專利名稱：薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主題名稱為″薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱″。它在生化研究、基因工程技術(shù)中，可用作酶、蛋白質(zhì)，核酸等生物大分子分離提純的核心裝備。學(xué)術(shù)上應(yīng)屬于色譜分析技術(shù)領(lǐng)域的分離材料或分離工具范疇。
二
背景技術(shù)：
層析柱作為色譜技術(shù)家族的最重要成員，具備該家族共有的三項(xiàng)標(biāo)志分離有效物質(zhì)的場(chǎng)所---固定相和在固定相里運(yùn)動(dòng)的液體或氣體---流動(dòng)相，以及后者必須能平穩(wěn)的攜帶著被分離的有效物質(zhì)并使其在固定相里經(jīng)過千百次的固，液相反復(fù)分配過程，最終達(dá)到分離純化目的。
沒有色譜分離技術(shù)就不會(huì)有今日的生命科學(xué)；分離材料科技一直在其母學(xué)科---生命科學(xué)的帶領(lǐng)下飛速發(fā)展。所有的色譜材料的開發(fā)和應(yīng)用技術(shù)的改進(jìn)，都集中在固定相和流動(dòng)相質(zhì)材品質(zhì)改良和兩者間相互最佳匹配狀態(tài)選擇上。理想狀態(tài)的層析柱按數(shù)學(xué)公式推導(dǎo)的要求，須要操作者把將近二十項(xiàng)相互關(guān)聯(lián)的變量參數(shù)調(diào)整到最佳協(xié)同狀態(tài)。與數(shù)學(xué)模型完全吻合的柱層析技術(shù)是可接近而不可企及的。它像所有科學(xué)技術(shù)一樣，將永遠(yuǎn)向勤奮的科學(xué)家開放一方可開墾的處女地。層析柱作為一類重要的研究和生產(chǎn)工具，緊密伴隨生命科學(xué)蓬勃發(fā)展的要求而不斷更新?lián)Q代?，F(xiàn)代生命科學(xué)發(fā)展要求分離材料技術(shù)不斷創(chuàng)新，令諸多分離材料專門家折腰。
本專利發(fā)明《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》(簡稱片層柱)即是在這樣大技術(shù)背景下補(bǔ)缺而生。它的設(shè)計(jì)思想和實(shí)物結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)理念有很大差異。
近些年來，市場(chǎng)上有多種予裝柱供應(yīng)，性能堪佳，使用方便；缺憾之處是回收再生依然費(fèi)時(shí)費(fèi)工，比起散裝柱并無改觀。究其根源，這似乎與設(shè)計(jì)者腦子里一直存在的″要求有一個(gè)臻于完美的固定相和一個(gè)幾乎不受干擾的流動(dòng)相″理念不無關(guān)系。
中國專利92111328.5《工業(yè)生產(chǎn)用固定化陰(陽)離子交換纖維素柱》是本文作者早年工作。實(shí)施過程中發(fā)現(xiàn)有明顯缺陷，盡管采取多種措施，柱體間參數(shù)離散性大的弊病仍是長期困擾人心的難題。長期摸索過后，意識(shí)到一味追求柱芯的細(xì)密，均勻和連續(xù)性來保證能有一個(gè)″幾乎不受干擾的流動(dòng)相″可能不是最佳的選擇?；蛟S徹底打破這種″細(xì)密，均勻，連續(xù)性″傳統(tǒng)格局，采取″于最紛亂之中求均勻，最斷續(xù)中求連續(xù)″的做法可能是另一個(gè)出口。這種設(shè)想指導(dǎo)下的具體實(shí)踐是改革傳統(tǒng)的柱芯結(jié)構(gòu)，沿柱芯縱軸方向垂直對(duì)柱芯做結(jié)構(gòu)上的等份分割，分割間距為1或數(shù)毫米。使這種柱芯由數(shù)百乃至上千層毫米級(jí)厚度的薄片疊加而成。
這就要對(duì)柱體內(nèi)流動(dòng)相的流體力學(xué)特性作出新的解釋在此新的分離系統(tǒng)中，流動(dòng)相除受重力或泵壓的驅(qū)動(dòng)之外，還隨時(shí)受到沿途各薄層片內(nèi)部毛細(xì)效應(yīng)的浸潤和片層間隙的阻滯。由于每片薄層都與柱芯的中心線垂直，使這種浸潤和阻滯效應(yīng)可隨時(shí)隨地對(duì)流動(dòng)相的擴(kuò)散起到矯正和限制作用。這樣，流動(dòng)相就可以攜帶著被分離溶質(zhì)沿經(jīng)向以狹窄的區(qū)帶循序漸進(jìn)。狹窄的區(qū)帶意味著良好的分離效果。
