專利名稱：核酸的濃縮精制方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及進(jìn)行檢體前處理的裝置。更詳細(xì)地說(shuō)是涉及在核酸檢查中，用于通過(guò)菌體等將成為檢查對(duì)象的核酸取出的前處理裝置。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，人類基因組的解讀取得發(fā)展，各種生命現(xiàn)象與基因之間的關(guān)聯(lián)也日漸明朗。而且，由此成果，醫(yī)學(xué)和醫(yī)療將視野從病態(tài)擴(kuò)展到病因、從治療擴(kuò)展到預(yù)防。這里，基因檢查技術(shù)成為重要的基礎(chǔ)。
基因檢查可進(jìn)行培養(yǎng)困難的病原微生物的鑒定檢查、抗生素治療中和感染初期的病原微生物的檢測(cè)、疑為轉(zhuǎn)移抗體時(shí)的抗原檢測(cè)、病原微生物的傳染源調(diào)查、親子鑒定等個(gè)體鑒別、以及白血病和實(shí)體瘤的基因水平的病型診斷、遺傳病的確診等以往在臨床檢查上困難的檢查。并且，直至獲得結(jié)果的時(shí)間短于使用菌的培養(yǎng)的方法，在培養(yǎng)花費(fèi)時(shí)間的細(xì)菌的檢測(cè)中發(fā)揮威力。而且，由于DNA隨保存條件而穩(wěn)定，因此也能夠從冷凍活組織檢查材料、骨等過(guò)去的檢體中進(jìn)行檢查。
另外，在近年有增加傾向的性傳染病的檢查中，為了謀求擴(kuò)大檢查機(jī)會(huì)，基因檢查引起人們的注意。
作為以往的核酸的精制濃縮方法，已知的有使用了苯酚/氯仿/乙醇的精制方法、使用了吸附核酸的柱/過(guò)濾器的精制方法、使用了磁性二氧化硅微珠的精制方法等。
作為從平板狀的電泳凝膠中回收核酸的方法，已知的有在制成的凝膠中電泳核酸，將回收裝置移動(dòng)至凝膠中目標(biāo)核酸的位置，進(jìn)一步通過(guò)電泳回收目標(biāo)核酸的方法(例如參照專利文獻(xiàn)1)。
另外已知有在平板狀的電泳凝膠中，將核酸進(jìn)行電泳而分離目標(biāo)核酸，在目標(biāo)核酸的條帶附近插入回收芯片從而將核酸回收的方法(例如參照專利文獻(xiàn)2)。
但是，在以往核酸的精制濃縮方法中，使用了苯酚/氯仿/乙醇的精制方法由于使用劇毒藥品，因此需要尖端的化學(xué)設(shè)備，利用環(huán)境受到限制。而且，操作上很費(fèi)工夫，同時(shí)需要高速離心，自動(dòng)化困難。并且，難以得到高的精制精度。
使用了吸附核酸的柱/過(guò)濾器的精制方法由于在流通溶液的同時(shí)來(lái)進(jìn)行，因此雜質(zhì)等混入量多的樣品容易引起柱/過(guò)濾器的堵塞，精制效率有可能降低。而且，必須進(jìn)行離心或抽吸操作，因此難以自動(dòng)化。
使用了磁性二氧化硅微珠的精制方法中，當(dāng)通過(guò)磁鐵進(jìn)行的微珠回收失敗時(shí)、或二氧化硅微珠從磁性體上脫落時(shí)，二氧化硅有可能混入至樣品中。而且難以得到高的回收率。
而且，在從平板狀的電泳凝膠中回收核酸的以往技術(shù)中，必需平板狀的電泳凝膠，同時(shí)必須在此平板狀電泳凝膠中一端進(jìn)行電泳、將目標(biāo)核酸相應(yīng)位置的凝膠進(jìn)行處理。
用于電泳中的凝膠不耐沖擊，隨著生成過(guò)程的不同，有時(shí)特性有很大不同。因此，通常在進(jìn)行了電泳之后，利用紫外線將電泳凝膠中目標(biāo)核酸的位置進(jìn)行識(shí)別，之后處理目標(biāo)核酸含量多的部分。
因此，在基因檢查等中利用此方法時(shí)，一次檢查所需要的時(shí)間延長(zhǎng)。另外，用于電泳的凝膠大且凝膠的不均導(dǎo)致核酸的條帶中產(chǎn)生污點(diǎn)，由此有可能核酸的回收率降低。而且，凝膠大的時(shí)候，電泳所必需的電力也變大。
專利文獻(xiàn)1日本實(shí)開(kāi)平5-88296號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2；日本特開(kāi)平8-327595號(hào)公報(bào)發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的問(wèn)題為，在核酸的精制濃縮方法中，需要復(fù)雜且尖端的化學(xué)設(shè)備。
為了解決上述課題進(jìn)行了各種試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使表面活性劑吸附檢體中存在的雜質(zhì)，使其顯示出與核酸不同的行為，由此使雜質(zhì)與核酸分離。
而且，利用陽(yáng)離子表面活性劑和非離子表面活性劑使核酸以外的雜質(zhì)帶電，并置于電場(chǎng)中，由此從含有雜質(zhì)的檢體中分離精制核酸，成為核酸的濃縮狀態(tài)或易于濃縮的狀態(tài)。
圖1為表示在表面活性劑存在下利用電泳的核酸濃縮構(gòu)成的示意圖。
