專利名稱：基于親和吸附的血液凈化方法及系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的血液凈化方法，凈化患者血液來治療疾病的方法以及所述方法專用的血液凈化系統(tǒng)。更具體地，本發(fā)明涉及改進(jìn)的、基于親和吸附的血液凈化方法和系統(tǒng)，所述的血液凈化方法是在常規(guī)的吸附凈化后增加另一吸附步驟，用以吸附脫落的配體，以減少常規(guī)血液凈化方法的副作用。
背景技術(shù)：
血液凈化治療是指患者血液在體外通過某種處理后再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，這種處理包括血液透析、血液過濾、血液滲透、血漿置換或免疫吸附，可以從患者血液中移除致病因子。
血漿置換被廣泛應(yīng)用于移除血漿中的各類病原體包括抗體、免疫復(fù)合物、異常的免疫球蛋白、冷沉(淀)蛋白、異常的凝結(jié)因子和其他毒性因子。然而，血漿置換在選擇性與特異性方面有一定局限性。它在移除病原體的同時還會移除某些人體血液中必需的蛋白。此外，血漿置換過程還需要使用替代液(如人體白蛋白溶液)，此替代液的價格昂貴，并且增加了此種治療方法引入污染物的可能，因此大大限制了血漿置換方法的應(yīng)用。
為了克服這些問題，基于免疫吸附方法的親和選擇開始被應(yīng)用于血液凈化，并且其作用日益明顯。免疫吸附能夠有選擇的移除血液中的致病因子。在免疫吸附方法中，Protein A應(yīng)用最為廣泛，protein A來源于金黃色葡萄球菌，能夠與IgG的Fc片段特異性結(jié)合。Protein A吸附方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于治療各種免疫疾病，M Gaubitzand KM Schneider就描述了用protein A吸附IgG和免疫復(fù)合物來治療某種自身免疫性疾病例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(M Gaubitz and KMSchneider，“Immunoadsorption in systemic lupus erythematosusdifferent techniques and their current role in medical therapy”，Therapeutic Apheresis and Dialysis，7(2)183-188(2003))。
低密度脂蛋白(LDL)和LDL膽固醇(LDL-C)是導(dǎo)致動脈硬化癥的主要因素之一。傳統(tǒng)治療方法是通過控制飲食和藥物來降低患者LDL與LDL-C水平，然而口服降脂藥如洛伐他汀(Lovastatin)很可能導(dǎo)致對肝的損害，而且降脂效果較低。通過親和吸附在體外移除LDL和LDL-C來降低患血液中膽固醇與LDL的濃度能夠表現(xiàn)出更好的效果，所使用的親和吸附劑包括抗LDL抗體和其他化學(xué)吸附劑如右旋糖苷硫酸鹽或苷磷脂。Strahilevitz的美國專利6,676,622設(shè)計了一種親和吸附系統(tǒng)，但是沒有提供實驗數(shù)據(jù)；也有關(guān)于某種治療動脈硬化癥的吸附劑的報道，由螯和因子移除能夠?qū)е翷DL氧化的重金屬；protein A也能吸附導(dǎo)致血液中LDL氧化的自身抗體。
