展緩慢，并允許更多成熟和功能性細(xì)胞生長(zhǎng)。白血病使淋巴細(xì)胞(淋巴細(xì)胞白血病)或骨髓細(xì)胞(骨髓的白血病)病變。淋巴細(xì)胞白血病使白細(xì)胞或淋巴細(xì)胞病變，而骨髓白血病則包括除淋巴細(xì)胞外的其他類(lèi)型血細(xì)胞病變。骨髓的或淋巴細(xì)胞的這兩個(gè)詞，是指累及的細(xì)胞類(lèi)型。有四種主要類(lèi)型的白血病，急性的或慢性的骨髓白血病，和急性的或慢性的淋巴白血病。白血病的原因尚不清楚，但似乎與白細(xì)胞未能發(fā)育成熟有關(guān)。
通常，成熟的白細(xì)胞不能再生，而由骨髓中產(chǎn)生的新的細(xì)胞取代。相反，白血病細(xì)胞有能力再生，但不會(huì)充分發(fā)育，達(dá)到適當(dāng)?shù)墓δ?。隨著白血病的發(fā)展，白血病細(xì)胞置換正常的白細(xì)胞，使病人極易受感染。有若干種白血病的形式，都有急性和慢性的，它們按照病變的白細(xì)胞分類(lèi)。白血病中涉及的主要白細(xì)胞類(lèi)型，包括白細(xì)胞和多形核白細(xì)胞。
有兩種主要的急性白血病形式，急性的成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)和急性的成髓細(xì)胞白血病(AML)。ALL使淋巴細(xì)胞病變，并更常見(jiàn)于在兒童出現(xiàn)。AML使形成多形核的白細(xì)胞的細(xì)胞病變，并更常見(jiàn)于成人，雖然它可以出現(xiàn)在任何年齡。急性白血病是一種迅速發(fā)展的疾病，可導(dǎo)致未成熟的、無(wú)功能的細(xì)胞在骨髓和血液中蓄積。骨髓常常不能再產(chǎn)生足夠的正常紅和白細(xì)胞及血小板。貧血，一種紅細(xì)胞缺乏，在實(shí)際上的所有白血病病人身上發(fā)展。正常的細(xì)胞的缺乏，損傷人體與感染斗爭(zhēng)的能力。血小板的短缺，導(dǎo)致皮下出血和易出血。
慢性白血病有兩種，慢性骨髓白血病(CML)和慢性淋巴白血病(CLL)。CML使未成熟的多形核白細(xì)胞病變，常見(jiàn)于35歲以后。CLL使淋巴組織和淋巴管細(xì)胞病變，常發(fā)生在超過(guò)50歲的男人身上。對(duì)那些患有慢性白血病病人的預(yù)后，很大程度上與疾病出現(xiàn)的年齡有關(guān)；如同AML一樣，癥狀可以控制，壽命可以延長(zhǎng)?；加蠧ML的病人比那些患有CLL的病人更易死于白血病，因?yàn)镃ML通常在更年輕的年齡上開(kāi)始。
白血病的專(zhuān)門(mén)診斷要求血細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓活組織檢查。白血病是通過(guò)血液中存在大量異常白細(xì)胞，和在骨髓中存在典型的白血病細(xì)胞而證實(shí)的。對(duì)慢性白血病，病人可能不知道患有該疾病，而診斷往往僅當(dāng)病人為另外原因，如在例行體檢或在外科手術(shù)前的檢查時(shí)作出的。
急性和慢性的白血病的治療，常常是類(lèi)似的，但還依賴(lài)于每一情況下涉及的各種因素。治療的目的，是抑制白血病細(xì)胞的再生。防止細(xì)胞繁殖的細(xì)胞毒素藥物，被用于此目的?？焖俜至训陌籽〖?xì)胞，比正常白細(xì)胞對(duì)這些藥物更為敏感。急性白血病的治療，常常涉及一并使用若干種細(xì)胞毒素藥物。一旦白血病細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)降下來(lái)，需用皮質(zhì)類(lèi)固醇和只用一種或兩種細(xì)胞毒素藥物維持病情的改善。對(duì)慢性白血病，也用細(xì)胞毒素藥物和皮質(zhì)類(lèi)固醇。在某些情形下，輸血可能是必要的。白血病的診斷，要求檢查血液中或骨髓中的細(xì)胞。治療的目的，是促成完全的緩解。完全的緩解是指沒(méi)有疾病的證據(jù)，和病人回復(fù)到良好的健康狀況，具有正常的血細(xì)胞和骨髓細(xì)胞。復(fù)發(fā)表示白血病細(xì)胞的回復(fù)，和疾病其他病征和癥狀的回復(fù)。
絕大多數(shù)急性白血病的臨床發(fā)現(xiàn)，是由于骨髓衰竭導(dǎo)致正常骨髓要素被惡性細(xì)胞代替。較少見(jiàn)的表現(xiàn)，包括直接器官浸潤(rùn)(皮膚、胃腸道、腦膜)。急性的成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)，兒童急性白血病占80％。高峰發(fā)病率在3歲到7歲的年齡之間。但是，ALL也見(jiàn)于成人，急性白血病中成人約占20％。急性骨髓白血病(AML；急性骨髓白血病，“ANLL”)主要是成人的疾病。
慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)，是一種B淋巴細(xì)胞(罕見(jiàn)于T淋巴細(xì)胞)單克隆惡性腫瘤。該疾病通常是無(wú)痛的，伴隨緩慢發(fā)展的長(zhǎng)壽小淋巴細(xì)胞的蓄積。這些細(xì)胞是無(wú)免疫活性的。慢性淋巴細(xì)胞白血病的臨床表現(xiàn)是免疫抑制、骨髓衰竭、和器官浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。
疾病的評(píng)定，是用判定支配胚細(xì)胞種群的譜系配位的主要小組完成的，接著是用依賴(lài)于主要小組結(jié)果的、表征胚細(xì)胞種群明確表型和成熟期的mAbs第二小組。另外，對(duì)樣品中廣泛范圍未成熟和成熟造血細(xì)胞的最直接的“大范圍”特征，選出一預(yù)定的小組。當(dāng)惡性細(xì)胞尚處在少數(shù)時(shí)，這些“大范圍”特征可以增加測(cè)試的靈敏度，并且有助于表征病理學(xué)細(xì)胞的異種性，以及在其他細(xì)胞譜系成熟中伴隨的干擾。此外，該對(duì)策為與染色結(jié)果的一致性提供一種更好的控制。
白血病免疫表型白血病中的表面標(biāo)記物，為診斷和預(yù)后目的，幫助識(shí)別腫瘤的譜系。了解白血病表型，從觀察臨床歷史和形態(tài)開(kāi)始，同時(shí)對(duì)每一情況選擇一小組標(biāo)記物。在大多數(shù)情況下，譜系能識(shí)別為T(mén)細(xì)胞、B細(xì)胞、或骨髓，然后可以作出診斷或分類(lèi)診斷。
白血病表型的目的，是識(shí)別瘤形成過(guò)程的細(xì)胞類(lèi)型。該表型識(shí)別可以描繪細(xì)胞譜系和成熟程度的輪廓，作為白血病或淋巴瘤分類(lèi)的輔助。還有，該表型識(shí)別可以幫助確定細(xì)胞種群是正常的還是異常的，并檢測(cè)樣品中細(xì)胞種群的以前特征，以便監(jiān)控疾病的緩解、發(fā)展、或復(fù)發(fā)。
然后，進(jìn)行全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(包括白細(xì)胞計(jì)數(shù))。血細(xì)胞計(jì)數(shù)是疾病對(duì)治療應(yīng)答的一個(gè)重要指數(shù)。這些計(jì)數(shù)對(duì)了解藥物治療或放射療法的效果，也是重要的。血細(xì)胞計(jì)數(shù)有助于確定某一藥物是否起作用。細(xì)胞的實(shí)際計(jì)數(shù)通常用昂貴的電子計(jì)數(shù)器完成，它要求技術(shù)專(zhuān)家使用該計(jì)數(shù)器進(jìn)行測(cè)試。每一種細(xì)胞的圖譜，表明是否存在白血病以及白血病類(lèi)型。
平均說(shuō)，每立方毫米血液約有4000到11,000個(gè)白細(xì)胞。如果總WBC計(jì)數(shù)超過(guò)11,000細(xì)胞/mm3，被稱(chēng)為白細(xì)胞增多，是一種身體對(duì)感染的正常應(yīng)答。但是，如果存在過(guò)量的異常WBC(白血病的胚細(xì)胞)，則被稱(chēng)為白血病。血液中有約5百萬(wàn)紅細(xì)胞/mm3。異常低的RBC可能是貧血的結(jié)果。貧血是白血病的征兆。
白血病免疫表型是在血液或骨髓樣本中完成的，但是，也可以觀察其他液體或組織。用RBC溶解方法，或用諸如聚蔗糖泛影鈉等密度梯度分離方法，獲得白細(xì)胞。只要有可能，應(yīng)在處理前進(jìn)行總的白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)，且細(xì)胞濃度要作相應(yīng)的調(diào)整。
單克隆抗體小組許多實(shí)驗(yàn)室使用多色免疫熒光檢測(cè)(multicolorimmunofluorescence detection)，但是在某些情形下，適合用單色免疫熒光檢測(cè)。抗體照例包括CD2、CD3、CD5、CD10、CD11c、CD14、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD45、CD103、FMC7、重鏈、Kappa、和Lambda。如果臨床的或形態(tài)學(xué)的特征提出“T”或“NK”淋巴細(xì)胞失調(diào)，那么，還需進(jìn)行下面附加的抗體組合CD3/CD4/CD8、CD7/CD5/HLA-DR、CD25/CD2/CD3、CD16/CD56/CD19、CD57/CD8/CD3、TCR alpha-beta/delta-gamma/CD3。
有許多當(dāng)前的生物療法可用于與白血病斗爭(zhēng)。例如，對(duì)白血病，骨髓置換療法并防止排斥捐獻(xiàn)者骨髓，已經(jīng)取得效果。干擾素也已經(jīng)用于慢性骨髓白血病(CML)的治療。
白血病胚細(xì)胞的存在也已經(jīng)被骨髓的觀察所證實(shí)。抽取骨髓液體并在顯微鏡下觀察。然后可以證實(shí)白血病胚細(xì)胞。如果在骨髓樣品中發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞，那么再進(jìn)行測(cè)試，以確定疾病的程度。用腰椎穿刺，檢驗(yàn)充滿(mǎn)腦索和脊索內(nèi)及周?chē)臻g的液體中的白血病細(xì)胞，用腦脊髓液及X射線(xiàn)檢驗(yàn)疾病向胸部的擴(kuò)散。
不同的化學(xué)療法藥物，以不同的方式攻擊癌細(xì)胞。因此，常常同時(shí)提供組合的化學(xué)療法治療，使化學(xué)療法的效果最大化。
淋巴瘤傳統(tǒng)上，已經(jīng)用形態(tài)學(xué)特征按功能相似性把細(xì)胞分類(lèi)成組。但是，僅靠形態(tài)學(xué)來(lái)區(qū)分淋巴細(xì)胞亞類(lèi)(T細(xì)胞、B細(xì)胞、和天然殺傷細(xì)胞，等等)的許多功能性能力，已被證明是不適當(dāng)?shù)?。已?jīng)發(fā)展了各種按功能區(qū)分淋巴細(xì)胞的技術(shù)，包括玫瑰花結(jié)分析、免疫熒光顯微鏡分析、酶組織化學(xué)分析、和最近的以熒光標(biāo)記的單克隆信號(hào)抗體的流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(flow cytometry)。淋巴細(xì)胞可以廣義地分為T(mén)細(xì)胞(胸腺衍化)和B細(xì)胞(囊等同)，它們分別負(fù)責(zé)細(xì)胞中介免疫和體液的免疫。
淋巴瘤是一組源自淋巴細(xì)胞，即一種白細(xì)胞的惡性失調(diào)的一般名稱(chēng)。淋巴細(xì)胞分布在整個(gè)身體，但集中在骨髓、淋巴結(jié)、脾臟、胃腸道、和皮膚。這些位點(diǎn)是組成淋巴系統(tǒng)的主要器官。
淋巴結(jié)很多，位于整個(gè)身體各部分，從頭皮到腳。它們由稱(chēng)為淋巴管的特殊循環(huán)系統(tǒng)連接。這些管輸送稱(chēng)為淋巴的液體，淋巴細(xì)胞混懸在淋巴液中隨淋巴液從一個(gè)結(jié)到一個(gè)結(jié)地移動(dòng)，最終進(jìn)入血液。淋巴細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化是淋巴瘤的開(kāi)始。這種情況通常出現(xiàn)在淋巴結(jié)，但也可能從胃、腸、皮膚、或其他器官開(kāi)始。惡性淋巴細(xì)胞或淋巴瘤細(xì)胞繁殖，導(dǎo)致細(xì)胞蓄積，產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)增大的淋巴結(jié)，或在另一組織，如胃、皮膚、或其他位點(diǎn)中產(chǎn)生一團(tuán)。在淋巴結(jié)中，正在生長(zhǎng)的淋巴瘤細(xì)胞排除正常的細(xì)胞并產(chǎn)生異常的細(xì)胞圖譜，該異常的細(xì)胞圖譜能夠被識(shí)別并在活組織檢查樣本中分類(lèi)。某些淋巴瘤可以累及骨髓并可能干擾血細(xì)胞的發(fā)育，導(dǎo)致貧血，而且，在更嚴(yán)重的情形下，可能導(dǎo)致低的白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)。
所有淋巴瘤通常都有惡性淋巴細(xì)胞的異常生長(zhǎng)。但是，淋巴瘤的類(lèi)型不同于染病的淋巴細(xì)胞類(lèi)型與涉及的淋巴結(jié)圖譜。淋巴瘤被分為三種主要類(lèi)型低等、中等、和高等。這些分類(lèi)根據(jù)的是存在的淋巴瘤細(xì)胞類(lèi)型、淋巴結(jié)破裂圖譜、淋巴細(xì)胞的免疫表型(特別是B細(xì)胞對(duì)T細(xì)胞)、和染色體的異常性質(zhì)。淋巴瘤歸屬于Hodgkin或非Hodgkin類(lèi)型兩者之一。Hodgkin疾病或Hodgkin淋巴瘤，是惡性細(xì)胞在淋巴系統(tǒng)中生長(zhǎng)。Hodgkin疾病是淋巴瘤中較熟識(shí)的形式，而其他的淋巴瘤被歸入所謂非Hodgkin的淋巴瘤。但是，1996年WHO推薦一種根據(jù)起源細(xì)胞(B對(duì)T)和分類(lèi)階段(未成熟或前體對(duì)成熟或外周)的分類(lèi)。
Hodgkin疾病常常在一個(gè)或多個(gè)淋巴結(jié)上發(fā)病。一個(gè)免疫系統(tǒng)細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)經(jīng)歷惡性轉(zhuǎn)化，它繁殖，排除并減損正常淋巴細(xì)胞在結(jié)中的功能，還使淋巴結(jié)擴(kuò)大。表征該疾病的惡性細(xì)胞，是Reed-Sternberg細(xì)胞，并從淋巴細(xì)胞衍化。當(dāng)在表征該疾病的淋巴結(jié)內(nèi)，結(jié)合其他異常細(xì)胞圖譜發(fā)現(xiàn)Reed-Sternberg細(xì)胞，即可作出診斷。
已經(jīng)確認(rèn)，Hodgkin疾病在一個(gè)淋巴結(jié)中開(kāi)始，然后該惡性細(xì)胞通過(guò)淋巴管通道傳播，淋巴管通道是連接相鄰淋巴結(jié)的管網(wǎng)。在更進(jìn)一步的Hodgkin疾病中，肺、肝、和骨髓都可能被腫瘤團(tuán)累及。當(dāng)惡性細(xì)胞從淋巴結(jié)通過(guò)淋巴管或血管擴(kuò)散時(shí)，疾病可以使這些其他組織病變。癥狀包括淋巴結(jié)腫大，大多數(shù)是頸兩側(cè)的淋巴結(jié)，但偶有在腋窩、腹股溝、或腹部。一些其他的癥狀或病征，包括疲勞；反復(fù)發(fā)燒；盜汗；搔癢；背、腿、或腹疼；骨疼；食欲減退；和體重下降。
淋巴瘤的診斷，由活體組織檢查證實(shí)。研究組織中惡性細(xì)胞的存在、類(lèi)型、和排列。還對(duì)組織上的細(xì)胞完成測(cè)試，確定它們是否淋巴細(xì)胞，和它們是什么類(lèi)型的淋巴細(xì)胞。還要完成附加的測(cè)試，以確定該疾病是否通過(guò)淋巴系統(tǒng)擴(kuò)散至身體的其他部分。這些測(cè)試可能包括附加的活組織檢查、核醫(yī)學(xué)、X射線(xiàn)、或磁共振成像。
淋巴瘤可能非常難以檢測(cè)。存在一些非Hodgkin的癥狀，但它們不是特異性的。常常有淋巴結(jié)腫脹，特別在身體的上部。診斷從取組織的活組織檢查開(kāi)始。在顯微鏡下觀察癌細(xì)胞。要作許多測(cè)試來(lái)評(píng)定淋巴瘤觀察淋巴結(jié)；異常血細(xì)胞計(jì)數(shù)的全血檢查；血化學(xué)；異常血沉速率；胸部X射線(xiàn)，以觀察淋巴結(jié)并查看是否累及其他器官；胸部、骨盤(pán)、和腹部計(jì)算機(jī)體層攝影(CT或CAT)掃描或磁共振成像(MRI)掃描，確定疾病可能的擴(kuò)散；鎵掃描放射性檢查，在顯示腫脹的淋巴系統(tǒng)中攝入鎵，并最終指示疾??；骨髓抽吸和活組織檢查，確定淋巴瘤是否已經(jīng)使骨髓病變；提取液體骨髓和骨碎片并在顯微鏡下觀察。非Hodgkin的淋巴瘤型屬于以下類(lèi)型成淋巴細(xì)胞的淋巴瘤、小的非分裂細(xì)胞淋巴瘤(Burkitt的/非Burkitt的)、和巨細(xì)胞淋巴瘤。淋巴瘤的分類(lèi)，涵蓋所有淋巴組織增生的贅生物。U.S.National CancerInstitute(NCI)說(shuō)明多于20條臨床病理學(xué)條目，對(duì)無(wú)痛的和攻擊型淋巴瘤，在臨床上更為有用。
淋巴瘤的診斷和治療，依賴(lài)于細(xì)胞類(lèi)型、涉及的淋巴結(jié)圖譜、及疾病的擴(kuò)展。在疾病的早期定位階段，可以用放射療法。淋巴瘤的化學(xué)療法則是更為常見(jiàn)的形式，因?yàn)樵谠\斷后，疾病往往在身體的多個(gè)位點(diǎn)。高等(攻擊型)淋巴瘤往往用若干不同的化學(xué)療法藥物同時(shí)治療。
Hodgkin的醫(yī)學(xué)診斷是取一組織樣品(活組織檢查)，并發(fā)現(xiàn)Reed-Sternberg細(xì)胞的存在，這是對(duì)Hodgkin疾病特異的細(xì)胞。有時(shí)用針吸組織檢查，但外科活組織檢查，摘除整個(gè)淋巴結(jié)，獲得足夠的組織，對(duì)確定的診斷是較為可取的。
疾病的評(píng)定，是用判定支配胚細(xì)胞種群的譜系配位的主要小組完成的，接著是用依賴(lài)于主要小組結(jié)果的、表征胚細(xì)胞種群明確表型和成熟期的單克隆抗體第二小組。另外，對(duì)樣品中廣泛范圍未成熟和成熟造血細(xì)胞的最直接的“大范圍”特征，選出一預(yù)定的小組。當(dāng)惡性細(xì)胞尚處在少數(shù)時(shí)，這些“大范圍”特征可以增加測(cè)試的靈敏度，并且有助于表征病理學(xué)細(xì)胞的異種性，以及在其他細(xì)胞譜系成熟中伴隨的干擾。此外，該對(duì)策為與染色結(jié)果的一致性提供一種更好的控制。
淋巴瘤免疫表型淋巴瘤中的表面標(biāo)記物，為診斷和預(yù)后目的，幫助識(shí)別腫瘤的譜系。了解白血病/淋巴瘤表型，從觀察臨床歷史和形態(tài)開(kāi)始，同時(shí)對(duì)每一情況選擇一小組標(biāo)記物。在大多數(shù)情況下，譜系能識(shí)別為T(mén)細(xì)胞、B細(xì)胞、或骨髓，然后可以進(jìn)行診斷或分類(lèi)診斷。
淋巴瘤表型的目的，是識(shí)別瘤形成過(guò)程的細(xì)胞類(lèi)型。該表型識(shí)別可以描繪細(xì)胞譜系和成熟程度的輪廓，作為淋巴瘤分類(lèi)的輔助。還有，該表型識(shí)別可以幫助確定細(xì)胞種群是正常的還是異常的，并檢測(cè)樣品中細(xì)胞種群以前的特征，以便監(jiān)控疾病的緩解、發(fā)展、或復(fù)發(fā)。
執(zhí)行全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(包括白細(xì)胞計(jì)數(shù))。血細(xì)胞計(jì)數(shù)是疾病對(duì)治療應(yīng)答的一個(gè)重要指數(shù)。這些計(jì)數(shù)對(duì)了解藥物治療或放射療法的效果，也是重要的。正常的白細(xì)胞計(jì)數(shù)約每立方毫米血液4000到11,000。如果總WBC計(jì)數(shù)超過(guò)11,000細(xì)胞/mm3，被稱(chēng)為白細(xì)胞增多，是一種身體對(duì)感染的正常應(yīng)答。血細(xì)胞計(jì)數(shù)有助于確定某一藥物是否起作用。傳統(tǒng)上，細(xì)胞的計(jì)數(shù)通常用類(lèi)似于FACS掃描器的昂貴的電子計(jì)數(shù)器完成，要求技術(shù)專(zhuān)家使用該計(jì)數(shù)器進(jìn)行測(cè)試。每一種細(xì)胞圖譜類(lèi)型表明，是否存在淋巴瘤以及淋巴瘤的類(lèi)型。
單克隆抗體小組許多實(shí)驗(yàn)室使用多色免疫熒光法(multicolorimmunofluorescence)，雖然在某些情形下，適合用單色免疫熒光法?？贵w照例包括CD2、CD3、CD5、CD10、CD11c、CD14、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD45、CD103、FMC7、重鏈、Kappa、和Lambda。如果臨床的或形態(tài)學(xué)的特征提出“T”或“NK”淋巴細(xì)胞失調(diào)，那么，還需進(jìn)行下面附加的抗體組合CD3/CD4/CD8、CD7/CD5/HLA-DR、CD25/CD2/CD3、CD16/CD56/CD19、CD57/CD8/CD3、TCR alpha-beta/delta-gamma/CD3。
近期發(fā)展的許多生物療法被用于與淋巴瘤斗爭(zhēng)。例如，單克隆抗體(產(chǎn)生的抗體清除特定的靶細(xì)胞)已經(jīng)用于淋巴瘤。
淋巴瘤病人的WBC分類(lèi)計(jì)數(shù)，通常是異常的，或者由于白細(xì)胞增加，白細(xì)胞的增加可能有兩個(gè)原因(a)反應(yīng)的-即僅次于感染、瘤形成、或炎癥，(b)瘤形成的-即白血病的和相關(guān)的失調(diào)，或者由于白細(xì)胞減少，白細(xì)胞的減少可能有兩個(gè)原因(a)消耗或破壞(如脾機(jī)能亢進(jìn))，(b)骨髓衰竭(此時(shí)通常是各類(lèi)血細(xì)胞減少癥)。
與感染作斗爭(zhēng)，中性白細(xì)胞是重要的。當(dāng)中性白細(xì)胞數(shù)下降至每微升1000細(xì)胞以下時(shí)，這種情況稱(chēng)為中性白細(xì)胞減少癥。淋巴瘤治療可能導(dǎo)致中性白細(xì)胞減少癥。肥胖癥和吸煙，會(huì)增加中性白細(xì)胞的計(jì)數(shù)。淋巴細(xì)胞分為B(骨髓成熟)和T(胸腺成熟)淋巴細(xì)胞。當(dāng)成人的淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)下降至每微升1500細(xì)胞以下，兒童下降至每微升300細(xì)胞以下時(shí)，這種情況稱(chēng)為淋巴細(xì)胞減少癥。淋巴瘤可能導(dǎo)致淋巴細(xì)胞減少癥。血小板(學(xué)名是thrombocyte)是類(lèi)細(xì)胞粒子，它們通過(guò)在出血出現(xiàn)的位點(diǎn)聚集，阻止出血。然后，它們發(fā)生作用并凝聚成塊，阻止出血并促進(jìn)凝結(jié)。如果病人有包括感染、炎癥、惡性腫瘤等骨髓組織增生失調(diào)，又如果脾臟已經(jīng)摘除，那么病人在緊張活動(dòng)時(shí)，血小板計(jì)數(shù)增加。在標(biāo)準(zhǔn)血樣中的血小板數(shù)，通常是每微升133,000到333,000血小板。如果血小板計(jì)數(shù)下降至30,000以下，則出現(xiàn)血小板減少癥，會(huì)導(dǎo)致異常出血。計(jì)數(shù)在5000以下，可以認(rèn)為危及生命。血小板增加可以是(a)反應(yīng)的-對(duì)出血、感染、或瘤形成，和(b)基本的-骨髓組織增生失調(diào)，等等。血小板減少可以由于(a)破壞性的-如免疫血小板減少癥，或(b)骨髓衰竭-通常也累及其他血細(xì)胞(即存在各類(lèi)血細(xì)胞減少癥)。因?yàn)榛瘜W(xué)療法影響血細(xì)胞的制造，所以檢查血液中各類(lèi)細(xì)胞的數(shù)量，是重要的。
用市售的手動(dòng)或電子儀器，測(cè)量血紅蛋白水平、血細(xì)胞比容、總的白細(xì)胞、和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)，可以完成CBC。一些變化可以包括血小板計(jì)數(shù)、白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)、和細(xì)胞指數(shù)。對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)、體液如CSF中細(xì)胞種類(lèi)、胸膜液、ascetic、心包液、胃抽液，血液學(xué)分析器完全是自動(dòng)的，測(cè)量結(jié)果是精確的。
用抗體技術(shù)檢測(cè)與細(xì)胞有關(guān)的抗原的能力，為診斷病理學(xué)添加一種新的手段。有各種技術(shù)可用于研究血淋巴失調(diào)免疫表型。但是，在對(duì)包括基于病毒的疾病，如獲得性免疫缺損和T細(xì)胞白血病，以及各種癌等許多疾病的總的檢測(cè)方法中，利用抗體抗原反應(yīng)的免疫測(cè)定方法的向前發(fā)展，還必須開(kāi)發(fā)。本領(lǐng)域熟練人員應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明的測(cè)定方法和光生物盤(pán)系統(tǒng)，可以用于完成這種免疫測(cè)定。
常規(guī)的微量免疫測(cè)定，如放射免疫測(cè)定(RIA)、酶免疫測(cè)定(EIA)、熒光免疫測(cè)定(FIA)，分別使用同位素、酶、或熒光物質(zhì)，檢測(cè)與這些物質(zhì)有專(zhuān)門(mén)反應(yīng)的相應(yīng)抗體或抗原的存在或不存在。但是，上述方法是受限制的和有缺點(diǎn)的。RIA要求特殊的裝備、預(yù)防措施、受半衰期限制、及各種其他因素。使用酶或熒光物質(zhì)作記號(hào)的方法，是通過(guò)確定顏色或照度來(lái)測(cè)量的，要求靈敏、復(fù)雜的儀器來(lái)檢測(cè)量熱計(jì)的或熒光的反應(yīng)，此外還要求若干清洗步驟，去除過(guò)量的、未結(jié)合的、未反應(yīng)的試劑。再有，上述檢測(cè)方法的應(yīng)用，對(duì)細(xì)胞，特別是淋巴細(xì)胞和癌細(xì)胞等樣本，還需要改進(jìn)的制備技術(shù)、高效率的檢測(cè)及分析。
圍繞專(zhuān)門(mén)用于細(xì)胞表面抗原的熒光抗體的使用，已經(jīng)發(fā)展的強(qiáng)有力工具，是熒光活化細(xì)胞分類(lèi)(FACS)技術(shù)。這是一種十分可靠、快速、和靈敏的方法。流式細(xì)胞計(jì)是最實(shí)用的方法，它是自動(dòng)的和定量的。流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)分析，對(duì)樣品最基本的要求是，該樣品需在單分散混懸液中，并對(duì)需要的細(xì)胞以熒光標(biāo)記物標(biāo)記。但是，這是非常高價(jià)的測(cè)試，且整個(gè)系統(tǒng)要求訓(xùn)練有素的技術(shù)員，在臨床分析實(shí)驗(yàn)室和昂貴的儀器中處理。單克隆抗體被用作分立的探子和流式細(xì)胞計(jì)量，對(duì)大量細(xì)胞作客觀的定量的計(jì)量。
此外，根本的缺點(diǎn)在于，細(xì)胞一旦被分析后，不能再用于重復(fù)分析或另外的調(diào)查，比如罕見(jiàn)病例細(xì)胞的顯微鏡觀察。已經(jīng)發(fā)展了許多另外的技術(shù)，與流式細(xì)胞計(jì)相比，有優(yōu)點(diǎn)也有缺點(diǎn)，都有它們自己特有的問(wèn)題。
表面標(biāo)記物分析是重要的實(shí)驗(yàn)室工具，特別在研究白血病、淋巴瘤、和免疫缺損等疾病中，非常有用?；诳贵w的微陣列技術(shù)，對(duì)包含在血液和組織樣品的樣品中特定抗原的識(shí)別，特別是在臨床診斷中，確實(shí)是最優(yōu)良的技術(shù)。大多數(shù)診斷測(cè)試，要求確定的只是分析物的有限的一小組(如在癌、白血病、淋巴瘤、甲狀腺疾病等等中)。因此，只要求非常少量的血樣、又節(jié)省時(shí)間和實(shí)驗(yàn)室人員成本、在單次測(cè)試中同時(shí)測(cè)量所有臨床上有關(guān)參數(shù)的微型化技術(shù)，因它的性能價(jià)格比、勞動(dòng)效率、和它的簡(jiǎn)約性，很可能證明對(duì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室和護(hù)理中心(point-of-care)設(shè)備有極大的吸引力。
作為另一種用于細(xì)胞計(jì)數(shù)的現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)和方法，我們已經(jīng)研發(fā)了一種簡(jiǎn)單的、價(jià)格低廉的系統(tǒng)，用于分析、檢測(cè)、和測(cè)定細(xì)胞數(shù)量特別是血細(xì)胞數(shù)量、包括檢測(cè)感染血液和其他生物液體如CSF的寄生蟲(chóng)和病原體。已經(jīng)研發(fā)了有關(guān)的信息和信號(hào)處理方法及軟件，可以識(shí)別各種血細(xì)胞、寄生蟲(chóng)、和病原體。
與現(xiàn)有方法和系統(tǒng)比較，我們已經(jīng)研發(fā)了一種簡(jiǎn)單的、微型化的、超靈敏的、價(jià)格低廉的系統(tǒng)，用于細(xì)胞分析。本系統(tǒng)使用光生物盤(pán)、有關(guān)的檢測(cè)組件、以及信息和信號(hào)處理方法和軟件。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)主要方面，是提供使用光生物盤(pán)，檢測(cè)生物樣品中血細(xì)胞分析物的方法和設(shè)備。本發(fā)明還涉及定性和定量的方法，用于細(xì)胞分離和包括免疫表型的分型。本發(fā)明可以?xún)?yōu)先用于與公開(kāi)在下述共同授予并共同待決的專(zhuān)利申請(qǐng)中的任何盤(pán)、測(cè)定法、和系統(tǒng)組合U.S.Provisional Application Serial No.60/302,757，標(biāo)題是“ClinicalDiagnostic Optical Bio-Disc And Related Methods For Selection AndDetection Of Lymphocytes IncludingHelper-Inducer/Suppressor-Cytotoxic Cells”，2001年7月3日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/306,035，標(biāo)題是“Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation and TypingIncluding Immunophenotyping”，2001年7月17日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/305,993，標(biāo)題是“CaptureLayer Assemblies and Optical Bio-Disc for Immunophenotyping”，2001年7月17日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/306,592，標(biāo)題是“Methods for Imaging Blood Cells，Blood-BomeParasities，and Other Biological Matter Including Related OpticalBio-Disc and Drive Assemblies”，2001年7月19日申請(qǐng)；和U.S.Provisional Application Serial No.60/307,263，標(biāo)題是“Quantitativeand Qualitative Methods for Cell Isolation and Typing IncludingImmunophenotyping”，2001年7月23日申請(qǐng)。本文引用所有這些申請(qǐng)，供參考。
另一方面，本發(fā)明針對(duì)細(xì)胞的分型，包括測(cè)定的CD科、CD4/CD8測(cè)定、屬的同種的固態(tài)細(xì)胞捕獲測(cè)定(a generic homogeneous solidphase cel capture assay)，以便快速確定CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量，并獲得血樣中CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞的比值。
本發(fā)明還有一個(gè)方面，是提供針對(duì)細(xì)胞分型，包括測(cè)定的CD科的測(cè)定和白血病與淋巴瘤癌的細(xì)胞表面標(biāo)記物的系統(tǒng)和方法。這些測(cè)定是同種的固態(tài)細(xì)胞捕獲測(cè)定，以便在血樣中，快速確定各種淋巴瘤或CD特定表面標(biāo)記物的絕對(duì)數(shù)量。