檢體中含有核酸1和雜質(zhì)2。在此檢體中混合表面活性劑。作為表面活性劑，使用非離子表面活性劑3和陽(yáng)離子表面活性劑4。
混合于檢體中的表面活性劑吸附雜質(zhì)2。可通過(guò)非離子性表面活性劑進(jìn)行帶電量的調(diào)節(jié)，也可通過(guò)添加氯化鈉等鹽類、聚陰離子性物質(zhì)(肝素、葡聚糖硫酸、DNA)來(lái)調(diào)節(jié)核酸與陽(yáng)離子表面活性劑的吸附。
陽(yáng)離子表面活性劑4所吸附的雜質(zhì)2帶上正電荷。然后，可以利用電泳將表面活性劑所吸附的雜質(zhì)2與表面活性劑未吸附的或者吸附量少的核酸1分離。由此，能夠容易地將雜質(zhì)2從檢體中除去，可將核酸1濃縮。
接著，對(duì)核酸濃縮的方法進(jìn)行說(shuō)明。
此核酸濃縮的方法中，通過(guò)進(jìn)行2次電泳來(lái)確實(shí)地進(jìn)行核酸的濃縮。在第一電泳中將檢體中多余的離子除去，在第二電泳中進(jìn)行檢體中的核酸濃縮。
作為添加于含有核酸的檢體中的非離子表面活性劑，可使用例如聚環(huán)氧乙烷對(duì)叔辛基苯基醚(Triton類表面活性劑等)、聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇酐烷基酯(Tween類表面活性劑等)、聚環(huán)氧乙烷烷基醚(Brij類表面活性劑等)等非離子性表面活性劑，具體地說(shuō)可舉出例如TritonX-100、Tween-20、Brij35等。優(yōu)選1％的TritonX-100。由于該表面活性劑的添加而細(xì)胞膜、核膜不被溶解時(shí)，加入非離子表面活性劑后在96℃下進(jìn)行10分鐘的加熱處理。
作為檢體中的陽(yáng)離子表面活性劑，可列舉出zephiramine、十六烷基三甲基氯化銨、十六烷基吡啶鎓甲基氯化銨、癸基吡啶鎓氯化物(DPC)，優(yōu)選加入100μL0.2％DPC。
也可在檢體中同時(shí)加入非離子表面活性劑和陽(yáng)離子表面活性劑后，進(jìn)行加熱處理。
為了在檢體中加入表面活性劑進(jìn)行前處理，即便核酸在大腸桿菌等原核細(xì)胞中存在，由于細(xì)胞壁被表面活性劑破壞，因此也能夠?qū)⒋竽c桿菌的培養(yǎng)液等作為檢體使用，也能夠容易地進(jìn)行檢體前處理的操作。
如此進(jìn)行檢體的前處理，施加100V的直流電壓，進(jìn)行10分鐘電泳，除去檢體中多余的離子。
其后，施加125～150V的直流電壓，進(jìn)行120分鐘電泳，在正極側(cè)獲取核酸。
對(duì)進(jìn)行檢體電泳的電泳槽的構(gòu)成進(jìn)行說(shuō)明。
首先，對(duì)第一電泳進(jìn)行說(shuō)明。
圖2所示為第一電泳的泳動(dòng)槽構(gòu)成。
在電泳槽5中設(shè)有樣品槽6、將正極側(cè)和負(fù)極側(cè)分開(kāi)的隔壁9。樣品槽6的構(gòu)成為，與隔壁9相貫通，一端向正極側(cè)突出、另一端向負(fù)極側(cè)突出。樣品槽6的兩端開(kāi)口，兩端的開(kāi)口部分別用凝膠8和8封閉。這樣，在樣品槽6內(nèi)產(chǎn)生電位差，進(jìn)行核酸和表面活性劑所吸附的雜質(zhì)的電泳。
在檢體中添加非離子表面活性劑和陽(yáng)離子表面活性劑，進(jìn)行加熱處理后，將檢體注入至樣品槽6。
然后，在電極間施加100V的電壓，進(jìn)行10分鐘的電泳。
由此，除去檢體中所含的多余離子。
在將檢體中所含的多余離子除去后，通過(guò)第二電泳進(jìn)行核酸的濃縮。
對(duì)第二電泳進(jìn)行說(shuō)明。
在第二電泳中，將在于第一電泳中注入有檢體的樣品槽中連接有核酸回收槽的部分配置在電泳槽內(nèi)，進(jìn)行電泳。
圖3所示為第二電泳的泳動(dòng)槽構(gòu)成。
在電泳槽5中設(shè)有樣品槽6、回收槽7、將正極側(cè)和負(fù)極側(cè)分開(kāi)的隔壁9。樣品槽6插入在隔壁9中，向負(fù)極側(cè)突出?；厥詹?插入在隔壁9中，向正極側(cè)突出。樣品槽6和回收槽7在隔壁9的配設(shè)部連接，介由凝膠8連接在一起。
樣品槽6的兩端開(kāi)口，兩端的開(kāi)口部分別用凝膠8和8封閉。回收槽7的兩端開(kāi)口，負(fù)極側(cè)由凝膠8封閉，正極側(cè)由超濾膜11封閉。
在如此構(gòu)成的電泳槽中，在電極間施加120V的電壓，進(jìn)行120分鐘的電泳。
這樣，通過(guò)在電泳槽中進(jìn)行第二電泳，能夠?qū)⒊ザ嘤嚯x子的檢體進(jìn)行電泳，可以在回收槽7中有效地將核酸回收。另外，在回收槽7的正極側(cè)上設(shè)有超濾膜11，核酸不會(huì)從回收槽7中被排出，而是留在回收槽7中。因此，能夠提高核酸的回收效率。
根據(jù)檢體狀態(tài)，也可不進(jìn)行第一電泳，而進(jìn)行第二電泳。通過(guò)在連接于回收槽7的樣品槽6中注入進(jìn)行了前處理的檢體并進(jìn)行電泳，能夠容易地進(jìn)行核酸的濃縮。由于檢體中存在的多余離子可透過(guò)超濾膜，因此不會(huì)影響核酸的回收。