疊層柱柱體以模塊為單位任意拆裝、重組會(huì)帶來獨(dú)到的應(yīng)用特點(diǎn)。另外，通過特制的清洗片可實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)柱芯從內(nèi)部進(jìn)行同步分段回收和再生。
數(shù)年實(shí)驗(yàn)下來，實(shí)踐證明了上述構(gòu)想不謬。有今日中國發(fā)明專利《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》的申報(bào)。
三

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的核心是改革傳統(tǒng)柱芯的固定相，使它由均一的連續(xù)結(jié)構(gòu)改為疏密相間、層層疊加的片層。要點(diǎn)如下1)從結(jié)構(gòu)上看，保持柱芯橫切面方向的物質(zhì)分布盡可能均勻，細(xì)密和連續(xù)性。沿縱軸方向?qū)χ咀鼋Y(jié)構(gòu)上垂直的等份分割，分割間距為1或數(shù)毫米。由此制成的″薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱″是一種新的固定床色譜柱，它的柱芯是由數(shù)百乃至上千層毫米級(jí)厚度的薄片疊加而成。2)這一種有勃于傳統(tǒng)的色譜柱芯柱芯，裝填物質(zhì)沿徑向是非均一的，不連續(xù)的固定相。柱體橫向剖面裝填物質(zhì)保持傳統(tǒng)理論所強(qiáng)調(diào)的細(xì)致，均一和連續(xù)性；但縱向剖面在物質(zhì)占位上是疏密相間和有規(guī)律的循環(huán)重復(fù)。3)柱身的基本構(gòu)件是模包組件，它是由若干層上述柱芯薄片疊加后，固定在塑料或有機(jī)玻璃預(yù)制的封套里。若干模包組件再疊加，機(jī)械固定組成完整的《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》。4)整個(gè)柱體可以以模包為單位隨意拆散和組裝，同等尺寸規(guī)格的模包組件可任意替換和重組。5)專用的可插入式清洗模片可多位點(diǎn)的從橫向切入待回收柱芯內(nèi)，使得片層柱被分割為若干柱節(jié)。清洗模片在垂直柱芯的軸向設(shè)有隔膜，同時(shí)可以從橫向往上，下方向輸入或輸出液體的預(yù)制件。清洗劑由清洗片導(dǎo)入柱芯，從內(nèi)部同時(shí)進(jìn)行清洗回收。既省時(shí)又省工，從而可獲得最大限度的利用效率。6)組成柱芯的片層材料由環(huán)氧樹脂，丙稀酸樹脂，硅橡膠等共聚物與陰(陽)離子交換材料膠合，固化成型。7)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》可以勝任兩種常規(guī)裝填柱不可能具備的工作方式A足夠長度的片層柱，充分展層后，將整個(gè)柱芯視為一個(gè)″部分收集器″找出攜帶欲分離物質(zhì)集中的模包單獨(dú)回收。
B多根柱床平行操作，按上法收集分離物質(zhì)集中的模包重新組裝成柱，集中回收或進(jìn)一步分離純化。
四說明書


(圖1)300*1毫米*30毫米陰離子交換纖維素片層柱。PH7.5，磷酸緩沖液，0---500毫摩氯化鈉直線梯度，雞卵清分離圖譜。該柱可將雞卵清分離為三個(gè)獨(dú)立的蛋白峰。
(圖2)300*1毫米*30毫米陰離子交換纖維素疊層柱。PH7.5，磷酸緩沖液，500毫摩氯化鈉對(duì)卵清蛋白洗脫圖譜。
(圖3)300*1毫米*30毫米陰離子交換纖維素疊層柱。PH7.5，磷酸緩沖液300毫摩爾氯化鈉分離雞卵清蛋白圖譜。
(圖4)300*1毫米*30毫米陰離子交換纖維素疊層柱。PH7.5，磷酸緩沖液，蚯蚓抽提液分離圖譜峰1為流出雜蛋白，峰2為0-300毫摩爾氯化鈉線性洗脫圖譜?？梢钥闯鼍€性洗脫不能對(duì)蚯蚓漿組分進(jìn)行有效分離，只是顯4有4-5個(gè)組分混合在一起。