本發(fā)明還針對(duì)特定細(xì)胞的捕獲方法，該方法用現(xiàn)場(chǎng)外培養(yǎng)(off-site incubation)的樣品的主抗體，捕獲特定的細(xì)胞，隨后用結(jié)合表面的副抗體捕獲。光生物盤(pán)和支持的軟件及處理方法，是本發(fā)明的又一方面。
本發(fā)明還有再一方面，是針對(duì)細(xì)胞分離和分型的系統(tǒng)和方法，該系統(tǒng)和方法的根據(jù)，是盤(pán)特定位置上的定位細(xì)胞捕獲原理。根據(jù)單克隆或多克隆抗體對(duì)特定淋巴細(xì)胞(白細(xì)胞)抗原的捕獲化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)對(duì)這一捕獲化學(xué)反應(yīng)的定位應(yīng)用，在盤(pán)上建立若干特定細(xì)胞的捕獲場(chǎng)。
測(cè)定是在生物盤(pán)上進(jìn)行的，生物盤(pán)上包括有特定抗體附著在固態(tài)上的流動(dòng)空腔。用輔助誘導(dǎo)物/抑制劑細(xì)胞毒素(helper-inducer/suppressor-cytotoxic)測(cè)試，確定捕獲區(qū)中特定抗體捕獲的細(xì)胞，例如CD4+、CD8+、CD3+、CD19+、和CD45+淋巴細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量，這一測(cè)試是用從全血分離的7-15μl(視空腔的深度而定)單核細(xì)胞(MNC)進(jìn)行的。在把MNC(30,000細(xì)胞/μl)注入空腔后，要研究的如CD4+、CD8+、CD3+、和CD45+細(xì)胞的細(xì)胞遞呈抗原或表面標(biāo)記物，在盤(pán)上的捕獲區(qū)被專(zhuān)門(mén)捕獲。后者，可以用當(dāng)前的細(xì)胞捕獲方法，以全血代替MNC直接測(cè)定。同時(shí)在分析空腔中還有確定的負(fù)控制區(qū)域。
本發(fā)明還有一個(gè)方面，是提供與光學(xué)分析盤(pán)結(jié)合，進(jìn)行細(xì)胞檢測(cè)并對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)的測(cè)定方法和設(shè)備。本發(fā)明還有一個(gè)方面，是提供與光學(xué)分析盤(pán)結(jié)合，進(jìn)行淋巴瘤檢測(cè)的測(cè)定方法和設(shè)備。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，是提供一種方法，該方法包括在盤(pán)表面內(nèi)或其上提供樣品，該盤(pán)有可供光閱讀機(jī)讀出的編碼信息。該信息能用于控制閱讀機(jī)相對(duì)于盤(pán)的掃描。
本測(cè)試或測(cè)定，至少可用兩種方式進(jìn)行。第一種方法，是根據(jù)位于光生物盤(pán)上特定通道中的血細(xì)胞的光學(xué)成像原理。把約5到20微升的全血，注入盤(pán)上特殊設(shè)計(jì)的通道。用細(xì)胞識(shí)別軟件分析像，該軟件能識(shí)別各種紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的亞型，并分別產(chǎn)生紅細(xì)胞和白細(xì)胞的分類(lèi)計(jì)數(shù)。第二種方法，是根據(jù)用抗某種特定細(xì)胞的細(xì)胞特定抗體，來(lái)捕獲特定的細(xì)胞。在其中的一個(gè)特殊實(shí)施例中，抗體被向著例如淋巴細(xì)胞(CD2、CD19)、單核細(xì)胞(CD14)、和嗜酸性細(xì)胞(CD15)引導(dǎo)。這些淋巴細(xì)胞亞型的特定抗體，被匯集/附著于包含流動(dòng)空腔的生物盤(pán)內(nèi)的固體表面。在其他的實(shí)施例中，捕獲抗體被向著有待研究的特定表面標(biāo)記物的其他細(xì)胞引導(dǎo)，如CD3、CD4、CD8、和CD45。
樣品一旦裝入分析空腔，并有足夠時(shí)間與它們相應(yīng)的捕獲劑在捕獲區(qū)結(jié)合，盤(pán)便在盤(pán)驅(qū)動(dòng)器或任何等同的旋轉(zhuǎn)器中，按預(yù)定的速度及時(shí)間旋轉(zhuǎn)，以便把未結(jié)合的細(xì)胞從捕獲區(qū)中除去。旋轉(zhuǎn)之后，把盤(pán)裝入光閱讀機(jī)，然后，來(lái)自輻射源的電磁輻射入射束被引向盤(pán)。通過(guò)盤(pán)繞中心軸旋轉(zhuǎn)并通過(guò)沿軸的徑向移動(dòng)光束，使光束在盤(pán)上掃描?；蛘叽┻^(guò)盤(pán)透射、或者從盤(pán)反射的電磁輻射束，被檢測(cè)并分析，以提取表征樣品的信息。
本發(fā)明各實(shí)施例還包括有襯底和頂蓋的盤(pán)，襯底和頂蓋隔開(kāi)，形成空腔。樣品材料，如有細(xì)胞的血，放進(jìn)空腔中。當(dāng)盤(pán)旋轉(zhuǎn)時(shí)，樣品通過(guò)捕獲區(qū)運(yùn)動(dòng)。捕獲區(qū)包括捕獲層，上有抗體或其他特定結(jié)合的配偶體，這些抗體或配偶體與如CD4和CD8的抗原結(jié)合，這些抗原是要研究的細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞表面標(biāo)記物。一次測(cè)試最好能用于使CD4和CD8和血樣中其他分析物成像。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，是提供一種盤(pán)閱讀機(jī)，用于把光引向捕獲區(qū)所在的靶區(qū)域，并檢測(cè)透射的或反射的光，對(duì)捕獲的細(xì)胞加以識(shí)別和計(jì)數(shù)。這些CD4和CD8的計(jì)數(shù)，和它們之間的比值，對(duì)監(jiān)控諸如AIDS的狀況是有用的。
測(cè)試樣品最好送至盤(pán)內(nèi)的空腔。單個(gè)空腔最好有多個(gè)捕獲區(qū)域，每一個(gè)可以有一種或多種抗體。在一個(gè)實(shí)施例中，單一通道有多個(gè)捕獲區(qū)，每一個(gè)有不同類(lèi)型的抗體，并可以有用作控制區(qū)的捕獲區(qū)。這些捕獲區(qū)可以順著盤(pán)的一條或多條半徑排列。檢測(cè)方法包括檢測(cè)特性中的變遷，或把觀察窗成像并用像識(shí)別軟件對(duì)捕獲的細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)可以是直接的，如對(duì)需要的細(xì)胞計(jì)數(shù)；也可以是間接的，如對(duì)需要的和不需要的細(xì)胞集合計(jì)數(shù)，對(duì)不需要的細(xì)胞計(jì)數(shù)，再用減法獲得需要的細(xì)胞計(jì)數(shù)。捕獲區(qū)可以有一層或多層抗體層。
當(dāng)某一細(xì)胞樣品已放在盤(pán)上時(shí)，盤(pán)可以按一檔或多檔旋轉(zhuǎn)，把細(xì)胞移至捕獲區(qū)，然后從捕獲區(qū)移去未結(jié)合的細(xì)胞。樣品也可以按其他方式處理，如，培養(yǎng)或用檢測(cè)的光源加熱?？梢杂蔑@微流態(tài)學(xué)方法添加染劑或其他需要處理盤(pán)上樣品的任何液體。該種處理最好在盤(pán)信息存儲(chǔ)器區(qū)域的編碼信息中說(shuō)明。最好采用存儲(chǔ)的信息，使驅(qū)動(dòng)器和閱讀機(jī)按需要的速度旋轉(zhuǎn)，并按其他中間步驟，如培養(yǎng)步驟旋轉(zhuǎn)需要的時(shí)間。
微技術(shù)在臨床診斷中，對(duì)識(shí)別細(xì)胞類(lèi)型、寄生蟲(chóng)、病原體、和其他生物物質(zhì)，特別有價(jià)值。本發(fā)明利用微技術(shù)，對(duì)光生物盤(pán)上的全血進(jìn)行白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)。此外，本發(fā)明針對(duì)成像的血液細(xì)胞，對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)計(jì)數(shù)，還針對(duì)相關(guān)的處理方法和軟件。
按照本發(fā)明的另一種測(cè)試或測(cè)定，可以按至少兩種方式進(jìn)行。第一種方法，是根據(jù)位于光生物盤(pán)上特定通道中的血細(xì)胞的光學(xué)成像原理。把約5到20微升的全血，注入盤(pán)上特殊設(shè)計(jì)的通道。用細(xì)胞識(shí)別軟件分析像，該軟件能識(shí)別各種淋巴細(xì)胞的亞型，并產(chǎn)生白細(xì)胞的分類(lèi)計(jì)數(shù)。第二種方法，是根據(jù)用抗某種特定細(xì)胞的細(xì)胞特定抗體，來(lái)捕獲特定細(xì)胞。在本具體實(shí)施例中，抗體被向著例如淋巴細(xì)胞(CD2、CD19)、單核細(xì)胞(CD14)、和嗜酸性細(xì)胞(CD15)引導(dǎo)。這些淋巴細(xì)胞亞型的特定抗體，被匯集/附著于包含流動(dòng)空腔的生物盤(pán)內(nèi)的固體表面。
采用生物盤(pán)驅(qū)動(dòng)器組件使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，讀出并處理任何存儲(chǔ)在盤(pán)上的編碼信息，還分析生物盤(pán)流動(dòng)空腔中的細(xì)胞捕獲區(qū)。生物盤(pán)驅(qū)動(dòng)器設(shè)有旋轉(zhuǎn)生物盤(pán)的電動(dòng)機(jī)、控制盤(pán)轉(zhuǎn)速的控制器、處理從盤(pán)返回信號(hào)的處理器、和分析被處理的信號(hào)的分析器。旋轉(zhuǎn)速度和旋轉(zhuǎn)方向是可變的，速度、旋轉(zhuǎn)時(shí)間兩者都可以精密控制。當(dāng)流動(dòng)空腔和靶區(qū)的測(cè)試材料被驅(qū)動(dòng)器讀出光束詢(xún)問(wèn)和分析器分析之前、之中、或之后，還可以利用生物盤(pán)把信息寫(xiě)入生物盤(pán)。生物盤(pán)可以包括用于控制盤(pán)旋轉(zhuǎn)的編碼信息；提供專(zhuān)門(mén)用于進(jìn)行免疫分型(immunotyping)測(cè)定類(lèi)型的處理信息；和用于在與生物盤(pán)有關(guān)的監(jiān)控器上顯示結(jié)果的處理信息。
已經(jīng)對(duì)CD、CD-R、或DVD格式、這些格式的修改版本、和另外的格式，開(kāi)發(fā)了一般的分類(lèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)計(jì)，特別是分類(lèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)計(jì)。驅(qū)動(dòng)器的讀出或詢(xún)問(wèn)光束，檢測(cè)分析樣品中各種細(xì)胞，并產(chǎn)生能供分類(lèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)器軟件分析的像。
顯微鏡方法或復(fù)雜的細(xì)胞計(jì)數(shù)器，基本上執(zhí)行的是這些冗長(zhǎng)而費(fèi)力的細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定。本發(fā)明用光生物盤(pán)及相關(guān)的組件。分析空腔中各種任意淋巴細(xì)胞亞型的光學(xué)像，或者那些被特定抗體方法捕獲的各種淋巴細(xì)胞亞型的光學(xué)像，是通過(guò)細(xì)胞識(shí)別軟件程序產(chǎn)生并分析的，細(xì)胞識(shí)別軟件通過(guò)血液中或其他體液中各種細(xì)胞單元的光散射性質(zhì)，識(shí)別血液中或其他體液中各種細(xì)胞單元。在經(jīng)過(guò)入射光束與要研究的樣品間光/物質(zhì)的相互作用后，檢測(cè)返回的光。處理被檢測(cè)的返回的光信號(hào)后，給出可辨識(shí)的信號(hào)特征波形或數(shù)字ID。而現(xiàn)有技術(shù)方法，通常要求準(zhǔn)備諸如細(xì)胞染色、RBC去除、或其他費(fèi)力的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，本方法的實(shí)施例不要求任何樣品的預(yù)處理。這些方法包括顯微鏡分析，或在CD型或用頂檢測(cè)器、底檢測(cè)器、甚至計(jì)數(shù)器、或細(xì)胞計(jì)數(shù)器的光盤(pán)閱讀機(jī)的細(xì)胞檢測(cè)。
下面各段按照本發(fā)明針對(duì)生物盤(pán)制作的某些特殊優(yōu)選實(shí)施例，給出主要的方法步驟概述。
盤(pán)的制備用空噴氣槍清潔金反射盤(pán)或透射盤(pán)，除去任何塵埃顆粒。用旋轉(zhuǎn)涂布機(jī)以異丙醇清洗盤(pán)兩次。把2％的聚苯乙烯旋轉(zhuǎn)涂布在盤(pán)上，在整個(gè)盤(pán)上給出非常厚的涂敷層。
化學(xué)淀積一個(gè)實(shí)施例包括三步淀積實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用于培養(yǎng)抗生蛋白鏈菌素，培養(yǎng)30分鐘；生物素基的第一抗體，培養(yǎng)60分鐘；第二捕獲抗體，培養(yǎng)30分鐘。所有步驟都在室溫下，在濕的箱中，在淀積之間用嚴(yán)格的清洗和干燥步驟完成。
簡(jiǎn)要地說(shuō)，磷酸鹽緩沖液鹽水(phosphate buffered saline)中1μl的1mg/ml抗生蛋白鏈菌素，在每一窗上形成層，并培養(yǎng)30分鐘。用蒸餾水把過(guò)量的抗生蛋白鏈菌素清洗掉并把盤(pán)干燥。通過(guò)把等體積的生物素基IgG(在PBS中125μg/ml)與醛活化(aldehyde-activated)右旋糖酐(200μg/ml)組合，制備生物素基IgG右旋糖酐絡(luò)合物。右旋糖酐醛生物素基IgG絡(luò)合物，在每一捕獲窗的抗生蛋白鏈菌素上形成層，并培養(yǎng)60分鐘，或置于冰箱中一個(gè)晚上。過(guò)量的試劑被清洗掉，盤(pán)被旋轉(zhuǎn)干燥。通過(guò)用捕獲抗體在生物盤(pán)縫隙上的指定點(diǎn)形成層，建立特定的條碼形分區(qū)捕獲模式。對(duì)分類(lèi)計(jì)數(shù)，例如，抗中性白細(xì)胞(CD128或其他)、抗淋巴細(xì)胞(CD2、CD19、CD56、及其他)、抗嗜酸性細(xì)胞(CD15)、抗單核細(xì)胞(CD14)、抗嗜堿白細(xì)胞(CD63)、和抗血小板(CD32和CD151)都在每一縫隙的指定點(diǎn)形成層。下面列出的表1、2、和3，是捕獲層組合的各種捕獲模式例子。培養(yǎng)30分鐘，或置于冰箱中一個(gè)晚上。盤(pán)的組裝，用25μm、50μm、或100μm(50μm通道要求的樣品體積，是25μm通道空腔需要的兩倍)，直的，U型的、或其他通道格式，加上透明的覆蓋盤(pán)(對(duì)使用頂檢測(cè)器)或反射的覆蓋盤(pán)(對(duì)使用底檢測(cè)器)。
表1捕獲層組合與變化I

作為無(wú)極性蛋白結(jié)構(gòu)與盤(pán)表面之間疏水相互作用的結(jié)果，蛋白(如抗原和抗體)被動(dòng)地吸附在盤(pán)表面。蛋白吸附率及程度，與許多因素有關(guān)，包括涂敷在體積上的涂敷溶液的表面面積比、被吸附的物質(zhì)濃度、溫度、和吸附時(shí)間。但是，化學(xué)性質(zhì)的牢固度與蛋白本身穩(wěn)定性有關(guān)。
與紅細(xì)胞比較，淋巴細(xì)胞要大得多，且對(duì)有效的細(xì)胞捕獲要求穩(wěn)定的、牢固的化學(xué)性質(zhì)。為此，在生物盤(pán)表面，我們利用生物素和卵白素的強(qiáng)相互作用。一種橋技術(shù)在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中使用，其中把結(jié)合生物素的抗鼠抗體IgG(在羊中培育)與醛活化右旋糖酐偶聯(lián)，作為主捕獲抗體與涂敷抗生蛋白鏈菌素的盤(pán)表面之間的橋。此外，或作為另一種卵白素與生物素交聯(lián)，可以用多功能的交聯(lián)劑，如活化的醛右旋糖酐(DCHO)，有利于抗體與盤(pán)表面的結(jié)合。捕獲層與盤(pán)表面之間穩(wěn)定的和強(qiáng)的鍵，可以增強(qiáng)細(xì)胞的捕獲，還可以減少抗血清的使用、減少反應(yīng)時(shí)間、和減少非指定的結(jié)合。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，在固態(tài)上的特定細(xì)胞捕獲，是用副捕獲抗體完成的，該副捕獲抗體對(duì)主抗體有特殊的親和力。該副捕獲抗體與固體表面結(jié)合。樣品細(xì)胞可以用主抗體在位點(diǎn)外培養(yǎng)，然后注入測(cè)定空腔，或者把主抗體在副抗體上形成層，下面還要說(shuō)明。簡(jiǎn)要地說(shuō)，例如，在磷酸鹽緩沖液鹽水中1μg的1mg/ml抗生蛋白鏈菌素，在每一窗上形成層，并培養(yǎng)30分鐘。用蒸餾水把過(guò)量的抗生蛋白鏈菌素清洗掉并把盤(pán)干燥。通過(guò)把等體積的生物素基IgG(在PBS中125μg/ml)與活化的醛右旋糖酐(200μg·ml)組合，制備IgG右旋糖酐絡(luò)合物。右旋糖酐醛生物素基IgG絡(luò)合物，在每一捕獲窗中在抗生蛋白鏈菌素上形成層，并培養(yǎng)60分鐘，或置于冰箱中一個(gè)晚上。過(guò)量的試劑被清洗掉，盤(pán)被旋轉(zhuǎn)干燥。通過(guò)用捕獲抗體在生物盤(pán)縫隙上的指定點(diǎn)形成層，建立特定捕獲區(qū)的模式。對(duì)輔助劑/誘導(dǎo)物及抑制劑/細(xì)胞毒素測(cè)定，按下面表2的指定，把抗CD4、抗CD8、和抗CD3、及抗CD45，在副抗體上形成層。培養(yǎng)30分鐘，或置于冰箱中一個(gè)晚上。盤(pán)的組裝，用25μm或100μm“U”型粘附層(3M)，加上在使用頂檢測(cè)器情形下的透明覆蓋盤(pán)，或在使用底檢測(cè)器情形下的反射覆蓋盤(pán)。有關(guān)雙層抗體捕獲方法的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，下面結(jié)合圖35A-35D、36、和37討論。
表2捕獲層組合與變化II

另外，MNC樣品的等分樣本，用抗要研究的細(xì)胞的抗體，在位點(diǎn)外培養(yǎng)。對(duì)輔助劑/誘導(dǎo)物及抑制劑/細(xì)胞毒素測(cè)定，MNC用抗CD4、抗CD8、抗CD3、抗CD14、及抗CD45培養(yǎng)15分鐘，使之充分相互作用。未結(jié)合的抗體用清洗去掉(以1000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘)。然后，把已清洗的絡(luò)合物，注入已用特定捕獲副抗體如特定的IgG打底的空腔25-100μm(用3M粘附層或之類(lèi)建立)。培養(yǎng)30分鐘之后，用頂檢測(cè)器(透明覆蓋盤(pán))或用底檢測(cè)器(反射的金覆蓋盤(pán))使專(zhuān)門(mén)捕獲的細(xì)胞成像。涉及該細(xì)胞捕獲方法的細(xì)節(jié)，下面結(jié)合圖31A-31E說(shuō)明。該方法能判定一種特定的要研究的抗體。因此，盤(pán)上每一縫隙或空腔，專(zhuān)門(mén)用于調(diào)查一種特定的要研究的細(xì)胞類(lèi)型。例如，確定譜系是淋巴瘤中的T細(xì)胞(以CD3培養(yǎng)的細(xì)胞)還是B細(xì)胞(以CD19培養(yǎng)的細(xì)胞)。通過(guò)盤(pán)的設(shè)計(jì)，可以容納需要數(shù)量的空腔/縫隙。下面表3所示例子，表明在8空腔/通道盤(pán)上附加的捕獲層模式。
表3捕獲層組合與變化III模式1

模式2

模式3

模式4

模式5

模式6

盤(pán)漏的檢測(cè)和阻斷不需要的細(xì)胞的非指定結(jié)合因?yàn)橐治龅氖茄?，一種生物公害材料，所以盤(pán)要查漏，這是本發(fā)明質(zhì)量控制制作的一部分，以確保在盤(pán)帶著樣品原地旋轉(zhuǎn)時(shí)，沒(méi)有任何空腔是泄漏的。每一通道最好充以StabilGuard，這是一種市場(chǎng)上可以買(mǎi)到阻隔劑，能阻隔一小時(shí)。盤(pán)以每分鐘5000轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)5分鐘，同時(shí)觀察泄漏情況和盤(pán)的穩(wěn)定性。檢查泄漏之后，把盤(pán)置于真空室中24小時(shí)。抽真空后，把充有PBS緩沖劑或空的各空腔放進(jìn)真空盒并存儲(chǔ)在冰箱中，直至使用。
從全血分離暗黃色膜(buffy coat)層把靜脈血在離心管中以每分鐘2800轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速，離心脫去纖維，制備暗黃色膜。用細(xì)移液管小心移去上層的清液血漿。然后用移液管取出下面包含淋巴細(xì)胞和血小板的白色層。一種另外的不用離心而從血液獲得暗黃色膜的方法是，用沉淀增強(qiáng)劑，如血纖維蛋白原、右旋糖酐、阿拉伯膠、Ficoll、或甲醛纖維素，使血液沉淀。Boyum試劑(甲醛纖維素與甲泛影鈉)特別適合用于制備沒(méi)有任何紅細(xì)胞含量的淋巴細(xì)胞。另外，淋巴細(xì)胞可以通過(guò)正的或負(fù)的選擇，或溶解方法，從全血分離淋巴細(xì)胞。
盤(pán)上測(cè)定-基本技術(shù)描述分類(lèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)盤(pán)測(cè)試的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，包括三個(gè)個(gè)別的部分，(1)包含化學(xué)反應(yīng)的基本盤(pán)，(2)通道層，和(3)覆蓋盤(pán)。
最好在PBS中稀釋了的暗黃色膜或全血，注入盤(pán)的空腔，空腔的入口和出口用膠帶密封，然后最好在室溫下把盤(pán)培養(yǎng)一段需要的時(shí)間。對(duì)第一種方法，用帶有頂檢測(cè)器或底檢測(cè)器光驅(qū)動(dòng)器中標(biāo)準(zhǔn)的780nm激光，掃描盤(pán)上給定區(qū)域(如，約1毫米平方的面積)。有關(guān)的細(xì)胞識(shí)別軟件，已由受讓人研發(fā)并公開(kāi)在U.S.Provisional ApplicationSerial No.60/363,949中，標(biāo)題是“Methods For Differential CellCounts Including Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc forPerforming Same”，2002年3月12日申請(qǐng)，和在U.S.ProvisionalApplication Serial No.60/404,921中，標(biāo)題是“Methods ForDifferential Cell Counts Including Related Apparatus and Softwarefor Performing Same”，2002年8月21日申請(qǐng)，這些識(shí)別軟件自動(dòng)地從捕獲的像，給出分類(lèi)計(jì)數(shù)，該捕獲的像例如最好等于1毫米平方。對(duì)第二種方法，用標(biāo)準(zhǔn)的780nm激光把捕獲區(qū)成像，該捕獲區(qū)可以包括淋巴細(xì)胞，中性白細(xì)胞、嗜堿白細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、單核細(xì)胞、和血小板。由受讓人研發(fā)的細(xì)胞識(shí)別軟件，自動(dòng)執(zhí)行如下程序(a)通過(guò)離心去除過(guò)量的未結(jié)合細(xì)胞，(b)把特定區(qū)域或特定的捕獲區(qū)成像，和(c)數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)處理包括每一捕獲區(qū)中特定細(xì)胞的計(jì)數(shù)和導(dǎo)出淋巴細(xì)胞不同子集的數(shù)量。
在處理步驟，識(shí)別軟件在每一捕獲區(qū)上把它遇到的細(xì)胞讀出并作標(biāo)記。處理從每一捕獲區(qū)得到的數(shù)據(jù)之后，軟件顯示每微升血液體積中淋巴細(xì)胞，中性白細(xì)胞、嗜堿白細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、單核細(xì)胞、和血小板區(qū)中的數(shù)量。整個(gè)處理，從把盤(pán)插入光驅(qū)動(dòng)器到顯示要研究的結(jié)果，約需10-15分鐘。
與本發(fā)明有關(guān)的已公開(kāi)的內(nèi)容，也在下面的專(zhuān)利申請(qǐng)中給出U.S.Provisional Application Serial No.60/307,262，標(biāo)題是“Capture layerAssemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping”，2001年7月23日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/307,264，標(biāo)題是“Method for Imaging Blood Cells，Blood-Bome Parasites andPathogens，and Other Biological Matter Including Related OpticalBio-Discs and Drive Assemblies”，2001年7月23日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/307,562，標(biāo)題是“OpticalAnalysis Discs Including Fluidic Circuits for Optical Imaging andQuantitative Evaluation of Blood Cells Including Lymphocytes”，2001年7月23日申請(qǐng)；和U.S.Provisional Application Serial No.60/307,487，標(biāo)題是“Method for Differential Cell Counts IncludingLeukocytes and Use of Optical Bio-Discs for Performing Same”，2001年7月24日申請(qǐng)，本文引用所有這些專(zhuān)利申請(qǐng)，供參考。
下面各段，按照本發(fā)明一些優(yōu)選的具體實(shí)施例，概括地給出盤(pán)說(shuō)明的主要基本單元。
跟蹤設(shè)計(jì)在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，盤(pán)是向前的WobbleSet FDL21:13707或FDL21:1270，鍍有300nm的金。在該反射盤(pán)上，用光刻刻蝕出大小是2×1mm的橢圓形數(shù)據(jù)窗?！癠”形通道使用25μm高的空腔建立的。它可令約7μl的樣品充滿(mǎn)整個(gè)空腔，空腔有入口和出口。最好使用4窗/4通道格式。但是，對(duì)透射盤(pán)，不刻蝕數(shù)據(jù)窗，整個(gè)盤(pán)都可供使用。
粘附層和結(jié)合劑在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，粘附層或通道層，包括該“U”形流體通路，是由Fraylock粘附層DBL 201 Rev C 3M94661構(gòu)成的。也可以用直的通道建立空腔。
覆蓋盤(pán)透明的盤(pán)，在目前盤(pán)組件的一個(gè)特定實(shí)施例中，使用全反射的覆蓋盤(pán)，在26mm半徑上等距離地設(shè)有48個(gè)0.040英寸直徑的樣品入口。
數(shù)據(jù)捕獲和處理用軟件以推薦的×4速度掃描數(shù)據(jù)盤(pán)并讀出，而使用受讓人的細(xì)胞識(shí)別軟件，抽樣速率為2.67MHz。
軟件本發(fā)明還包括處理方法和相關(guān)的細(xì)胞識(shí)別與成像軟件。本軟件針對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)的執(zhí)行及顯示。本軟件可以存儲(chǔ)在光生物盤(pán)上、存儲(chǔ)在光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器閱讀機(jī)裝置中、或只能由光閱讀機(jī)從安全的服務(wù)器接入。該服務(wù)器可以在計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中實(shí)現(xiàn)，如局域網(wǎng)(LAN)、廣域網(wǎng)(WAN)、或在互連網(wǎng)上規(guī)定的條款和條件下可用的其他服務(wù)器。該分布式方法在共同授予的下述專(zhuān)利申請(qǐng)中公開(kāi)U.S.Provisional Application Serial No.60/246,824，標(biāo)題是“InteractiveMethod and System for Analyzing Biological Samples and ProcessingRelated Medical Information Using Specially Prepared Bio-OpticalDisc，Optical Disc Drive，and Internet Connections”，2000年11月8日申請(qǐng)，及相關(guān)的U.S.Patent Application Serial No.09/986,078，標(biāo)題是“Interactive System for Analyzing Biological Samples andProcessing Related Information and the Use Thereof”，2001年11月7日申請(qǐng)，本文引用該兩專(zhuān)利申請(qǐng)全文，供參考。
材料在本文公開(kāi)的不同優(yōu)選實(shí)施例中，采用的材料包括向前擺動(dòng)的用金金屬化的光刻膠盤(pán)；透射式金金屬化盤(pán)；移液管和尖；旋轉(zhuǎn)涂布器；離心機(jī)；擺起電動(dòng)機(jī)(swing-out rotor)；帶抗凝血?jiǎng)鐧幟仕徕c或乙二胺四乙酸(EDTA)的VacutainerTMCPT管；濕的箱；盤(pán)沖壓機(jī)；粘附層；覆蓋盤(pán)；透明覆蓋盤(pán)；膠帶之類(lèi)；真空設(shè)備；金引頭(yellow tips)；和真空室。
試劑按照本發(fā)明的一些方法，在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)中采用的試劑，包括磷酸鹽緩沖液鹽水、異丙基乙醇、蒸餾水、和StabilGuard。
本發(fā)明的一個(gè)目的，是克服已知技術(shù)中的限制。本發(fā)明的另一個(gè)目的，是使已知的光盤(pán)系統(tǒng)，適于在光生物盤(pán)上完成全血中的分類(lèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)。本發(fā)明還有一個(gè)目的，是使血細(xì)胞成像并完成分類(lèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)。
本發(fā)明的這些和其他的優(yōu)點(diǎn)，是在完成簇指定計(jì)數(shù)(clusterdesignation count)的光盤(pán)和驅(qū)動(dòng)器系統(tǒng)中取得的，該光盤(pán)和驅(qū)動(dòng)器系統(tǒng)包括光學(xué)測(cè)定盤(pán)、光源、光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器的光電檢測(cè)器電路、和處理器。光學(xué)測(cè)定盤(pán)包括襯底、在襯底上的活性層、和通過(guò)粘附層或通道單元整體附著在活性層上的頂蓋部分。粘附單元有一部分或多部分被從其上除去，以便形成空腔，在空腔中，有一種或多種捕獲劑是固定不動(dòng)的。捕獲劑，在活性層上是不動(dòng)的，并在空腔之內(nèi)，所以定義了分立的捕獲區(qū)。光源把光引導(dǎo)至盤(pán)上的捕獲區(qū)。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器的光電檢測(cè)器電路，用于檢測(cè)從盤(pán)反射的光，或透過(guò)盤(pán)的光，并從光盤(pán)組件提供載有信息的信號(hào)。處理器與光電檢測(cè)器電路耦合，從載有信息的信號(hào)，獲得用于操作光盤(pán)系統(tǒng)的操作信息，并對(duì)與捕獲劑結(jié)合的樣品中各項(xiàng)目進(jìn)行計(jì)數(shù)。