即本發(fā)明的第一發(fā)明為，使用了電泳的核酸的濃縮精制方法，對(duì)含有核酸的試樣中的雜質(zhì)進(jìn)行帶電量的調(diào)節(jié)后，將試樣置于電場(chǎng)中，進(jìn)行核酸的濃縮精制。
第二發(fā)明為，利用電泳進(jìn)行的核酸的濃縮精制方法，在含有核酸的試樣中加入陽(yáng)離子表面活性劑，對(duì)試樣中雜質(zhì)的帶電量進(jìn)行調(diào)節(jié)，將該試樣置于電場(chǎng)中進(jìn)行電泳，由此進(jìn)行核酸的濃縮精制。
第三發(fā)明為，利用電泳進(jìn)行的核酸的濃縮精制方法，在含有核酸的試樣中加入陽(yáng)離子表面活性劑和非離子表面活性劑，對(duì)試樣中雜質(zhì)的帶電量進(jìn)行調(diào)節(jié)，將該試樣置于電場(chǎng)中進(jìn)行電泳，由此進(jìn)行核酸的濃縮精制。
第四發(fā)明為，在通過(guò)陽(yáng)離子表面活性劑的吸附來(lái)對(duì)核酸以外的帶電量進(jìn)行調(diào)節(jié)的同時(shí)，通過(guò)非離子表面活性劑的添加量來(lái)調(diào)節(jié)陽(yáng)離子表面活性劑的吸附量。
第五發(fā)明為，構(gòu)成一種裝置，其為在試樣中添加非離子表面活性劑和陽(yáng)離子表面活性劑，將該試樣進(jìn)行電泳，在陽(yáng)極側(cè)進(jìn)行核酸的濃縮精制的裝置。
第六發(fā)明為，進(jìn)行電泳的核酸的濃縮精制裝置，此裝置的構(gòu)成為，通過(guò)抑制擴(kuò)散的導(dǎo)電性分離體將側(cè)面由絕緣體構(gòu)成的容器內(nèi)隔開(kāi)，在該容器內(nèi)構(gòu)成試樣投入室和核酸回收室，該容器的端部分別經(jīng)由緩沖液槽與電極相連接。
本發(fā)明的第一發(fā)明為使用了電泳的核酸的濃縮精制方法，由于采取對(duì)含有核酸的試樣中的雜質(zhì)進(jìn)行帶電量的調(diào)節(jié)后，將試樣置于電場(chǎng)中進(jìn)行核酸的濃縮精制的方法，因此，能夠使電泳中核酸和雜質(zhì)的行為有所不同，從而有效地將核酸分離。雜質(zhì)和核酸的行為差異可通過(guò)電荷進(jìn)行調(diào)節(jié)，可容易地進(jìn)行行為的控制。
可以不需利用離心分離裝置等就緊湊地構(gòu)成進(jìn)行核酸濃縮的裝置。
第二發(fā)明為利用電泳的核酸的濃縮精制方法，在含有核酸的試樣中加入陽(yáng)離子表面活性劑，對(duì)試樣中雜質(zhì)的帶電量進(jìn)行調(diào)節(jié)，將該試樣置于電場(chǎng)中進(jìn)行電泳，由此可進(jìn)行核酸的濃縮精制，由于使用陽(yáng)離子表面活性劑，因此操作容易，可容易地確保操作安全。
并且，通過(guò)使對(duì)雜質(zhì)的吸附量增大，能夠增大電泳中核酸和雜質(zhì)的行為差別，可有效地分離核酸。而且，由于雜質(zhì)向與核酸相反的方向泳動(dòng)，因此能夠防止雜質(zhì)對(duì)精制的阻礙，可容易地進(jìn)行核酸的精制。
第三發(fā)明為利用電泳進(jìn)行的核酸的濃縮精制方法，由于在含有核酸的試樣中加入陽(yáng)離子表面活性劑和非離子表面活性劑，對(duì)試樣中雜質(zhì)的帶電量進(jìn)行調(diào)節(jié)，將該試樣置于電場(chǎng)中進(jìn)行電泳，由此進(jìn)行核酸的濃縮精制，因此可通過(guò)陽(yáng)離子表面活性劑和非離子表面活性劑的比例來(lái)調(diào)節(jié)陽(yáng)離子表面活性劑的吸附量，可容易地調(diào)節(jié)電泳中的雜質(zhì)的行為。
另外，通過(guò)使非離子表面活性劑吸附核酸，還有可能阻礙陽(yáng)離子表面活性劑對(duì)核酸的吸附。
第四發(fā)明中，由于在通過(guò)陽(yáng)離子表面吸附劑的吸附來(lái)對(duì)核酸以外的帶電量進(jìn)行調(diào)節(jié)的同時(shí)，通過(guò)非離子表面活性劑的添加量來(lái)調(diào)節(jié)陽(yáng)離子表面活性劑的吸附量，因此通過(guò)容易的操作，就可操作陽(yáng)離子表面活性劑和非離子表面活性劑對(duì)雜質(zhì)的吸附比例。而且通過(guò)容易的操作可進(jìn)行雜質(zhì)帶電量的調(diào)節(jié)。另外，通過(guò)使非離子表面活性劑吸附核酸，還有可能阻礙陽(yáng)離子表面活性劑對(duì)核酸的吸附。
第五發(fā)明中，由于構(gòu)成一種裝置，其為在試樣中添加非離子表面活性劑和陽(yáng)離子表面活性劑，將該試樣進(jìn)行電泳，在陽(yáng)極側(cè)進(jìn)行核酸的濃縮精制的裝置，因此通過(guò)簡(jiǎn)單的構(gòu)成，就能精制試樣中的核酸，同時(shí)能夠控制核酸的行為，因此在維持安全性的同時(shí)，可緊湊地構(gòu)成濃縮精制裝置。