(圖5)300*1毫米*30毫米陰離子交換纖維素疊層柱。PH7.5，磷酸緩沖液，蚯蚓抽提液分離圖譜峰1為流出雜蛋白，-------為予設(shè)的洗脫液離子強(qiáng)度變化曲線，依次遞增的氯化鈉濃度為50、90、130、140、200、250、300、350、410毫摩爾，在每個(gè)濃度間隔里插入一個(gè)柱體積的5毫摩爾氯化鈉作為過度。
從圖中可以看出(圖4)里的峰2在(圖5)條件下被分解為8個(gè)獨(dú)立的蛋白峰。
(圖6)實(shí)驗(yàn)用《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》(A2工作柱 B2加裝清洗片的回收柱)①進(jìn)料管 ②緊固螺栓 ③模包組件 ④清洗片 ⑤封頭 ⑥出料管(圖7)生產(chǎn)用《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》(A1工作柱 B1加裝清洗片的回收柱)①緊固螺杠 ②把手 ③壓板 ④清洗片 ⑤模包組件 ⑥封頭 ⑦基座 ⑧龍門架五
具體實(shí)施例方式(一)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》的制作方法。
陰離子交換柱芯芯料配方1二乙氨基乙基離子交換纖維素 55.25％2環(huán)氧樹脂 7％3丙稀酸甲脂 8.5％4偶氮2異庚氰0.3％5硅橡膠予聚體 3.5％6鄰苯2甲酸2甲脂 1％7去離子水 4％8氯化鈉 21％芯料制備；按配方要求將物料2，3，4，6依次投入反應(yīng)釜中，升溫至75攝氏度，保溫90分鐘，待物料黏度變稠至可扯起絲時(shí)立即降溫至15攝氏度以下，使反應(yīng)暫時(shí)停止。將物料5，8依序加進(jìn)上述反應(yīng)釜中，攪拌均勻。物料1與7預(yù)先拌勻后一并加進(jìn)反應(yīng)釜。始終保持釜內(nèi)15攝氏度，直至全部物料被下步工序用完。
軋輥間隙1毫米，將反應(yīng)釜中物料扎制成薄板，隨即切割成規(guī)定尺寸的圓片。
105攝氏度固化12小時(shí)后，冷卻到室溫，包裝備用。模包組件裝配模包組件的外皮是塑料預(yù)制件，將上述的柱芯薄片疊層安裝在中心孔中，膠料粘接即成。整柱的裝配模包組件疊加，配上，下封頭，(或清洗片)螺栓緊固。
(二)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》實(shí)用舉例1---流動(dòng)相的抗干擾性能。
對(duì)片層柱而言，最嚴(yán)重的隱患莫過于因柱芯被切割和片層疊加給流動(dòng)相可能造成的層層″渦流″。沿途存在渦流必然使行進(jìn)中的流動(dòng)相倍受攪擾，如果是這種情況，樣品分離工作將無法進(jìn)行。如果疊層層析柱抗逆性能強(qiáng)，可避免出現(xiàn)上述不良情況。
如下做法可考驗(yàn)疊層層析柱抗逆性能。
一種慣常的生化現(xiàn)象是成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品，單憑一根層析柱很難獲得單純分離產(chǎn)物。每個(gè)洗脫峰里包含的只能是一組電性相近的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)會(huì)隨洗脫液離子強(qiáng)度改變而發(fā)生組分遷移現(xiàn)象。組分遷移意味樣品在流動(dòng)相里進(jìn)行了重新分配。介質(zhì)顆粒阻滯會(huì)造成流動(dòng)相形成“渦流”，被擾動(dòng)的流動(dòng)相將會(huì)使這一分配過程變得亂無章法。
依據(jù)上述原理，比較疊層柱對(duì)雞卵清蛋白的三次分離實(shí)踐過程，從分離圖譜的分辨率、主峰區(qū)帶寬度、實(shí)驗(yàn)塔板數(shù)就可判斷柱芯內(nèi)形成“渦流”對(duì)流動(dòng)相的干擾情況。
(圖1)、(圖2)、(圖3)為三次分離卵清蛋白實(shí)踐過程的紫外監(jiān)測(cè)儀記錄圖譜，分離條件見各圖的文字說明。
結(jié)果見下表(圖1)，(圖2)，(圖3)各圖譜相關(guān)分離參數(shù)變化對(duì)照表

