專利名稱：以磺胺二甲嘧啶為配基的親和色譜填料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種色譜填料以及其在在生物大分子分離、純化中的應(yīng)用。具體涉及到一種親和色譜填料，即利用磺胺二甲嘧啶(SMZ)為配基的親和色譜填料，以及其在分離、純化丙種抗體球蛋白(IgG)方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
IgG(Immunoglobulin G)在體液免疫中起著“主力免疫”的作用，具有重要的生理功能，主要包括1.中和毒素和病毒；2.凝集作用和沉淀作用；3.激活補(bǔ)體；4.親細(xì)胞功能；5.免疫損傷等。以雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體，屬于均質(zhì)的IgG，廣泛應(yīng)用于疾病的生物化學(xué)分析、診斷和導(dǎo)向藥物的制備。但是，IgG的分離、純化一直是其制備過程中的瓶頸技術(shù)，應(yīng)用親和色譜方法純化IgG一直是研究的熱點[劉國詮，李振甫，趙?！犊贵w工程》，董志偉，王琰主編，北京醫(yī)科大學(xué)出版社，北京，2002年，185-208]。
親和色譜是用于生物大分子的分離與純化的一種液相色譜模式，它是根據(jù)生物大分子與其配基間所具有的高親和力而設(shè)計的一種高選擇性的色譜分離方法。1967年Axen等人[R.Axen，J.Porath and S.ErnbackNature，1967，2141302-1304]首次將具有伯氨基的分子鍵合到以CNBr活化的多糖基質(zhì)上。此后，大量的親和色譜填料被開發(fā)并生產(chǎn)出來，使親和色譜成為了實驗室中廣泛應(yīng)用的一種分離純化的手段。1978年，Ohlso等人[S.Ohlson，L.Hansson，P.-O.Larssom and K.MosbachFEBS Lett.，1978，935-9]提出了高效親和色譜的概念，以小粒徑高效基質(zhì)取代習(xí)用的軟膠，大大提高了親和色譜的分離效率與速度。
在親和色譜中，首先須將配基以共價鍵連接于不溶性載體相上，得到具有固定化配基的親和色譜填料。將這種親和色譜填料填充成親和色譜柱。若將含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的混合物加到柱上，則只有能與固定化配基表現(xiàn)出明顯親和作用的蛋白質(zhì)被保留；其他不能識別固定化配基的組分則不受阻礙地流過色譜柱床。然后，改變?nèi)軇┑慕M成便可將目標(biāo)蛋白質(zhì)從固定化配基上解離和洗脫下來。
與其它經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離方法比較，親和色譜有許多突出的優(yōu)點1，親和色譜幾乎可應(yīng)用于任何兩種有特異性相互作用的生物分子的分離。
2，親和色譜是選擇性最高的色譜模式。在許多場合下，親和色譜是純化倍數(shù)最高的操作，可大大減少操作所需時間、步驟和成本。
3，操作條件溫和，有利于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性，提高蛋白質(zhì)的活性回收率。
4，適于分離復(fù)雜生物體系中低濃度的蛋白質(zhì)組份。
對于親和色譜而言，選擇合適的親和配基是最重要的一環(huán)。高效親和色譜的配基可分為兩大類非專一性親和配基和生物專一性相互作用配基。非專一性配基如染料、類染料、固定化和氨基酸類似物等。它們的特點在于便宜易得，容易鍵合且鍵合量大，易于大規(guī)模生產(chǎn)，缺點是專一性差，選擇性較低。專一性配基主要是利用抗原—抗體、酶—底物、酶—抑制劑等的生物專一性作用。它們往往有高的選擇性，但其成本高，來源困難。在親和色譜中配基必須具備以下條件1.在一定條件下，能和欲分離的生物大分子進(jìn)行專一性結(jié)合，所形成復(fù)合物的解離常數(shù)一般在10-4～10-8mol/L之間。
2.配基和生物大分子結(jié)合后，在一定條件下又能解離，而且解離后不能破壞生物大分子的生物活性。
3.配基上必須含有可被利用的官能團(tuán)，以便用適宜的化學(xué)方法將其偶聯(lián)到固相載體上，且偶聯(lián)后不應(yīng)影響配基和欲分離生物大分子的專一性結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明中提出了一種新的親和色譜用配基—磺胺二甲嘧啶(SMZ)?；前范奏奏橐环N大量生產(chǎn)且廣泛應(yīng)用的抗菌消炎藥物。其分子結(jié)構(gòu)中含有氨基，這一氨基可以與表面或整體含有環(huán)氧基、氨基、羥基、羧基、醛基或其它能與氨基進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)的基團(tuán)的固體載體進(jìn)行反應(yīng)，從而可通過很多方法將其鍵合至載體上，便可制備出親和色譜填料并據(jù)以制備出相應(yīng)的親和色譜柱。