第六發(fā)明為進(jìn)行電泳的核酸的濃縮精制裝置，由于此裝置的構(gòu)成為，通過(guò)抑制擴(kuò)散的導(dǎo)電性分離體將側(cè)面由絕緣體構(gòu)成的容器內(nèi)隔開(kāi)，在該容器內(nèi)構(gòu)成試樣投入室和核酸回收室，該容器的端部分別經(jīng)由緩沖液槽與電極相連接，因此通過(guò)簡(jiǎn)單的構(gòu)成就能構(gòu)成濃縮精制裝置，可構(gòu)成在降低制作所需成本的同時(shí)、控制容易且安全性高的裝置。


為表示在表面活性劑存在下利用電泳的核酸濃縮構(gòu)成的示意圖。
為表示第一電泳的泳動(dòng)槽構(gòu)成的圖。
為表示第二電泳的泳動(dòng)槽構(gòu)成的圖。
為表示第一電泳槽的構(gòu)成的圖。
為表示第二電泳槽的構(gòu)成的圖。
為表示取樣單元構(gòu)成的立體圖。
為取樣單元的平面圖。
為取樣單元的側(cè)面圖。
為取樣單元的側(cè)面剖面圖。
為連接部的立體圖。
為連接部的側(cè)面剖面圖。
為過(guò)濾部的側(cè)面剖面圖。
為表示分離單元的組合構(gòu)成的圖。
為回收溶液的UV光譜。
為顯示電泳裝置整體構(gòu)成的圖。
為電泳單元的立體圖。
為電泳單元的側(cè)面剖面圖。
為利用電泳單元的精制過(guò)程前期的示意圖。
為同一精制過(guò)程后期的示意圖。
為表示電泳單元的組裝構(gòu)成的側(cè)面剖面圖。
為表示電泳單元的組裝構(gòu)成的立體圖。
為顯示第1模塊的構(gòu)成的圖。
為顯示第2模塊的構(gòu)成的圖。
為密封件的正面圖。
為顯示淋菌基因組精制的比較結(jié)果的圖。
為將顯示DNA濃縮結(jié)果的樣品進(jìn)行電泳后的凝膠的圖。
符號(hào)說(shuō)明1核酸2雜質(zhì)3非離子表面活性劑4陽(yáng)離子表面活性劑5電泳槽 6樣品槽9隔壁具體實(shí)施方式
通過(guò)使用了表面活性劑和電泳的方法，實(shí)現(xiàn)了構(gòu)成一種不使用危險(xiǎn)藥品、且精制率高的核酸濃縮裝置的目的。
實(shí)施例1接著，對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。
首先，對(duì)用于電泳的電泳槽的構(gòu)成進(jìn)行說(shuō)明。
圖4為顯示第一電泳槽的構(gòu)成的圖。
電泳槽21被隔壁24和25分成負(fù)極側(cè)槽22和正極側(cè)槽23。隔壁24和25設(shè)置于電泳槽21的中央部，在隔壁24和25上裝有取樣單元26。取樣單元26的一端向負(fù)極側(cè)槽22突出，另一端向正極側(cè)槽23突出。在取樣單元26的負(fù)極側(cè)填充有凝膠，在側(cè)面上開(kāi)有樣品注入用的注入孔。注入孔在電泳時(shí)由栓封閉。
然后，在負(fù)極側(cè)槽22插入負(fù)極，在正極側(cè)槽23插入正極，對(duì)電泳槽21施加電壓。
接著，對(duì)電泳槽的另一構(gòu)成例進(jìn)行說(shuō)明。
圖5為顯示第二電泳槽的構(gòu)成的圖。
在第二電泳中，電泳槽21被隔壁24和25分成負(fù)極側(cè)槽22和正極側(cè)槽23。隔壁24和25設(shè)置于電泳槽21的中央部，在隔壁24和25上裝有分離單元32。分離單元32的一端向負(fù)極側(cè)槽22突出，另一端向正極側(cè)槽23突出。在負(fù)極側(cè)槽22插入負(fù)極，在正極側(cè)槽23插入正極，對(duì)電泳槽21施加電壓。
分離單元32連接三個(gè)構(gòu)件而構(gòu)成，由取樣單元26、連接部33和過(guò)濾部34構(gòu)成。在取樣單元26和連接部33之間，以及連接部33和過(guò)濾部34之間裝有O形環(huán)來(lái)確保連接，同時(shí)防止緩沖液的流出。
在取樣單元26的負(fù)極側(cè)填充有凝膠，在連接部33的正極側(cè)也填充有凝膠。而且，在過(guò)濾部34上裝有超濾膜。
使用這種電泳槽進(jìn)行核酸的濃縮。
首先，在第一電泳中，將前處理過(guò)的樣品從注入孔注入，用栓封閉。然后，在電泳槽21上按照取樣單元26的上面稍露出液體的方式設(shè)置取樣單元26。其后，施加100V的直流電壓，進(jìn)行20分鐘的電泳。由此將樣品中的多余離子除去。緩沖液為1×TAE溶液，由40mM Tris、40mM冰醋酸、1mM EDTA制備，pH為8.0。
然后，在第一電泳槽21中將多余離子除去后，將連接部33和過(guò)濾部34連接于取樣單元26。各連接處安裝O形環(huán)防止漏液。
在連接部33中預(yù)先裝入以6∶4的比例混合有100％乙醇和1×TAE的溶液，在取樣單元26內(nèi)預(yù)先裝入TE-1(10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、pH為8.0)。在過(guò)濾部34內(nèi)預(yù)先裝入TE-1。