按照該系統(tǒng)的一個(gè)特定的方面，處理器包括像識(shí)別軟件，用于檢測(cè)細(xì)胞并使細(xì)胞成像。在一個(gè)實(shí)施例中，光電檢測(cè)器與光源在盤(pán)的同一側(cè)，以便檢測(cè)從捕獲區(qū)反射的光。在另一個(gè)實(shí)施例中，光電檢測(cè)器與光源在盤(pán)的兩個(gè)相反側(cè)，以便檢測(cè)透過(guò)捕獲區(qū)的光。
本發(fā)明還針對(duì)用光盤(pán)和盤(pán)驅(qū)動(dòng)器進(jìn)行簇指定計(jì)數(shù)的方法。方法包括如下步驟把血樣放進(jìn)含有分離梯度(separation gradient)的第一管；按一定時(shí)間和足以把血樣分離成層的速度，旋轉(zhuǎn)該第一管；使含有T細(xì)胞的MNC層再混懸，形成MNC混懸液；把MNC混懸液樣品放在包括至少一個(gè)捕獲區(qū)的盤(pán)表面，該至少一個(gè)捕獲區(qū)包含至少一種捕獲劑；把盤(pán)裝入光閱讀機(jī)；旋轉(zhuǎn)盤(pán)；引導(dǎo)入射的電磁輻射束到達(dá)捕獲區(qū)；檢測(cè)經(jīng)過(guò)與盤(pán)的捕獲區(qū)相互作用之后形成的電磁輻射束；把檢測(cè)的電磁束轉(zhuǎn)換為輸出信號(hào)；和分析該輸出信號(hào)，提取與捕獲區(qū)上捕獲的細(xì)胞數(shù)有關(guān)的信息。在該方法的一個(gè)實(shí)施例中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)有反射層，可使引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光被反射。在該方法的另一個(gè)實(shí)施例中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)可使引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光，透過(guò)光盤(pán)。其他屬于確定樣品中細(xì)胞種群濃度的有關(guān)方面，公開(kāi)在下述共同授予并共同待決的專(zhuān)利申請(qǐng)中U.S.Provisional ApplicationSerial No.60/384,205，標(biāo)題是“Optical Disc Systems For DeterminingThe Concentration Of Cells or Particles In A Sample And MethodsRelating Thereto”，2002年5月30日申請(qǐng)。本文引用該申請(qǐng)全文，供參考。
按照該方法的另一個(gè)方面，盤(pán)表面以第一組細(xì)胞捕獲劑涂敷。在該方面的一個(gè)實(shí)施例中，捕獲劑借助交聯(lián)系統(tǒng)，在盤(pán)表面是固定不動(dòng)的。在另外的一個(gè)實(shí)施例中，捕獲劑直接在盤(pán)表面，是固定不動(dòng)的。
按照該方法的再一個(gè)方面，捕獲劑定義一個(gè)或多個(gè)分立的捕獲區(qū)。在其中的一個(gè)特定實(shí)施例中，該一個(gè)或多個(gè)分立捕獲區(qū)，位于光盤(pán)內(nèi)一個(gè)或多個(gè)空腔中。在該方法的又一個(gè)實(shí)施例中，捕獲劑對(duì)細(xì)胞表面抗原，有選擇性的親和力。在另外的實(shí)施例中，捕獲劑用于與主捕獲劑結(jié)合，該主捕獲劑對(duì)細(xì)胞表面抗原有選擇性的親和力。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，細(xì)胞表面抗原是獨(dú)立地從抗原的CD科選擇的。在一個(gè)更為可取的實(shí)施例中，細(xì)胞表面抗原選自包含CD3、CD4、CD8、和CD45的一組。
按照該方法的又一個(gè)方面，旋轉(zhuǎn)包括以足夠的速度旋轉(zhuǎn)一段足夠的時(shí)間，使細(xì)胞有機(jī)會(huì)與捕獲抗原結(jié)合。在該方法該方面的一個(gè)實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)還包括以足夠的速度旋轉(zhuǎn)一段足夠的時(shí)間，以便把未結(jié)合的細(xì)胞移出捕獲區(qū)。在該方法該方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)是以單一的速度完成的。
按照本發(fā)明這些方面的方法的實(shí)施例，最好還包括如下步驟把MNC細(xì)胞樣品引導(dǎo)至捕獲劑附近、在已有的捕獲劑中培養(yǎng)細(xì)胞、和使細(xì)胞與捕獲劑進(jìn)行專(zhuān)門(mén)的結(jié)合。該方法的一個(gè)實(shí)施例，還包括分析捕獲的細(xì)胞數(shù)的步驟，據(jù)此確定樣品中細(xì)胞的濃度。在該實(shí)施例的一個(gè)方面中，分析包括，檢測(cè)從盤(pán)反射或透過(guò)盤(pán)的光強(qiáng)足夠大的變化。在該實(shí)施例的另一個(gè)方面中，分析包括，用像識(shí)別對(duì)捕獲的細(xì)胞計(jì)數(shù)。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，像識(shí)別可以把白細(xì)胞的一種類(lèi)型從另一種類(lèi)型區(qū)分開(kāi)來(lái)。
該方法的另一個(gè)實(shí)施例，還包括對(duì)每一捕獲區(qū)中捕獲的細(xì)胞計(jì)數(shù)的步驟，和給出包含細(xì)胞計(jì)數(shù)的輸出的步驟。在該實(shí)施例的一個(gè)方面，該輸出包括CD4細(xì)胞和CD8細(xì)胞的計(jì)數(shù)，及CD4與CD8細(xì)胞的比值。
按照本發(fā)明的又一個(gè)主要方面，是提供另一種進(jìn)行簇指定計(jì)數(shù)的方法。該另一種方法包括如下步驟(1)在有分離梯度的管中提供血樣；(2)以足夠使血樣分離成層的時(shí)間和速度旋轉(zhuǎn)該管；(3)使包含T細(xì)胞的MNC層再混懸，形成MNC混懸液；(4)向MNC混懸液添加主抗體，形成主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物；(5)把主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物的樣品放在盤(pán)表面，該盤(pán)表面包括至少一個(gè)含有至少一種捕獲劑的捕獲區(qū)；(6)把盤(pán)裝入光閱讀機(jī)；(7)把入射的電磁輻射束引向捕獲區(qū)；(8)檢測(cè)經(jīng)過(guò)與盤(pán)的捕獲區(qū)相互作用之后形成的電磁輻射束；(9)把檢測(cè)的電磁束轉(zhuǎn)換為輸出信號(hào)；和(10)分析該輸出信號(hào)，提取與捕獲區(qū)上捕獲的細(xì)胞數(shù)有關(guān)的信息。
類(lèi)似地，在該另外的方法的一個(gè)實(shí)施例中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)有反射層，以便反射引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光。在該方法的另一個(gè)實(shí)施例中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)可使引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光，透過(guò)光盤(pán)。
按照該方法的一個(gè)方面，盤(pán)表面以第一組捕獲劑涂敷。在該方面的一個(gè)實(shí)施例中，捕獲劑借助交聯(lián)系統(tǒng)，在盤(pán)表面是固定不動(dòng)的。在另外的實(shí)施例中，捕獲劑直接在盤(pán)表面，是固定不動(dòng)的。
按照該方法的又一個(gè)方面，捕獲劑定義了一個(gè)或多個(gè)分立的捕獲區(qū)。在該方面的一個(gè)特定的實(shí)施例中，該一個(gè)或多個(gè)分立捕獲區(qū)，位于光盤(pán)內(nèi)一個(gè)或多個(gè)空腔中。在該方法的另一個(gè)實(shí)施例中，捕獲劑用于與細(xì)胞表面抗原結(jié)合。在另外的實(shí)施例中，捕獲劑用于與第二組捕獲劑結(jié)合，該第二組捕獲劑對(duì)細(xì)胞表面抗原有選擇性的親和力。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，細(xì)胞表面抗原是獨(dú)立地從抗原的CD科選擇的。在一個(gè)更為可取的實(shí)施例中，細(xì)胞表面抗原選自包含CD3、CD4、CD8、和CD45的一組。
按照該方法的再一個(gè)方面，旋轉(zhuǎn)包括以足夠的速度旋轉(zhuǎn)一段足夠的時(shí)間，使細(xì)胞有機(jī)會(huì)與捕獲抗原結(jié)合。在該方法該方面的一個(gè)實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)還包括以足夠的速度旋轉(zhuǎn)一段足夠的時(shí)間，以便把未結(jié)合的細(xì)胞移出捕獲區(qū)。在該方法該方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)是以單一的速度完成的。
按照本發(fā)明這些方面的方法的實(shí)施例，最好還包括如下步驟把主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物引導(dǎo)至捕獲劑附近、在已有的捕獲劑中培養(yǎng)該絡(luò)合物、和使絡(luò)合物與捕獲劑進(jìn)行專(zhuān)門(mén)的結(jié)合。該方法的一個(gè)實(shí)施例，還包括分析捕獲的絡(luò)合物數(shù)的步驟，據(jù)此確定樣品中細(xì)胞的濃度。在該實(shí)施例的一個(gè)方面中，分析包括，檢測(cè)從盤(pán)反射或透過(guò)盤(pán)的光強(qiáng)足夠大的變化。在該實(shí)施例的另一個(gè)方面中，分析包括，用像識(shí)別對(duì)捕獲的絡(luò)合物計(jì)數(shù)。在該方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，像識(shí)別可以把白細(xì)胞的一種類(lèi)型從另一種類(lèi)型區(qū)分開(kāi)來(lái)。
該方法的另一個(gè)實(shí)施例，還包括對(duì)每一捕獲區(qū)中捕獲的細(xì)胞計(jì)數(shù)的步驟，和給出包含細(xì)胞計(jì)數(shù)的輸出的步驟。在該實(shí)施例的一個(gè)方面，該輸出包括CD4細(xì)胞和CD8細(xì)胞的計(jì)數(shù)，及CD4與CD8細(xì)胞的比值。
在上述方法的任一個(gè)中，管還可以包括抗凝血?jiǎng)＿€有，在許多這些方法的特定實(shí)施方案和實(shí)施例中，捕獲劑在其上固定不動(dòng)的表面，是在盤(pán)內(nèi)的表面，并被襯底和頂蓋兩個(gè)相對(duì)側(cè)封閉。
按照本發(fā)明的制作方面，是提供一種制作實(shí)施簇指定計(jì)數(shù)的光學(xué)測(cè)定盤(pán)的方法。制作光學(xué)測(cè)定盤(pán)的方法，包括如下步驟向管中提供交聯(lián)劑、向管添加捕獲劑、使交聯(lián)劑與捕獲劑組合(形成絡(luò)合物)、設(shè)置襯底、以活性層涂敷襯底、把絡(luò)合物淀積在活性層上、和用粘附單元把頂蓋部分附著于活性層。在本實(shí)施例中，交聯(lián)劑是醛活化右旋糖酐。捕獲劑用于與細(xì)胞表面抗原結(jié)合。
按照本方法的一個(gè)方面，淀積包括把絡(luò)合物淀積在預(yù)定的位置，從而形成捕獲區(qū)。在本方法的一個(gè)實(shí)施例中，附著包括附著有反射層的頂蓋部分，以便反射引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光。在本方法的另外的實(shí)施例中，附著包括附著有半反射層的頂蓋部分，以便使引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光，透過(guò)光盤(pán)。
在另外的實(shí)施例中，捕獲劑包括主、副捕獲抗體。副抗體與盤(pán)表面結(jié)合，并對(duì)主捕獲抗體有特殊的親和力。在本實(shí)施例中，主捕獲抗體對(duì)要研究的細(xì)胞表面抗原，有選擇性的親和力。在本實(shí)施例的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞表面抗原，是從抗原的CD科中選擇的。在一個(gè)更可取的優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞表面抗原選自包含CD3、CD4、CD8、和CD45的一組。
還是按照本發(fā)明的制作方面，在于提供一種另外的制作進(jìn)行簇指定計(jì)數(shù)的光學(xué)測(cè)定盤(pán)方法。該制作光學(xué)測(cè)定盤(pán)的另外的方法，包括如下步驟設(shè)置襯底、以活性層涂敷襯底、把捕獲劑淀積在活性層上(形成捕獲區(qū))、培養(yǎng)襯底、旋轉(zhuǎn)襯底、和用粘附單元把頂蓋部分附著于活性層上。在本方法的一個(gè)特定的實(shí)施例中，培養(yǎng)步驟包括，在足夠的溫度上培養(yǎng)足夠的一段時(shí)間，使捕獲劑在活性層上固定不動(dòng)。在本方法的另一個(gè)實(shí)施例中，旋轉(zhuǎn)步驟包括，以足夠的速度旋轉(zhuǎn)一段足夠的時(shí)間，以便把非固定不動(dòng)的捕獲劑移出捕獲區(qū)。
按照本方法的另一個(gè)方面，捕獲劑是從以下一組中選擇的，該組包括IgG、生物素基的IgG、抗CD3抗體、生物素基抗CD3抗體、抗CD4抗體、生物素基抗CD4抗體、抗CD8抗體、生物素基抗CD8抗體、抗CD45抗體、和生物素基抗CD45抗體。在該方面的一個(gè)實(shí)施例中，捕獲劑是主捕獲劑。在另外一個(gè)實(shí)施例中，捕獲劑是副捕獲劑。按照該另外一個(gè)實(shí)施例的一個(gè)方面，本方法還包括，在旋轉(zhuǎn)步驟之后，把主捕獲劑淀積在副捕獲劑上的步驟。在該另外一個(gè)實(shí)施例的另一個(gè)方面中，本方法還包括，在把主捕獲劑淀積在副捕獲劑上面之后，培養(yǎng)并旋轉(zhuǎn)該襯底的步驟。
按照本發(fā)明的又一個(gè)主要方面，是提供一種實(shí)施簇指定計(jì)數(shù)的光學(xué)測(cè)定盤(pán)。光學(xué)測(cè)定盤(pán)包括襯底、放在襯底上的活性層、通過(guò)粘附單元整體地附著在活性層上的頂蓋部分(有一部分或多部分被除去，以形成一個(gè)或多個(gè)定義在其間的空腔)、和在活性層上一種或多種固定不動(dòng)的捕獲劑。捕獲劑在一個(gè)或多個(gè)空腔內(nèi)定義分立的捕獲區(qū)。在該測(cè)定盤(pán)的一個(gè)實(shí)施例中，捕獲劑借助交聯(lián)系統(tǒng)而固定不動(dòng)。在該測(cè)定盤(pán)的另外的一個(gè)實(shí)施例中，捕獲劑借助活性層而固定不動(dòng)。
在該光學(xué)測(cè)定盤(pán)的一個(gè)特定實(shí)施例中，捕獲劑是對(duì)細(xì)胞表面抗原有選擇性的親和力的抗體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，捕獲劑選自包含對(duì)CD3、CD4、CD8、和CD45的抗體的一組。在該光學(xué)測(cè)定盤(pán)的另一個(gè)實(shí)施例中，捕獲劑是對(duì)主抗體有選擇性的親和力的抗體，該主抗體對(duì)細(xì)胞表面抗原有選擇性的親和力。類(lèi)似地，在光學(xué)測(cè)定盤(pán)該方面的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，主抗體選自包含對(duì)CD3、CD4、CD8、和CD45的抗體的一組。在光學(xué)測(cè)定盤(pán)本實(shí)施例中，主捕獲劑是在鼠中產(chǎn)生的抗人抗體，而副捕獲劑是在羊中產(chǎn)生的抗鼠抗體。
涉及本發(fā)明的技術(shù)方面，也在下述專(zhuān)利申請(qǐng)中說(shuō)明U.S.Provisional Application Serial No.60/307,489，標(biāo)題是“OpticalAnalysis Discs Including Microfluidic Circuits for Performing CellCounts”，2001年7月24日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application SerialNo.60/307,825，標(biāo)題是“Methods for Reducing Non-Specific Bindingof Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter IncludingHeparin，Plasma，or Poly-Lysine”，2001年7月25日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/307,762，標(biāo)題是“Methods forReducing Non-Specific Binding of Cells on Optical Bio-Discs UtilizingBlocking Agents”，2001年7月25日申請(qǐng)；U.S.Provisional ApplicationSerial No.60/307,764，標(biāo)題是“Methods for Reducing Bubbles inFluidic Chambers Using Polyvinyl Alcohol and Related Techniquesfor Achieving Same in Optical Bio-Discs”，2001年7月25日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/308,214，標(biāo)題是“SealingMethods for Containment of Hazardous Biological Materials withinOptical Analysis Disc Assemblies”，2001年7月27日申請(qǐng)；和U.S.Provisional Application Serial No.60/308,197，標(biāo)題是“Methods forCalculating Qualitative and Quantitative Ratios ofHelper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using OpticalBio-Disc Platform”，2001年7月27日申請(qǐng)，本文引用所有這些專(zhuān)利申請(qǐng)全文。
本發(fā)明的方法和設(shè)備，與現(xiàn)有技術(shù)相比，有一個(gè)或多個(gè)優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明包括，但不限于簡(jiǎn)單和快速的盤(pán)上處理、無(wú)需有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員操作測(cè)試、小的樣品體積、使用廉價(jià)的材料、和使用已知光盤(pán)格式及驅(qū)動(dòng)器制作技術(shù)。這些和其他的特征及優(yōu)點(diǎn)，在參照附圖與技術(shù)例子，閱讀下面的詳細(xì)說(shuō)明后，將有更好的了解。


本發(fā)明還有的目的，連同提供的另外的特征及由此產(chǎn)生的利益，將從下面本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的說(shuō)明中變得更明顯，附圖表明這些優(yōu)選的實(shí)施例，圖中自始至終以相同的參考數(shù)字指示相同的部件，其中圖1是按照本發(fā)明的生物盤(pán)系統(tǒng)的圖形表示；圖2是本發(fā)明使用的反射生物盤(pán)的分解透視圖；圖3是圖2所示盤(pán)的頂視圖；圖4用剖開(kāi)部分，表明圖2所示盤(pán)不同層的透視圖；
圖5是本發(fā)明使用的透射生物盤(pán)的分解透視圖；圖6用剖開(kāi)部分，畫(huà)出圖5所示盤(pán)的透視圖，說(shuō)明盤(pán)的半反射層的功能方面；圖7是曲線(xiàn)，表示薄金膜的厚度與透射率之間的關(guān)系；圖8是圖5所示盤(pán)的頂視圖；圖9用剖開(kāi)部分，畫(huà)出圖5所示盤(pán)的透視圖，表明圖6所示的包括半反射層的不同層；圖10是圖1所示系統(tǒng)更詳細(xì)的透視圖和方框圖；圖11是局部截面圖，取自垂直于圖2、3、和4所示反射式光生物盤(pán)的半徑，表明在其中形成的流動(dòng)通道；圖12是局部截面圖，取自垂直于圖5、8、和9所示透射式光生物盤(pán)的半徑，表明在其中形成的流動(dòng)通道和頂檢測(cè)器；圖13是圖2、3、和4所示反射式光生物盤(pán)局部縱向截面圖，表明在其中形成的擺動(dòng)的槽；圖14是圖5、8、和9所示透射式光生物盤(pán)局部縱向截面圖，表明在其中形成的擺動(dòng)的槽和頂檢測(cè)器；圖15是類(lèi)似于圖11的圖，表明反射盤(pán)的整個(gè)厚度和它初始的折射性質(zhì)；圖16是類(lèi)似于圖12的圖，表明透射盤(pán)的整個(gè)厚度和它初始的折射性質(zhì)；圖17A是用圖形表示的流程圖，表明用本發(fā)明的方法分析血樣；圖17B是用圖形表示的細(xì)節(jié)，表明使用圖17A的盤(pán)，把抗體附著于白細(xì)胞上；圖18A是抗生蛋白鏈菌素的圖形表示；圖18B是生物素的圖形表示；圖18C是由抗生蛋白鏈菌素與生物素構(gòu)成的交聯(lián)系統(tǒng)的圖形表示；圖18D是副抗體的圖形表示；圖18E是生物素基的副抗體的圖形表示；
圖18F是主抗體的圖形表示；圖18G是生物素基的主抗體的圖形表示；圖18H是CD4+細(xì)胞的圖形表示，表明四個(gè)CD4表面抗原；圖18I是CD8+細(xì)胞的圖形表示，表明四個(gè)CD8表面抗原；圖18J是與醛活化右旋糖酐結(jié)合的副抗體的圖形表示；圖18K是圖18J的截面圖的圖形表示；圖19A和19B是細(xì)胞被主抗體捕獲的圖形表示，按照本發(fā)明的第一實(shí)施方案，該主抗體借助交聯(lián)系統(tǒng)與襯底結(jié)合；圖19C和19D是細(xì)胞被主抗體捕獲的圖形表示，按照本發(fā)明的第一實(shí)施方案，該主抗體直接與襯底結(jié)合；圖20A-20I是反射生物盤(pán)的截面?zhèn)纫晥D，表明用按照本發(fā)明的交聯(lián)系統(tǒng)，把捕獲劑淀積在捕獲區(qū)方法的第一實(shí)施方案的實(shí)施例；圖21是不用交聯(lián)系統(tǒng)的圖20A-20I所示反射盤(pán)另外的實(shí)施例；圖22作為透射盤(pán)格式中實(shí)施的方案，畫(huà)出圖20A-20I中利用的捕獲化學(xué)反應(yīng)；圖23A和23B是細(xì)胞被主抗體捕獲的圖形表示，按照本發(fā)明的第二實(shí)施方案，該主抗體與副抗體結(jié)合，副抗體則借助交聯(lián)系統(tǒng)與襯底結(jié)合；圖23C和23D是細(xì)胞被主抗體捕獲的圖形表示，按照本發(fā)明的第二實(shí)施方案，該主抗體與副抗體結(jié)合，副抗體則直接與襯底結(jié)合；圖24A-24L是反射生物盤(pán)的截面?zhèn)纫晥D，表明用按照本發(fā)明的主和副捕獲抗體及交聯(lián)系統(tǒng)，把捕獲劑淀積在捕獲區(qū)方法的第二實(shí)施方案的實(shí)施例；圖25是不用交聯(lián)系統(tǒng)的圖24A-24L所示反射盤(pán)另外的實(shí)施例；圖26作為透射盤(pán)格式中實(shí)施的方案，畫(huà)出圖24A-24L中利用的捕獲化學(xué)反應(yīng)；圖27A和27B是細(xì)胞被主抗體捕獲的圖形表示，按照本發(fā)明的第二實(shí)施方案，該主抗體與副抗體結(jié)合，副抗體則通過(guò)DCHO鏈與襯底結(jié)合；
圖27C和27D是細(xì)胞被主抗體捕獲的圖形表示，按照本發(fā)明的第二實(shí)施方案，該主抗體通過(guò)DCHO鏈，直接與襯底結(jié)合；圖28A是用圖形表示的流程圖，表明抗體DCHO絡(luò)合物的制備；圖28B-28J是反射生物盤(pán)的截面?zhèn)纫晥D，表明用主和副抗體及DCHO鏈，把捕獲劑淀積在捕獲區(qū)方法的第二實(shí)施方案的實(shí)施例；圖29是不用副抗體的圖28B-28J所示反射盤(pán)另外的實(shí)施例；圖30作為透射盤(pán)格式中實(shí)施的方案，畫(huà)出圖28B-28J中利用的捕獲化學(xué)反應(yīng)；圖31A是光生物盤(pán)的頂視圖，畫(huà)出四條流體通路，各有若干個(gè)用于特定細(xì)胞表面標(biāo)記物的捕獲區(qū)和負(fù)控制區(qū)；圖31B和31C是主抗體細(xì)胞絡(luò)合物被副抗體捕獲的圖形表示，按照本發(fā)明的第三實(shí)施方案，該副抗體借助交聯(lián)系統(tǒng)與襯底結(jié)合；圖31D和31E是主抗體細(xì)胞絡(luò)合物被副抗體捕獲的圖形表示，按照本發(fā)明的第三實(shí)施方案，該副抗體直接與襯底結(jié)合；圖32A-32I是反射生物盤(pán)的截面?zhèn)纫晥D，表明用交聯(lián)系統(tǒng)把捕獲劑淀積在捕獲區(qū)方法的第二實(shí)施方案的實(shí)施例，；圖33是不用交聯(lián)系統(tǒng)的圖32A-32I所示反射盤(pán)另外的實(shí)施例；圖34作為透射盤(pán)格式中實(shí)施的方案，畫(huà)出圖32A-32I中利用的捕獲化學(xué)反應(yīng)；圖35A是光生物盤(pán)的頂視圖，畫(huà)出四條流體通路，各有若干個(gè)用于不同細(xì)胞表面標(biāo)記物的捕獲區(qū)和負(fù)控制區(qū)；圖35B、35C、和35D是反射式光生物盤(pán)的截面?zhèn)纫晥D，表明用交聯(lián)系統(tǒng)分析血樣方法的第一實(shí)施方案；圖36是不用交聯(lián)系統(tǒng)的圖35B、35C、和35D所示反射盤(pán)另外的實(shí)施例；圖37作為透射盤(pán)格式中實(shí)施的方案，畫(huà)出圖35B、35C、和35D中利用的捕獲化學(xué)反應(yīng)；圖38A、38B、和38C是反射式光生物盤(pán)的截面?zhèn)纫晥D，表明用主和副捕獲抗體及交聯(lián)系統(tǒng)，分析血樣方法的第二實(shí)施方案的實(shí)施例；
圖39是不用交聯(lián)系統(tǒng)的圖38A、38B、和38C所示反射盤(pán)另外的實(shí)施例；圖40作為透射盤(pán)格式中實(shí)施的方案，畫(huà)出圖38A、38B、和38C中利用的捕獲化學(xué)反應(yīng)；圖41A、41B、和41C是反射式光生物盤(pán)的截面?zhèn)纫晥D，表明用主和副抗體及DCHO鏈，分析血樣方法的第三實(shí)施方案的實(shí)施例；圖42是不用副抗體的圖41A、41B、和41C所示反射盤(pán)另外的實(shí)施例；圖43作為透射盤(pán)格式中實(shí)施的方案，畫(huà)出圖41A、41B、和41C中利用的捕獲化學(xué)反應(yīng)；圖44A是制備主抗體細(xì)胞絡(luò)合物的用圖形表示的流程圖；圖44B、44C、和44D是反射式光生物盤(pán)的截面?zhèn)纫晥D，表明用主和副捕獲抗體及交聯(lián)系統(tǒng)，分析血樣方法的第四實(shí)施方案的實(shí)施例；圖45是不用交聯(lián)系統(tǒng)的圖44B、44C、和44D所示反射盤(pán)另外的實(shí)施例；圖46作為透射盤(pán)格式中實(shí)施的方案，畫(huà)出圖44B、44C、和44D中利用的捕獲化學(xué)反應(yīng)；圖47畫(huà)出有空腔的光盤(pán)的示意圖，表明按照本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的條碼形分區(qū)技術(shù)；圖48A表明按照本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的條碼形分區(qū)格式得到的測(cè)定結(jié)果；圖48B畫(huà)出顯微鏡及盤(pán)對(duì)應(yīng)的CD4、CD8、和控制區(qū)域的像；圖49畫(huà)出顯微鏡及盤(pán)對(duì)應(yīng)的像的更大視圖，表明本發(fā)明的方法和設(shè)備能獲得的結(jié)果；圖50和51按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，畫(huà)出像識(shí)別的使用；圖52表明按照本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的條碼形分區(qū)得到的期望的輸出屏幕圖；圖53按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，畫(huà)出從被捕獲的細(xì)胞到可用的輸出的方法；
圖54是曲線(xiàn)，表示從抽樣的模擬信號(hào)到對(duì)應(yīng)的數(shù)字信號(hào)的變換，該數(shù)字信號(hào)作為一維陣列被存儲(chǔ)起來(lái)；圖55是對(duì)標(biāo)出部分以放大的詳細(xì)視圖表示的光盤(pán)透視圖，表明被捕獲的白細(xì)胞相對(duì)于生物盤(pán)軌道的位置，該被捕獲的白細(xì)胞在與入射光束相互作用后，產(chǎn)生含有信號(hào)的光束；圖56A按照本發(fā)明，畫(huà)出白細(xì)胞相對(duì)于生物盤(pán)軌道的位置的圖形表示；圖56B是按照本發(fā)明，從圖56A的白細(xì)胞得到的一系列特征波形軌跡；圖57是表明圖57A、57B、57C、和57D之間的關(guān)系的圖解表示；圖57A、57B、57C、和57D，當(dāng)把它們放在一起時(shí)，表示從圖56B的特征波形軌跡到數(shù)字信號(hào)的變換，這些數(shù)字信號(hào)作為一維陣列存儲(chǔ)，并組合成兩維陣列作為數(shù)據(jù)輸出；圖58按照本發(fā)明相關(guān)的處理方法和計(jì)算的算法，畫(huà)出數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)主要步驟的邏輯流程圖；圖59是分析空腔的圖形表示，該分析空腔有不同的分析白細(xì)胞的捕獲區(qū)；圖60A和60B是分析空腔的圖形表示，該分析空腔有不同的分析紅和白細(xì)胞的捕獲區(qū)；圖61是使用本發(fā)明的光生物盤(pán)，在CD標(biāo)記物測(cè)定中，作為細(xì)胞濃度函數(shù)的被捕獲的CD4+細(xì)胞數(shù)曲線(xiàn)；圖62A是使用本發(fā)明的光生物盤(pán)，從被分析的血樣中，得到的CD4/CD8比值的數(shù)據(jù)散布曲線(xiàn)；和圖62B是使用FACS分析，從同一血樣中，得到的CD4/CD8比值的數(shù)據(jù)散布曲線(xiàn)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明針對(duì)盤(pán)驅(qū)動(dòng)器系統(tǒng)、光生物盤(pán)、細(xì)胞測(cè)定及細(xì)胞計(jì)數(shù)方法、像處理技術(shù)、和相關(guān)的軟件。本發(fā)明這些方面的每一個(gè)，下面更詳細(xì)地說(shuō)明。