然而，在免疫治療中，存在著吸附劑配體從載體脫落的問題。據(jù)報道，有41％的高血脂患者在接受LDL抗體免疫治療后會出現(xiàn)低血壓癥狀(伍強(qiáng)等人，“免疫吸附法治療高血脂癥療效觀察”，Journalof Modern Clinical Medical Bioengineering，9110-112，2003)。目前所使用的大多數(shù)抗體是鼠源或羊源，這些非人源性抗體如果脫落進(jìn)入人體內(nèi)就會作為抗原引發(fā)人體內(nèi)難以預(yù)測的免疫反應(yīng)。在透析和血漿灌注過程中，血漿會多次經(jīng)過免疫親和吸附柱，因此配體很有可能脫落進(jìn)入血液中，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。目前已有許多關(guān)于protein A從載體上脫落問題的研究，如果脫落數(shù)量達(dá)到一定值將會引起嚴(yán)重的副作用。已有報道從血漿中發(fā)現(xiàn)了脫落的protein A并且導(dǎo)致各種副作用(JP Balint，F(xiàn)R Jones and HW Snyder，“ThePROSORBA Column Clinical Trial GroupSelective extracorporealremoval of immunoglobulin G and circulating immune complexesAreview”，Plasma Therapy and Transfusion Technology，7333-349(1986))。
美國專利6,441,146和5,962,641中描述了His(6)標(biāo)記蛋白的純化方法，然而沒有涉及血液凈化及解決配體脫落問題的方法。
至今為止，在血液凈化領(lǐng)域，關(guān)于配體脫落問題還沒有好的解決方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員仍在不斷尋找更有效的血液凈化方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上研究了一種新的血液凈化方法和應(yīng)用于該方法的血液凈化系統(tǒng)，所述的凈化方法其特征在于包括兩步親和吸附，即第一步吸附用于移除患者血液中的致病因子，第二步吸附用于去除第一步吸附后脫落的配體。相應(yīng)的，用于該方法的血液凈化系統(tǒng)包括串聯(lián)連接的兩種吸附柱，即用于移除患者血液中致病因子的第一吸附柱，和用于去除由第一吸附柱脫落的配體的第二吸附柱。本發(fā)明的方法及系統(tǒng)解決了血液凈化中配體脫落的難題，大大減少了血液凈化可能出現(xiàn)的副作用。并且，將本發(fā)明的血液凈化方法和系統(tǒng)用于治療時無需替代液參與。
本發(fā)明的血液凈化方法和系統(tǒng)可用于治療諸如動脈硬化癥、自身免疫性疾病和其他與血液有關(guān)的疾病。
本發(fā)明的目的是提供一種通過親和吸附進(jìn)行血液凈化的新方法。該方法是一種基于親和作用的血液凈化方法，該方法沒有或只有很少配體脫落問題，因此大大減少了血液凈化中可能出現(xiàn)的副作用。
具體的，本發(fā)明提供了一種新的血液凈化方法，該方法包括在常規(guī)的凈化吸附步驟之后加入吸附第一步吸附后由載體上脫落的蛋白的步驟，從而克服了配體脫落的問題。
更具體地，本發(fā)明通過親和吸附進(jìn)行血液凈化的方法包括以下步驟
(1)將血液或經(jīng)過分離的血漿通過第一親和吸附柱A，該柱中的吸附劑以蛋白作為配體，用于去除致病因子；(2)使經(jīng)過柱A凈化的血液或血漿通過第二親和吸附柱B，該柱以固定的金屬離子為配體，能夠吸附從柱A脫落的配體蛋白。
本發(fā)明的方法可用于處理血漿或血液，用于處理血漿時，所述的血漿可以是用血漿分離器將血液分離為血漿與血細(xì)胞后所獲得的血漿。
采用上述方法凈化后的血液可輸回患者體內(nèi)；用上述方法凈化后的血漿在與患者的血細(xì)胞混合后也可被輸回患者體內(nèi)。所以此凈化過程無需替代液參與。
本發(fā)明的血液凈化方法可用于治療諸如動脈硬化癥、自身免疫性疾病和其他與血液凈化有關(guān)的疾病。