接著，對(duì)取樣單元26、連接部33、過(guò)濾部34的構(gòu)成進(jìn)行說(shuō)明。
首先說(shuō)明取樣單元26的構(gòu)成。
圖6為顯示取樣單元的構(gòu)成的立體圖，圖7為取樣單元的平面圖，圖8為取樣單元的側(cè)面圖，圖9為取樣單元的側(cè)面剖面圖。
取樣單元26是在容器中保持凝膠的構(gòu)成，是對(duì)Millipore公司生產(chǎn)的Microcon(注冊(cè)商標(biāo))YM-3Microcon離心式過(guò)濾部件進(jìn)行加工利用的單元，拆掉內(nèi)部的超濾膜，在內(nèi)部開(kāi)有直徑為5mm的孔。當(dāng)然，只要可得到同樣效果，并不限定于此。
取樣單元26由筒體41和底座43構(gòu)成。筒體41連接于底座43，設(shè)有用于注入樣品的注入孔42。底座43構(gòu)成為階梯式圓柱狀，在底座43中構(gòu)成有連通于上下面的孔44。
筒體41內(nèi)設(shè)有凝膠48。凝膠48的厚度為數(shù)mm左右，為堵塞筒體41的開(kāi)口部的構(gòu)成。由此，從注入孔42被供給的檢體被供給至凝膠48的內(nèi)側(cè)。
對(duì)連接部33的構(gòu)成進(jìn)行說(shuō)明。
圖10為連接部的立體圖，圖11為連接部的側(cè)面剖面圖。
連接部33也與取樣單元26同樣，是加工利用Millipore公司生產(chǎn)的離心式過(guò)濾部件的部分，拆掉內(nèi)部的超濾膜，在內(nèi)部開(kāi)有直徑為5mm的孔。
連接部33由筒體41和底座43構(gòu)成。筒體41與底座43相連接。底座43構(gòu)成為階梯式圓柱狀，在底座43中構(gòu)成有連通于上下面的孔44。
筒體41內(nèi)設(shè)有厚度為數(shù)mm左右的凝膠48。凝膠48在筒體41中位于底座43的上面，防止與取樣單元26之間的液體流動(dòng)。
對(duì)過(guò)濾部34進(jìn)行說(shuō)明。
圖12為過(guò)濾部的側(cè)面剖面圖。
過(guò)濾部35也是加工利用Millipore公司生產(chǎn)的離心式過(guò)濾部件的部分。
過(guò)濾部35由筒體41和底座43構(gòu)成。筒體41底座43相連接，筒體41的長(zhǎng)度短于取樣單元26和連接部33而構(gòu)成，大約短5mm。底座43構(gòu)成為階梯式圓柱狀，在底座43中構(gòu)成有連通于上下面的孔44。
在筒體41內(nèi)，底座43的上面設(shè)有超濾膜49。由此可防止核酸的流出，進(jìn)行核酸的濃縮。
接著，對(duì)核酸的濃縮操作例進(jìn)行說(shuō)明。
使用大腸桿菌培養(yǎng)液作為檢體。通過(guò)上述第一電泳和第二電泳進(jìn)行核酸的濃縮，利用吸光度測(cè)定對(duì)回收的核酸濃度進(jìn)行研究。
檢體使用100μL的大腸桿菌(Escherichia coli DH5α)培養(yǎng)液。
在檢體中加入100μL 1％Triton(注冊(cè)商標(biāo))X-100溶液，在96℃下加熱處理10分鐘。
其后，加入100μL 0.2％DPC，制備電泳用試樣。
使用0.5×TAE作為電泳用緩沖液。
使用1×TAE溶解瓊脂糖。
1×TAE溶液由40mM Tris、40mM冰醋酸、1mM EDTA制備，pH為8.0。
將筒體41的開(kāi)口側(cè)置于上方靜置連接部33，從筒體41的開(kāi)口側(cè)注入1％瓊脂糖凝膠(SeaKem Gold agaroseTaKaRa)，以使得凝膠厚度達(dá)到3～7mm左右，使凝膠凝固。
將取樣單元26也與連接部33同樣，將筒體41的開(kāi)口側(cè)置于上方靜置，從筒體41的開(kāi)口側(cè)注入1％瓊脂糖凝膠(SeaKem Gold agarose購(gòu)自TaKaRa)，以使得凝膠厚度達(dá)到數(shù)mm左右。然后，在凝膠凝固后，將取樣單元26翻過(guò)來(lái)，將凝固的凝膠流入至筒體41的開(kāi)口側(cè)。
電泳槽使用HU-6(AR BROWN公司生產(chǎn))，電源使用MPSU-200(AR BROWN公司生產(chǎn))。
將制備的電泳用試樣從取樣單元26的注入孔42注入，用栓封閉。
利用油灰將電泳槽分為正極側(cè)和負(fù)極側(cè)，在正極側(cè)和負(fù)極側(cè)中加入0.5xTAE。
然后，在油灰上按照取樣單元26的上面稍露出緩沖液的方式設(shè)置取樣單元26。
其后，施加100V直流電壓，進(jìn)行20分鐘的第一電泳。
接著，在進(jìn)行了第一電泳后的取樣單元26上連接連接部33和過(guò)濾部34，構(gòu)成分離單元，進(jìn)行第二電泳。
說(shuō)明第二電泳的操作例。
在連接部33中加入以6∶4的比例混合有100％乙醇和1×TAE的溶液。
在過(guò)濾部34內(nèi)加入TE-1(10mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、pH為8.0)溶液。