從上表可以看出1)洗脫條件不同，分辨率無明顯劣化改變。各洗脫峰的位置，寬度變化不大。主峰的高度有明顯差異，存在主峰間塔板數(shù)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。這意味著樣品在流動(dòng)相里進(jìn)行了重新分配。2)每組實(shí)驗(yàn)圖譜的主峰都仍保持了很高的實(shí)驗(yàn)塔板數(shù)?？梢钥闯?，由于離子強(qiáng)度等實(shí)驗(yàn)條件的影響，在各組實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相內(nèi)，被分離組分濃度變化很大；盡管流動(dòng)相內(nèi)部各組分間存在明顯的交叉混合，但都保持著一個(gè)十分銳利的主峰；以上現(xiàn)象意味著在柱芯已經(jīng)被分割為300片*1毫米/片的不連續(xù)的固定相里，流動(dòng)相并不因此被擾動(dòng)。這樣就驗(yàn)證了“利用片層內(nèi)部的毛細(xì)浸潤和片層間隙的阻滯作用，持續(xù)不斷的抑制和矯正頑固的區(qū)帶擴(kuò)散傾向”″于最紛亂之中求均勻，最斷續(xù)中求連續(xù)″的總體設(shè)想的合理性。這些實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》而言″渦流″現(xiàn)象不足為患。(三)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》實(shí)用舉例2----解析能力。
對(duì)一組線性梯度不能分開的混合蛋白質(zhì)(見圖4，峰2)，按照予先設(shè)定的洗脫液離子強(qiáng)度變化曲線進(jìn)行階段洗脫。可操作性良好的層析柱應(yīng)對(duì)原本難以分離的復(fù)雜樣品有令人滿意的進(jìn)一步解析能力。(圖4)，(圖5)為實(shí)際操作過程的紫外檢測(cè)圖譜，工作條件見各圖說明。對(duì)照(圖4)，(圖5)可以看出兩圖的峰1是未被吸附的蛋白峰，在兩次實(shí)驗(yàn)中保持著相同的形狀和位置。而(圖4)里的峰2是一組線性梯度不能分開的混合蛋白質(zhì)。但在(圖5)的實(shí)驗(yàn)條件下，這組蛋白質(zhì)已被分割成8個(gè)互相獨(dú)立的蛋白峰。顯示了″薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱″的解析能力良好。(四)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》實(shí)用舉例3----再生效率。
使用后的層析柱必須回收、再生才能再次使用，尤其是工業(yè)生產(chǎn)用柱，幾乎一半的工時(shí)都耗費(fèi)在回收車間里。片層柱有獨(dú)特的清洗和回收方法，清洗模片可多位點(diǎn)的從橫向切入待回收柱芯內(nèi)，使得片層柱被分割為若干柱節(jié)。清洗劑由清洗片導(dǎo)入柱芯，從內(nèi)部同時(shí)進(jìn)行清洗回收。
利用專用的清洗片對(duì)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》進(jìn)行回收再生處理。從下邊的耗時(shí)統(tǒng)計(jì)表里可以看到，不加裝清洗片時(shí)，回收時(shí)間沒有改進(jìn)。一旦加裝了清洗片后，回收再生所消耗的時(shí)間就大大縮短。它的再生效率比傳統(tǒng)的填充柱可提高數(shù)倍，實(shí)際效果與當(dāng)時(shí)使用清洗片的數(shù)量成正比。
不同條件下回收、清洗層析柱的耗時(shí)統(tǒng)計(jì)表(小時(shí))

從上表可看出由于清洗劑由清洗片導(dǎo)入柱芯，從內(nèi)部同時(shí)進(jìn)行清洗回收，使回收時(shí)間縮短了4---8倍。使用的清洗片越多越節(jié)省時(shí)間。
由此看來，《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》用于工業(yè)生產(chǎn)可節(jié)省很多時(shí)間。
權(quán)利要求