所指的載體為多孔或無孔的球形、無定型、薄膜或纖維狀的硅膠、可控孔徑玻璃、氧化物陶瓷、合成高分子材料或天然高分子材料。其中，所述的氧化物陶瓷為氧化鋁、氧化鋯或氧化鈦為基質(zhì)的陶瓷；所述的合成高分子材料為聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸乙二醇酯、聚丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或聚酰胺材料或它們的復(fù)合物；所述的天然高分子材料為瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、殼聚糖、纖維素材料或它們的復(fù)合物。所發(fā)明的親和色譜填料具有下圖所示的結(jié)構(gòu) 固相載體空間臂 SMZ配基當(dāng)使用多孔或無孔聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、聚甲基丙烯酸乙二醇酯或以瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、殼聚糖或纖維素材料為基質(zhì)的固體材料為載體時。其制備方法，按下列合成步驟進(jìn)行(1)接活化的空間臂取一份多孔或無孔聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，其直徑2～200微米，若為多孔微球，其孔徑應(yīng)大于20納米。加入0.1～10份0.01～1.0mol/L的NaOH，0.1～10份雙官能團(tuán)化合物，如乙二醇二縮水甘油醚或丁二醇二縮水甘油醚，再加入0.001～0.1份硼氫化鈉，在振蕩器或在攪拌下，于10℃～90℃反應(yīng)2～72小時，產(chǎn)物抽吸過濾并以蒸餾水洗凈備用。
(2)偶聯(lián)配基取一份上述產(chǎn)物，置于含0.1～10份磺胺二甲嘧啶的NaCO3緩沖液(pH10)中，于10℃～90℃下振蕩或攪拌反應(yīng)2～72h。反應(yīng)物過濾，以大量水沖洗，抽吸過濾，于30～70℃下真空干燥。
(3)封閉殘余活性基團(tuán) 取一份上述產(chǎn)物，加入5～30份1M的pH 8.5的Tris-HCl緩沖液，10℃～90℃下振蕩或攪拌反應(yīng)1.0～10h，過濾，用大量水沖洗，最后用甲醇洗滌2次，于30～70℃下真空干燥至干，得到以SMZ為配基的親和色譜填料將所制備的親和色譜填料填裝進(jìn)不銹鋼、塑料或玻璃制的柱管中制成親和色譜柱，將此種親和色譜柱連接至色譜系統(tǒng)中，便可用以進(jìn)行目的產(chǎn)物的分離與分析。進(jìn)行色譜分離時，流動相A液為pH 5.0～6.0的0.005～0.05mol/L的緩沖液，B液為A液中加入0.020～0.5mol/L氯化鈉或氯化鉀?？刹捎秒A段梯度，也可采用其它梯度模式。在280nm或在220nm下進(jìn)行監(jiān)測。所發(fā)明的親和色譜填料，在pH5.0～pH6.0時，可以與丙種抗體球蛋白產(chǎn)生專一性的分子識別相互作用，但不與人血清白蛋白(HAS)、牛血清白蛋白(BSA)、A蛋白(Protein A)、伴刀豆球蛋白A(Con A)、胰蛋白酶(Trypsin)、抗凝血酶III(AT III)等常見蛋白質(zhì)產(chǎn)生專一性的分子識別相互作用。固定化的磺胺二甲嘧啶與人丙種抗體球蛋白具有強(qiáng)的相互作用力，若以解離常數(shù)表示，其解離常數(shù)可達(dá)3×10-6mol/L。從而，該填料可以從復(fù)雜的體系中，例如，從血漿、發(fā)酵液、組織勻漿液或其它含有丙種抗體球蛋白的物質(zhì)中專一性地將其中的丙種抗體球蛋白分離出來。使用血漿為樣品時，血漿不需特別預(yù)處理，使用血漿原液或以A液稀釋，以0.45μm的濾膜過濾后直接進(jìn)樣，所得到的抗體球蛋白的純度大于91％(以SDS-PAGE測定)。
這種新的親和色譜填料與既有的分離抗體球蛋白的親和色譜填料，具有親和作用力強(qiáng)、安全性高、原料易得、價格低廉的特點?？捎糜趶难獫{、發(fā)酵液、組織勻漿液或其它含有丙種抗體球蛋白的物質(zhì)中將其中所含的丙種抗體球蛋白的加以分離、純化，也可將其用于丙種抗體球蛋白或丙種抗體球蛋白復(fù)合物的分析與測定。
具體實施例方式1.選擇粒徑單分散的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯高分子微球(PGMA)為載體，微球粒徑約11μm，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，可在pH 2～13范圍內(nèi)使用，其表面富含環(huán)氧基，含量為1.1mmol/g樹脂。取PGMA微球1.5g，置于圓底燒瓶中，加入5ml 0.5mol/LNaOH，5ml乙二醇二縮水甘油醚及10mg硼氫化鈉，在搖床上室溫振蕩反應(yīng)8小時，抽吸過濾并以蒸餾水洗凈、稱取上述干樹脂1.2g，加至溶有2g SMZ的NaCO3緩沖液(pH10)30ml中，50℃下振蕩反應(yīng)36h。反應(yīng)物過濾，以大量水沖洗，抽干。加入10ml 1M的pH8.5的Tris-HCl緩沖液，室溫下振蕩反應(yīng)3h，過濾，用大量水沖洗，最后用甲醇洗滌2次，真空下烘干備用。此即為以PGMA為載體、以SMZ為配基的親和色譜填料。