接著將連接部33和過(guò)濾部34連接于取樣單元26，組合分離單元。
圖13為顯示分離單元的組合構(gòu)成的圖。
分離單元為將取樣單元26、連接部33和過(guò)濾部34朝向同一方向組合的單元，在連接部33和過(guò)濾部34之間、以及連接部33和過(guò)濾部34之間分別裝有O形環(huán)51，防止從分離單元的漏液。
利用油灰將電泳槽分為正極側(cè)和負(fù)極側(cè)，在正極側(cè)和負(fù)極側(cè)中加入0.5×TAE。
將組合的分離單元的取樣單元26側(cè)端作為負(fù)極側(cè)，過(guò)濾部34作為正極側(cè)，配置于油灰上。
其后，施加200V直流電壓，進(jìn)行240分鐘的第二電泳。
接著，在過(guò)濾部34中將核酸溶液回收，測(cè)定吸光度，由UV光譜計(jì)算回收的核酸濃度。
圖14為回收溶液的UV光譜。
求得的核酸濃度為32.3ng(6.7×106copies/μL)。
核酸濃度如下計(jì)算，即260nm的吸光度(A260)乘以核酸的性狀固有系數(shù)，再乘以吸光池的光路長(zhǎng)度(mm)，然后除以10。
回收的核酸的純度由UV光譜求出。
求出的核酸純度為1.91。
純度的計(jì)算通過(guò)260nm的吸光度(A260)除以280nm的吸光度(A280)而求得。樣品為純度100％的DNA時(shí)，此值約為1.8；樣品為純度100％的RNA時(shí)，此值為2.0。A280的值反映混入在被測(cè)物中的蛋白質(zhì)、苯酚的量，當(dāng)吸光度比遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1.5時(shí)，可認(rèn)為混入了蛋白質(zhì)等低分子物質(zhì)。
實(shí)施例2接著，對(duì)第2實(shí)施例中的電泳裝置進(jìn)行說(shuō)明。
圖15為顯示電泳裝置的整體構(gòu)成的圖。
電泳裝置50通過(guò)配置于電泳槽50b內(nèi)的電泳單元51來(lái)進(jìn)行檢體中所含核酸的濃縮。電泳槽50b具有緩沖液槽55和56以及冷卻水槽57，在緩沖液槽55和56中裝滿用于電泳的緩沖液，在冷卻水槽57中裝滿用于冷卻電泳單元51的冰水等冷卻水。緩沖液槽55上設(shè)有正極53，緩沖液槽56上設(shè)有負(fù)極54。電泳單元51的端部分別露出至緩沖液槽55和56內(nèi)，將檢體導(dǎo)入至此電泳單元51中，在正極53和負(fù)極54之間施加電壓，由此進(jìn)行檢體中的核酸的濃縮。
緩沖液槽55和56以及冷卻水槽57是通過(guò)隔壁52隔開(kāi)的，隔壁52和電泳槽50b使用具有絕緣性的物質(zhì)，隔壁52可以使用硅酮類填充材或環(huán)氧樹(shù)脂類的油灰。通過(guò)隔壁52，電泳單元51的側(cè)部連接于冷卻水而被冷卻。由此，消除了電泳時(shí)的發(fā)熱，可在穩(wěn)定的溫度環(huán)境下進(jìn)行檢體的精制。
接著，對(duì)電泳單元51進(jìn)行說(shuō)明。
圖16為電泳單元的立體圖，圖17為電泳單元的側(cè)面剖面圖，圖18為利用電泳單元的精制過(guò)程前期的示意圖，圖19為相同精制過(guò)程的后期的示意圖。
電泳單元51主要由丙烯酸樹(shù)脂等絕緣材料構(gòu)成，多個(gè)構(gòu)件由螺栓等固定，作為1個(gè)電泳單元51而構(gòu)成。電泳單元51設(shè)有沿著向內(nèi)部延伸方向的圓柱上的空間51b，按照與此空間51b的延伸方向垂直的方式設(shè)置了2個(gè)孔。1個(gè)為用于將檢體導(dǎo)入至空間51b內(nèi)的導(dǎo)入孔67，另一個(gè)為用于采集經(jīng)空間51b濃縮過(guò)的檢體的采集孔66。導(dǎo)入孔67和采集孔66分別連通于空間51b。
在電泳單元51的內(nèi)部，設(shè)有回收槽71和樣品槽72，導(dǎo)入孔67和采集孔66分別連接于樣品槽72和回收槽71。樣品槽72和回收槽71之間設(shè)有凝膠壁64，樣品槽72的負(fù)極側(cè)上也設(shè)有凝膠壁64。在回收槽71的正極側(cè)設(shè)有超濾膜65。即，樣品槽72在2個(gè)凝膠壁64和64之間構(gòu)成，回收槽71在凝膠壁64和超濾膜65之間構(gòu)成。
接著，說(shuō)明利用電泳單元51的精制過(guò)程。
進(jìn)行檢體的精制時(shí)，電泳單元51內(nèi)的空間51b裝滿有電泳用緩沖液，樣品槽72和回收槽71也裝滿有緩沖液。如圖18(a)所示，將檢體導(dǎo)入至樣品槽72后，對(duì)電泳單元51的兩端施加電壓。檢體中含有以精制為目標(biāo)的核酸和雜質(zhì)，以及比目標(biāo)核酸小的核酸。