本發(fā)明的另一目的是提供一種通過凈化患者血液來治療疾病的方法，該方法包括以下步驟(1)將從病人體內(nèi)輸出的血液分離得到的血漿通過第一親和吸附柱A，或?qū)牟∪梭w內(nèi)輸出的血液直接通過第一親和吸附柱A，該柱中的吸附劑以蛋白作為配體，用于去除致病因子；(2)使經(jīng)過柱A凈化的血液或血漿通過第二親和吸附柱B，該柱以固定的金屬離子為配體，能夠吸附從柱A脫落的配體蛋白；(3)將凈化后的血液輸送至患者體內(nèi)；或?qū)艋蟮难獫{與患者的血細(xì)胞混合后輸送至患者體內(nèi)。
本發(fā)明的另一目的是提供一種用于上述血液凈化方法和治療方法的專用血液凈化系統(tǒng)，它是一種新穎的親和吸附凈化系統(tǒng)。
具體的說，本發(fā)明的血液凈化系統(tǒng)包括二種吸附柱，即用于去除致病因子的第一親和吸附柱A，和用于吸附由柱A脫落的蛋白的第二親和吸附柱B。
本發(fā)明的血液凈化系統(tǒng)還可包括血漿分離器，用于將血液分離為血漿和血細(xì)胞。在此情況下，本發(fā)明的血液凈化系統(tǒng)包括三部分，即血漿分離器、第一親和吸附柱A和第二親和吸附柱B。
更具體地，本發(fā)明的血液凈化系統(tǒng)包括以蛋白為配體的第一親和柱A和以固定的金屬離子為配體的第二親和柱B，且柱A與柱B串聯(lián)連接。所述的血液凈化系統(tǒng)還可包括血漿分離器。
在將本發(fā)明的系統(tǒng)和方法用于治療疾病時，可按照下述方法進(jìn)行將患者的血液經(jīng)血漿分離器分離為血漿與血細(xì)胞，再將所述的血漿在該系統(tǒng)中按照上述血液凈化方法經(jīng)過兩步處理；或者將患者的血液在該系統(tǒng)中按照上述血液凈化方法直接進(jìn)行兩步處理。第一步處理是用親和吸附柱A，柱A以蛋白為配體，用于移除血液或血漿中的致病因子；第二步處理用親和吸附柱B，柱B以固定的金屬離子為配體，用于吸附從柱A脫落的配體；凈化后的血液再輸回到患者體內(nèi)，或?qū)艋蟮难獫{與細(xì)胞混合后再輸回到患者體內(nèi)。因此，此凈化過程無需替代液參與。
在本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中，第一親和吸附柱A是一種蛋白吸附柱，其配體是一種蛋白，連接到某種載體上。本文所用的術(shù)語“蛋白”是指廣義的蛋白，也包括抗體。所述蛋白可以是蛋白的整體或是一部分，即多肽，具有能與血液中的致病分子結(jié)合的能力?？捎糜谥鵄的配體蛋白的實例例如protein A、protein G或相關(guān)變體等；所述蛋白或多肽包括體外合成的，或是通過重組DNA技術(shù)細(xì)胞或動物合成的。所述的蛋白是抗體時，該抗體包括完整抗體、抗體片段、或單鏈Fv等，如IgG或Ig A，能夠結(jié)合血液中的致病抗原或分子，這些抗體可以是體外合成的，也可以是通過基因重組技術(shù)獲得的。
本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中所述柱A吸附劑的配體蛋白優(yōu)選是His(n)標(biāo)記的，即組氨酸標(biāo)記的蛋白。由于組氨酸殘基具有易于和金屬離子結(jié)合的特性，在配體上引入此標(biāo)記使脫落的配體更易于被第二親和吸附柱吸附。術(shù)語“His(n)”是指至少4個連續(xù)的組氨酸殘基，優(yōu)選6-10個連續(xù)的組氨酸殘基，最優(yōu)選為6個連續(xù)的組氨酸殘基，因此n為大于4的整數(shù)，優(yōu)選n為6-10的整數(shù)，最優(yōu)選n為6。His(n)標(biāo)記與配體蛋白的連接位置可以在配體蛋白的N-端，C-端或其他不影響蛋白性質(zhì)功能的位置。所述的His(n)標(biāo)記必須暴露在柱A配體蛋白表面，以便配體蛋白脫落后能與金屬親和柱B結(jié)合。