本文公開(kāi)的本發(fā)明各方面涉及的盤(pán)驅(qū)動(dòng)器系統(tǒng)、光生物盤(pán)、細(xì)胞測(cè)定及細(xì)胞計(jì)數(shù)方法、像處理技術(shù)、和相關(guān)的軟件，也在下面的專(zhuān)利申請(qǐng)中給出U.S.Provisional Application Serial No.60/338,679，標(biāo)題是“Quantitative and Qualitative Methods for Cell Isolation andTyping Including Immunophenotyping”，2001年11月13日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/332,001，標(biāo)題是“CaptureLayer Assemblies and Optical Bio-Discs for Immunophenotyping”，2001年11月14日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/334,131，標(biāo)題是“Methods for Calculating Qualitative andQuantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/CytotoxicT-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform”，2001年11月30日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/349,392，標(biāo)題是“RBC Sieving Protocol Evaluations ofHelper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymph0cytes Using WholeBlood and Related Optical Bio-Disc”，2002年1月17日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/349,449，標(biāo)題是“RBC LysisProtocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/CytotoxicT-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc”，2002年1月18日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/353,300，標(biāo)題是“Methods For Differential Cell Counts IncludingLeukocytes and Use of Optical Bio-Disc for Performing Same”，2002年1月31日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/355,644，標(biāo)題是“Cluster Designation Assays Performed on Optical Bio-DiscIncluding Equi-Radial Analysis Zones”，2002年2月5日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/358,479，標(biāo)題是“ClusterDesignation Assays Performed on Optical Bio-Disc IncludingEqui-Radial Analysis Zones and Related Systems and Methods”，2002年2月19日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/363,949，標(biāo)題是“Methods for Differential Cell Counts Including Leukocytesand Use of Optical Bio-Disc for Performing Same”，2002年3月12日申請(qǐng)；和U.S.Provisional Application Serial No.60/404,921，標(biāo)題是“Methods For Differential Cell Counts Including Related Apparatusand Software For Performing Same”，2002年8月21日申請(qǐng)，本文引用所有這些專(zhuān)利申請(qǐng)，供參考。
驅(qū)動(dòng)器系統(tǒng)及有關(guān)的盤(pán)圖1按照本發(fā)明，畫(huà)出光生物盤(pán)110的透視圖，作為本文公開(kāi)的進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)的實(shí)施方案。該光生物盤(pán)110是結(jié)合光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112及顯示監(jiān)控器114一起畫(huà)出的。有關(guān)該類(lèi)盤(pán)驅(qū)動(dòng)器和盤(pán)分析系統(tǒng)，在共同授予并共同待決的U.S.Patent Application Serial No.10/008,156中公開(kāi)，標(biāo)題是“Disc Drive System and Methods for Usewith Bio-discs”，2001年11月9日申請(qǐng)，和U.S.Patent ApplicationSerial No.10/043,688，標(biāo)題是“Optical Disc Analysis System IncludingRelated Methods For Biological and Medical Imaging”，2002年1月10日申請(qǐng)，本文引用該兩個(gè)專(zhuān)利申請(qǐng)，供參考。
圖2是光生物盤(pán)110實(shí)施例的主要結(jié)構(gòu)單元的分解透視圖。圖2是反射式區(qū)的光生物盤(pán)110(本文此后稱(chēng)“反射盤(pán)”)例子，它可以在本發(fā)明中使用。主要結(jié)構(gòu)單元包括頂蓋部分116、粘附單元或通道層118、和襯底120。頂蓋部分116包括一個(gè)或多個(gè)入口122和一個(gè)或多個(gè)出口124。頂蓋部分116可以由聚碳酸酯形成，并最好在從圖2透視圖看去的底部鍍上反射表面146(圖4)。在該優(yōu)選的實(shí)施例中，反射層142(圖4)表面包括觸發(fā)標(biāo)記或記號(hào)126。觸發(fā)記號(hào)126可以包括在生物盤(pán)所有三層都透明的窗、不透明區(qū)域、或用信息編碼的反射或半反射區(qū)域，該觸發(fā)記號(hào)把數(shù)據(jù)發(fā)送至處理器166，如圖10所示，該觸發(fā)記號(hào)接著與詢(xún)問(wèn)或入射光束152的操作功能相互作用，見(jiàn)圖6和10。
圖2所示第二單元是粘附單元或通道層118，在其中形成流體通路128或U形通道。流體通路128是通過(guò)沖壓或切割該隔膜，去除塑料薄膜，形成如圖所示形狀。每一流體通路128包括流動(dòng)通道130和返回通道132。圖2所示的一些流體通路128，包括混合空腔134。圖中畫(huà)出兩種不同類(lèi)型的混合空腔134。第一種是對(duì)稱(chēng)的混合空腔136，它相對(duì)于流動(dòng)通道130是對(duì)稱(chēng)地形成的。第二種是偏移的混合空腔138。偏移的混合空腔138形成在流動(dòng)通道的一側(cè)，如圖所示。
圖2所示第三單元是襯底120，它包括靶或捕獲區(qū)140。襯底120最好用聚碳酸酯制成，并在其上部淀積反射層142，見(jiàn)圖4。靶區(qū)140是按指定形狀或按另外需要的任何形狀，除去反射層142形成的?；蛘?，靶區(qū)140可以通過(guò)掩模技術(shù)形成，掩模技術(shù)是在鍍上反射層142之前遮蓋著靶區(qū)140區(qū)域。反射層142可以用鋁或金等金屬形成。
圖3是圖2所示在其頂蓋部分116有反射層142的光生物盤(pán)110的頂視圖，圖上反射層142是當(dāng)作透明畫(huà)出的，以便露出置于盤(pán)內(nèi)的流體通路128、靶區(qū)140、和觸發(fā)記號(hào)126。
圖4按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，畫(huà)出反射區(qū)型光生物盤(pán)110的放大的透視圖。該圖包括被剖去的各層的一部分，以便畫(huà)出每一主要層、襯底、鍍層、或隔膜的部分截面圖。圖4畫(huà)出的襯底120鍍有反射層142?；钚詫?44加在反射層142上。在本優(yōu)選實(shí)施例中，活性層144由聚苯乙烯形成。或者，也可以用聚碳酸酯、金、活化的玻璃、改性玻璃、或改性聚苯乙烯，例如聚苯乙烯共順丁烯二酐(polystyrene-co-maleic anhydride)。此外，也可以用水凝膠。或者，如在本實(shí)施例所示，把塑料粘附單元118加在活性層144上面。塑料粘附單元118的暴露部分，表明切去的或被沖壓去的U形，用于建立流體通路128。在本生物盤(pán)反射區(qū)實(shí)施例中最后的主要結(jié)構(gòu)層，是頂蓋部分116。頂蓋部分116包括在其底部的反射表面146。反射表面146可以由金屬如鋁或金形成。
現(xiàn)在參考圖5，圖上按照本發(fā)明，畫(huà)出透射式光生物盤(pán)110的主要結(jié)構(gòu)單元。透射式光生物盤(pán)110的主要結(jié)構(gòu)單元，同樣包括頂蓋部分116、粘附或通道單元118、和襯底120層。頂蓋部分116包括一個(gè)或多個(gè)入口122和一個(gè)或多個(gè)出口124。頂蓋部分116可以由聚碳酸酯形層成?？蛇x的觸發(fā)記號(hào)126可以包括在薄的半反射層143表面之上，最好如圖6和9所示。觸發(fā)記號(hào)126可以包括在生物盤(pán)所有三層都透明的窗、不透明區(qū)域、或用信息編碼的反射或半反射區(qū)域，該觸發(fā)記號(hào)把數(shù)據(jù)發(fā)送至處理器166，如圖10所示，該觸發(fā)記號(hào)接著與詢(xún)問(wèn)或入射光束152的操作功能相互作用，見(jiàn)圖6和10。
圖5所示第二單元是粘附單元或通道層118，在其上形成流體通路128或U形通道。流體通路128是通過(guò)沖壓或切割該隔膜，去除塑料薄膜，形成如圖所示形狀。每一流體通路128包括流動(dòng)通道130和返回通道132。圖5所示的一些流體通路128，包括混合空腔134。圖中畫(huà)出兩種不同類(lèi)型的混合空腔134。第一種是對(duì)稱(chēng)的混合空腔136，它相對(duì)于流動(dòng)通道130是對(duì)稱(chēng)地形成的。第二種是偏移的混合空腔138。偏移的混合空腔138形成在流動(dòng)通道的一側(cè)，如圖所示。
圖5所示第三單元是襯底120，它包括靶或捕獲區(qū)140。襯底120最好用聚碳酸酯制成，并在其上部淀積薄的半反射層143，見(jiàn)圖6。示于圖5和6與盤(pán)110的襯底120相關(guān)的半反射層143，比圖2、3、和4所示反射盤(pán)110襯底120上的反射層142薄得多。薄得多的半反射層143，能使詢(xún)問(wèn)光束152某一透射率透過(guò)圖6和12所示的透射盤(pán)的結(jié)構(gòu)層。該薄的半反射層143可以由如鋁或金等金屬形成。
圖6是圖5所示透射式實(shí)施例的襯底120和半反射層143放大的透視圖。薄的半反射層143可以由如鋁或金等金屬形成。在該優(yōu)選實(shí)施例中，圖5和6所示透射盤(pán)的薄的半反射層143厚度可以在10-300范圍，且不超過(guò)400。該較薄的半反射層143，能使部分入射或詢(xún)問(wèn)光束152穿透并通過(guò)半反射層143，被頂檢測(cè)器158檢測(cè)，見(jiàn)圖10和12，同時(shí)一些光沿入射路徑反射或返回。如下面所指出，表4給出金膜對(duì)膜厚的反射和透射特性。金膜在厚度大于800時(shí)全反射。而光通過(guò)金膜透射的閾值密度約為400。
除了表4之外，圖7根據(jù)金的厚度，給出薄半反射層143反射和透射性質(zhì)的相反關(guān)系的曲線(xiàn)表示。圖7所示曲線(xiàn)使用的反射和透射值是絕對(duì)值。
表4Au膜的反射率和透射率(絕對(duì)值)

下面參考圖8，圖上畫(huà)出圖5和6所示透射式光生物盤(pán)110頂視圖，上有透明的頂蓋部分116，以便露出盤(pán)內(nèi)的流體通道、觸發(fā)記號(hào)126、和靶區(qū)140。
圖9按照本發(fā)明透射盤(pán)實(shí)施例，畫(huà)出光生物盤(pán)110放大的透視圖。圖上畫(huà)出的盤(pán)110的各層被剖去一部分，以便畫(huà)出每一主要層、襯底、鍍層、或隔膜的部分截面圖。圖9畫(huà)出一種透射盤(pán)格式，它有透明的頂蓋部分116、在襯底120上薄的半反射層143、和觸發(fā)記號(hào)126。在本實(shí)施例中，觸發(fā)記號(hào)126包括位于頂蓋上部的不透明材料?；蛘?，觸發(fā)記號(hào)126可以由刻蝕在盤(pán)的薄反射層143上透明的、不反射的窗形成，或任何吸收或不反射來(lái)自圖10觸發(fā)檢測(cè)器160信號(hào)的標(biāo)記形成。圖9還畫(huà)出靶區(qū)140，它是按指定形狀或按另外需要的任何形狀作記號(hào)形成的。指示靶區(qū)140的記號(hào)，可以制作在襯底120的薄反射層143上或在襯底120的底部(在盤(pán)下面)?；蛘?，靶區(qū)140可以通過(guò)掩模技術(shù)形成，該掩模遮蓋除靶區(qū)140外的整個(gè)薄反射層143。在本實(shí)施例中，靶區(qū)140可以通過(guò)絲網(wǎng)印刷，把油墨印在薄反射層143上。在圖5、8、和9所示透射盤(pán)格式中，靶區(qū)140也可以由盤(pán)上編碼的地址信息定義。在本實(shí)施例中，靶區(qū)140不包括物理上可辨識(shí)的邊界。
繼續(xù)參考圖9，活性層144是作為加在薄半反射層143上畫(huà)出的。在本優(yōu)選實(shí)施例中，活性層144是40至200μm厚的2％聚苯乙烯層?；蛘?，也可以用聚碳酸酯、金、活化的玻璃、改性玻璃、或改性聚苯乙烯，例如聚苯乙烯共順丁烯二酐。此外，也可以用水凝膠。如在本實(shí)施例所示，塑料粘附單元118是加在活性層144上的。塑料粘附單元118的暴露部分，表明切去的或被沖壓去的U形，以便建立流體通路128。
在本生物盤(pán)110透射式實(shí)施例中，最后的主要結(jié)構(gòu)層，是透明的、不反射的頂蓋部分116，它包括入口122和出口124。
現(xiàn)在參考圖10，圖上用透視的和方框的圖表示光學(xué)部件148、產(chǎn)生入射或詢(xún)問(wèn)光束152的光源150、返回光束154、及透射光束156。在圖4所示反射生物盤(pán)的情形，返回光束154是從光生物盤(pán)110頂蓋部分116的反射表面146反射的。在光生物盤(pán)110的本反射式實(shí)施例中，返回光束154被底檢測(cè)器157對(duì)信號(hào)單元的存在進(jìn)行檢測(cè)和分析。另一方面，按照透射生物盤(pán)的格式，透射的光束156由頂檢測(cè)器158檢測(cè)，并同樣對(duì)信號(hào)單元的存在進(jìn)行分析。在透射式實(shí)施例中，可以用光電檢測(cè)器作為頂檢測(cè)器158。
圖10還畫(huà)出硬件的觸發(fā)機(jī)構(gòu)，它包括盤(pán)上的觸發(fā)器記號(hào)126和觸發(fā)器檢測(cè)器160。硬件觸發(fā)機(jī)構(gòu)被用在反射生物盤(pán)(圖4)和透射生物盤(pán)(圖9)兩種情形。觸發(fā)機(jī)構(gòu)只當(dāng)詢(xún)問(wèn)光束152落在相應(yīng)的靶區(qū)140上時(shí)，才讓處理器166收集數(shù)據(jù)。此外，在透射生物盤(pán)系統(tǒng)中，也可以用軟件觸發(fā)器。軟件觸發(fā)器使用底檢測(cè)器來(lái)發(fā)出信號(hào)，只要詢(xún)問(wèn)光束152落在相應(yīng)靶區(qū)140的邊緣，就讓處理器166收集數(shù)據(jù)。圖10還畫(huà)出驅(qū)動(dòng)電動(dòng)機(jī)162，和控制光生物盤(pán)110旋轉(zhuǎn)的控制器164。圖10也畫(huà)出處理器166和分析器168，用于在透射式光生物盤(pán)在別的情況下處理返回光束154及透射光束156。
如圖11所示，圖上按照本發(fā)明，畫(huà)出光生物盤(pán)110反射盤(pán)實(shí)施例的局部截面圖。圖11畫(huà)出襯底120和反射層142。如上所述，反射層142可以由諸如鋁、金、或其他適當(dāng)?shù)姆瓷洳牧现瞥?。在本?shí)施例中，襯底120的上表面是光滑的。圖11還畫(huà)出加在反射層142上的活性層144。如圖11所示，靶區(qū)140是在需要的位置上，通過(guò)移去反射層142某一面積或部分形成的，或者，通過(guò)在加上反射層142之前，遮蔽需要的面積而形成。圖11還畫(huà)出加在活性層144上的塑料粘附單元118。圖11也畫(huà)出頂蓋部分116和在其內(nèi)的反射表面146。因此，當(dāng)把頂蓋部分116加到有按需要形狀切掉的塑料粘附單元118上時(shí)，流動(dòng)通道130便據(jù)此形成。如圖11的箭頭所示，入射光束152的路徑，開(kāi)始時(shí)從盤(pán)110的下面引向襯底120。然后，入射光束會(huì)聚在靠近反射層142的一點(diǎn)。由于會(huì)聚發(fā)生在缺少一部分反射層142的靶區(qū)140，所以入射光束繼續(xù)沿通過(guò)活性層144的路徑傳播，并進(jìn)入流動(dòng)通道130。然后，入射光束繼續(xù)向上傳播，通過(guò)流動(dòng)通道，最后落在反射表面146。在該點(diǎn)，入射光束152沿入射路徑折回去或反射回去，并據(jù)此形成返回光束154。
圖12按照本發(fā)明生物盤(pán)110透射式實(shí)施例，畫(huà)出局部截面圖。圖12畫(huà)出的透射盤(pán)格式，有透明的頂蓋部分116和襯底120上的薄半反射層143。圖12也畫(huà)出加在薄半反射層143上的活性層144。在本優(yōu)選實(shí)施例中，透射盤(pán)的薄半反射層143由10-300且不超過(guò)400厚的諸如鋁或金等金屬形成。該薄半反射層143能使來(lái)自圖10光源150的部分入射或詢(xún)問(wèn)光束152穿透并向上通過(guò)盤(pán)，被頂檢測(cè)器158檢測(cè)，同時(shí)，一些光沿與入射路徑相同但方向相反的路徑，反射回去。在這種安排中，返回的或被反射的光束154，是被半反射層143反射的。因此，按此方式，返回光束154不進(jìn)入流動(dòng)通道130?？梢杂梅瓷涔饣蚍祷毓馐?54，在預(yù)先記錄的、形成在半反射層143之內(nèi)或之上的信息軌道上，跟蹤入射光束152，在結(jié)合圖13和14的說(shuō)明中將更詳細(xì)說(shuō)明。在圖12所示的盤(pán)實(shí)施例中，物理上限定的靶區(qū)140，可以存在也可以不存在。可以通過(guò)在襯底120的薄半反射層143上制作的引導(dǎo)記號(hào)，建立靶區(qū)140。這些記號(hào)可以用絲網(wǎng)印刷或任何等價(jià)方法形成。在不用物理記號(hào)限定靶區(qū)(例如，當(dāng)利用編碼軟件尋址時(shí))的另外實(shí)施例中，可以采用實(shí)際的流動(dòng)通道130作為被限定的靶區(qū)域，在該靶區(qū)域中檢查要調(diào)查的特性。
圖13按照本發(fā)明生物盤(pán)110的反射盤(pán)實(shí)施例，畫(huà)出橫跨軌道的截面圖。該圖是順著盤(pán)的半徑和流動(dòng)通道的縱向切取的。圖13包括襯底120和反射層142。在本實(shí)施例中，襯底120包括一系列槽170。槽170以螺旋形式從靠近盤(pán)的中心向外邊緣伸延。提供槽170是為了使詢(xún)問(wèn)光束152可以沿盤(pán)上的螺旋形槽170跟蹤。這種類(lèi)型的槽170被稱(chēng)為“擺動(dòng)槽”。以起伏的或波浪形側(cè)壁的底部，形成槽170，而升起的或升高的部分，則把相鄰的呈螺旋形的槽170分開(kāi)。在本實(shí)施例中，加在槽170上的反射層142，如圖所示，事實(shí)上是共形的。圖13還畫(huà)出加在反射層142上的活性層144。如圖13所示，靶區(qū)140是在需要的位置上，通過(guò)移去反射層142某一面積或部分形成的，或者，通過(guò)在加上反射層142之前，遮蔽需要的面積而形成。圖13也畫(huà)出，塑料粘附單元118是加在活性層144上的。圖13同時(shí)畫(huà)出頂蓋部分116和在其內(nèi)的反射表面146。因此，當(dāng)把頂蓋部分116加到有按需要形狀切掉的塑料粘附單元118上時(shí)，流動(dòng)通道130便據(jù)此形成。
圖14按照本發(fā)明的生物盤(pán)110的透射盤(pán)實(shí)施例，比如圖12，畫(huà)出橫跨軌道的截面圖。該圖是順著盤(pán)的半徑和流動(dòng)通道的縱向切取的。圖14畫(huà)出襯底120和薄半反射層143。薄半反射層143能使來(lái)自光源150的入射或詢(xún)問(wèn)光束152穿透，并通過(guò)盤(pán)被頂檢測(cè)器158檢測(cè)，同時(shí)一些光以返回光束154的形式被反射回去。薄半反射層143的厚度，由盤(pán)閱讀機(jī)保持跟蹤能力需要的反射光的最小光量確定。在本實(shí)施例中的襯底120，類(lèi)似于圖13所示，包括一系列槽170。本實(shí)施例的槽170最好也以螺旋形式從靠近盤(pán)的中心向外邊緣伸延。提供槽170是為了使詢(xún)問(wèn)光束152可以沿螺旋線(xiàn)跟蹤。圖14還畫(huà)出加在薄半反射層143上的活性層144。圖14還畫(huà)出，塑料粘附單元118是加在活性層144上的。圖14也畫(huà)出沒(méi)有反射表面146的頂蓋部分116。因此，當(dāng)把頂蓋加到有按需要形狀切掉的塑料粘附單元118上時(shí)，流動(dòng)通道130便據(jù)此形成，且能使部分入射光束152基本上不被反射地通過(guò)。
圖15與圖11類(lèi)似，但畫(huà)出反射盤(pán)的整個(gè)厚度及其初始的折射性質(zhì)。圖16與圖12類(lèi)似，但畫(huà)出透射盤(pán)的整個(gè)厚度及其初始的折射性質(zhì)。圖15和16中沒(méi)有槽170，因?yàn)榻孛媸茄夭?70切割的。圖15和16表明存在窄的流動(dòng)通道130，在這些實(shí)施例中，流動(dòng)通道130都與槽170垂直。圖13、14、15、和16畫(huà)出相應(yīng)的反射式和透射盤(pán)的整個(gè)厚度。在這些圖中，畫(huà)出的入射光束開(kāi)始與襯底120相互作用，襯底120的折射性質(zhì)如圖所示，使入射光束改變路徑，把光束152會(huì)聚在反射層142或薄半反射層143上。
細(xì)胞測(cè)定利用本發(fā)明的方法，可以進(jìn)行通用的同種固態(tài)細(xì)胞捕獲測(cè)定，用于快速確定血樣中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞種群的絕對(duì)數(shù)量，及CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞的比值。藏在生物盤(pán)中小的流動(dòng)通道內(nèi)進(jìn)行的測(cè)試，確定被特定抗體捕獲的CD4+、CD8+、CD2+、CD3+、CD19+、和CD45+細(xì)胞的數(shù)量，這些特定抗體在從全血分離的7-15μl單核細(xì)胞(MNC)的捕獲區(qū)上。該測(cè)試是根據(jù)盤(pán)特定位置上的定位細(xì)胞捕獲原理。根據(jù)單克隆或多克隆抗體對(duì)特定血細(xì)胞表面抗原的捕獲化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)這種捕獲化學(xué)反應(yīng)的定位應(yīng)用，在盤(pán)的若干個(gè)位置上建立特定的細(xì)胞捕獲區(qū)。在以MNC血(10,000-30,000細(xì)胞/μl)注入各25-100μl的空腔后，表達(dá)CD4、CD8、CD2、CD3、CD19、和CD45抗原的細(xì)胞，被盤(pán)內(nèi)的捕獲區(qū)捕獲。同樣，藏在捕獲區(qū)內(nèi)的還有確定的負(fù)控制區(qū)域。
圖17A是用圖形表示的血樣分析的流程圖。在步驟1，收集血液(4-8ml)，直接放進(jìn)4或8ml的Becton Dickinson CPT VacutainerTM及抗凝血?jiǎng)﹥?nèi)，抗凝血?jiǎng)┤鏓DTA、檸檬酸葡萄糖(acid citratedextrose)、或肝素。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例的等價(jià)步驟中，在抗凝血?jiǎng)﹥?nèi)的3ml血液，疊放在含有分離梯度176如Histopaque1077的管172內(nèi)。不論哪種情況，血樣174最好在收集后兩小時(shí)內(nèi)使用。疊放著血樣174的包含分離梯度176的管172，在室溫下，放在有水平電動(dòng)機(jī)和擺起桶(swing out bucket)的生物公害離心機(jī)中，以400×g離心25分鐘。離心后，除去血漿層178(步驟2)，留下約2mm血漿在單核細(xì)胞(MNC)部分180之上。收集MNC層180并用磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)清洗。在室溫下以300RCF(每分鐘1200轉(zhuǎn))離心10分鐘，使細(xì)胞成為丸狀，并除去任何殘留的血小板。除去上層清液，并把MNC丸180在PBS中再混懸，輕拍管子。最后的丸180又再混懸(步驟3)，直至細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)10,000-30,000細(xì)胞/μl，取決于生物盤(pán)110流動(dòng)通道130的高度。
生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130被注入7μl的MNC混懸液，然后以粘附片(tab)或其他適當(dāng)?shù)拿芊鈫卧?，密封入?22和出口124(圖3和8)(步驟4)。生物盤(pán)110在室溫下培養(yǎng)15分鐘，然后用光驅(qū)動(dòng)器112的780nm激光掃描，把捕獲場(chǎng)成像(步驟5)。應(yīng)當(dāng)指出，如果用透射生物盤(pán)110，那么光驅(qū)動(dòng)器112可選地包括使捕獲場(chǎng)成像的頂檢測(cè)器158(圖10)。最好在盤(pán)上把軟件編碼，以便指令驅(qū)動(dòng)器自動(dòng)執(zhí)行如下任務(wù)(a)以一個(gè)檔或多個(gè)檔使盤(pán)離心旋轉(zhuǎn)，除去過(guò)量的的未結(jié)合細(xì)胞；(b)把特定的捕獲窗在顯示監(jiān)控器114上成像；和(c)處理數(shù)據(jù)。處理數(shù)據(jù)包括，但不限于，對(duì)每一捕獲區(qū)專(zhuān)門(mén)捕獲的細(xì)胞計(jì)數(shù)，并導(dǎo)出CD4+/CD8+的比值或任何要確定的已編程的比值。其他需要的比值也很容易由本發(fā)明另外的實(shí)施例給出。
圖17A還進(jìn)一步表明，本發(fā)明針對(duì)一種用光盤(pán)和盤(pán)驅(qū)動(dòng)器系統(tǒng)，進(jìn)行簇指定計(jì)數(shù)的方法。本方法包括如下步驟向含有分離梯度的第一管提供血樣；用足以把血樣分離成層的速度和時(shí)間旋轉(zhuǎn)第一管；再混懸包含T細(xì)胞的MNC層，形成MNC混懸液；在包括至少一個(gè)捕獲區(qū)的盤(pán)表面提供MNC混懸液樣品，該至少一個(gè)捕獲區(qū)包含至少一種捕獲劑；把盤(pán)裝入光閱讀機(jī)；旋轉(zhuǎn)盤(pán)；把入射電磁輻射束引導(dǎo)至捕獲區(qū)；檢測(cè)與盤(pán)在捕獲區(qū)相互作用之后形成的電磁輻射束；把檢測(cè)的電磁輻射束轉(zhuǎn)換為輸出信號(hào)；和分析輸出信號(hào)，抽取與捕獲區(qū)捕獲的細(xì)胞數(shù)相關(guān)的信息。在本方法的一個(gè)實(shí)施例中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)具有反射層，以便反射引導(dǎo)到捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光。在本方法的另一個(gè)實(shí)施例中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)是使引導(dǎo)到捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光，透過(guò)光盤(pán)。
在分析/處理步驟中，軟件讀出每一捕獲區(qū)上的像，并當(dāng)軟件遇到細(xì)胞的像時(shí)，對(duì)細(xì)胞的像作記號(hào)。例如，隨著被捕獲的CD4+和CD8+細(xì)胞的計(jì)數(shù)，軟件計(jì)算CD4+/CD8+細(xì)胞的比值，并顯示每微升全血在CD4+、CD8+、CD3+、和CD45+捕獲區(qū)中細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量，與CD4+/CD8+比值。整個(gè)過(guò)程從盤(pán)插入光學(xué)驅(qū)動(dòng)器到獲得數(shù)量和比值，約需12分鐘。其他關(guān)于樣品中特定細(xì)胞種群的定量測(cè)定方面，公開(kāi)在下面共同授予并共同待決的專(zhuān)利申請(qǐng)中U.S.Provisional ApplicationSerial No.60/382,327，標(biāo)題是“Methods For Calculating SpecificPopulations Of Cells Captured In An Optical Bio-Disc”，2002年5月22日申請(qǐng)。本文引用該申請(qǐng)全文，供參考。
在一個(gè)實(shí)施例中，盤(pán)是向前的Wobble Set FDL21:13707或FDL21:1270 CD-R盤(pán)，鍍有300nm的金作為編碼信息層。在反射盤(pán)上，用熟知的光刻技術(shù)，從反射層刻蝕出大小為2×1mm的橢圓形觀察窗。在一些透射盤(pán)的設(shè)計(jì)中，不刻蝕分離的觀察窗，而整個(gè)盤(pán)都可供使用。在一個(gè)特定的實(shí)施例中，粘附層是Fraylock粘附層DBL 201Rev C 3M94661。頂蓋是透明盤(pán)，有48個(gè)直徑0.040英寸的樣品入口，等距地分布在半徑26mm上。用軟件以4×的速度對(duì)數(shù)據(jù)盤(pán)進(jìn)行掃描和讀出，而用CD4+/CD8+計(jì)數(shù)軟件的抽樣速率是2.67MHz。
現(xiàn)在參考圖17B，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，厚的聚苯乙烯層118形成在襯底120上，并用(可選地)抗生蛋白鏈菌素182形成層。細(xì)胞捕獲抗體通過(guò)生物素附著在抗生蛋白鏈菌素182上。這些抗體可以包括涂敷在抗生蛋白鏈菌素上、附著在活化右旋糖酐醛上的生物素基抗體，以便為捕獲抗體建立足夠數(shù)量的結(jié)合結(jié)點(diǎn)。這樣可以建立與白細(xì)胞(WBC)專(zhuān)門(mén)形成牢固的鍵的、強(qiáng)的捕獲化學(xué)反應(yīng)。
圖18A、18B、和18C是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例使用的交聯(lián)系統(tǒng)的圖形表示。應(yīng)當(dāng)指出，交聯(lián)系統(tǒng)涉及使大分子的一部分或更多部分彼此交聯(lián)的一種或多種交聯(lián)劑，或結(jié)合物。交聯(lián)可以是共價(jià)的或非共價(jià)的兩個(gè)大分子部分間的相互作用，通常在兩個(gè)大分子自由基組合時(shí)形成。為獲得交聯(lián)的化學(xué)改性或結(jié)合處理，包括使一個(gè)功能團(tuán)與另一個(gè)功能團(tuán)的發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致鍵的形成。具有反應(yīng)或有選擇反應(yīng)功能團(tuán)的生物結(jié)合試劑的建立，構(gòu)成簡(jiǎn)單的和可重復(fù)的交聯(lián)或靶分子標(biāo)簽的基礎(chǔ)(“Bioconjugate Techniques”，Greg T.Hermanson，Academic Press，San Diego，CA，(1996))。
交聯(lián)劑包括，但不限于，同型雙功能聯(lián)結(jié)子(homobifunctionallinker)、異型雙功能聯(lián)結(jié)子(heterobifunctional linker)、和零長(zhǎng)交叉聯(lián)結(jié)子(zero-lenth cross linker)。同型雙功能聯(lián)結(jié)子如戊二醛，有兩個(gè)同功能的反應(yīng)結(jié)點(diǎn)。這些試劑通過(guò)兩個(gè)分子相同的公共團(tuán)的共價(jià)反應(yīng)，把一個(gè)蛋白與另一個(gè)蛋白聯(lián)結(jié)起來(lái)。異型雙功能聯(lián)結(jié)試劑包含兩種不同的反應(yīng)團(tuán)，能與蛋白及其他大分子上兩個(gè)不同功能的靶偶聯(lián)。例如，交叉聯(lián)結(jié)子的一部分可以包含一胺反應(yīng)團(tuán)，而另一部分可以包含一巰基反應(yīng)團(tuán)。結(jié)果產(chǎn)生向著已選擇的靶分子部分引導(dǎo)交聯(lián)反應(yīng)的能力，從而對(duì)聯(lián)結(jié)過(guò)程獲得更好的控制。零長(zhǎng)交叉聯(lián)結(jié)子通過(guò)形成不包含附加原子的鍵，作為兩個(gè)分子聯(lián)結(jié)的媒介。從而一個(gè)分子的一個(gè)原子，共價(jià)地附著于第二個(gè)分子的一個(gè)原子上，中間不插入聯(lián)結(jié)子或間隔段。本領(lǐng)域一般人員可以參考“Bioconjugate Techniques”，Greg T.Hermanson，Academic Press，San Diego，CA，(1996)，該書(shū)有交聯(lián)劑的詳細(xì)說(shuō)明。