1)本發(fā)明《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》的核心在于改革傳統(tǒng)層析柱的柱芯結(jié)構(gòu)。徹底打破了那種旨在保持“細(xì)密，均勻，連續(xù)性”固定相的傳統(tǒng)設(shè)計(jì)格局。創(chuàng)造出一種新理念的實(shí)驗(yàn)或工業(yè)生產(chǎn)用柱。其特征是對(duì)柱芯沿橫斷面最大限度的進(jìn)行機(jī)械性等份分割，把柱芯制作成薄層疊加，疏密相間的結(jié)構(gòu)。分割間距為1或數(shù)毫米。使這種柱芯由數(shù)百乃至上千層毫米級(jí)厚度的薄片疊加而成。
2)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》柱身的基本構(gòu)件為模包組件，該模包組件是由若干層上述柱芯薄片疊加后，固定在塑料或有機(jī)玻璃預(yù)制的封套里。若干模包組件再疊加，機(jī)械固定組成完整的柱體。
3)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》整個(gè)柱體可以以模包為單位隨意拆散和組裝。同等尺寸規(guī)格的模包組件可任意替換和重組。
4)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》，借助可插入式清洗模片使片層柱再生。清洗模片的垂直柱芯的軸向設(shè)有隔膜和輸液管道。清洗劑由清洗片導(dǎo)入柱芯，同時(shí)可以從橫向往上，下方向輸入或輸出液體，構(gòu)成片層柱獨(dú)特的清洗和回收方法。其特點(diǎn)是清洗模片可多位點(diǎn)的從橫向切入待回收柱芯內(nèi)，使得片層柱被分割為若干柱節(jié)。清洗劑由清洗片導(dǎo)入柱芯，從內(nèi)部對(duì)各柱節(jié)同時(shí)進(jìn)行清洗回收。省工省時(shí)，插入的清洗片越多越省回收時(shí)間。
5)《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》可以勝任的兩種常規(guī)裝填柱不可能具備的工作方式A足夠長度的片層柱，充分展層后，將整個(gè)柱芯視為一個(gè)″部分收集器″找到并抽出攜帶欲分離物質(zhì)集中的模包單獨(dú)回收。B多根柱床平行操作，按上法收集分離物質(zhì)集中的模包重新組裝成柱，集中回收或進(jìn)一步分離純化。
6)組成柱芯的片層材料的化學(xué)原料組成。由環(huán)氧樹脂，丙稀酸樹脂，硅橡膠予聚物為固化成型原料。凡不與這些原料在本專利說明書限定條件下起化學(xué)反應(yīng)的分離介質(zhì)如離子交換樹脂，離子交換纖維素，分子篩及各種生化親和試劑均可依本專利闡明的原理和工藝制作出各種薄層疊加式層析柱。
7)適合工業(yè)生產(chǎn)的大型《薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱》借助螺栓和龍門架式的機(jī)械裝置固定。其特點(diǎn)是拆卸方便，清洗回收節(jié)省工時(shí)，比傳統(tǒng)柱利用率高。
全文摘要
本發(fā)明主題名稱為“薄層疊加式固定化陰(陽)離子交換層析柱”，可在生物工程技術(shù)中用作酶、蛋白質(zhì)等生物大分子分離、提純的核心裝備。它的特征是柱芯是由數(shù)百乃至上千層毫米級(jí)厚度的薄片疊加而成。柱體橫剖面裝填物質(zhì)在占位上保持傳統(tǒng)理論所強(qiáng)調(diào)的細(xì)致、均一和連續(xù)性；但從縱剖面看卻是層層重疊、疏密相間、循環(huán)重復(fù)的分離介質(zhì)。獨(dú)特的柱體結(jié)構(gòu)使柱體沿橫斷面可任意拆裝，重新組合；有著比傳統(tǒng)層析柱更多的可變通性。專用的可插入式清洗模片，可多位點(diǎn)的從橫向切入待回收柱芯內(nèi)，使片層柱被分割為若干柱節(jié)；清洗劑由清洗片導(dǎo)入柱芯，可從內(nèi)部同時(shí)對(duì)各柱節(jié)進(jìn)行清洗回收，既省時(shí)又省工，可使層析柱獲得最大限度的利用效率。
文檔編號(hào)B01D15/08GK1481919SQ03149949
公開日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2003年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月31日
發(fā)明者倪寶謙 申請(qǐng)人:倪寶謙