本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中所述的His(n)標(biāo)記相對較短，通常情況下不會影響蛋白活性。組氨酸標(biāo)記的免疫原性低，最近有許多實例證明蛋白增加了該標(biāo)記后并不影響治療效果。Poon和Hunt在大腸桿菌中表達(dá)了His6標(biāo)記protein A，并且通過固定金屬親和色譜(immorbilized-metal affinity chromatography，IMAC)純化(R.Poon和T.Hunt，“Reversible Immunoprecipitation Using Histidine-orGlutaththione-S-Transferase-Tagged Staphylococcal Protein A”，Analytical Biochemistry 21826-33(1994))。該His6protein A連接到瓊脂糖凝膠上，其結(jié)合IgG的能力與通常的protein A-瓊脂糖凝膠相似，也就是說His6標(biāo)記并不影響protein A的蛋白活性。
本發(fā)明所使用的His(n)標(biāo)記蛋白是在通常所用的吸附劑蛋白上引入His(n)標(biāo)記。引入His(n)標(biāo)記的方法可參見上述Poon和Hunt的文獻(xiàn)。在本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中，第二步的親和吸附柱B用來吸附由第一柱A脫落的配體。該柱B可以是生化領(lǐng)域中常用的固定金屬親和柱，其采用了固定金屬親和色譜(IMAC)方法。IMAC是近年來出現(xiàn)的應(yīng)用很廣的一種分離技術(shù)，它的作用原理是柱填料中的固相載體通過共價鍵螯合金屬離子，某些金屬離子作為配體能夠結(jié)合具有組氨酸殘基標(biāo)記的蛋白質(zhì)。IMAC具有配體穩(wěn)定、高蛋白吸附能力、洗脫條件溫和、再生簡單、成本低廉的特點(diǎn)，因此在蛋白純化中應(yīng)用廣泛。
本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中，第二親和吸附柱B所使用的配體固定金屬包括但不僅限于以下幾種Ni(II)，Co(II)，Cu(II)，F(xiàn)e(II)和Zn(II)。關(guān)于固定金屬親和柱現(xiàn)有技術(shù)中已有報道，固定金屬親和柱非常穩(wěn)定，痕量的此類金屬如果脫落也不會對人體造成傷害。
在本發(fā)明中，親和吸附柱A和B中的載體可以是顆粒、纖維、大孔基質(zhì)、膜或中空纖維，其中的顆粒優(yōu)選是球形顆粒，例如瓊脂糖、纖維素顆粒。
本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中所述的第一親和吸附柱A和第二親和吸附柱B是串聯(lián)連接。柱A和柱B各自可以是單柱，也可以是一組柱，例如二個或二個以上的柱并聯(lián)。優(yōu)選使用單柱或平行雙柱。
本發(fā)明的血液凈化方法和系統(tǒng)可用于治療與血液有關(guān)的疾病，這些疾病包括但不限于由于自身抗體異常導(dǎo)致的疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管球性腎炎和脈管炎、先天性血小板減少性紫癜、IgG引起的自身免疫溶血性貧血、多發(fā)性硬化癥、天皰瘡、韋格內(nèi)肉芽腫病、血小板無力癥、肺出血腎炎綜合征、系統(tǒng)性脈管炎、慢性脫髓鞘性神經(jīng)炎、急性感染性多發(fā)性神經(jīng)炎、重癥肌無力擴(kuò)張型心肌癥、化療引起的溶血性尿毒癥、血友病、腎臟移植引起的白細(xì)胞抗原機(jī)能亢進(jìn)、免疫球蛋白E過高癥候群等，以及由于血液中某些蛋白異?？赡軐?dǎo)致的疾病，例如高脂血癥、動脈硬化癥、透析相關(guān)性淀粉樣變性、末期腎臟疾病、慢性腎衰竭、敗血癥、內(nèi)毒素休克和艾滋病等等。特別是用于治療高脂血癥、動脈硬化癥和自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、天皰瘡等。