2.選擇粒徑單分散的聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯高分子微球(PGMA)為載體，微球粒徑約11μm，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性，可在pH2～13范圍內(nèi)使用，其表面富含環(huán)氧基，含量為1.1mmol/g樹脂。取PGMA微球1.5g，置于于圓底燒瓶中，加入5ml 0.5mol/LNaOH，5ml乙二醇二縮水甘油醚及10mg硼氫化鈉，在搖床上室溫振蕩反應(yīng)8小時，抽吸過濾并以蒸餾水洗凈、稱取上述干樹脂1.2g，加至30ml NaCO3緩沖液(pH10)中，50℃下振蕩反應(yīng)36h。反應(yīng)物過濾，以大量水沖洗，抽干。加入10ml 1M的pH8.5的Tris-HCl緩沖液，室溫下振蕩反應(yīng)3h，過濾，用大量水沖洗，最后用甲醇洗滌2次，真空下烘干備用。此即為以PGMA為載體、不接SMZ的空白親和色譜填料。
3.取直徑為4mm，長度為70mm d1不銹鋼柱管洗凈備用。1g以PGMA為載體、以SMZ為配基的親和色譜填料，懸浮于pH為7.4的50mM磷酸緩沖液(PBS)中，在15Mpa壓力下以勻漿法裝柱，制備出親和色譜柱。以同樣方法可以制備出空白親和色譜柱。
4.以PGMA為載體、以SMZ為配基的親和色譜柱及未鍵合配基的空白柱與IgG親和作用的比較將親和色譜柱或空白柱連接于高效液相色譜儀上，樣品為人IgG。流動相A液為50mM PBS(pH5.5)，B液為50mM PBS+250mM鹽(pH5.5)，梯度條件0-10minA液，10-20minB液，20-30minA液；在280nm下監(jiān)測，從色譜分離結(jié)果可知，人IgG在空白柱上沒有保留，在親和柱上可保留且在換為B液時重新被洗脫下來，說明鍵合SMZ配基的親和柱與IgG有專一性作用。
5.不同蛋白質(zhì)在親和柱上保留行為將親和色譜柱連接于高效液相色譜儀上，樣品為人血清白蛋白(HAS)、牛血清白蛋白(BSA)、A蛋白(ProteinA)、伴刀豆球蛋白A(ConA)、胰蛋白酶(Trypsin)、抗凝血酶III(AT III)等常見蛋白質(zhì)。流動相A液為50mMPBS(pH5.5)，B液為50mM PBS+250mM鹽(pH5.5)，梯度條件0-10min A液，10-20min B液，20-30minA液；在280nm下監(jiān)測。從色譜分離結(jié)果可知，上述不同類型的蛋白質(zhì)中，只有人IgG顯示了特異性的吸附。
6.不同種屬的IgG在親和柱上保留行為將親和色譜柱連接于高效液相色譜儀上，樣品為羊IgG、鼠IgG以及人IgG。流動相A液為50mMPBS(pH5.5)，B液為50mM PBS+250mM鹽(pH5.5)，梯度條件0-10min A液，10-20min B液，20-30min A液；在280nm下監(jiān)測，從其色譜分離結(jié)果可知，它們與配基SMZ作用強(qiáng)度的順序是鼠IgG＜羊IgG＜人IgG。
7.將親和色譜柱連接于高效液相色譜儀上，樣品為人IgG。流動相為50mM PBS(pH5.5)，以前沿色譜法測定固定化SMZ與人IgG的親和常數(shù)。若以解離常數(shù)Kd表示其親和常數(shù)，則Kd＝3.49×10-6mol/L，此親和常數(shù)值恰恰處于一般親和色譜的最適親和常數(shù)范圍內(nèi)。
8.從人血漿中直接分離純化IgG將親和色譜柱連接于高效液相色譜儀上，流動相為50mMPBS(pH5.5)，樣品為人IgG。血漿樣品不需特別預(yù)處理，于實驗前將冷凍保存的血漿樣品于37℃水浴中解凍，用上樣液稀釋一倍，以0.45μm的濾膜過濾后，取50μl此50％血漿溶液進(jìn)樣，可直接得到人球蛋白。以SDS-PAGE測定，其純度大于91％。
權(quán)利要求
1.一種親和色譜填料，其特征在于所述的親和色譜填料以抗菌消炎藥物磺胺二甲嘧啶SMZ為親和配基，具有如下結(jié)構(gòu) 固相載體 空間臂SMZ配基