對(duì)電泳單元51施加電壓，如圖18(b)所示，核酸1和多余的電解物2b向正極側(cè)移動(dòng)，雜質(zhì)2向負(fù)極側(cè)移動(dòng)。通過(guò)施加一定時(shí)間的電壓，如圖19(c)所示，核酸1和多余的電解物2b通過(guò)凝膠壁64到達(dá)回收槽71。接著，繼續(xù)施加電壓，如圖19(d)所示，分子量小的多余電解物2b通過(guò)超濾膜65從回收槽71排出。作為目標(biāo)物的核酸1留在回收槽71內(nèi)。
這樣，通過(guò)在電泳單元51中使用電泳和超濾膜，能夠從檢體中容易地將目標(biāo)核酸1分離。
接著，對(duì)電泳單元51的各部分構(gòu)成進(jìn)行說(shuō)明。
圖20為顯示電泳單元組裝構(gòu)成的側(cè)面剖面圖，圖21為相同構(gòu)成的立體圖。圖22為顯示第1模塊的構(gòu)成的圖，圖23為顯示第2模塊的構(gòu)成的圖，圖24為密封件的正面圖。
電泳單元51由第1模塊61、第2模塊62、第3模塊63、密封件73和超濾膜65組合而成。第1模塊61、第2模塊62、第3模塊63中，中央設(shè)有連通于用于構(gòu)成電泳單元51的空間51b的前后面的孔，四個(gè)角上設(shè)有連通于用于螺栓固定各部件的前后面的孔。
第1模塊61構(gòu)成了電泳單元51的端部，第2模塊62構(gòu)成了樣品槽72和回收槽71，第3模塊63保持凝膠壁64。各模塊之間設(shè)有密封件73，防止模塊間的冷卻水流入到電泳單元51中。在電泳單元51的一端側(cè)，超濾膜65被密封件73和73夾住。
第1模塊61的中央部中，如圖22所示，設(shè)有孔61b，此孔構(gòu)成了電泳單元51的空間51b的一部分。在第1模塊61的四角上設(shè)有用于插入螺栓的孔61c。
在第2模塊62的中央部，如圖23所示，設(shè)有孔62b，此孔構(gòu)成了電泳單元51的空間51b的一部分。在第2模塊62的四角上也設(shè)有用于插入螺栓的孔62c。在第2模塊62中設(shè)有孔62d，孔62d設(shè)在了連通于孔62b的上下方向上。此孔62d成為電泳單元51的導(dǎo)入孔67和采集孔66。
第3模塊63的形狀為減小了第1模塊61的前后方向厚度的形狀，在設(shè)于中央的孔中保持凝膠壁64。
密封件73由正面看為十字形的片材構(gòu)成。中央部上設(shè)有孔73b，本實(shí)施例中，由厚度為0.5mm的硅酮片材構(gòu)成。密封件73如圖24所示，為四角欠缺的構(gòu)成，成為不與用于連接部件的螺栓相接觸的形狀?？?3b的徑與第1模塊61的孔61b、第2模塊62的孔62b的徑一致。
超濾膜65使用比孔73b大的濾膜，為可被密封件73和73夾住的構(gòu)成。
接著，對(duì)使用本實(shí)施例的電泳裝置的核酸的濃縮精制分離試驗(yàn)進(jìn)行說(shuō)明。
比較試驗(yàn)1對(duì)使用本實(shí)施例的電泳裝置和使用磁性二氧化硅微珠法從培養(yǎng)淋菌添加尿中精制淋菌基因組進(jìn)行了比較。
首先，對(duì)使用本實(shí)施例電泳裝置的操作進(jìn)行說(shuō)明。
在巧克力培養(yǎng)基EX(日水制藥株式會(huì)社)上、37℃下培養(yǎng)淋菌(Nesseria gonorrhoeae)2天。
將所得到的菌落混懸于生理鹽水中，將吸光度調(diào)節(jié)為OD530＝0.18后，用生理鹽水稀釋100倍，得到菌體稀釋液。
然后，在60μL健康人混合尿中添加1.2μL菌體稀釋液。在其中，添加60μL表1所示組成的溶解緩沖液A并混合。
將混合液在96℃下加熱10分鐘。從混合液中取100μL作為樣品，導(dǎo)入至本實(shí)施例的電泳裝置中，在150V電壓下進(jìn)行60分鐘的電泳。
對(duì)100μL回收樣品中的5μL進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)處理，測(cè)定熒光強(qiáng)度。
PCR處理的處方如表2所示。
第1模塊61的尺寸為寬20mm、高20mm、厚5mm，孔61b的直徑為5mm，第2模塊62同樣，孔62d的直徑為2mm。第3模塊63的尺寸為，寬和高與第1模塊61相同，厚為2.5mm，凝膠壁使用瓊脂糖凝膠，瓊脂糖使用SeaKem Gold agarose(TaKaRa)，溶解液使用10mMTris-HCl(pH為8.0)。超濾膜使用YM-100(Millipore)。密封件73的厚度為0.5mm。
接著，對(duì)使用磁性二氧化硅微珠的操作進(jìn)行說(shuō)明。
使用MagExtractor(東洋紡織株式會(huì)社)作為磁性二氧化硅微珠。
到96℃下加熱混合液10分鐘為止的操作與上述使用電泳裝置的操作同樣。從混合液中取100μL作為樣品，按照MagExtractor的操作規(guī)程進(jìn)行處理。對(duì)所得100μL回收樣品中的5μL進(jìn)行PCR處理，測(cè)定熒光強(qiáng)度。
PCR處理的熱循環(huán)如表3所示，在50℃下保持2分鐘后，95℃下保持2分鐘，之后進(jìn)行在95℃下保持10秒和56℃C下保持60秒的50個(gè)循環(huán)。
表1 溶解緩沖液A組成

表2 PCR處方每1個(gè)反應(yīng)的處方