試驗結(jié)果表明，用本發(fā)明的方法進(jìn)行治療的患者其血液中的異常蛋白或抗體明顯減少，由柱A上脫落的配體His(n)標(biāo)記蛋白可被金屬親和柱B吸附。因此可減少由此而產(chǎn)生的副作用。很顯然，患者血液中異常蛋白的減少可使他們的臨床癥狀得到明顯改善。


下面參照附圖進(jìn)一步描述本發(fā)明的實施方案。
圖1是本發(fā)明的兩步法親和吸附血液凈化系統(tǒng)簡圖。該系統(tǒng)包括血漿分離器、吸附柱A和吸附柱B，以及吸附劑的再生系統(tǒng)。圖1具體說明了使用兩步親和吸附法對患者的血漿進(jìn)行血液凈化的過程患者血液通過導(dǎo)管流入血池101，肝素102或其他穩(wěn)定的抗凝劑加入血池中，關(guān)于抗凝劑的加入可參考美國專利4,614,513。血液通過導(dǎo)管104流入血漿分離器105，血漿與血細(xì)胞分離，所述血漿流入柱A(113)，柱A中的吸附劑以蛋白為配體，優(yōu)選以His(n)標(biāo)記的蛋白為配體。在柱A中，發(fā)生親和吸附反應(yīng)，如抗原與抗體之間，通過親和吸附移除血液中異常的致病分子。經(jīng)過柱A凈化的血漿流入柱B(121)，柱B中的吸附劑是金屬親和樹脂，能夠吸附從柱A中脫落的配體蛋白，特別是吸附脫落的His(n)標(biāo)記蛋白。當(dāng)關(guān)閉閥門108，打開閥門109時，柱A就進(jìn)入再生狀態(tài)，沖洗緩沖液由111流入柱A，打開閥門114，廢液就流到廢液池115中，該池中液體可直接丟棄或進(jìn)行分析。當(dāng)關(guān)閉閥門109，打開閥門110時，緩沖液從112中進(jìn)入柱A中平衡。閥門114打開，緩沖液進(jìn)入115。柱B的再生與此類似，用118中的沖洗緩沖液清洗，119中的緩沖液進(jìn)行平衡，最終廢液流到廢液池123中，泵103與125控制血漿流速。通過兩個柱子凈化后的血漿進(jìn)入混合小血池(127)中與血細(xì)胞重新混合，最后輸回到患者體內(nèi)，控制器128可以控制閥門108，109，110，114，116，117，120，122和124，如果不使用在線再生，也可以直接更換吸附劑。
圖2是本發(fā)明另一血液凈化系統(tǒng)簡圖，其中兩種親和吸附柱各自采用兩個平行柱，即并聯(lián)雙柱。當(dāng)柱A1(204)凈化時，柱A2(227)再生；類似地，當(dāng)柱B1(206)凈化時，柱B2(229)再生，因此可提高凈化效率。
圖2具體描述了一個改進(jìn)的血液凈化系統(tǒng)用于治療的過程。與圖1不同的是，此系統(tǒng)每一步吸附采用的都是平行柱，這可以大大增加血液凈化效率。當(dāng)柱A1和柱B1在進(jìn)行凈化操作時，柱A2和柱B2可以進(jìn)行再生；反之，當(dāng)柱A2和柱B2在進(jìn)行凈化操作時，柱A1和柱B1可以再生。因此，此雙柱系統(tǒng)可比單柱系統(tǒng)更快的完成血液凈化過程。
如圖所示，患者的血液經(jīng)過血漿分離器后，血漿通過導(dǎo)管106進(jìn)入柱A1(204)，在柱A1中發(fā)生親和反應(yīng)，移除致病因子；從柱A1流出的血漿流經(jīng)柱B1，凈化后的血漿進(jìn)入混合小血池(未顯示)與血細(xì)胞混合后輸回患者體內(nèi)，泵201和203可控制壓力保證血漿的流動，在柱A1和柱B1行使凈化功能時，柱A2和柱B2可進(jìn)行再生，再生過程與圖1中說明類似。
應(yīng)用此系統(tǒng)對患者的血液進(jìn)行凈化時，可比圖1所描述的單柱系統(tǒng)更快的完成血液凈化過程。
圖3是His6標(biāo)記protein A與非標(biāo)記protein A結(jié)合IgG水平的比較。試驗所用的商購protein A和對照protein(HSA-人血清白蛋白)是由Sigma公司.購買，Protein A和His6標(biāo)記protein A按照實施例1所述方法制備。