本發(fā)明中，交聯(lián)劑與生物盤(pán)表面結(jié)合，使捕獲劑在靶區(qū)內(nèi)固定不動(dòng)。一種可取的交聯(lián)系統(tǒng)是包含生物素抗生蛋白鏈菌素的異型雙功能團(tuán)，即與偶聯(lián)卵白素襯底結(jié)合的生物素基捕獲劑。圖18A是抗生蛋白鏈菌素182的圖形表示。不加限制地說(shuō)，抗生蛋白鏈菌素包括卵白素、抗生蛋白鏈菌素、及其改性物。如圖所示，蛋白包括四個(gè)子單元，每一個(gè)包含一個(gè)生物素的結(jié)合結(jié)點(diǎn)(Hermanson)?？股鞍祖溇?82能夠通過(guò)各種化學(xué)反應(yīng)與塑料，如聚苯乙烯偶聯(lián)。理想的情況下，抗生蛋白鏈菌素182附著在生物盤(pán)的活性層144(圖4和9)，與生物素基的敏感單元(如抗體)基本上不可逆地結(jié)合。
圖18B是生物素184的圖形表示。生物素(或維他命H)是自然出現(xiàn)的生長(zhǎng)因子，少量地存在于每一個(gè)細(xì)胞中。生物素與蛋白卵白素和抗生蛋白鏈菌素的相互作用，屬于已知的最強(qiáng)非共價(jià)鍵親和力之一。生物素分子184可以通過(guò)它的戊酸側(cè)鏈或其他有機(jī)成分衍生物(orderivitized with other organic components)，建立間隔段臂(spacerarms)和各種反應(yīng)團(tuán)，直接附著在蛋白上。通過(guò)適當(dāng)選擇生物素衍生物，胺、羧酸鹽、巰基、和碳水化合物團(tuán)可以專(zhuān)門(mén)作為生物素基的靶子(Hermanson)。圖18C是包含與抗生蛋白鏈菌素182相互作用的生物素184交聯(lián)系統(tǒng)的圖形表示。
本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)施方案，是利用捕獲劑進(jìn)行本文說(shuō)明的測(cè)定。應(yīng)當(dāng)指出，捕獲劑是指用于檢測(cè)分析物的任何大分子。本發(fā)明的捕獲劑包括的大分子，對(duì)要研究的分析物有優(yōu)先選擇性，或有選擇性的結(jié)合親和力。捕獲劑包括，但不限于合成的或用生物方法產(chǎn)生的核酸，以及合成的或用生物方法產(chǎn)生的蛋白。本發(fā)明可以采用的捕獲劑例子包括，但不限于脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物、或這些核苷酸的嵌合體、抗體(單克隆或多克隆)、細(xì)胞膜受體、和與特定抗原決定簇(如在病毒、細(xì)胞或其他材料上)反應(yīng)的抗血清、藥物、肽、輔助因子、凝集素、C型多糖、細(xì)胞、細(xì)胞膜、和細(xì)胞器。本發(fā)明的捕獲劑最好是抗體。
抗體包括，但不限于多克隆、單克隆、和用重組體建立的抗體。本發(fā)明的抗體可以體內(nèi)也可以體外產(chǎn)生?？贵w的產(chǎn)生方法，本領(lǐng)域熟練人員是熟知的。例如可見(jiàn)Antibody Production，Peter Delves(Ed.)，John Wiley & Son Ltd，ISBN0471970107(1997)，本文引用該書(shū)全文，供參考。另外，抗體可以從商業(yè)資源獲得，如Research DiagnosticsInc.，Pleasant Hill Road，F(xiàn)landers，NJ 07836。本發(fā)明的抗體不限于任何一種特定物種；例如，人類(lèi)的、鼠的、大鼠的、和羊的抗體，全在本發(fā)明考慮之列。本發(fā)明的主抗體最好是在鼠中產(chǎn)生的抗人抗體，而本發(fā)明的副抗體是在羊中產(chǎn)生的抗鼠抗體。
“抗體”一詞也包括任何類(lèi)或亞類(lèi)抗體，因?yàn)槿魏位蛩锌贵w類(lèi)型，都可用于與細(xì)胞表面抗原結(jié)合?？贵w在醫(yī)藥診斷領(lǐng)域中的使用，本領(lǐng)域熟練人員是熟知的。例如見(jiàn)Diagnostic and TherapeuticAntibodies(Methods in Molecular Medicine)，Andrew J.T.Georgeand Catherine E.Urch(Eds.)，Humana Press；ISBN0896037983(2000)及Antibodies in Diagnosis and TherapyTechnologies，Mechanisms and Clinical Data(Studies in Chemistry Series)，Siegfried Matzku and Rolf A.Stahel(Eds.)，Harwood Academic Pub.；ISBN9057023105(1999)，本文引用以上兩書(shū)全文，供參考。
至少在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，用多種捕獲劑檢測(cè)要研究的分析物。圖18D是本發(fā)明方法中使用的IgG類(lèi)抗體的圖形表示，它們被用作副捕獲劑186。應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明的副捕獲劑包括，但不限于對(duì)另一種捕獲劑有親和力的劑，而另一種捕獲劑對(duì)要研究的分析物有親和力。圖18E畫(huà)出與生物素分子184結(jié)合的副捕獲劑IgG 186，該種生物素分子184本文此后稱(chēng)為生物素基IgG。
圖18F是主捕獲劑188的圖形表示。應(yīng)當(dāng)指出，本發(fā)明的主捕獲劑188對(duì)要研究的分析物有選擇性的親和力。主捕獲劑最好是對(duì)淋巴細(xì)胞有親和力的抗體。更具體說(shuō)，這些抗體能被引向淋巴細(xì)胞(CD2、CD19)、單核細(xì)胞(CD14)、嗜酸性細(xì)胞(CD15)、及其他要研究的細(xì)胞表面標(biāo)記物。圖18G畫(huà)出與生物素分子184結(jié)合的主捕獲劑188。除去CD4和CD8，存在許多抗其他細(xì)胞表面抗原(如，CD3、CD16、CD19、CD45、CD55、)的抗體，這些抗體都可以用來(lái)識(shí)別淋巴細(xì)胞的亞型。
圖18H是CD4+T細(xì)胞190的圖形表示。CD4+T細(xì)胞與特定的抗原結(jié)合，該特定抗原由諸如吞噬細(xì)胞的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞(APC)表達(dá)，CD4+T細(xì)胞還釋放淋巴因子，淋巴因子把其他免疫系統(tǒng)細(xì)胞吸引至該區(qū)域。結(jié)果是炎癥，同時(shí)，細(xì)胞和分子蓄積起來(lái)，試圖把抗原物質(zhì)隔開(kāi)并破壞抗原物質(zhì)。應(yīng)當(dāng)指出，CD4+T細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞表面有許多抗原192。但是，為圖示目的，圖18H只畫(huà)出CD4+T細(xì)胞有四個(gè)抗原192。
圖18I是CD8+T細(xì)胞194的圖形表示。這些T細(xì)胞分泌分子，破壞已經(jīng)與T細(xì)胞結(jié)合的細(xì)胞。這對(duì)與病毒感染的斗爭(zhēng)是重要的，因?yàn)樵诒桓腥镜募?xì)胞釋放新的、能感染其他細(xì)胞的病毒粒子前，CD8+T細(xì)胞便破壞這些被感染的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)指出，CD8+T細(xì)胞在整個(gè)細(xì)胞表面有許多抗原196。但是，為圖示目的，圖18I只畫(huà)出CD8+T細(xì)胞有四個(gè)抗原196。
圖18J畫(huà)出與醛活化右旋糖酐(DCHO)198的3維矩陣結(jié)合的副抗體186，從而形成DCHO抗體絡(luò)合物199。右旋糖酐主要是直線(xiàn)的C型多糖，包括由糖苷鍵聯(lián)結(jié)在一起的重復(fù)的D葡萄糖單元。廣泛地用作交聯(lián)劑的右旋糖酐，性質(zhì)上是多價(jià)的，能使分子沿聚合物鏈附著在許多結(jié)點(diǎn)上(Hermanson)。只是為了圖示的目的，圖上附著在右旋糖酐198的抗體186被畫(huà)成如圖18K所示。
本發(fā)明有關(guān)細(xì)胞測(cè)定的各方面，也公開(kāi)在下述專(zhuān)利申請(qǐng)中U.S.Provisional Application Serial No.60/308,176，標(biāo)題是“Quantitativeand Qualitative Methods for Characterizing Cancerous Blood CensIncluding Leukemic Blood Samples Using Optical Bio-DiscPlatform”，2001年7月27日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application SerialNo.60/312,248，標(biāo)題是“Methods for Quantitative and QualitativeCharacterization of Cancerous Blood Cells Including LymphomaBlood Samples Using Optical Bio-Disc Platform”，2001年8月15日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/313,514，標(biāo)題是“Methods for Specific Cell Capture by Off-Site Incubation of PrimaryAntibodies with Sample and Subsequent Capture by Surface-BoundSecondary Antibodies and Optical Bio-Disc Including Same”，2001年8月20日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/313,715，標(biāo)題是“RBC Lysis Protocol Evaluations ofHelper/Inducer-Suppressor/Cytotoxic T-Lymphocytes Using WholeBlood and Related Optical Bio-Disc”，2001年8月20日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/313,536，標(biāo)題是“RBC SievingProtocol Evaluations of Helper/Inducer-Suppressor/CytotoxicT-Lymphocytes Using Whole Blood and Related Optical Bio-Disc”，2001年8月20日申請(qǐng)；和U.S.Provisional Application Serial No.60/315,937，標(biāo)題是“Quantitative and Qualitative Methods for CellIsolation and Typing Including Immunophenotyping”，2001年8月30日申請(qǐng)，本文引用所有這些專(zhuān)利申請(qǐng)，供參考。
實(shí)施方案I圖19A-19D是本發(fā)明第一實(shí)施方案的分析物捕獲的圖形表示。圖19A和19B畫(huà)出CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194被生物素基主抗體捕獲(圖18G)的圖形表示。借助交聯(lián)劑抗生蛋白鏈菌素182，抗體188在生物盤(pán)110(圖4和9)的活性層144上是固定不動(dòng)的。圖19C和19D畫(huà)出本發(fā)明同一實(shí)施方案的另一個(gè)沒(méi)有交聯(lián)系統(tǒng)的實(shí)施例。在該實(shí)施例中，主抗體188直接在生物盤(pán)110的活性層144上，是固定不動(dòng)的。
圖20A-20I是截面圖，畫(huà)出本發(fā)明第一實(shí)施方案一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)。第一實(shí)施例包括反射盤(pán)結(jié)構(gòu)，它利用交聯(lián)系統(tǒng)使捕獲劑在生物盤(pán)流動(dòng)通道內(nèi)固定不動(dòng)。現(xiàn)在參考圖20A，圖上畫(huà)出光生物盤(pán)110對(duì)光透明的襯底120、反射層142、和活性層144。反射層142的一部分被除去(或在淀積時(shí)建立的開(kāi)孔)，產(chǎn)生觀察窗200，光透過(guò)觀察窗，被引導(dǎo)至抗體被固定的捕獲區(qū)140位置。圖20A畫(huà)出5個(gè)這樣的捕獲區(qū)140，第一個(gè)以捕獲區(qū)141表示?；钚詫?44最好是聚苯乙烯，它可以用旋轉(zhuǎn)涂布，也可以用本領(lǐng)域熟知的其他方法淀積在反射層142上，形成光滑的表面，厚度約40至300微米。然后在每一捕獲區(qū)140和141上淀積抗生蛋白鏈菌素182，并把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)30分鐘(圖20B)。清洗盤(pán)110，除去未結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素182，然后用旋轉(zhuǎn)干燥，完全除去盤(pán)110表面的水分(圖20C)。在第一捕獲區(qū)141上淀積參考標(biāo)記或校準(zhǔn)點(diǎn)202，又把生物素基主抗體188淀積在每一相繼的捕獲區(qū)140(圖20D和20E)上。然后，把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)30分鐘。用PBS清洗，除去未結(jié)合的抗體188，之后把盤(pán)110旋轉(zhuǎn)干燥，除去表面的水分(圖20F)。粘附單元118附著于活性層144(圖20G)上。頂蓋部分116(圖2)可用聚碳酸酯構(gòu)成，且最好在底部鍍上反射表面146，盡量如圖4所示。頂蓋部分116整體地附著在粘附單元118上，據(jù)此在盤(pán)內(nèi)形成流動(dòng)通道130(圖20G)。把阻斷劑204，如StabilGuard，注入每一流動(dòng)通道130，以便迅速地并有效地阻斷活性層144任何殘留的非指定的結(jié)合結(jié)點(diǎn)(圖20H)。把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)預(yù)定的時(shí)間，最好是30分鐘，然后經(jīng)抽真空，完全清除任何殘留的溶液(圖20I)。
本發(fā)明第一實(shí)施方案第二實(shí)施例的結(jié)構(gòu)，是不用交聯(lián)系統(tǒng)而使捕獲劑在盤(pán)110的流動(dòng)通道130中固定不動(dòng)的反射盤(pán)110。在本實(shí)施例中，在第一窗141上淀積參考標(biāo)記或校準(zhǔn)點(diǎn)202，又把非生物素基的主抗體188(圖18F)直接淀積在活性層144(圖20A)的每一相繼捕獲區(qū)140上。然后，把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中最好培養(yǎng)30分鐘(圖20E)。用PBS清洗，除去未結(jié)合的抗體188，之后把盤(pán)110旋轉(zhuǎn)干燥，除去表面的水分(圖20F)。粘附單元118附著于活性層144上。頂蓋部分116(圖2)可用聚碳酸酯構(gòu)成，且最好在底部鍍上反射表面146，盡量如圖4所示。頂蓋部分116整體地附著在粘附單元118上，據(jù)此在盤(pán)內(nèi)形成流動(dòng)通道130(圖20G)。把阻斷劑204，如StabilGuard，注入每一流動(dòng)通道130，以便迅速地并有效地阻斷活性層144任何殘留的非指定的結(jié)合結(jié)點(diǎn)(圖20H)。把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)30分鐘，然后經(jīng)抽真空，完全清除任何殘留的溶液(圖20I)。圖21畫(huà)出不用交聯(lián)系統(tǒng)完成的反射生物盤(pán)110的截面圖。
本發(fā)明第一實(shí)施方案第三實(shí)施例的結(jié)構(gòu)，是利用交聯(lián)系統(tǒng)使捕獲劑在盤(pán)110的流動(dòng)通道130中固定不動(dòng)的透射盤(pán)110。在本實(shí)施例中，襯底120、沒(méi)有觀察窗200(圖20A)的半反射層143，和活性層144如圖5所示?？股鞍祖溇?82、生物素基的主抗體188、參考點(diǎn)202、和阻斷劑204的淀積如上所述，并示于圖20B-20H。相應(yīng)的粘附單元118附著于活性層144上。光學(xué)上透明的頂蓋部分116(圖5)可用聚碳酸酯構(gòu)成。頂蓋部分116整體地附著在粘附單元118，由此在盤(pán)內(nèi)形成流動(dòng)通道130(圖20G)。圖22畫(huà)出利用交聯(lián)系統(tǒng)完成的透射生物盤(pán)110的截面圖。應(yīng)當(dāng)指出，第一實(shí)施方案的第四實(shí)施例，可以由本領(lǐng)域熟練人員構(gòu)建。第四實(shí)施例包括的結(jié)構(gòu)，是不用交聯(lián)系統(tǒng)而使捕獲劑在盤(pán)110的流動(dòng)通道130中固定不動(dòng)的透射盤(pán)110(圖21和22)。
實(shí)施方案II圖23A-23D是本發(fā)明捕獲分析物第二實(shí)施方案的圖形表示。圖23A和23B畫(huà)出CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194被主抗體188捕獲(圖18F)。主抗體188與生物素基副抗體186結(jié)合(圖18E)，副抗體186借助交聯(lián)劑抗生蛋白鏈菌素182，在生物盤(pán)110的活性層144上是固定不動(dòng)的。圖23C和23D畫(huà)出本發(fā)明同一實(shí)施方案的另一個(gè)沒(méi)有交聯(lián)系統(tǒng)的實(shí)施例。在本實(shí)施例中，副抗體186直接置于生物盤(pán)110的活性層144上。
圖24A-24L是本發(fā)明第二實(shí)施方案一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)截面圖。第一實(shí)施例包括反射盤(pán)結(jié)構(gòu)，它利用交聯(lián)系統(tǒng)使捕獲劑在生物盤(pán)110流動(dòng)通道130內(nèi)固定不動(dòng)?，F(xiàn)在參考圖24A，圖上畫(huà)出光生物盤(pán)110的對(duì)光透明的襯底120、反射層142、和活性層144。反射層142的一部分被除去(或在淀積時(shí)建立的開(kāi)孔)，產(chǎn)生觀察窗200，光透過(guò)觀察窗，被引導(dǎo)至抗體被固定的捕獲區(qū)140位置。圖24A畫(huà)出5個(gè)這樣的捕獲區(qū)140，第一個(gè)指定為捕獲區(qū)141?；钚詫?44最好是聚苯乙烯，它可以用旋轉(zhuǎn)涂布在反射層142上，形成光滑的表面，厚度約40至300微米。然后在每一捕獲區(qū)140和141上淀積抗生蛋白鏈菌素182，并把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)約30分鐘(圖24B)。清洗盤(pán)110，以除去未結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素182，然后用旋轉(zhuǎn)干燥，完全除去盤(pán)110表面的水分(圖24C)。在第一捕獲區(qū)141上淀積參考標(biāo)記或校準(zhǔn)點(diǎn)202，又把生物素基副抗體186淀積在每一相繼的捕獲區(qū)140(圖24D和24E)。然后，把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中最好培養(yǎng)30分鐘(圖24E)。用PBS清洗，除去未結(jié)合的副抗體186，之后把盤(pán)110旋轉(zhuǎn)干燥，除去表面的水分(圖24F)。然后，把主抗體(圖18F)淀積在每一捕獲區(qū)140上(圖24G)。然后，把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中最好培養(yǎng)約30分鐘(圖24H)。用PBS清洗，除去未結(jié)合的主抗體188，之后把盤(pán)110旋轉(zhuǎn)干燥，除去表面的水分(圖24I)。相應(yīng)的粘附單元118附著于活性層144。頂蓋部分116(圖2)可以類(lèi)似地用聚碳酸酯形成，且最好在底部鍍上反射表面146，盡量如圖4所示。頂蓋部分116整體地附著在粘附單元118上，由此在盤(pán)內(nèi)形成流動(dòng)通道130(圖24J)。把阻斷劑204，如StabilGuard，注入每一流動(dòng)通道130，以便迅速地并有效地阻斷活性層144任何殘留的非指定的結(jié)合結(jié)點(diǎn)(圖24K)。把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)30分鐘，然后經(jīng)抽真空，完全清除任何殘留的溶液(圖20L)。
本發(fā)明第二實(shí)施方案第二實(shí)施例的結(jié)構(gòu)，是不用交聯(lián)系統(tǒng)而使捕獲劑在盤(pán)110的流動(dòng)通道130中固定不動(dòng)的反射盤(pán)110。在本實(shí)施例中，在第一窗141上淀積參考標(biāo)記或校準(zhǔn)點(diǎn)202，又把非生物素基的副抗體186(圖18D)直接淀積在活性層144(圖24A)的每一相繼捕獲區(qū)140上。然后，把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)30分鐘(圖24E)。用PBS清洗，除去未結(jié)合的副抗體186，之后把盤(pán)110旋轉(zhuǎn)干燥，除去表面的水分(圖24F)。然后，把主抗體188(圖18F)淀積在每一捕獲區(qū)140上(圖24G)。然后，把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)30分鐘(圖24H)。用PBS清洗，除去未結(jié)合的主抗體188，并把盤(pán)110旋轉(zhuǎn)干燥，除去表面的水分(圖24I)。粘附單元118附著于活性層144上。如前面的實(shí)施例，本實(shí)施例的頂蓋部分116可用聚碳酸酯構(gòu)成，且最好在底部鍍上反射表面146，盡量如圖4所示。頂蓋部分116整體地附著在粘附單元118上，由此在盤(pán)內(nèi)形成流動(dòng)通道130(圖24J)。把阻斷劑204，如StabilGuard，注入每一流動(dòng)通道130，以便迅速地并有效地阻斷活性層144任何殘留的非指定的結(jié)合結(jié)點(diǎn)(圖24K)。在本實(shí)施例中，盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)最好30分鐘，然后經(jīng)抽真空，完全清除任何殘留的溶液(圖24L)。圖25畫(huà)出不用交聯(lián)系統(tǒng)完成的反射生物盤(pán)110的截面圖。
本發(fā)明第二實(shí)施方案第三實(shí)施例的結(jié)構(gòu)，是利用交聯(lián)系統(tǒng)使捕獲劑在盤(pán)110的流動(dòng)通道130中固定不動(dòng)的透射盤(pán)110。在本實(shí)施例中，襯底120、沒(méi)有觀察窗200(圖24A)的半反射層143，和活性層144如圖5所示?？股鞍祖溇?82、生物素基的副抗體186、主抗體188、參考點(diǎn)202、和阻斷劑204的淀積如上所述，并示于圖24B-24K。粘附單元118以類(lèi)似方式附著于活性層144上。光學(xué)上透明的頂蓋部分116(圖5)可用聚碳酸酯構(gòu)成。頂蓋部分116整體地附著在粘附單元118上，由此在盤(pán)內(nèi)形成流動(dòng)通道130(圖24J)。圖26畫(huà)出利用交聯(lián)系統(tǒng)完成的透射生物盤(pán)110的截面圖。應(yīng)當(dāng)指出，該第二實(shí)施方案的第四實(shí)施例，可以由本領(lǐng)域熟練人員構(gòu)建。第四實(shí)施例包括的結(jié)構(gòu)，是不用交聯(lián)系統(tǒng)而使捕獲劑在盤(pán)110的流動(dòng)通道中固定不動(dòng)的透射盤(pán)110(圖21和22)。
實(shí)施方案III圖27A-D是按照本發(fā)明第三實(shí)施方案的分析物捕獲的圖形表示。圖27A和27B畫(huà)出CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194被主抗體188(圖18F)捕獲。主抗體188與副抗體186(圖18D)結(jié)合，副抗體則與DCHO鏈結(jié)合。DCHO鏈在生物盤(pán)110的活性層144上是固定不動(dòng)的(圖4和9)。圖27C和27D畫(huà)出本發(fā)明同一實(shí)施方案的另一個(gè)沒(méi)有副抗體186的實(shí)施例。在該實(shí)施例中，主抗體188直接與DCHO結(jié)合，DCHO則在生物盤(pán)110的活性層144上，是固定不動(dòng)的。
圖28A是用圖形表示的流程圖，表明抗體DCHO絡(luò)合物的制備，而圖28B-28J是多個(gè)視圖，表明本發(fā)明第三實(shí)施方案一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)。該第三實(shí)施方案第一實(shí)施例的結(jié)構(gòu)，是用交聯(lián)劑DCHO使捕獲劑在生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130中固定不動(dòng)的反射盤(pán)。圖28A畫(huà)出DCHO抗體絡(luò)合物199的制備。混合相等濃度的DCHO 198和副抗體186，并使之組合，從而形成DCHO抗體(副)絡(luò)合物199?，F(xiàn)在參考圖28B，圖上畫(huà)出光生物盤(pán)110的透光襯底120、反射層142、和活性層144。反射層142的一部分被除去(或在淀積時(shí)建立的開(kāi)孔)，產(chǎn)生觀察窗200，光透過(guò)觀察窗，被引導(dǎo)至抗體被固定的捕獲區(qū)140位置。圖28B畫(huà)出5個(gè)這樣的捕獲區(qū)140，第一個(gè)以捕獲區(qū)141表示。活性層144最好是聚苯乙烯，它可以用旋轉(zhuǎn)涂布在反射層142上，形成光滑的表面，厚度約40至300微米。然后，在本實(shí)施例中，在每一捕獲區(qū)140和141上淀積DCHO抗體(副)絡(luò)合物199，并把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)30分鐘(圖28C)。清洗盤(pán)110，以除去未結(jié)合的DCHO抗體(副)絡(luò)合物199，然后用旋轉(zhuǎn)干燥，完全除去盤(pán)110表面的水分(圖28D)。在第一捕獲區(qū)141上淀積參考點(diǎn)202，又把主抗體188淀積在每一相繼的捕獲區(qū)140上(圖28E)。然后，把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)30分鐘(圖28F)。用PBS清洗，除去未結(jié)合的主抗體188，之后把盤(pán)110旋轉(zhuǎn)干燥，除去表面的水分(圖28G)。粘附單元或通道層118附著于活性層144上。與前面各實(shí)施例相似，一般示于圖2的頂蓋部分116，可用聚碳酸酯構(gòu)成，且最好在底部鍍上反射表面146，盡量如圖4所示。在本實(shí)施例中，頂蓋部分116整體地附著在粘附單元118上，由此在盤(pán)內(nèi)形成流動(dòng)通道130，如圖28H所示。把阻斷劑204，如StabilGuard，注入每一流動(dòng)通道130，以便迅速地并有效地阻斷活性層144任何殘留的非指定的結(jié)合結(jié)點(diǎn)。該步驟畫(huà)在圖28I。在本實(shí)施例中，把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)約30分鐘，然后經(jīng)抽真空，完全清除任何殘留的溶液，如圖28J所示。
按照本發(fā)明的制作方面，圖28A-28J還表明一種進(jìn)行簇指定計(jì)數(shù)的光學(xué)測(cè)定盤(pán)的制作方法。光學(xué)測(cè)定盤(pán)的制作方法，包括的步驟如下在管中提供交叉聯(lián)結(jié)子、向管添加捕獲劑、使交叉聯(lián)結(jié)子與捕獲劑組合(形成絡(luò)合物)、提供襯底、以活性層涂敷襯底、在活性層上淀積絡(luò)合物、和用粘附單元把頂蓋部分附著在活性層上。在本實(shí)施例中，叉聯(lián)結(jié)子是活化醛右旋糖酐。捕獲劑用于與細(xì)胞表面抗原結(jié)合。在另外的一個(gè)實(shí)施例中，捕獲劑用于與主捕獲劑結(jié)合，該主捕獲劑對(duì)細(xì)胞表面抗原有選擇性的親和力。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，細(xì)胞表面抗原獨(dú)立地選自抗原的CD科。在一個(gè)更可取的實(shí)施例中，細(xì)胞表面抗原獨(dú)立地選自包含CD3、CD4、CD8、和CD45的一組。
本發(fā)明第三實(shí)施方案第二實(shí)施例的結(jié)構(gòu)，是不用副抗體而使主捕獲劑在生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130中固定不動(dòng)的反射盤(pán)。在本實(shí)施例中，混合相等濃度的DCHO 198和主抗體188，并使之組合，從而形成DCHO抗體(主)絡(luò)合物199，如圖28A所示。在第一窗141上淀積參考或校準(zhǔn)標(biāo)記202，并在每一相繼的捕獲區(qū)140把DCHO抗體(主)絡(luò)合物199淀積在活性層144上(圖28C)。然后，把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)最好30分鐘，并用PBS清洗，除去未結(jié)合的DCHO抗體(主)絡(luò)合物199。把盤(pán)110旋轉(zhuǎn)干燥，除去表面的水分，如圖28D所示。粘附單元或通道層118類(lèi)似地附著于活性層144上。頂蓋部分116可用聚碳酸酯構(gòu)成，且最好在底部鍍上反射表面146，盡量如圖4所示。頂蓋部分116整體地附著在粘附單元118上，由此在盤(pán)內(nèi)形成流動(dòng)通道130，如圖28H所示。把阻斷劑204，如StabilGuard，注入每一流動(dòng)通道130，以便迅速地并有效地阻斷活性層144任何殘留的非指定的結(jié)合結(jié)點(diǎn)(圖28I)。把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)約30分鐘，然后經(jīng)抽真空，完全清除任何殘留的溶液，如圖28J所示。圖29畫(huà)出不用副抗體完成的反射生物盤(pán)110的截面圖。
本發(fā)明第三實(shí)施方案第三實(shí)施例的結(jié)構(gòu)，是利用交叉聯(lián)結(jié)子DCHO使捕獲劑在盤(pán)110的流動(dòng)通道130中固定不動(dòng)的透射盤(pán)110。在本實(shí)施例中，襯底120、沒(méi)有觀察窗200(圖28B)的半反射層143，和活性層144如圖5所示。DCHO抗體(副)絡(luò)合物199、主抗體188、參考標(biāo)記或點(diǎn)202、和阻斷劑204的淀積如上所述，并示于圖28C-28I。粘附單元或通道層118附著于活性層144上。光學(xué)上透明的頂蓋部分116(圖5)可用聚碳酸酯構(gòu)成。頂蓋部分116整體地附著在粘附單元118上，由此在盤(pán)110內(nèi)形成流動(dòng)通道130。圖30畫(huà)出利用DCHO抗體(副)絡(luò)合物199和主抗體188完成的透射生物盤(pán)110的截面圖。應(yīng)當(dāng)指出，第三實(shí)施方案的第四實(shí)施例，可以由本領(lǐng)域熟練人員構(gòu)建。第四實(shí)施例包括的結(jié)構(gòu)，是不用副抗體使主捕獲劑在盤(pán)110的流動(dòng)通道中固定不動(dòng)的透射盤(pán)110(圖29和30)。其他的實(shí)施例可以包括使用抗生蛋白鏈菌素182(圖18A)和生物素184(圖18B)，使主或副抗體對(duì)盤(pán)110的活性層144固定不動(dòng)。之后，固定不動(dòng)的抗體(主和副兩者)從而可以與DCHO 198絡(luò)合，以便增加生物盤(pán)110流動(dòng)通道130中捕獲劑的濃度。