表3 熱循環(huán) 圖25為顯示淋菌基因組精制的比較結(jié)果的圖。圖25中的粗線為使用本實(shí)施例的結(jié)果、細(xì)線為使用磁性二氧化硅微珠法的結(jié)果。虛線為標(biāo)準(zhǔn)。
其結(jié)果是，使用本實(shí)施例與使用磁性二氧化硅微珠相比，可更快地進(jìn)行檢測(cè)。這說(shuō)明，本發(fā)明與磁性二氧化硅微珠法相比，核酸的精制和分離的效率更高。
接著，對(duì)使用本實(shí)施例的電泳裝置的DNA的濃縮操作進(jìn)行說(shuō)明。
在本實(shí)施例的電泳裝置中，樣品槽的容積為200μL，回收槽的容積為50μL。
將2.7ng/μL的λ/HindIII DNA制成100μL，與100μL的溶解緩沖液A混合，制備樣品。將樣品導(dǎo)入至電泳裝置的樣品槽，施加100V電壓進(jìn)行30分鐘的電泳并濃縮。
其后，對(duì)濃縮前的樣品和濃縮后的回收樣品分別取樣2μL、4μL、6μL、8μL，進(jìn)行凝膠電泳。將濃縮后的回收樣品也進(jìn)行電泳，樣品量為10μL。
圖26為將顯示DNA濃縮結(jié)果的樣品進(jìn)行電泳后的凝膠的圖。
圖26中，A為濃縮前的樣品，B為濃縮后被回收的樣品。如圖26所示，對(duì)于各樣品量，濃縮后回收的樣品與濃縮前的樣品相比，得到更清晰的條帶。
圖26中，回收樣品2μL的條帶狀態(tài)與濃縮前的6μL的條帶狀態(tài)相當(dāng)。
由此，使用本實(shí)施例的電泳裝置可進(jìn)行DNA的濃縮。
本發(fā)明由于操作簡(jiǎn)單且裝置構(gòu)成簡(jiǎn)單，因此可適用于自動(dòng)進(jìn)行核酸濃縮和檢查的檢查裝置等用途中。
權(quán)利要求
1.一種使用了電泳的核酸的濃縮精制方法，其特征在于，對(duì)含有核酸的試樣中的雜質(zhì)進(jìn)行帶電量的調(diào)節(jié)后，將試樣置于電場(chǎng)中來(lái)進(jìn)行核酸的濃縮精制。
2.一種利用電泳進(jìn)行的核酸的濃縮精制方法，其特征在于，在含有核酸的試樣中加入陽(yáng)離子表面活性劑，對(duì)試樣中雜質(zhì)的帶電量進(jìn)行調(diào)節(jié)，將該試樣置于電場(chǎng)中進(jìn)行電泳，由此進(jìn)行核酸的濃縮精制。
3.一種利用電泳進(jìn)行的核酸的濃縮精制方法，其特征在于，在含有核酸的試樣中加入陽(yáng)離子表面活性劑和非離子表面活性劑，對(duì)試樣中雜質(zhì)的帶電量進(jìn)行調(diào)節(jié)，將該試樣置于電場(chǎng)中進(jìn)行電泳，由此進(jìn)行核酸的濃縮精制。
4.如權(quán)利要求3所述的核酸的濃縮精制方法，其特征在于，在通過(guò)陽(yáng)離子表面活性劑的吸附來(lái)對(duì)核酸以外的帶電量進(jìn)行調(diào)節(jié)的同時(shí)，通過(guò)非離子表面活性劑的添加量來(lái)調(diào)節(jié)陽(yáng)離子表面活性劑的吸附量。
5.一種核酸的濃縮精制裝置，其特征在于，在試樣中添加非離子表面活性劑和陽(yáng)離子表面活性劑，將該試樣進(jìn)行電泳，在陽(yáng)極側(cè)進(jìn)行核酸的濃縮精制。
6.一種進(jìn)行電泳的核酸的濃縮精制裝置，其特征在于，通過(guò)抑制擴(kuò)散的導(dǎo)電性分離體將側(cè)面由絕緣體構(gòu)成的容器內(nèi)隔開(kāi)，在該容器內(nèi)構(gòu)成試樣投入室和核酸回收室，該容器的端部分別經(jīng)由緩沖液槽與電極相連接。
全文摘要
以往的核酸精制濃縮方法由于使用劇毒藥品，因此需要尖端的化學(xué)設(shè)備，利用環(huán)境受到限制。而且，操作麻煩，需要高速離心等，難以自動(dòng)化，難以得到高的精制精度。另外，使用了柱/過(guò)濾器的精制方法中，當(dāng)為雜質(zhì)混入較多的樣品時(shí)，有可能引起堵塞，從而精制效率降低，需要進(jìn)行離心或抽吸操作，難以自動(dòng)化。而通過(guò)使表面活性劑(3和4)吸附試樣中存在的雜質(zhì)(2)，從而顯示與核酸(1)不同的行為，則使雜質(zhì)(2)與核酸(1)分離，通過(guò)利用陽(yáng)離子表面活性劑(4)和非離子表面活性劑(3)使核酸(1)以外的雜質(zhì)(2)帶電并置于電場(chǎng)中，則從含有雜質(zhì)(2)的檢體中將核酸(1)分離精制，成為核酸(1)的濃縮或易于濃縮的狀態(tài)。
文檔編號(hào)B01D61/42GK1878863SQ20048003306
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2004年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日
發(fā)明者橋口智史, 豬瀨健 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社