具體實施方案以下用實例舉例說明本發(fā)明的方法、系統(tǒng)和治療方法，但本發(fā)明并不限于以下應(yīng)用。
實施例1柱A配體His6標(biāo)記protein A的制備本例旨在說明柱A所用His(n)標(biāo)記配體蛋白的制備。并通過IgG的結(jié)合力之功能測定對所制備的柱A配體和無標(biāo)記的天然protein A(常規(guī)使用的配體)進(jìn)行比較。為了符合柱A所用配體蛋白的要求，所制備的標(biāo)記protein A中His6不能影響該蛋白的活性并且可被柱B的固定金屬配體結(jié)合。試驗表明，His6-protein A與IgG的結(jié)合力和protein A類似。
Protein A和His6protein A均可通過基因重組技術(shù)獲得(Sambrook J.Fritsch BF and Maniatis T.，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd.Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。根據(jù)報道已知位于protein A C-端的His6不會影響protein A活性(Poon and Hunt，“Reversible Immunoprecipitation UsingHistidine-or Glutaththione-S-Transferase-Tagged StaphylococcalProtein A”，Analytical Biochemistry 21826-331994)。
His6標(biāo)記protein A，按照上述文獻(xiàn)公開的方法制備。
通過PCR方法構(gòu)建編碼protein A和C-端His6標(biāo)記的cDNA，克隆到載體pET21b(Novagen公司)，并且在Escherichia coliBL21菌株(DE3)中表達(dá)，異丙硫基-(β)-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)，通過Ni-NTA樹脂(Qiagen公司)純化His6-protein A后連接到瓊脂糖凝膠上。重組protein A的獲得及連接到載體上的過程與前者類似。
測定IgG結(jié)合能力采用如下方法。10ml protein A或10ml His6protein A與50ml醫(yī)學(xué)實驗用的狗血清于4℃孵育1小時，緩沖液為20mM Tris-HCl(pH7.5)和50mM NaCl。用緩沖液沖洗，結(jié)合的IgG洗脫后用抗狗IgG抗體通過ELISA方法定量(測定方法參見H.Sato，T.Kidaka and M.Hori，“Leakage of Immobilized IgG from TherapeuticImmunoadsorpents”，Applied Biochemistry and Biotechnology，15145-158(1987))。如圖三所示His6protein A具有與protein A相似的IgG結(jié)合能力，也就是說加入的組氨酸標(biāo)記不會阻擋proteinA與IgG的結(jié)合區(qū)域。
結(jié)果說明His6標(biāo)記不影響protein A功能。
實施例2此例旨在比較用常規(guī)的單柱層析法進(jìn)行體外血液凈化和用本發(fā)明的雙柱串聯(lián)層析法進(jìn)行體外血液凈化后，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者血漿中IgG水平與His6-protein A的脫落情況。