實(shí)施方案IV圖31A是光生物盤(pán)110的頂視圖，畫(huà)出四個(gè)流體通路128，各有若干個(gè)針對(duì)特定細(xì)胞標(biāo)記物的捕獲區(qū)140和負(fù)控制區(qū)。如圖所示，每一流體通路有專(zhuān)用于專(zhuān)門(mén)針對(duì)CD3、CD4、CD8、和CD45的捕獲區(qū)140。任何其他需要的模式或細(xì)胞表面抗原的組合，例如別的CD標(biāo)記物或細(xì)胞表面標(biāo)記物，也可以采用。在本特定的實(shí)施方案中，對(duì)每個(gè)個(gè)別的流體通路，在每一捕獲區(qū)140中，必須只有單一的共同的捕獲劑。圖31A中畫(huà)出的盤(pán)，專(zhuān)門(mén)適合與下面圖31B-31E、44A-44D、45、和46說(shuō)明的細(xì)胞捕獲化學(xué)反應(yīng)及方法一起使用。圖31A中畫(huà)出的盤(pán)110，可以是反射盤(pán)，也可以是透射盤(pán)。
現(xiàn)在轉(zhuǎn)向圖31B-31E，圖上畫(huà)出分析物捕獲的本發(fā)明第四實(shí)施方案的圖形表示。圖31B和31C畫(huà)出被CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194的副抗體捕獲，形成主抗體細(xì)胞絡(luò)合物，這些CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194已經(jīng)預(yù)先與主抗體188(圖18F)組合。主抗體188與生物素基副抗體186(圖18E)結(jié)合，副抗體186借助交聯(lián)劑抗生蛋白鏈菌素182，在生物盤(pán)110的活性層114(圖4和9)上是固定不動(dòng)的。圖31D和31E畫(huà)出本發(fā)明沒(méi)有交聯(lián)系統(tǒng)的同一實(shí)施方案另一個(gè)實(shí)施例。在該實(shí)施例中，副抗體186直接在生物盤(pán)110的活性層144上，是固定不動(dòng)的。
圖32A-32I是截面圖，畫(huà)出本發(fā)明第四實(shí)施方案一個(gè)實(shí)施例的結(jié)構(gòu)。第一實(shí)施例包括反射盤(pán)結(jié)構(gòu)，它利用交聯(lián)系統(tǒng)使捕獲劑在生物盤(pán)流動(dòng)通道內(nèi)固定不動(dòng)?，F(xiàn)在參考圖32A，圖上畫(huà)出光生物盤(pán)110的對(duì)光透明的襯底120、反射層142、和活性層144。反射層142的一部分被除去(或在淀積時(shí)建立的開(kāi)孔)，產(chǎn)生觀察窗200，光透過(guò)觀察窗，被引導(dǎo)至抗體被固定的捕獲區(qū)140位置。圖32A畫(huà)出5個(gè)這樣的捕獲區(qū)140，第一個(gè)指定為捕獲區(qū)141?；钚詫?44最好是聚苯乙烯，它可以用旋轉(zhuǎn)涂布在反射層142上，形成光滑的表面，厚度約40至300微米。然后在每一捕獲區(qū)140和141上淀積抗生蛋白鏈菌素182，并把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)約30分鐘，如圖32B所示。清洗盤(pán)110，以除去未結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素182，然后用旋轉(zhuǎn)干燥，完全除去盤(pán)110表面的水分，如圖32C所示。在第一捕獲區(qū)141上淀積參考標(biāo)記或校準(zhǔn)點(diǎn)202，又把生物素基副抗體186淀積在每一相繼的捕獲區(qū)140上，如圖32D和32E所示。然后，在本實(shí)施例中，把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)約30分鐘。該步驟示于圖32E。用PBS清洗，除去未結(jié)合的副抗體186，之后把盤(pán)110旋轉(zhuǎn)干燥，除去表面的水分。本方法的這一步驟示于圖32F。粘附單元或通道層118被類(lèi)似地加在活性層144上。相應(yīng)的頂蓋部分116最好用聚碳酸酯構(gòu)成，并在底部鍍上反射表面146，盡量如圖4所示。頂蓋部分116整體地附著在粘附單元118上，由此在盤(pán)內(nèi)形成流動(dòng)通道130，如圖32G所示。把阻斷劑204，如StabilGuard，注入每一流動(dòng)通道130，以便迅速地并有效地阻斷活性層144任何殘留的非指定的結(jié)合結(jié)點(diǎn)。這一步驟畫(huà)在圖32H。把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)最好30分鐘，然后經(jīng)抽真空，完全清除任何殘留的溶液，如圖32I所示。
本發(fā)明第四實(shí)施方案第二實(shí)施例的結(jié)構(gòu)，是不用交聯(lián)系統(tǒng)而使捕獲劑在盤(pán)110的流動(dòng)通道130中固定不動(dòng)的反射盤(pán)110。在本實(shí)施例中，在第一窗141上淀積參考標(biāo)記或校準(zhǔn)點(diǎn)202，又把一般示于圖18D的非生物素基的副抗體186，直接淀積在活性層144的每一相繼捕獲區(qū)140上。然后，把盤(pán)110在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)30分鐘。用PBS清洗，除去未結(jié)合的副抗體186，之后把盤(pán)110旋轉(zhuǎn)干燥，除去表面的水分。粘附單元118附著于活性層144上。頂蓋部分116由聚碳酸酯構(gòu)成，且最好在底部鍍上反射表面146，盡量如圖4所示。頂蓋部分1 16整體地附著在粘附單元118上，由此在盤(pán)內(nèi)形成流動(dòng)通道130。把阻斷劑204，如StabilGuard，注入每一流動(dòng)通道130，以便迅速地并有效地阻斷活性層144任何殘留的非指定的結(jié)合結(jié)點(diǎn)。把盤(pán)在室溫下放進(jìn)濕的箱中培養(yǎng)約30分鐘，然后經(jīng)抽真空，完全清除任何殘留的溶液。圖33畫(huà)出不用交聯(lián)系統(tǒng)完成的反射生物盤(pán)110的截面圖。
本發(fā)明第四實(shí)施方案第三實(shí)施例的結(jié)構(gòu)，是利用交聯(lián)系統(tǒng)使捕獲劑在生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130中固定不動(dòng)的透射盤(pán)110。在本實(shí)施例中，襯底120、沒(méi)有觀察窗200(圖32A)的半反射層143，和活性層144示于圖5?？股鞍祖溇?82、生物素基的主抗體188、參考標(biāo)記202、和阻斷劑204的淀積如上所述，并示于圖32B-32H。粘附單元118附著于活性層144上。光學(xué)上透明的頂蓋部分116(圖5)可用聚碳酸酯構(gòu)成。頂蓋部分116整體地附著在粘附單元118，由此在盤(pán)110內(nèi)形成流動(dòng)通道130(圖32G)。圖34畫(huà)出利用交聯(lián)系統(tǒng)完成的透射生物盤(pán)110的截面圖。應(yīng)當(dāng)指出，第四實(shí)施方案的第四實(shí)施例，可以由本領(lǐng)域熟練人員構(gòu)建。第四實(shí)施例包括的結(jié)構(gòu)，是不用交聯(lián)系統(tǒng)而使副捕獲劑在生物盤(pán)110的流動(dòng)通道中固定不動(dòng)的透射盤(pán)110(圖33和34)。
簇指定計(jì)數(shù)-實(shí)施方案I圖35A是光生物盤(pán)110的頂視圖，畫(huà)出四個(gè)流體通路128，各有若干個(gè)針對(duì)四種不同特定細(xì)胞表面標(biāo)記物的捕獲區(qū)140和負(fù)控制區(qū)。如圖所示，每一流體通路專(zhuān)設(shè)四個(gè)捕獲區(qū)140，每一捕獲區(qū)專(zhuān)門(mén)針對(duì)CD4、CD8、CD3、和CD45。任何其他需要的模式或細(xì)胞表面抗原的組合，例如別的CD標(biāo)記物或細(xì)胞表面標(biāo)記物，也可以采用。在本特定的實(shí)施方案中，對(duì)每個(gè)個(gè)別的流體通路，在每一捕獲區(qū)140中，不限制必須只有單一的共同的捕獲劑。相反，在本實(shí)施方案中，希望有不同捕獲劑的捕獲區(qū)。這些捕獲區(qū)，例如可以排列成陣列格式，至少是2乘2的矩陣。圖35A中畫(huà)出的盤(pán)，專(zhuān)門(mén)適合與下面圖35B-35E、36、37、38A-38C、39、40、41A-41C、42、和43說(shuō)明的細(xì)胞捕獲化學(xué)反應(yīng)及方法一起使用。圖35A中畫(huà)出的盤(pán)110，可以是反射盤(pán)，也可以是透射盤(pán)。
下面參考圖35B-35D，圖上畫(huà)出用本發(fā)明第一實(shí)施方案的生物盤(pán)，分析已提純并已清洗的MNC樣品(圖17A)。如圖35B所示，把MNC樣品注進(jìn)生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與主抗體188接觸。如圖35C所示，主抗體與之發(fā)生接觸，然后捕獲任何存在于測(cè)試樣品中的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖20I)中未結(jié)合的T細(xì)胞。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194相互作用，見(jiàn)圖35D，并把返回光束154反射回檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
圖36畫(huà)出用本發(fā)明第一實(shí)施方案第二實(shí)施例，分析圖35B-35D的同一測(cè)試樣品。生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130被注以MNC樣品(圖35B)。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與主抗體188接觸。主抗體與之發(fā)生接觸，然后捕獲任何存在于測(cè)試樣品中的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194(圖35C)。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖20I)中未結(jié)合的T細(xì)胞。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194相互作用(圖35D)，并把返回光束154反射回檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
圖37畫(huà)出用本發(fā)明第一實(shí)施方案第三實(shí)施例，分析圖35B-35D的同一測(cè)試樣品。生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130被注以MNC樣品(圖35B)。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與主抗體188接觸。主抗體與之發(fā)生接觸，然后捕獲任何存在于測(cè)試樣品中的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194(圖35C)。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖20I)中未結(jié)合的T細(xì)胞。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194相互作用(圖35D)，之后，透射光束156傳送至檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
簇指定計(jì)數(shù)-實(shí)施方案II現(xiàn)在參考圖38A-38C，圖上畫(huà)出用本發(fā)明第二實(shí)施方案的生物盤(pán)，分析已提純并已清洗的MNC樣品(圖17A)。生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130被注以MNC樣品，如圖38A所示。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與主抗體188接觸。主抗體與之發(fā)生接觸，然后捕獲任何存在于測(cè)試樣品中的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194。該步驟畫(huà)在圖38B。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖24L)中未結(jié)合的T細(xì)胞。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194相互作用，見(jiàn)圖38C，并把返回光束154反射回檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
圖39畫(huà)出用本發(fā)明第二實(shí)施方案第二實(shí)施例，分析圖38A-38C的同一測(cè)試樣品。生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130被注以MNC樣品(圖38A)。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與主抗體188接觸。主抗體與之發(fā)生接觸，然后捕獲任何存在于測(cè)試樣品中的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194(圖38B)。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖24L)中未結(jié)合的T細(xì)胞。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194相互作用(圖38C)，并把返回光束154反射回檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
圖40畫(huà)出用本發(fā)明第二實(shí)施方案第三實(shí)施例，分析圖38A-38C的同一測(cè)試樣品。生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130被注以MNC樣品(圖38A)。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與主抗體188接觸。主抗體與之發(fā)生接觸，然后捕獲任何存在于測(cè)試樣品中的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194(圖38B)。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖24L)中未結(jié)合的T細(xì)胞。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194相互作用(圖38C)，之后，透射光束156傳送至檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
簇指定計(jì)數(shù)-實(shí)施方案III下面轉(zhuǎn)到圖41A-41C，圖上畫(huà)出用本發(fā)明第三實(shí)施方案的生物盤(pán)，分析已提純并已清洗的MNC樣品(圖17A)。如圖41A所示，把MNC樣品注進(jìn)生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與主抗體188接觸。主抗體與之發(fā)生接觸，然后捕獲任何存在于測(cè)試樣品中的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194。本方法的這一步驟畫(huà)在圖41B。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖28J)中未結(jié)合的T細(xì)胞。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194相互作用，見(jiàn)圖41C，并把返回光束154反射回檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
圖42畫(huà)出用本發(fā)明第三實(shí)施方案第二實(shí)施例，分析圖41A-41C的同一測(cè)試樣品。生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130被注以MNC樣品(圖41A)。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與主抗體188接觸。主抗體與之發(fā)生接觸，然后捕獲任何存在于測(cè)試樣品中的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194(圖41B)。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖28J)中未結(jié)合的T細(xì)胞。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194相互作用(圖41C)，并把返回光束154反射回檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
圖43畫(huà)出用本發(fā)明第三實(shí)施方案第三實(shí)施例，分析圖41A-41C的同一測(cè)試樣品。生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130被注以MNC樣品(圖41A)。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與主抗體188接觸。主抗體與之發(fā)生接觸，然后捕獲任何存在于測(cè)試樣品中的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194(圖41B)。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖28J)中未結(jié)合的T細(xì)胞。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194相互作用(圖41C)，之后，透射光束156傳送至檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
簇指定計(jì)數(shù)-實(shí)施方案IV現(xiàn)在參考圖44A-44D，圖上畫(huà)出用本發(fā)明第四實(shí)施方案的生物盤(pán)，分析已提純并已清洗的MNC樣品(圖17A)。圖44A是用圖形表示的制備主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物的流程圖。包含CD4+T細(xì)胞190和CD8+T細(xì)胞194兩種細(xì)胞的MNC混懸液，與主抗體188混合，并使它們結(jié)合，從而形成主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物。正如本領(lǐng)域熟練人員所知，其他有不同表面標(biāo)記物的細(xì)胞，也可以用本實(shí)施方案加標(biāo)記。如圖44B所示，生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130被注以主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與副抗體188接觸，該副抗體在生物盤(pán)110的活性層144上是固定不動(dòng)的。對(duì)主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物有親和力的副抗體186，捕獲該絡(luò)合物，如圖44C所示。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖32I)中未結(jié)合的絡(luò)合物。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的絡(luò)合物相互作用，見(jiàn)圖44D，并把返回光束154反射回檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
圖44A-44D還表明本發(fā)明方法另一個(gè)主要方面。與圖17A結(jié)合，可以提供另一種進(jìn)行簇指定計(jì)數(shù)的方法。該方法包括步驟(1)向包含分離梯度的管中提供血樣；(2)以足夠使血樣分離成層的時(shí)間和速度旋轉(zhuǎn)該管；(3)使包含T細(xì)胞的MNC層再混懸，形成MNC混懸液；(4)向MNC混懸液添加主抗體，形成主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物；(5)把主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物的樣品放在盤(pán)表面，該盤(pán)表面包括至少一個(gè)含有至少一種捕獲劑的捕獲區(qū)；(6)把盤(pán)裝入光閱讀機(jī)；(7)把入射的電磁輻射束引向捕獲區(qū)；(8)檢測(cè)經(jīng)過(guò)與盤(pán)捕獲區(qū)相互作用之后形成的電磁輻射束；(9)把檢測(cè)的電磁束轉(zhuǎn)換為輸出信號(hào)；和(10)分析該輸出信號(hào)，提取與捕獲區(qū)上捕獲的細(xì)胞數(shù)有關(guān)的信息。在該方法的一個(gè)實(shí)施例中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)有反射層，可使引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光被反射。在該方法的另一個(gè)實(shí)施例中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)可使引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光，透過(guò)光盤(pán)。
圖45畫(huà)出用本發(fā)明第四實(shí)施方案第二實(shí)施例，分析圖44A-44D的同一測(cè)試樣品。生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130被注以主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物(圖44B)。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與生物盤(pán)110活性層144上固定不動(dòng)的副抗體188接觸。對(duì)主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物有親和力的副抗體186，捕獲該絡(luò)合物(圖44C)。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖321)中未結(jié)合的絡(luò)合物。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的絡(luò)合物相互作用(圖44D)，并把返回光束154反射回檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
圖46畫(huà)出用本發(fā)明第四實(shí)施方案第三實(shí)施例，分析圖44A-44D的同一測(cè)試樣品。生物盤(pán)110的流動(dòng)通道130被注以主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物(圖44B)。毛細(xì)作用、外部點(diǎn)樣器施加的壓力、和/或離心力(即作用在曲線(xiàn)運(yùn)動(dòng)物體上的力，它使物體遠(yuǎn)離曲率中心或旋轉(zhuǎn)軸)作用在測(cè)試樣品上，使之與生物盤(pán)110活性層144上固定不動(dòng)的副抗體188接觸。對(duì)主抗體T細(xì)胞絡(luò)合物有親和力的副抗體186，捕獲該絡(luò)合物(圖44C)。光驅(qū)動(dòng)器電動(dòng)機(jī)162(圖10)使盤(pán)旋轉(zhuǎn)，清除捕獲區(qū)140(圖32I)中未結(jié)合的絡(luò)合物。光盤(pán)驅(qū)動(dòng)器112的入射光束152(圖1)與被捕獲的絡(luò)合物相互作用(圖44D)，之后，透射光束156傳送至檢測(cè)器157(圖10)，供處理和分析。
本領(lǐng)域的熟練人員顯然知道，借助上述教導(dǎo)，可以組合本發(fā)明方法的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例，而不違背本發(fā)明的范圍和精神。
細(xì)胞檢測(cè)和有關(guān)的軟件現(xiàn)在參考圖47，圖上畫(huà)出的光生物盤(pán)，包括保持樣品的流體通路128。圖47還畫(huà)出放大的流體通路47，表明不同的捕獲或靶區(qū)140和包括參考標(biāo)記或校準(zhǔn)點(diǎn)202的靶區(qū)141。在本特定的實(shí)施例中，采用5個(gè)捕獲區(qū)140，分別實(shí)施對(duì)CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD3+細(xì)胞、CD45+細(xì)胞、和作為負(fù)控制的肌紅蛋白的捕獲。
圖48A是從不同實(shí)施例獲得的像，該實(shí)施例包括6個(gè)捕獲區(qū)140，各捕獲區(qū)分別實(shí)施對(duì)CD45+細(xì)胞、CD15+細(xì)胞、CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞、CD15+細(xì)胞的第二捕獲區(qū)、和CD45+細(xì)胞的第二捕獲區(qū)的捕獲。在該實(shí)施例中，用兩個(gè)CD45+細(xì)胞和CD15+細(xì)胞捕獲區(qū)作為驗(yàn)證控制或檢驗(yàn)捕獲效率與期望的計(jì)數(shù)結(jié)果是否一致。圖48A還以放大圖表明CD4、CD8、和控制的一系列細(xì)胞表面抗原。如圖所示，該像是在背景視場(chǎng)中的許多細(xì)胞。圖48B代表從實(shí)際顯微鏡得到的控制、CD4、和CD8捕獲區(qū)像的近攝圖，并與從本發(fā)明生物盤(pán)得到的像比較。圖49表明實(shí)際顯微鏡的像與本發(fā)明生物盤(pán)相應(yīng)的像另一個(gè)更細(xì)致的比較。如圖48B和49給出的，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，生物盤(pán)的像，與從顯微鏡得到的像比較，有相等的質(zhì)量和分辨率。因此，這些像表明，用本發(fā)明的設(shè)備和方法的背景映襯下，能使個(gè)別細(xì)胞成為可見(jiàn)的。用于檢測(cè)要調(diào)查的特性的方法，在下面共同授予的專(zhuān)利申請(qǐng)中有更詳細(xì)的說(shuō)明U.S.Provisional Application Serial No.60/270,095和60/292,108，標(biāo)題都是“Signal Processing Apparatus and Methods forObtaining Signal Signature of Investigation Features Detected on aSurface of an Optical Disc Assembly”，分別在2001年2月2日和2001年5月18日申請(qǐng)，和共同授予的專(zhuān)利申請(qǐng)U.S.Patent ApplicationSerial No.10/043,688，標(biāo)題是“Optical Disc Analysis System IncludingRelated Methods For Biological and Medical Imaging”，2002年1月10日申請(qǐng)，本文引用全部這些專(zhuān)利申請(qǐng)，供參考。
這些細(xì)胞能夠通過(guò)各種不同方法之一檢測(cè)，這些方法包括，例如使用刀口檢測(cè)硬件或軟件，對(duì)透射或反射光強(qiáng)足夠大的變化進(jìn)行檢測(cè)和計(jì)數(shù)，從而對(duì)其變遷亦即對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。另一種下面還要更詳細(xì)說(shuō)明的方法，是使用像或模式識(shí)別軟件，識(shí)別背景上的細(xì)胞。像識(shí)別能區(qū)分WBC和RBC，還能區(qū)分中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜堿白細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、粒性白細(xì)胞、和淋巴細(xì)胞。
可以用具有相隔1.6微米量級(jí)的軌道的光盤(pán)，使盤(pán)上的細(xì)胞或凝集物成像。例如，一個(gè)白細(xì)胞通常的直徑，至少占5條軌道，最大占12條軌道，因此可以獲得該白細(xì)胞的像。
為了獲得這樣的像，可以用如圖2、3、和4所示類(lèi)型的透射盤(pán)(雖然也可用反射盤(pán))，和圖10所示類(lèi)型的包括觸發(fā)器傳感器160及頂檢測(cè)器158的盤(pán)驅(qū)動(dòng)器系統(tǒng)。觸發(fā)器檢測(cè)器158檢測(cè)透射盤(pán)中的觸發(fā)標(biāo)記126，并當(dāng)檢測(cè)到該標(biāo)記時(shí)，向計(jì)算機(jī)提供信號(hào)，指示開(kāi)始收集和/或處理數(shù)據(jù)。隨著光源在觀察窗中的軌道上通過(guò)，從接收的透射光中可以獲得像。在這種情形下的頂檢測(cè)器，可以是單個(gè)的檢測(cè)器，也可以是沿徑向和/或圓周方向排列的多個(gè)檢測(cè)器單元的陣列。該類(lèi)檢測(cè)器和檢測(cè)方法，例如在下述共同授予的專(zhuān)利申請(qǐng)中有說(shuō)明U.S.Provisional Application Serial No.60/247,465，標(biāo)題是“Optical DiscDrive For Bio-Optical Disc”，2000年11月9日申請(qǐng)；U.S.ProvisionalApplication Serial No.60/293,093，標(biāo)題是“Disc Drive Assembly ForOptical Bio-Discs”，2001年5月22日申請(qǐng)；和U.S.Patent ApplicationSerial No.10/008,156，標(biāo)題是“Disc Drive System and Methods forUse with Bio-Discs”，2001年11月9日申請(qǐng)，本文引用以上各專(zhuān)利申請(qǐng)全文，供參考。
獲得諸如圖48A、48B、和49的像之后，可以用像識(shí)別軟件進(jìn)一步處理像的數(shù)據(jù)，該軟件可用于識(shí)別需要的特性。還要求該像識(shí)別軟件不僅有能力區(qū)別細(xì)胞和背景，而且有有能力區(qū)分細(xì)胞的各種類(lèi)型。
現(xiàn)在參考圖50，圖上畫(huà)出從要調(diào)查的數(shù)據(jù)中導(dǎo)出的像，該數(shù)據(jù)包括紅細(xì)胞和白細(xì)胞兩種細(xì)胞。如在放大的視圖中所示，這些白細(xì)胞和紅細(xì)胞，有鮮明的區(qū)分特征，因此能夠從背景中檢測(cè)，還能用像識(shí)別把它們彼此區(qū)分。此外，還有可能區(qū)分各種白細(xì)胞類(lèi)型，包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性白細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、粒性白細(xì)胞、和嗜堿白細(xì)胞。