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親和色譜填料，其特征在于所述的親和色譜填料，在pH5.0～pH6.0時可以與丙種抗體球蛋白產(chǎn)生專一性的分子識別相互作用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親和色譜填料，其特征在于所述的親和色譜填料，在pH5.0～pH6.0時與丙種抗體球蛋白產(chǎn)生專一性的分子識別相互作用，但不與人血清白蛋白HAS、牛血清白蛋白BSA、A蛋白ProteinA、伴刀豆球蛋白AConA、胰蛋白酶Trypsin、抗凝血酶IIIATIII等常見蛋白質(zhì)產(chǎn)生專一性的分子識別相互作用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親和色譜填料，其特征在于所述的親和色譜填料上固定化的磺胺二甲嘧啶與人丙種抗體球蛋白具有強(qiáng)的相互作用力，若以解離常數(shù)表示，其解離常數(shù)可達(dá)3×10-6mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親和色譜填料，其特征在于所述的親和色譜填料的固相載體為多孔或無孔的球形、無定型、薄膜或纖維狀的硅膠、可控孔徑玻璃、氧化物陶瓷、合成高分子材料或天然高分子材料，。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的親和色譜填料，其特征在于所述的氧化物陶瓷為氧化鋁、氧化鋯或氧化鈦為基質(zhì)的陶瓷。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的親和色譜填料，其特征在于所述的合成高分子材料為聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸乙二醇酯、聚丙烯腈、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或聚酰胺材料或它們的復(fù)合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的親和色譜填料，其特征在于所述的天然高分子材料為瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、殼聚糖、纖維素材料或它們的復(fù)合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親和色譜填料的制備方法，其特征在于使用多孔或無孔聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯、聚甲基丙烯酸乙二醇酯或以瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、殼聚糖或纖維素材料為基質(zhì)的固體材料為固相載體的親和色譜填料的制備方法，按下列合成步驟進(jìn)行(1)接活化的空間臂取一份多孔或無孔聚甲基丙烯酸環(huán)氧丙酯微球，其直徑2～200微米，若為多孔微球，其孔徑應(yīng)大于20納米。加入0.1～10份0.01～1.0mol/L的NaOH，0.1～10份雙官能團(tuán)化合物，如乙二醇二縮水甘油醚或丁二醇二縮水甘油醚，再加入0.001～0.1份硼氫化鈉，在振蕩器或在攪拌下，于10℃～90℃反應(yīng)2～72小時，產(chǎn)物抽吸過濾并以蒸餾水洗凈備用。(2)偶聯(lián)配基取一份上述產(chǎn)物，置于含0.1～10份磺胺二甲嘧啶的NaCO3緩沖液(pH10)中，于10℃～90℃下振蕩或攪拌反應(yīng)2～72h。反應(yīng)物過濾，以大量水沖洗，抽吸過濾，于30～70℃下真空干燥。(3)封閉殘余活性基團(tuán)取一份上述產(chǎn)物，加入5～30份1M的pH8.5的Tris-HCl緩沖液，10℃～90℃下振蕩或攪拌反應(yīng)1.0～10h，過濾，用大量水沖洗，最后用甲醇洗滌2次，，于30～70℃下真空干燥至干，得到以SMZ為配基的親和色譜填料。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的親和色譜填料的用途，其特征在于所述的親和色譜填料用于從血漿發(fā)酵液、組織勻漿液或其它含有丙種抗體球蛋白的物質(zhì)體系中專一性地將其中的丙種抗體球蛋白分離出來。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用磺胺二甲嘧啶(SMZ)為配基的親和色譜填料，可用于專一性地分離抗體球蛋白(IgG)。SMZ為一種廣泛應(yīng)用的抗菌消炎藥物，利用其分子上的氨基，可將其鍵合至各種載體上，制備出親和色譜填料。該填料用于從血漿、發(fā)酵液、組織勻漿液或其它含有丙種抗體球蛋白的物質(zhì)體系中專一性地將其中的丙種抗體球蛋白分離出來。其純度可達(dá)91％以上。固定化的SMZ與人IgG的相互作用解離常數(shù)可達(dá)3×10
文檔編號B01D15/08GK1548224SQ0313783
公開日2004年11月24日 申請日期2003年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月21日
發(fā)明者劉國詮, 劉陽, 趙睿 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所