SLE患者為一位40歲的婦女，從患者體內(nèi)取血200ml，離心分離血漿與血細(xì)胞。各取100ml血漿通過常規(guī)的單柱層析和本發(fā)明的雙柱串聯(lián)層析系統(tǒng)。單柱層析系統(tǒng)包括一個以實施例1制備的His6-protein A為吸附劑的的75ml柱；本發(fā)明的雙柱串聯(lián)層析系統(tǒng)包括一個與此相同的柱，以及一個20ml金屬親和樹脂Ni-NTA柱(Qiagen公司)(該柱的吸附劑是金屬Ni)。血漿過柱后用酸性洗脫液和中性平衡緩沖液再生、重平衡柱子。根據(jù)凈化需要，可對血漿進(jìn)行多次凈化。完成凈化后，測定純化血漿中IgG和His6-proteinA的量。IgG通過色譜法和免疫電泳方法測定，脫落的His6-proteinA用抗protein A抗體和抗His6抗體按照ELISA方法測定(測定方法參見H.Sato，T.Kidaka and M.Hori，“Leakage of Immobilized IgG fromTherapeutic Immunoadsorpents”，Applied Biochemistry andBiotechnology，15145-158(1987))。結(jié)果列于表一。
表一經(jīng)過常規(guī)的單柱處理系統(tǒng)和本發(fā)明的雙柱處理系統(tǒng)凈化后SLE患者血漿中抗體和His6-Protein A的含量

如表一所示，單柱層析和雙柱串聯(lián)層析在體外結(jié)合IgG的能力相近，然而單柱層析系統(tǒng)處理后的血漿中His6-protein A明顯高于雙柱串聯(lián)層析系統(tǒng)。
實施例3本例旨在比較用常規(guī)的單柱系統(tǒng)和本發(fā)明的雙柱親和吸附血液凈化系統(tǒng)凈化后，狗血清中IgG水平與His6-protein A的脫落情況。
本實施例應(yīng)用了圖2所示的雙柱親和吸附血液凈化系統(tǒng)，其中柱A和柱B使用的吸附劑各自與實施例2相同，柱A體積為150ml，柱B為40ml。而常規(guī)的單柱血液凈化系統(tǒng)只包括柱A。
實驗動物為雄性、供醫(yī)學(xué)實驗用的狗，體重為10-13公斤。狗全身麻醉后，血液從狗的后腿股動脈引出，進(jìn)入血漿膜分離器。膜分離器將血液分成血球、血漿兩部分，血漿以30mL/min的速度流過柱1系統(tǒng)(A1-B1雙柱串聯(lián))，柱2系統(tǒng)(A2-B2雙柱串聯(lián))關(guān)閉，運(yùn)行10分鐘以后，關(guān)閉柱1系統(tǒng)入口和出口，開啟柱2系統(tǒng)。柱1系統(tǒng)進(jìn)入洗脫、平衡過程，再生過程為先用酸性洗脫液洗去吸附的蛋白，再用平衡緩沖液平衡柱子。再生過程完畢后，開啟柱1系統(tǒng)入口，同時關(guān)閉柱2系統(tǒng)入口。重復(fù)以上操作，每柱各切換5次，經(jīng)圖2所示裝置處理后，純化的血漿與血球混合后一同輸回狗的后腿靜脈。
系統(tǒng)運(yùn)行10分鐘后開始取樣測量。IgG通過色譜法和免疫電泳方法測定，脫落的His6-protein A用ELISA方法測定，用于測量His6-protein A抗體包括抗protein A抗體和抗His6抗體，測定方法如實施例2所述。結(jié)果列于表二。
表二 單柱和雙柱系統(tǒng)處理后狗血漿中IgG抗體和His6-Protein A的含量變化

如表二所示，與常規(guī)的單柱吸附血液凈化系統(tǒng)相比，通過雙柱親和吸附血液凈化系統(tǒng)后的His6-protein A配體脫落的數(shù)量大大地降低。
試驗結(jié)果表明本發(fā)明的血液凈化方法和系統(tǒng)使凈化的血液中脫落配體的數(shù)量大大減少，因此可相應(yīng)的減少由配體脫落引起的副作用，解決了血液凈化治療方法中所存在的難題。