圖51畫(huà)出有許多細(xì)胞的樣品視場(chǎng)，其中帶加號(hào)的表示已被識(shí)別為細(xì)胞的對(duì)象。在已經(jīng)對(duì)每一區(qū)或需要的任何數(shù)量的區(qū)檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量后，得到細(xì)胞計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可以顯示在單個(gè)屏上，給出易于觀察的數(shù)據(jù)表示，例如如圖52所示。如在圖52中畫(huà)出的，與特定的細(xì)胞計(jì)數(shù)一起提供的是直方圖，表明細(xì)胞的相對(duì)數(shù)量。在CD4/CD8分析中，系統(tǒng)還可以產(chǎn)生CD4/CD8比值，以及任何其他需要的數(shù)學(xué)計(jì)算或比較。圖53提供一種不同的處理視，表明在像場(chǎng)中的細(xì)胞，被轉(zhuǎn)換為CD4計(jì)數(shù)、CD8計(jì)數(shù)、和比值，還有指示該比值在正常范圍的輸出。
本發(fā)明涉及細(xì)胞檢測(cè)和相關(guān)處理方法的各個(gè)方面，也公開(kāi)在下述專(zhuān)利申請(qǐng)中U.S.Provisional Application Serial No.60/316,273，標(biāo)題是“Capture Layer Assemblies and Optical Bio-Disc forImmunophenotyping”，2001年8月31日申請(qǐng)；U.S.ProvisionalApplication Serial No.60/318,026，標(biāo)題是“Methods for ImagingBlood Cells，Blood-Bome Parasities and Pathogens，and OtherBiological Matter Including Related Optical Bio-Disc and DriveAssemblies”，2001年9月7日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application SerialNo.60/322,527，標(biāo)題是“Optical Analysis Discs IncludingMicrofluidic Circuits for Performing Cell Counts”，2001年9月14日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/322,040，標(biāo)題是“Optical Analysis Discs Including Fluidic Circuits for OpticalImaging and Quantitative Evaluation of Blood Cells IncludingLymphocytes”，2001年9月11日申請(qǐng)；U.S.Provisional ApplicationSerial No.60/322,863，標(biāo)題是“Methods for Differential Cell CountsIncluding Leukocytes and Use of Optical Bio-Disc for PerformingSame”，2001年9月12日申請(qǐng)；和U.S.Provisional Application SerialNo.60/322,793，標(biāo)題是“Methods for Reducing Non-Specific Bindingof Cells on Optical Bio-Discs Utilizing Charged Matter IncludingHeparin，Plasma，or Poly-Lysine”，2001年9月17日申請(qǐng)，本文引用以上所有專(zhuān)利申請(qǐng)，供參考。
分類(lèi)細(xì)胞計(jì)數(shù)方法和有關(guān)的軟件用光盤(pán)數(shù)據(jù)對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)的許多方法和相關(guān)算法，在這里作更詳細(xì)的討論。這些方法和有關(guān)的算法，不限于對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)，也可以容易用于對(duì)任何類(lèi)型細(xì)胞物質(zhì)計(jì)數(shù)，包括，但不限于紅細(xì)胞、白細(xì)胞、珠、及任何其他對(duì)象，不論是生物的或非生物的，只要產(chǎn)生能被光閱讀機(jī)檢測(cè)的類(lèi)似的光學(xué)特征波形。
為說(shuō)明的目的，下面與本發(fā)明有關(guān)的方法和算法的說(shuō)明，將參照?qǐng)D54-58，是針對(duì)白細(xì)胞計(jì)數(shù)的。稍加修改，這些方法和算法可以用于對(duì)其他類(lèi)型的細(xì)胞、或與白細(xì)胞大小相似對(duì)象的計(jì)數(shù)。本文一般地說(shuō)明細(xì)胞計(jì)數(shù)方法和算法的數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)方面，以便為本發(fā)明的方法和設(shè)備提供相關(guān)的背景。捕獲和處理來(lái)自光生物盤(pán)的調(diào)查數(shù)據(jù)的方法和算法，具有廣泛的可用性，并已經(jīng)更詳細(xì)地公開(kāi)在下述共同授予的專(zhuān)利申請(qǐng)中U.S.Provisional Application Serial No.60/291,233，標(biāo)題是“Variable Sampling Control For Rending Pixelation of AnalysisResults In Optical Bio-Disc Assembly And Apparatus RelatingThereto”，2001年5月16日申請(qǐng)，本文引用，供參考，還有上面已引用的U.S.Provisional Application Serial No.60/404,921，標(biāo)題是“Methods For Differential Cell Counts Including Related ApparatusAnd Software For Performing Same”。
下面的討論，簡(jiǎn)要地解釋這些方法和算法的基本綱要。如圖10所示，關(guān)于生物測(cè)試樣品屬性的信息，是以電磁輻射束的形式，從光生物盤(pán)110提取的，該電磁輻射束因與測(cè)試樣品的相互作用而被改變或被調(diào)制。在與圖2、3、4、11、13、和15結(jié)合討論的反射式光生物盤(pán)情形中，返回光束154載有生物樣品的信息。如上面討論那樣，實(shí)際上只有當(dāng)入射光束在流動(dòng)通道130內(nèi)，或在靶區(qū)140內(nèi)，從而與樣品接觸時(shí)，返回光束中才包含關(guān)于生物樣品的該種信息。在生物盤(pán)110的反射式實(shí)施例中，返回光束154也可以載有在反射層之內(nèi)或之上已編碼的信息，要不然就是在圖13和14所示的擺動(dòng)槽170中已編碼的信息。本領(lǐng)域熟練人員應(yīng)當(dāng)知道，只當(dāng)相應(yīng)的入射光束與反射層142接觸時(shí)，有靶區(qū)的反射盤(pán)的返回光束154中，才包含預(yù)先記錄的信息。當(dāng)入射光束152所在的區(qū)域，承載信息的反射層142已經(jīng)被除去或因其他原因缺失，那么，返回光束就不包含該種信息。在與圖5、6、8、9、12、14、和16結(jié)合討論的透射式光生物盤(pán)情形中，透射光束156載有生物樣品的信息。
繼續(xù)參考圖10，有關(guān)生物測(cè)試樣品的信息，不論是從反射盤(pán)的返回光束154獲得，還是從透射盤(pán)的透射光束156獲得，都被引導(dǎo)到信號(hào)處理的處理器166。這種處理包括把被底檢測(cè)器157(反射盤(pán))檢測(cè)的，或被頂檢測(cè)器158(透射盤(pán))檢測(cè)的模擬信號(hào)，轉(zhuǎn)換為離散的數(shù)字信號(hào)形式。
下面參考圖54，信號(hào)變換包括對(duì)模擬信號(hào)210按固定的時(shí)間間隔212抽樣，并對(duì)信號(hào)相應(yīng)的即時(shí)模擬幅度214編碼，成為離散的二進(jìn)制整數(shù)216。抽樣開(kāi)始于某一開(kāi)始時(shí)間218，并在某一結(jié)束時(shí)間220結(jié)束。與任何模數(shù)轉(zhuǎn)換過(guò)程相關(guān)的兩個(gè)共通的值，是抽樣頻率和比特深度。抽樣頻率，也稱(chēng)為抽樣速率，是每單位時(shí)間的抽樣數(shù)。較高的抽樣頻率要求相繼抽樣之間較短的時(shí)間間隔212，導(dǎo)致數(shù)字信號(hào)222與原來(lái)的模擬信號(hào)210比較，有較高的保真度。比特深度是在每一抽樣點(diǎn)上，對(duì)模擬信號(hào)210的抽樣幅度214進(jìn)行編碼的比特?cái)?shù)。比特深度越大，二進(jìn)制整數(shù)216越接近原來(lái)的模擬幅度214。在本實(shí)施例中，抽樣速率是8MHz，比特深度是每抽樣12比特，允許的整數(shù)抽樣范圍是0到4095(0到(2n-1))，這里n是比特深度。這一組合可以改變，以容納其他實(shí)施例中特定的精度需求。僅作例子而非限制，可以在涉及對(duì)珠計(jì)數(shù)的實(shí)施例中，要求增加抽樣頻率，因?yàn)橹橐话惚燃?xì)胞更小。然后，把抽樣數(shù)據(jù)發(fā)送至處理器166，供模數(shù)變換。
在進(jìn)行模數(shù)變換時(shí)，沿激光路徑每一相繼的抽樣點(diǎn)224，作為一維陣列226，相繼地存儲(chǔ)在盤(pán)或存儲(chǔ)器中。每一相繼的軌道給出一獨(dú)立的一維陣列，于是產(chǎn)生兩維的陣列228(圖57A)，它類(lèi)似于一個(gè)像。
圖55是本發(fā)明光生物盤(pán)110的透視圖，它把位于光生物盤(pán)軌道232上被捕獲的白細(xì)胞230局部放大畫(huà)出。如圖所示，入射光束152與白細(xì)胞230的相互作用，產(chǎn)生包含信號(hào)的光束，不論該光束是以反射盤(pán)返回光束154的形式，還是以透射盤(pán)透射光束156的形式，它不是被檢測(cè)器157檢測(cè)，就是被檢測(cè)器158檢測(cè)。
圖56A是圖55所示被捕獲的白細(xì)胞230的另一個(gè)圖形表示，該白細(xì)胞230位于光生物盤(pán)軌道232上。如圖55和56A所示，白細(xì)胞230覆蓋約4條軌道A、B、C、和D。圖56B畫(huà)出從圖55和56A的白細(xì)胞210導(dǎo)出的一系列特征波形軌跡。如圖56B所指出，檢測(cè)系統(tǒng)提供4個(gè)與軌跡A、B、C、和D對(duì)應(yīng)的模擬信號(hào)A、B、C、和D。圖56B還進(jìn)一步表明，模擬信號(hào)A、B、C、和D的每一個(gè)，都載有白細(xì)胞230的特定信息。因此，如圖所示，在白細(xì)胞230上的掃描，產(chǎn)生對(duì)入射光束清楚的擾動(dòng)，該擾動(dòng)能夠被檢測(cè)和處理。然后，模擬的特征波形軌跡(信號(hào))210被引送至處理器166，以便變換為類(lèi)似的數(shù)字信號(hào)222，如圖57A和57C所示，下面還要更詳細(xì)討論。
圖57是圖形表示，表明圖57A、57B、57C、和57D之間的關(guān)系。圖57A、57B、57C、和57D，是圖56B的特征波形軌跡變換為數(shù)字信號(hào)222的圖形表示，這些數(shù)字信號(hào)222，作為一維陣列226存儲(chǔ)，并組合成數(shù)據(jù)輸入244的兩維陣列228。
現(xiàn)在具體參考圖57A，圖上畫(huà)出從圖55和56A所示光生物盤(pán)軌道A和B抽樣的模擬信號(hào)210。處理器166然后對(duì)模擬信號(hào)210相應(yīng)的即時(shí)模擬幅度214編碼，成為離散的二進(jìn)制整數(shù)216(見(jiàn)圖54)。產(chǎn)生的一系列數(shù)據(jù)點(diǎn)，是相似于被抽樣的模擬信號(hào)210的數(shù)字信號(hào)222。
下面參考圖57B，來(lái)自軌道A和B(圖57A)的數(shù)字信號(hào)222，作為獨(dú)立的一維存儲(chǔ)陣列226存儲(chǔ)。每一相繼的軌道給出相應(yīng)的一維陣列，當(dāng)與先前的一維陣列組合時(shí)，產(chǎn)生類(lèi)似于一個(gè)像的兩維陣列228。然后，數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)作為抽樣點(diǎn)224(圖54)的兩維陣列228，存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器或盤(pán)，這些抽樣點(diǎn)，代表樣品區(qū)域特定點(diǎn)上返回光束154或透射光束156(圖55)的相對(duì)強(qiáng)度。然后，兩維陣列以原始文件或圖像文件240的形式，存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器中或盤(pán)上，如圖57B所示。之后，從存儲(chǔ)器檢索242以圖像文件240存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)，并作為圖10所示分析器168的數(shù)據(jù)輸入244。
圖57C畫(huà)出從圖55和56A所示光生物盤(pán)軌道C和D抽樣的模擬信號(hào)210。處理器166然后對(duì)模擬信號(hào)210相應(yīng)的即時(shí)模擬幅度214編碼，成為離散的二進(jìn)制整數(shù)216(圖54)。產(chǎn)生的一系列數(shù)據(jù)點(diǎn)，是相似于被抽樣的模擬信號(hào)210的數(shù)字信號(hào)222。
現(xiàn)在參考圖57D，來(lái)自軌道C和D的數(shù)字信號(hào)222，作為獨(dú)立的一維存儲(chǔ)陣列226存儲(chǔ)。每一相繼的軌道給出相應(yīng)的一維陣列，當(dāng)與先前的一維陣列組合時(shí)，產(chǎn)生類(lèi)似于一個(gè)像的兩維陣列228。然后，如上所述，數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)作為抽樣點(diǎn)224(圖54)的兩維陣列228，存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器或盤(pán)，這些抽樣點(diǎn)，代表樣品區(qū)域特定點(diǎn)上返回光束154或透射光束156(圖55)的相對(duì)強(qiáng)度。然后，兩維陣列以原始文件或圖像文件240的形式存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器中或盤(pán)上，如圖57B所示。之后，如上所述，從存儲(chǔ)器檢索242以圖像文件240存儲(chǔ)的數(shù)據(jù)，并作為圖10分析器168的數(shù)據(jù)輸入244。
本發(fā)明的計(jì)算和處理算法，存儲(chǔ)在分析器168(圖10)中，并運(yùn)用于輸入數(shù)據(jù)244，產(chǎn)生可以顯示在顯示監(jiān)控器114(圖10)上的有用的輸出結(jié)果262(圖58)?，F(xiàn)在參考圖58，圖上按照本發(fā)明的處理方法和計(jì)算算法，畫(huà)出數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)主要步驟的邏輯流程圖。本處理方法的第一主要步驟，包括接收輸入數(shù)據(jù)244。如上所述，數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)以范圍0到4095的整數(shù)陣列開(kāi)始。
下一個(gè)主要步驟246，是選擇盤(pán)的計(jì)數(shù)區(qū)域。該區(qū)域一旦確定，目標(biāo)就變成對(duì)包含在所確定區(qū)域內(nèi)所有白細(xì)胞，進(jìn)行實(shí)際計(jì)數(shù)。步驟246的實(shí)施方案，依賴(lài)于盤(pán)的配置和用戶(hù)的選項(xiàng)。只作例子而不是限制，本發(fā)明的實(shí)施例使用的盤(pán)有窗，如圖2和5所示的靶區(qū)140，軟件識(shí)別這些窗，并圈出其上的一部分供分析和計(jì)數(shù)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，例如在圖2的實(shí)施例中，靶區(qū)或窗是1×2mm的兩端有半圓形部分的矩形。在該實(shí)施例中，軟件在相應(yīng)窗內(nèi)圈出標(biāo)準(zhǔn)的1×2mm矩形面積。在該實(shí)施例的一個(gè)方面中，閱讀機(jī)可以取若干個(gè)相繼的樣品值，以比較若干不同窗中的細(xì)胞數(shù)。
在本發(fā)明使用沒(méi)有窗的透射盤(pán)的實(shí)施例中，如圖5、6、8、和9中，步驟246可按一種或兩種不同的方式進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)矩形位置的選擇，或者通過(guò)把標(biāo)準(zhǔn)矩形的中心相對(duì)于固定坐標(biāo)的一點(diǎn)定位，或者通過(guò)找出參考標(biāo)記202(例如見(jiàn)圖24L、25、和26)，這是黑色染料的一點(diǎn)。在采用參考標(biāo)記202的情況中，把具有需要反差的染料，淀積在盤(pán)上相對(duì)于兩簇細(xì)胞的指定位置141(例如圖20E)。然后，引導(dǎo)光盤(pán)閱讀機(jī)跳到細(xì)胞簇之一的中心，并使標(biāo)準(zhǔn)的矩形對(duì)準(zhǔn)選擇的簇。
至于上述步驟246中用戶(hù)的選項(xiàng)，用戶(hù)可以通過(guò)用鼠標(biāo)選擇或其他方式的直接對(duì)話(huà)形式，為細(xì)胞計(jì)數(shù)指定樣品區(qū)域需要的形狀，例如矩形區(qū)域。在軟件的本實(shí)施例中，這樣做涉及使用鼠標(biāo)點(diǎn)擊，并在監(jiān)控器114上顯示的、由光生物盤(pán)導(dǎo)出的像的需要部分，拖出一矩形。不論評(píng)價(jià)區(qū)域的選擇方法如何，在下一步驟248中，是對(duì)用于計(jì)數(shù)的相應(yīng)的矩形區(qū)域進(jìn)行評(píng)價(jià)。
圖58的第三主要步驟是步驟248，該步驟針對(duì)背景照明的均勻化。通過(guò)該過(guò)程，校正某些硬件配置可能產(chǎn)生的背景均勻性起伏。背景照明均勻化把每一樣品點(diǎn)的強(qiáng)度水平偏移，以便整個(gè)背景，或沒(méi)有細(xì)胞的部分，接近有任意背景值Vbackground的水平。而Vbackground可以用許多方式?jīng)Q定，例如取標(biāo)準(zhǔn)矩形樣品區(qū)域的平均值，在本實(shí)施例中，該值設(shè)為2000。選出的矩形樣品區(qū)域每一點(diǎn)P的值V，用數(shù)(Vbackground+(V-P鄰域的平均值))取代，并在必要時(shí)截?cái)?，以適應(yīng)實(shí)際可能的值范圍，該范圍在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中是0到4095。鄰域大小的選擇，要比細(xì)胞的大小大得多，又比標(biāo)準(zhǔn)矩形小得多。
圖58流程圖的下一步驟，是規(guī)一化步驟250。執(zhí)行規(guī)一化步驟250時(shí)，用標(biāo)準(zhǔn)矩形樣品區(qū)域中的數(shù)據(jù)施行線(xiàn)性變換，使平均值變成2000且標(biāo)準(zhǔn)偏差為600。如有必要，截?cái)嘣撝?，以適應(yīng)0到4095的范圍。該步驟250，以及背景照明均勻化步驟248，使軟件對(duì)硬件的改變及調(diào)節(jié)更不敏感。只作例子而非限制，可以改變檢測(cè)電路如頂檢測(cè)器158的信號(hào)增益，對(duì)最后的細(xì)胞計(jì)數(shù)不會(huì)有明顯影響。
如圖58所示，下一步是執(zhí)行濾波步驟252。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)矩形中的每一點(diǎn)P，在比步驟248指出的大小更小的P點(diǎn)鄰域，按與Vbackground有充分差別的值來(lái)計(jì)算該鄰域的點(diǎn)數(shù)。被計(jì)算的點(diǎn)應(yīng)接近像中細(xì)胞的大小。如果該數(shù)足夠大，P點(diǎn)的值保留；否則把它指定為Vbackground。執(zhí)行這一濾波操作，是為了消除噪聲，且在最佳的情況下，只有細(xì)胞被保留在像中，而背景則一致地等于Vbackground。
可選的步驟254，是針對(duì)不良成分的消除，該步驟可按圖58所示進(jìn)行。諸如劃痕、氣泡、污物、或其他類(lèi)似的不合規(guī)則的疵點(diǎn)，可能被濾波步驟252放過(guò)。這些疵點(diǎn)可能直接地，或通過(guò)影響像的直方圖的整個(gè)分布，使細(xì)胞計(jì)數(shù)產(chǎn)生誤差。通常，這些疵點(diǎn)的大小比細(xì)胞大得多，并能夠在步驟254中去除，辦法如下。首先，形成與選擇的區(qū)域尺寸相同的二進(jìn)制像。如果在原來(lái)的像某一點(diǎn)的值等于Vbackground，則在該二進(jìn)制像中相應(yīng)點(diǎn)定義為白，否則定義為黑。其次，連接的黑點(diǎn)成分被抽去。然后，接著是施行侵蝕和展開(kāi)，使成分的視圖規(guī)則化。最后，大于已規(guī)定閾值的成分，從原來(lái)的像中除去。在本可選步驟的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)向原來(lái)像中對(duì)應(yīng)的樣品點(diǎn)賦值Vbackground，從原來(lái)的像中除去這種成分。決定哪些成分構(gòu)成可計(jì)數(shù)的對(duì)象，而哪些成分必須消除的閾值，是用戶(hù)定義的值。該閾值也可以隨要計(jì)數(shù)的調(diào)查特性，即白細(xì)胞、紅細(xì)胞、或其他生物物質(zhì)而改變。在可選步驟254之后，最好再重復(fù)步驟248、250、和252。
圖58的下一個(gè)主要步驟是步驟256，該步驟是按明亮的中心對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)步驟256包括若干子步驟。第一子步驟包括施行卷積。在該卷積的子步驟中，形成稱(chēng)為卷積圖的輔助陣列。卷積圖中點(diǎn)P的值，是對(duì)P的圓形鄰域進(jìn)行濾波之后的圖進(jìn)行積分得到的。更準(zhǔn)確地說(shuō)，對(duì)某一特定實(shí)施例，被積分的函數(shù)，是當(dāng)v大于2000時(shí)等于v-2000，當(dāng)v小于或等于2000時(shí)等于0的函數(shù)。計(jì)數(shù)步驟256要執(zhí)行的下一個(gè)子步驟，是找出卷積圖在細(xì)胞大小的半徑鄰域中的局部極大。再下一步，是避免在彼此緊密連接的鄰域中有成對(duì)的相同局部極大。計(jì)數(shù)步驟256的最后一個(gè)子步驟，是把剩余的局部極大視為標(biāo)記的細(xì)胞。
在某些硬件配置中，一些細(xì)胞可能呈現(xiàn)出沒(méi)有明亮的中心。在這些情況中，只有暗的邊緣是可見(jiàn)的，那么下面的兩個(gè)可選步驟258和260是有用的。
步驟258用于從該圖中消除發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。在步驟258，環(huán)繞每一個(gè)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞中心的圓形區(qū)域，用值2000填充，使既有明亮中心又有暗邊緣的細(xì)胞，不會(huì)被發(fā)現(xiàn)兩次。
步驟260是針對(duì)用暗的邊緣對(duì)附加的細(xì)胞計(jì)數(shù)。在步驟258之后，要對(duì)該像進(jìn)行兩種變換。該程序的第一子步驟，即子步驟(a)，用(2000-v)取代每一點(diǎn)的值v，又如果結(jié)果是負(fù)的，則以0代替。然后，在子步驟(b)，對(duì)得到的圖，以?xún)?nèi)徑R1和外徑R2的環(huán)作卷積。R1和R2分別是細(xì)胞的最小和最大期望半徑，隨后，該環(huán)在子步驟(d)中，要向左、向右、向上、和向下移動(dòng)。在子步驟(c)，把經(jīng)過(guò)4種移動(dòng)得到的結(jié)果加起來(lái)。在這樣變換之后，暗邊緣細(xì)胞的像，看起來(lái)仿佛是一朵四瓣的花。最后在子步驟(b)，按計(jì)數(shù)步驟256采用的方式，找出子步驟(c)得到的函數(shù)的極大。找出的極大就是在步驟256中被忽略的標(biāo)記的細(xì)胞。
在計(jì)數(shù)步驟256之后，或在可選地采用計(jì)數(shù)步驟260之后，圖58最后一個(gè)主要步驟是結(jié)果輸出步驟262。在標(biāo)準(zhǔn)矩形中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞數(shù)，顯示在圖1和5的監(jiān)控器114上，且對(duì)每一個(gè)已識(shí)別的細(xì)胞，用紅十字在顯示的光生物盤(pán)導(dǎo)出的像上作標(biāo)記。
現(xiàn)在參考圖59，該圖畫(huà)出的分析空腔，有分析白細(xì)胞的不同的捕獲區(qū)。暗黃色膜或白細(xì)胞樣品，是用各種方法從全血分離的，這些方法包括溶解、正的或負(fù)的選擇、和梯度離心或任何這些方法的組合。涉及樣品制備的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，在下面的例子1、2、和3中說(shuō)明，也公開(kāi)在例如下面共同授予和共同待決的專(zhuān)利申請(qǐng)中U.S.ProvisionalApplication Serial No.60/382,319，標(biāo)題是“Methods For Isolation OfT-Lymphocytes For Use In Differential Cell Counting And Use OfOptical Bio-Disc For Performing Same”，2002年5月22日申請(qǐng)。本文引用該申請(qǐng)全文，供參考。一旦MNC或暗黃色膜被分離，則把MNC引進(jìn)分析空腔，在分析空腔中，要研究的細(xì)胞與它們各自的捕獲劑結(jié)合，并執(zhí)行下面例如例子7列出的過(guò)程。
現(xiàn)在參考圖60A和60B，圖上畫(huà)出的分析空腔，有分析紅與白細(xì)胞的不同的捕獲區(qū)。圖60A畫(huà)出紅細(xì)胞ABO分析，及暗黃色膜CDMarker測(cè)定，后者有用于CD標(biāo)記物2、19、44、4、和8的捕獲區(qū)。圖60B畫(huà)出另一種紅細(xì)胞進(jìn)行分析，它使用對(duì)A、B、O、和Rh表面標(biāo)記物有特定親和力的IgM捕獲抗體。圖60B還畫(huà)出用全血作樣品的白細(xì)胞分析。在該測(cè)定中，白細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、嗜堿白細(xì)胞、中性白細(xì)胞、單核細(xì)胞、和淋巴細(xì)胞)在特定捕獲區(qū)中被捕獲，并用第二篩選門(mén)(secondary gate)來(lái)識(shí)別和確定捕獲的細(xì)胞數(shù)量。用于識(shí)別要研究的細(xì)胞的第二篩選門(mén)，是多組珠子；每一組珠子有唯一的物理特征，并有專(zhuān)門(mén)用于某種細(xì)胞的信號(hào)劑且附著在珠子上。物理特征可以包括大小、形狀、紋理、顏色、熒光、和磷光。例如，A組珠子可以是1μm的黃綠色(YG)熒光珠子，有抗T細(xì)胞的信號(hào)抗原附著在珠子上。那么，A組細(xì)胞專(zhuān)門(mén)與捕獲的T細(xì)胞結(jié)合，從而以1μm的YG熒光珠子對(duì)T細(xì)胞作標(biāo)記。另一組珠子，例如B組珠子，是2μm的紅熒光珠子，有附著在其上的抗單核細(xì)胞的抗體，該組珠子可用來(lái)標(biāo)記單核細(xì)胞。第二篩選門(mén)能更精確判定捕獲的細(xì)胞數(shù)，因?yàn)樗诓东@區(qū)內(nèi)只標(biāo)記特定要研究的細(xì)胞，而不標(biāo)記非指定結(jié)合的細(xì)胞。關(guān)于使用珠子或微球來(lái)標(biāo)記要研究的細(xì)胞的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，例如公開(kāi)在共同授予、共同待決的下述專(zhuān)利申請(qǐng)中U.S.ProvisionalApplication Serial No.60/382,944，標(biāo)題是“Methods and Apparatusfor Use in Detection and Quantitation of Cell Populations and Use ofOptical Bio-Disc for Performing Same”，2002年5月24日申請(qǐng)。本文引用該申請(qǐng)全文，供參考。
下面參考圖61，圖上畫(huà)出從血樣中獲得的CD4+細(xì)胞數(shù)的曲線(xiàn)，細(xì)胞是用光生物盤(pán)，在CD標(biāo)記物測(cè)定中，在捕獲區(qū)內(nèi)作為細(xì)胞濃度函數(shù)捕獲的。曲線(xiàn)表明細(xì)胞捕獲的增加與樣品中細(xì)胞數(shù)增加的關(guān)系。細(xì)胞是用兩個(gè)來(lái)源(抗體A來(lái)自DAKO，而抗體B來(lái)自Serotech)的CD4抗體捕獲的。曲線(xiàn)還表明，用兩種捕獲抗體的捕獲效率有類(lèi)似趨勢(shì)。關(guān)于完成該實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程的進(jìn)一步細(xì)節(jié)，在下面的例子7中說(shuō)明。
現(xiàn)在參考圖62A和62B，圖上畫(huà)出用本發(fā)明的光生物盤(pán)及用FACS分析，分析血樣得到的CD4/CD8比值數(shù)據(jù)的散布曲線(xiàn)。用于產(chǎn)生這些曲線(xiàn)的數(shù)據(jù)，列在下面表8。關(guān)于收集所示數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程的細(xì)節(jié)，在下面的例8中說(shuō)明。
實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)雖然本發(fā)明已經(jīng)參照附圖詳細(xì)說(shuō)明，但下面還要給出一些例子和進(jìn)一步的說(shuō)明。
例1圖17A畫(huà)出用圖形表示的流程圖，說(shuō)明使用生物盤(pán)時(shí)樣品的制備，以及提供的示于圖52和53更詳細(xì)的結(jié)果。后面例子的細(xì)節(jié)，如各個(gè)處理步驟的持續(xù)時(shí)間、旋轉(zhuǎn)速率、及其他細(xì)節(jié)，比上面參照?qǐng)D17A、52、和53更為具體。盡管本例提供的基本步驟與上述的那些步驟類(lèi)似。
A.包括襯底制備和化學(xué)淀積的盤(pán)的制作在本例中，用噴氣槍清潔反射盤(pán)或透射盤(pán)的襯底120(分別對(duì)應(yīng)于圖2和5)，清除任何塵埃顆粒。用旋轉(zhuǎn)涂布器以異丙醇清洗盤(pán)兩次。把2％的聚苯乙烯旋轉(zhuǎn)涂布在盤(pán)上，在整個(gè)盤(pán)上得到非常厚的涂層。
然后是淀積化學(xué)物品。一個(gè)實(shí)施例包括三步驟的淀積設(shè)計(jì)，培養(yǎng)抗生蛋白鏈菌素，培養(yǎng)30分鐘；生物素基第一抗體，培養(yǎng)60分鐘；和第二捕獲抗體，培養(yǎng)30分鐘。第一抗體可以在第一物種(如羊)中，按照抗第二物種(如鼠)的某種免疫球蛋白(如IgG、IgE、IgM)培育。第二捕獲抗體在第二物種中按照抗某種特定細(xì)胞表面抗原(如CD4、CD8)培養(yǎng)。這些步驟是在室溫下的濕的箱中完成的，在淀積之間需用清洗和干燥步驟。
1μl比值為1mg/ml在磷酸鹽緩沖液鹽水中的抗生蛋白鏈菌素，在每一窗上形成層，并培養(yǎng)30分鐘。過(guò)量的抗生蛋白鏈菌素用蒸餾水清洗干凈，然后使盤(pán)干燥。等體積的生物素基抗鼠IgG抗體(在PBS中的125μg/ml)與活化的右旋糖酐醛(200μg/m1)組合。右旋糖酐醛(DCHO)生物素基抗鼠IgG，在每一捕獲窗的抗生蛋白鏈菌素上形成層，并培養(yǎng)60分鐘或放在冰箱中一整夜。過(guò)量的試劑被清洗干凈，并用旋轉(zhuǎn)使盤(pán)干燥。