以上已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明的實施方案，對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯可以做很多改進(jìn)和變化而不會背離本發(fā)明的基本精神。所有這些變化和改進(jìn)都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，其特征由上述說明書確定。
權(quán)利要求
1.通過親和吸附進(jìn)行血液凈化的方法，該方法包括在常規(guī)的凈化吸附步驟之后加入另一吸附步驟，該吸附步驟用于吸附上一步驟吸附后又由載體上脫落的配體蛋白。
2.按照權(quán)利要求1的血液凈化方法，該方法包括以下步驟(1)將血液或經(jīng)過分離的血漿通過第一親和吸附柱A，該柱的吸附劑以蛋白為配體，連接到載體上；(2)使經(jīng)柱A凈化的血液或血漿通過第二親和吸附柱B，該柱以固定的金屬離子為配體，能夠吸附從柱A中脫落的蛋白。
3.按照權(quán)利要求1或2的血液凈化方法，其中所述經(jīng)過分離的血漿是使用血漿分離器分離的。
4.按照權(quán)利要求2的血液凈化方法，其中所述柱A的配體蛋白是完整蛋白或多肽，優(yōu)選為His(n)標(biāo)記的蛋白，并且可以是體外合成的，也可以是通過重組DNA技術(shù)獲得的；其中所述His(n)標(biāo)記的位置可以位于蛋白的N-端、C-端或其他不影響蛋白功能活性的任何位置。
5.按照權(quán)利要求4的血液凈化方法，其中所述蛋白中的組氨酸殘基數(shù)量至少為4，優(yōu)選為6-10。
6.按照權(quán)利要求2的血液凈化方法，其中所述柱B中的金屬離子選自Ni(II)、Cu(II)、Co(II)、Fe(II)和Zn(II)。
7.一種血液凈化系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括以蛋白為配體的第一親和吸附柱A，和以固定的金屬離子為配體的第二親和吸附柱B，所述的柱A與柱B串聯(lián)連接，可各自獨(dú)立地是單柱或并聯(lián)多柱；該系統(tǒng)還可選擇性包括血漿分離器。
8.按照權(quán)利要求7的血液凈化系統(tǒng)，其中所述柱A的配體蛋白是完整蛋白或多肽，優(yōu)選為His(n)標(biāo)記的蛋白，并且可以是體外合成的，也可以是通過重組DNA技術(shù)獲得的，其中所述His(n)的位置可以位于蛋白的N-端、C-端或其他不影響蛋白功能活性的任何位置。
9.按照權(quán)利要求8的血液凈化系統(tǒng)，其中所述蛋白中的組氨酸殘基數(shù)量至少為4，優(yōu)選為6-10。
10.按照權(quán)利要求7的血液凈化系統(tǒng)，其中所述柱B中的金屬離子選自Ni(II)、Cu(II)、Co(II)、Fe(II)和Zn(II)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種血液凈化的方法及其專用系統(tǒng)，以及應(yīng)用該方法和系統(tǒng)凈化患者血液以治療疾病的方法，該方法可用于治療多種與血液凈化有關(guān)的疾病，包括高血脂癥、動脈硬化癥及免疫性疾病。本發(fā)明的血液凈化方法包括將血液或血漿進(jìn)行兩步親和吸附柱吸附，第一親和吸附柱用于移除患者血液中的致病因子如非正常水平的蛋白；第二親和吸附柱用于吸附從第一柱上脫落的配體，因此可減少血液凈化中因配體脫落帶來的副作用。
文檔編號B01J20/00GK1830495SQ20051001141
公開日2006年9月13日 申請日期2005年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月11日
發(fā)明者傅和亮, 侯永敏 申請人:傅和亮, 侯永敏, 廣州市博普生物技術(shù)有限公司, 廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司