如在圖47所示，可以有許多沿徑向取向的觀察窗，用于不同的測(cè)試，如CD4(窗2)、CD8(窗3)、CD3(窗4)、和CD45(窗5)，及負(fù)控制(窗6)，使用抗人的這些細(xì)胞表面抗原的鼠IgG抗體。把如此制備的襯底培養(yǎng)30分鐘，或放在冰箱中一整夜。
化學(xué)淀積的模式，提供在下面的表5中。
表5

B.盤(pán)的組裝盤(pán)是用粘附層和頂蓋116組裝的，粘附層例如是25、50、或100微米厚(圖2和5中的通道層118)，有U形的或“e-rad”的沖壓通道，用于建立流體通道，而頂蓋116是透明頂蓋116(圖5，與帶頂檢測(cè)器的透射盤(pán)一起使用)或在捕獲區(qū)上有反射層142的頂蓋116(圖2，與帶底檢測(cè)器的反射盤(pán)一起使用)。
在一個(gè)實(shí)施例中，盤(pán)是前向Wobble Set FDL21:13707或FDL21:1270 CD-R盤(pán)，鍍有300nm的金作為編碼信息層。在反射盤(pán)上，用熟知的光刻技術(shù)，從反射層刻蝕出大小為2×1mm的橢圓形觀察窗。在一些透射盤(pán)的設(shè)計(jì)中，不刻蝕分離的觀察窗，而整個(gè)盤(pán)都可供使用。在該特定的實(shí)施例中，通道層是Fraylock粘附層DBL 201 RevC 3M94661。蓋是透明盤(pán)，有48個(gè)直徑0.040英寸的樣品入口，等距地分布在半徑26mm上。用軟件以4×的速度對(duì)數(shù)據(jù)盤(pán)進(jìn)行掃描和讀出，而用CD4+/CD8+計(jì)數(shù)軟件的抽樣速率是2.67MHz。
C.盤(pán)漏的檢測(cè)因?yàn)榉治龅氖茄?，盤(pán)必須首先檢漏，以確保盤(pán)帶著樣品在現(xiàn)場(chǎng)旋轉(zhuǎn)時(shí)，不會(huì)有空腔泄漏。每一通道以阻斷劑，如StabilGuard和PBS-Tween填充。阻斷至少持續(xù)1小時(shí)。盤(pán)以每分鐘5000轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)5分鐘，檢測(cè)盤(pán)的泄漏和盤(pán)的穩(wěn)定性。在泄漏檢測(cè)之后，盤(pán)放在真空室中24小時(shí)。在抽真空24小時(shí)后，盤(pán)放進(jìn)真空盒并存儲(chǔ)在冰箱中，直至使用。
D.樣品的收集、制備、和加到盤(pán)上下面的一節(jié)是針對(duì)樣品處理的步驟，該步驟已經(jīng)在圖17A中一般地畫(huà)出。通過(guò)密度梯度離心方法，如使用Becton Dickinson CPTVacutainer，提純單核細(xì)胞(MNC)。血液(4-8ml)直接收集進(jìn)4或8ml包含CPT Vacutainer的EDTA中。在室溫下，把該管放在有水平電動(dòng)機(jī)和擺起桶(swing out bucket)的生物公害離心機(jī)中，以1500至1800×g離心25分鐘。血液最好在收集后兩小時(shí)內(nèi)使用。離心后，除去疊在單核細(xì)胞(MNC)部分之上的血漿，留下約2mm血漿在單核細(xì)胞(MNC)層之上。收集MNC并用PBS清洗。在室溫下以300×g離心10分鐘，使細(xì)胞成為丸狀。除去上層清液，并把包含MNC的丸在PBS中再混懸，輕拍管子。再以300×g清洗10分鐘多次，各在室溫下進(jìn)行，以除去血小板。最后的丸又再混懸，直至細(xì)胞計(jì)數(shù)達(dá)10,000細(xì)胞/μl。把18μl體積的MNC引入一個(gè)或多個(gè)分析空腔或通道，把盤(pán)不動(dòng)地在室溫下培養(yǎng)15分鐘。密封通道。然后，用盤(pán)驅(qū)動(dòng)器使盤(pán)以每分鐘3000轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)3至4分鐘。盤(pán)最好用軟件以速度4×及抽樣速率2.67MHz掃描和讀出。
如果血樣不能立即處理，單核細(xì)胞在第一次離心后，可以再混懸在血漿中輕輕顛倒CPT管若干次，并在室溫下可存儲(chǔ)最多24小時(shí)。在24小時(shí)內(nèi)，血漿中的細(xì)胞可以如前所述收集并清洗。
E.CD4/CD8測(cè)定格式在本例中的測(cè)定，是屬的同種的固態(tài)細(xì)胞捕獲測(cè)定，以便快速確定血樣中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞種群的絕對(duì)數(shù)量，和CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞的比值。這一測(cè)定是在藏進(jìn)CD-ROM中的小空腔內(nèi)進(jìn)行的，通過(guò)捕獲區(qū)上從全血分離的7μl單核細(xì)胞(MNC)，確定特定抗體捕獲的CD4+、CD8+、CD2+、CD3+、和CD45+細(xì)胞數(shù)。測(cè)試的根據(jù)，是在盤(pán)特定位置上的定位細(xì)胞捕獲原理。根據(jù)單克隆和多克隆抗體對(duì)特定血細(xì)胞表面抗原的捕獲化學(xué)反應(yīng)，通過(guò)定位應(yīng)用該捕獲化學(xué)反應(yīng)，在盤(pán)上建立若干個(gè)特定細(xì)胞捕獲區(qū)。在把MNC血(30,000細(xì)胞/μl)注進(jìn)空腔后，細(xì)胞表達(dá)抗原CD4、CD8、CD2、CD3、和CD45在盤(pán)的捕獲區(qū)中被捕獲。同時(shí)藏在條碼形分區(qū)內(nèi)的還有規(guī)定的負(fù)控制區(qū)域。
F.在盤(pán)分析在上面步驟D中制備的MNC細(xì)胞(PBS中18μl)，被注入盤(pán)的空腔，然后密封空腔的入口和出口。盤(pán)在室溫下培養(yǎng)15分鐘，之后用光驅(qū)動(dòng)器的780nm激光掃描，用頂檢測(cè)器把捕獲場(chǎng)成像，如前所述。
軟件是在盤(pán)上編碼的，用于指令驅(qū)動(dòng)器自動(dòng)執(zhí)行如下操作(a)使盤(pán)按一檔或多檔離心旋轉(zhuǎn)，去掉過(guò)量的未結(jié)合的細(xì)胞，(b)使特定的捕獲窗成像，和(c)處理數(shù)據(jù)，包括在每一捕獲區(qū)中對(duì)專(zhuān)門(mén)捕獲的細(xì)胞計(jì)數(shù)，并導(dǎo)出CD4/CD8比值(或不論哪一種已編程要確定的比值)。
在處理步驟中，軟件讀出每一捕獲區(qū)的像，并對(duì)遇到的細(xì)胞加上標(biāo)記。例如，在估算CD4+和CD8+細(xì)胞數(shù)之后，軟件計(jì)算CD4+/CD8+細(xì)胞比值，還顯示CD4+、CD8+、CD3+、及CD45+捕獲區(qū)每微升全血中細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)，而且也顯示CD4+/CD8+比值。從插入光盤(pán)到獲得數(shù)量和比值，整個(gè)過(guò)程約需12分鐘。
G.使用的試劑抗生蛋白鏈菌素(Sigma，cat.#S-4762)添加去離子水，得到5mg/ml的溶液，等分樣本并保存在-30C中。使用時(shí)，添加Tris緩沖液，直至最后的濃度為1mg/ml。
正控制CD45(Sigma，Lot#038H4892，cat.#C7556)。存儲(chǔ)在在2-8℃中。
副捕獲抗體生物素基抗鼠IgG(在羊中培育，Vector實(shí)驗(yàn)室，Lot#L0602，Catalog#BA-9200)在蒸餾水制成原液1.5mg/ml。在0.1MPBS中的工作b-IgG溶液125μg/ml。存儲(chǔ)在在2-8℃中。若要長(zhǎng)期存儲(chǔ)，可以保存在-30℃中。
醛活化右旋糖酐(Pierce，lot#97111761，cat.#1856167)。在PBS中的原液5mg/ml，存儲(chǔ)在在2-8℃中。
主捕獲抗體CD4(DAKO，cat.#M0716)，CD8(DAKO，cat.#M0707)，CD2(DAKO，cat.#M720)，CD45(DAKO，cat.#M0701)，CD14(DAKO，cat.#M825)，和CD3(DAKO，cat.#M7193)。
存儲(chǔ)在在2-8℃中。
負(fù)控制鼠IgG1(DAKO，cat.#X0931)。存儲(chǔ)在在2-8℃中。
磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)，pH7.4(Life Technologies/GIBCOBRL，cat.#10010-023)或等價(jià)物。室溫保存。
異丙基醇，90-100％H.RBC溶解設(shè)計(jì)氯化銨溶解緩沖液
1×氯化銨溶解緩沖液原液，應(yīng)保存在2-8℃中。內(nèi)含0.155MNH4Cl、10mM KHCO3、和0.1mM乙二胺四乙酸鈉；pH7.3到7.4。保存在2-8℃中。使用前置于室溫中。
過(guò)程1.對(duì)每100μl血，添加2ml溶解緩沖液。(該過(guò)程最好在生物公害防護(hù)罩中完成)。
2.在室溫下攪拌并培養(yǎng)15分鐘。
3.在室溫下，在生物公害防護(hù)罩離心機(jī)中，以500×g使血液離心5分鐘。
4.除去上層清液，并用PBS中2％的FCS或FBS清洗細(xì)胞。把細(xì)胞離心。
5.計(jì)算WBC總數(shù)，并使注入樣品的最后濃度為10,000WBC細(xì)胞/μl。
例2單核細(xì)胞分離過(guò)程使用有檸檬酸鈉的Becton and Dickinson CPT Vacutainer(4ml是BD catalog#362760，8ml是#362761)細(xì)胞制備管。步驟1.血液直接收集進(jìn)4或8ml包含CPT Vacutainer的EDTA中。如果血樣已經(jīng)在抗凝血?jiǎng)┲?，則首先倒出Vacutainer中的EDTA，然后把6-8ml血樣倒進(jìn)CPT管。
2.在室溫下，把管放在有水平電動(dòng)機(jī)和擺起桶(swing outbucket)的生物公害離心機(jī)中，以1500至1800×g離心25分鐘。要得到最佳結(jié)果，血液應(yīng)在收集的兩小時(shí)之內(nèi)離心。但是，超過(guò)兩小時(shí)的舊血液也可以離心，但會(huì)降低MNC數(shù)和增加RBC污染。
3.離心后，除了在MNC層上留下約2mm血漿外，除去其余血漿。收集并轉(zhuǎn)移稍帶白色的單核細(xì)胞層，放進(jìn)15ml的錐形離心管中。
4.把10-15ml的PBS添加到MNC層，輕輕顛倒離心管若干次，使細(xì)胞混合。
5.在室溫下，通過(guò)把管放在生物公害離心機(jī)中，以200×g離心10分鐘，清洗細(xì)胞。
6.除去上層清液。輕輕拍打管，使細(xì)胞再混懸。
7.在10ml的PBS中再次清洗。在室溫下，以200-300×g離心10分鐘，除去血小板。
8.除去上層清液，并在50μl的PBS中再混懸小丸。
9.估算樣品中的細(xì)胞計(jì)數(shù)。運(yùn)行CBC或把2μl細(xì)胞稀釋在18μl的臺(tái)盼藍(lán)中，輕輕混合并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。把樣品配制成最后的細(xì)胞計(jì)數(shù)為10,000細(xì)胞/μl，供分析。
10.如果細(xì)胞不能立即處理，單核細(xì)胞在第一次離心(上面步驟2)后，可以通過(guò)輕輕顛倒CPT管若干次，使單核細(xì)胞再混懸在分離的血漿中，這樣在室溫下可存儲(chǔ)最多24小時(shí)。在24小時(shí)內(nèi)，血漿中的細(xì)胞可以如前所述收集并繼續(xù)清洗。
每μl總的細(xì)胞計(jì)數(shù)＝25個(gè)小方格中細(xì)胞數(shù)×(乘)100。
例3用Histopaque-1077從全血分離MNC把1ml的Histopaque-1077放進(jìn)15ml的離心管，再把1ml的全血輕輕放在Histopaque-1077上面。然后，在室溫下，以400×g離心30分鐘。小心地用巴斯德移液管抽吸混合液，并把不透明交界面轉(zhuǎn)移至離心管。然后在離心管中添加10ml的PBS。然后把溶液以300×g離心10分鐘。輕輕倒出上層清液，再把細(xì)胞丸在10.0ml的PBS中再混懸，并以250×g離心10分鐘。再次在10.0ml的PBS中再混懸細(xì)胞丸并以250×g旋轉(zhuǎn)繼續(xù)清洗。最后的細(xì)胞丸在0.5ml的PBS中再混懸。
例4盤(pán)的制備和化學(xué)淀積A.包括襯底制備和化學(xué)淀積的盤(pán)的制作在本實(shí)施例中，用噴氣槍清潔透射盤(pán)的襯底，清除任何塵埃。然后把盤(pán)安裝在旋轉(zhuǎn)涂布器中，并以穩(wěn)定流動(dòng)的異丙醇清洗兩次。之后，用溶解在310m甲苯和65ml異丙醇中的2％聚苯乙烯的聚苯乙烯溶液，均勻涂布在盤(pán)上。
對(duì)副抗體的淀積，把活化的右旋糖酐醛新鮮溶液(在PBS中200μg/ml)，與等體積的Vector IgG(在PBS中125μg/ml)組合。用手工的針淀積，把約1μl的IgG+DCHO絡(luò)合物，淀積在盤(pán)的每一捕獲區(qū)。盤(pán)在濕的箱中培養(yǎng)60分鐘。用D.I.水把過(guò)量的抗體清洗干凈，然后把盤(pán)旋轉(zhuǎn)干燥。
對(duì)主抗體，把DAKO CD4在PBS中稀釋至50μg/ml，DAKO CD8在PBS中稀釋至25μg/ml，和DAKO CD45在PBS中稀釋至145μg/ml。用手工的針點(diǎn)樣器，把每一種主抗體約1μl淀積在已吸收的副抗體上部。在濕的箱中培養(yǎng)30分鐘。用PBS清洗過(guò)量的抗體并使盤(pán)旋轉(zhuǎn)干燥。
B.盤(pán)的組裝使用的蓋盤(pán)是透明的，上面附著有Fraylock粘附的通道層。在粘附層中有沖壓形成的4個(gè)U形通道，構(gòu)成流體通路。把頂蓋放在透射盤(pán)襯底之上，使流體通道在抗體區(qū)之上。之后，為了使兩個(gè)盤(pán)緊固在一起，要把它們經(jīng)過(guò)8次盤(pán)模壓。
C.盤(pán)漏的檢測(cè)、阻斷每一流體通道以StabilGuard填充，并培養(yǎng)1小時(shí)。在培養(yǎng)時(shí)，盤(pán)在旋轉(zhuǎn)涂布器上，以每分鐘5000轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)5分鐘。旋轉(zhuǎn)后，檢測(cè)盤(pán)通道的泄漏。然后，把StabilGuard從通道吸出，再把盤(pán)放在真空室中抽真空一整夜。次日早晨，把盤(pán)放在真空盒中并保存在4℃中。
例5淋巴瘤細(xì)胞譜系A(chǔ).細(xì)胞譜系描述細(xì)胞譜系是帶有指定SUP-TI的人類(lèi)T細(xì)胞淋巴瘤。ATCC cat.#是CRL-1942。該譜系是從患有T-LL病的8歲兒童惡性胸膜積液收集的惡性細(xì)胞中得到的。該細(xì)胞表達(dá)多種T譜系標(biāo)記物?？乖磉_(dá)是CD1a+、CD3+、CD4+、CD5+、和CD8+。通過(guò)每?jī)芍芴砑硬⒂?0％FBS代替RPMI媒質(zhì)，使培養(yǎng)物保持在2×105與2×106細(xì)胞/ml之間。培養(yǎng)物是混懸液，在37℃的含5％CO2的大氣中水平地培育。
B.SUP-TI的制備用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器估算細(xì)胞濃度。通過(guò)離心和除去過(guò)量的上層清液，把細(xì)胞濃縮至需要的濃度。
例6使用淋巴瘤細(xì)胞譜系的盤(pán)檢測(cè)A.用SUP-TI細(xì)胞的測(cè)試抗體按照例4使用25μm的粘附層/通道層制備盤(pán)。SUP-TI細(xì)胞的濃度用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器確定。細(xì)胞濃縮至30,000細(xì)胞/μl。把細(xì)胞注入分析盤(pán)的兩個(gè)通道內(nèi)。15分鐘后，以每分鐘3000轉(zhuǎn)把盤(pán)離心5分鐘。拍攝捕獲區(qū)上被捕獲細(xì)胞的顯微照片，并對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果列在下面表6。
表6捕獲區(qū)捕獲的SUP-TI細(xì)胞數(shù)

例7血樣CD標(biāo)記物測(cè)試A.制備臨床血樣上午10:00抽取的12ml血(樣品#176)，放進(jìn)EDTA管中。中午12:00，在4×15ml的管中，把3ml血在3ml的Histopaque 1077上形成層。在室溫下，把管以400×g離心30分鐘。離心后，把不透明MNC層內(nèi)0.5cm的血漿吸出。把剩余的不透明MNC層轉(zhuǎn)移至清潔的15ml管并添加12ml的PBS。對(duì)剩余的3管重復(fù)該過(guò)程。
清洗之后，把細(xì)胞混懸液以250×g離心10分鐘。吸出上層清液。細(xì)胞在14ml的PBS中再混懸。再把混懸液以250×g離心10分鐘。吸出上層清液，并以175μl的PBS把每一細(xì)胞丸再混懸。然后，把所有4個(gè)MNC混懸液組合，而細(xì)胞濃度則用Cell Dyne 1600細(xì)胞計(jì)數(shù)器運(yùn)行CBC確定。最后的體積是650μl，濃度為23.5K細(xì)胞/μl。然后我們進(jìn)行了6種系列稀釋劑的稀釋?zhuān)詽舛确秶?000細(xì)胞/μl到100,000細(xì)胞/μl為止，見(jiàn)下面的表7。
B.購(gòu)自DAKO和Serotec的CD4抗體的比較有6個(gè)通道的兩個(gè)盤(pán)(#338&#339)，各按例4用100μm粘附層制作。另一種購(gòu)自Serotec的主CD抗體(50μg/ml，cat.#LN1298)，也用于本實(shí)驗(yàn)。
我們向盤(pán)338的每一通道，注入用一種系列稀釋劑稀釋的樣品176。15分鐘后，以每分鐘3000轉(zhuǎn)把盤(pán)離心5分鐘。拍攝化學(xué)區(qū)上被捕獲細(xì)胞的顯微照片，并用細(xì)胞計(jì)數(shù)軟件(Metamorph)對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。另外，捕獲的細(xì)胞數(shù)可以用光盤(pán)閱讀機(jī)及隨盤(pán)軟件評(píng)估。該過(guò)程是用于盤(pán)339的。在DAKO CD4化學(xué)區(qū)上捕獲細(xì)胞的計(jì)數(shù)，與Serotec CD4化學(xué)區(qū)捕獲的細(xì)胞比較。從該實(shí)驗(yàn)收集的數(shù)據(jù)，示于表7及圖61。
表7用DAKO和Serotec CD4捕獲抗體捕獲的細(xì)胞

例8把盤(pán)的CD4/CD8比值與FACS的CD4/CD8比值比較臨床樣品(No.154、156、157、159和175)的制備與例7同，每一樣品只用3ml血，最后樣品的濃度是10,000細(xì)胞/μl。
盤(pán)(No.272、275、276、267和327)的制備與例4同，使用100μm的粘附層通道。
各樣品按下面表8所示注入對(duì)應(yīng)的盤(pán)。15分鐘后，以每分鐘3000轉(zhuǎn)把盤(pán)離心5分鐘。拍攝化學(xué)區(qū)上被捕獲細(xì)胞的顯微照片，并對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。各臨床樣品還用FACS進(jìn)行分析。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，示于下面的表8及圖62A和62B。
表8用光生物盤(pán)和FACS的血CD4/CD8比值

結(jié)束聲明本文公開(kāi)本發(fā)明涉及設(shè)備、方法、和處理的各個(gè)方面，也在下面的專(zhuān)利申請(qǐng)中給出U.S.Provisional Application Serial No.60/323,682，標(biāo)題是“Methods for Reducing Non-Specific Binding ofCells on Optical Bio-Discs Utilizing Blocking Agents”，2001年9月20日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/324,336，標(biāo)題是“Methods for Reducing Bubbles in Fluidic Chambers Using PolyvinylAlcohol and Related Techniques for Achieving Same in OpticalBio-Discs”，2001年9月24日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application SerialNo.60/326,800，標(biāo)題是“Sealing Methods for Containment ofHazardous Biological Materials within Optical Analysis DiscAssemblies”，2001年10月3日申請(qǐng)；U.S.Provisional ApplicationSerial No.60/328,246，標(biāo)題是“Methods for Calculating Qualitativeand Quantitative Ratios of Helper/Inducer-Suppressor/CytotoxicT-Lymphocytes Using Optical Bio-Disc Platform”，2001年10月10日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/386,072，標(biāo)題是“Quantitative and Qualitative Methods for Characterizing CancerousBlood Cells Including Leukemic Blood Samples Using OpticalBio-Disc Platform”，2001年10月19日申請(qǐng)；U.S.ProvisionalApplication Serial No.60/386,073，標(biāo)題是“Methods for Quantitativeand Qualitative Characterization of Cancerous Blood Cells IncludingLymphoma Blood Samples Using Optical Bio-Disc Platform”，2001年10月19日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application Serial No.60/386,071，標(biāo)題是“Methods for Specific Cell Capture by Off-Site Incubation ofPrimary Antibodies with Sample and Subsequent Capture bvSurface-Bound Secondary Antibodies and Optical Bio-Disc IncludingSame”，2001年10月26日申請(qǐng)；U.S.Provisional Application SerialNo.60/344,977，標(biāo)題是“Quantitative and Qualitative Methods forCell Isolation and Typing Including Immunophenotyping”，2001年11月7日申請(qǐng)；和U.S.Provisional Application Serial No.60/349,975，標(biāo)題是“Methods for Reducing Non-Specific Binding of Cells onOptical Bio-Discs Utilizing Charged Matter Including Heparin，Plasma，or Poly-Lysine”，2001年11月9日申請(qǐng)，本文引用所有這些專(zhuān)利申請(qǐng)，供參考。
雖然本發(fā)明已經(jīng)參照一些優(yōu)選實(shí)施例和技術(shù)例子詳細(xì)說(shuō)明，但顯而易見(jiàn)，本發(fā)明不限于那些精確的實(shí)施例或例子。相反，借助現(xiàn)在公開(kāi)的、說(shuō)明目前實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳模式，本領(lǐng)域熟練人員會(huì)發(fā)現(xiàn)，在不違背本發(fā)明的范圍和精神的情況下，存在許多變化和修改。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)由下面的權(quán)利要求書(shū)規(guī)定，而不是由前面的說(shuō)明規(guī)定。所有與權(quán)利要求書(shū)等效的意義和范圍內(nèi)的變化、修改、和變更，都應(yīng)認(rèn)為涵蓋在權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)生物樣品中血細(xì)胞分析物的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括有襯底的光盤(pán)；平行于所述襯底的頂蓋；在所述襯底與頂蓋之間的空腔，所述空腔包括捕獲區(qū)；捕獲區(qū)上與所述襯底關(guān)聯(lián)的捕獲層，以便第一捕獲區(qū)有第一細(xì)胞捕獲劑和第二捕獲區(qū)有第二細(xì)胞捕獲劑；光源，把光引至盤(pán)的捕獲區(qū)上；檢測(cè)器，檢測(cè)從盤(pán)的捕獲區(qū)反射的光，或透過(guò)盤(pán)的捕獲區(qū)的透射光，并給出信號(hào)；和處理器，用該信號(hào)對(duì)與捕獲劑結(jié)合的樣品的各項(xiàng)目計(jì)數(shù)。
2.一種采用光盤(pán)和盤(pán)驅(qū)動(dòng)器檢測(cè)生物樣品中血細(xì)胞分析物的方法，所述方法包括如下步驟向盤(pán)的空腔中的盤(pán)表面提供細(xì)胞樣品，空腔包括至少一個(gè)有捕獲劑的捕獲區(qū)；把盤(pán)裝入光閱讀機(jī)；旋轉(zhuǎn)光盤(pán)；把入射的電磁輻射束引向捕獲區(qū)；檢測(cè)與捕獲區(qū)上的盤(pán)相互作用后形成的電磁輻射束；把檢測(cè)的束轉(zhuǎn)換為輸出信號(hào)；和分析輸出信號(hào)，提取其上與捕獲區(qū)捕獲的細(xì)胞數(shù)有關(guān)的信息。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中，以盤(pán)表面支承樣品的空腔，是在盤(pán)內(nèi)并被襯底及頂蓋的相對(duì)兩側(cè)封閉。
4.按照權(quán)利要求2的方法，其中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)有反射層，可使引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光被反射。
5.按照權(quán)利要求2的方法，其中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)可使引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光，透過(guò)光源與檢測(cè)器之間的光盤(pán)。
6.按照權(quán)利要求2的方法，其中的盤(pán)表面以第一組細(xì)胞捕獲劑涂敷。
7.按照權(quán)利要求6的方法，其中各細(xì)胞捕獲劑定義了分立的捕獲區(qū)。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中第二組細(xì)胞捕獲劑，按預(yù)定的模式定義第二組分立的捕獲區(qū)。
9.按照權(quán)利要求8的方法，其中第一組和第二組捕獲區(qū)是在一個(gè)空腔中。
10.按照權(quán)利要求6的方法，其中的細(xì)胞捕獲劑用于與細(xì)胞表面抗原結(jié)合。
11.按照權(quán)利要求10的方法，其中的細(xì)胞表面抗原，是從抗原的CD科中選擇的。
12.一種以光盤(pán)和盤(pán)驅(qū)動(dòng)器施行簇指定計(jì)數(shù)的方法，所述方法包括如下步驟向有分離梯度的第一個(gè)管中提供血樣；按足夠使血樣分離成層的時(shí)間和速度，旋轉(zhuǎn)第一個(gè)管；使包含T細(xì)胞的MNC層再混懸，由此形成MNC混懸液；向包括至少一個(gè)捕獲區(qū)、捕獲區(qū)上至少有一種捕獲劑的光盤(pán)表面，提供MNC混懸液樣品；把光盤(pán)裝入光閱讀機(jī)；旋轉(zhuǎn)光盤(pán)；把入射的電磁輻射束引向所述至少一個(gè)捕獲區(qū)；檢測(cè)與捕獲區(qū)上的盤(pán)相互作用后形成的電磁輻射束；把檢測(cè)的束轉(zhuǎn)換為輸出信號(hào)；和分析輸出信號(hào)，提取其上與捕獲區(qū)捕獲的細(xì)胞數(shù)有關(guān)的信息。
13.按照權(quán)利要求12的方法，其中的分離梯度，由經(jīng)離心后形成密度梯度的基質(zhì)提供。
14.按照權(quán)利要求12的方法，其中的第一個(gè)管還包含抗凝血?jiǎng)?br> 15.按照權(quán)利要求14的方法，其中的抗凝血?jiǎng)┦荅DTA。
16.按照權(quán)利要求14的方法，其中的抗凝血?jiǎng)┦菣幟仕嵊倚囚?br> 17.按照權(quán)利要求14的方法，其中的抗凝血?jiǎng)┦歉嗡亍?br> 18.按照權(quán)利要求12的方法，其中的表面是在盤(pán)內(nèi)，并并被襯底及頂蓋的相對(duì)兩側(cè)封閉。
19.按照權(quán)利要求12的方法，其中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)有反射層，可使引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光被反射。
20.按照權(quán)利要求12的方法，其中，光盤(pán)的結(jié)構(gòu)可使引導(dǎo)至捕獲區(qū)又不落在細(xì)胞上的光，透過(guò)光源與檢測(cè)器之間的光盤(pán)。
21.按照權(quán)利要求12的方法，其中的盤(pán)表面以第一組細(xì)胞捕獲劑涂敷。
22.按照權(quán)利要求21的方法，其中各捕獲劑是抗體。
23.按照權(quán)利要求22的方法，其中各抗體選自如下的一組，該組包括單克隆、多克隆、和通過(guò)重組創(chuàng)建的抗體(recombinantlycreated antibodies)。
24.按照權(quán)利要求21的方法，其中，捕獲劑借助交聯(lián)系統(tǒng)，在盤(pán)表面是固定不動(dòng)的。
25.按照權(quán)利要求20的方法，其中的捕獲劑直接在盤(pán)表面，是固定不動(dòng)的。
26.按照權(quán)利要求20的方法，其中各捕獲劑定義了一組或多組分立的捕獲區(qū)。
27.按照權(quán)利要求26的方法，其中的一組或多組捕獲區(qū)，位于光盤(pán)中一個(gè)或多個(gè)空腔內(nèi)。
28.按照權(quán)利要求20的方法，其中的捕獲劑，對(duì)細(xì)胞表面抗原具有選擇性的親和力。
29.按照權(quán)利要求28的方法，其中的細(xì)胞表面抗原，是從抗原的CD科中選擇的。
30.按照權(quán)利要求29的方法，其中的細(xì)胞表面抗原，是選自包含CD3、CD4、CD8、和CD45的一組。
31.按照權(quán)利要求12的方法，其中的血樣包括正常血細(xì)胞、白血病血細(xì)胞、或淋巴瘤血細(xì)胞。
全文摘要
一種在光學(xué)生物盤(pán)上施行并用盤(pán)驅(qū)動(dòng)器讀出的臨床診斷測(cè)定。本文公開(kāi)的是，用光學(xué)生物盤(pán)檢測(cè)和確定生物樣品中特定血細(xì)胞分析物含量的方法和設(shè)備。確定生物樣品中特定類(lèi)型血細(xì)胞含量的方法，包括把某種抗體與盤(pán)上某一捕獲區(qū)結(jié)合、向該捕獲區(qū)提供樣品、除去沒(méi)有與捕獲區(qū)結(jié)合的樣品部分、和對(duì)結(jié)合的細(xì)胞計(jì)數(shù)。本發(fā)明還說(shuō)明，用光盤(pán)及盤(pán)驅(qū)動(dòng)器施行簇指定計(jì)數(shù)的方法和設(shè)備，以及制作實(shí)施該種簇指定計(jì)數(shù)的光學(xué)測(cè)定盤(pán)的方法。
文檔編號(hào)B01L3/00GK1592684SQ02821386
公開(kāi)日2005年3月9日 申請(qǐng)日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月30日
發(fā)明者高瑞·P·賽爾文, 約翰·F·戈登, 卡恩·J·布萊茲爾, 約瑟夫·R·I·爾斯?fàn)?申請(qǐng)人:伯斯坦技術(shù)公司, 長(zhǎng)岡實(shí)業(yè)株式會(huì)社