專利名稱：電層析分離制備生物物質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種用于生物科學(xué)領(lǐng)域的分離方法，具體是一種電層析分離制備生物物質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
毛細(xì)管電層析是綜合了高效液相層析和毛細(xì)管電泳的優(yōu)勢(shì)而發(fā)展起來(lái)的一種微分析技術(shù)，具有高效、快速、樣品用量少的特點(diǎn)。毛細(xì)管電層析的局限性是只能用于微量分析，不能用于樣品的制備。
目前，國(guó)外有些學(xué)者正在進(jìn)行制備型電層析的研究。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，比較典型的制備型電層析方法見(jiàn)Carlos M.Tellez和Kenneth D.Cole發(fā)表在Electrophoresis(電泳)2000年第21卷第1001-1009頁(yè)的文章Preparativeelectrochromatography of proteins in various types of porous media(蛋白質(zhì)在各種類型的多孔介質(zhì)中的制備型電層析)。此文獻(xiàn)的目的是用制備型電層析技術(shù)分離蛋白質(zhì)類生物大分子，所用的固定相是體積排阻葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠，洗脫液是3.9mmol/L Tris(三羥甲基氨基甲烷)和47mmol/L甘氨酸組成的緩沖液(pH8.3)，分離α-乳請(qǐng)蛋白、β-乳球蛋白、γ-球蛋白、牛血清白蛋白。這種方法的不足和缺陷是只能用于分離蛋白質(zhì)等生物大分子，不能用于分離小分子物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足和缺陷，提出一種電層析分離制備生物物質(zhì)的方法。通過(guò)改變固定相和緩沖液，可分離如抗生素、有機(jī)酸、生物堿等小分子物質(zhì)，也可分離如蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)，適用范圍廣。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明用制備規(guī)模的電層析方法分離生物物質(zhì)，具體步驟如下(1)裝柱，將處理好的固定相加入電層析柱中；(2)平衡電層析柱，向電層析柱中注入緩沖液，直到進(jìn)入柱內(nèi)和流出柱外的緩沖液的pH及組成相同；
(3)加樣，將需要分離的樣品加入電層析柱中；(4)電層析，向電層析柱中加入緩沖液，開(kāi)啟與柱兩端的電極相連接的高壓電源，收集流出液，進(jìn)行分析或進(jìn)一步純化。
所述的電層析柱內(nèi)可裝填各種固定相。固定相的顆粒大小為10-1000μm。固定相體積為1-4000ml。所述的固定相為離子交換樹(shù)脂、吸附樹(shù)脂、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠的任一種。所用的緩沖液為無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)鹽及酸、堿配制成。包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、乙酸鹽、Tris(三羥甲基氨基甲烷)、氨基酸。
緩沖液中加入乙醇、甲醇、丙酮水溶性有機(jī)溶劑；緩沖液中鹽類濃度范圍為0.01-0.50mol/L，pH范圍為2-10，有機(jī)溶劑含量為0％-60％。
所述的需要分離的樣品是水溶性的離子性生物產(chǎn)物，如抗生素、生物堿、有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、核酸等。
在電層析柱的進(jìn)口處加入需要分離的樣品，加樣量為0.1-2000mg。
本發(fā)明具有層析法選擇性好、電泳法分辨率高的優(yōu)點(diǎn)；成本低；樣品處理量大，可達(dá)毫克級(jí)至克級(jí)，可做制備用；可由操作者手工裝柱；通過(guò)改變固定相和緩沖液，可用于分離大分子物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、核酸)，也可用于分離小分子物質(zhì)(如抗生素、有機(jī)酸、生物堿)；通用性強(qiáng)，適用范圍廣。本發(fā)明供化學(xué)、化工、生物、制藥、食品、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域使用，用于實(shí)驗(yàn)室中生物物質(zhì)的分離純化和樣品制備。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1四環(huán)素和博來(lái)霉素分別用0.06mol/L丙氨酸-乙酸緩沖液(pH3.0)配制為10mg/ml溶液，各取25μl樣品，混合后進(jìn)樣。固定相為MCI-Gel大孔吸附樹(shù)脂，用0.06mol/L丙氨酸-乙酸緩沖液(pH3.0)∶乙醇(V∶V)＝3∶1洗脫。在通電情況下，四環(huán)素先流出，博來(lái)霉素后流出，兩種物質(zhì)得到分離。如果不通電，在相同條件下按通常層析法操作，則四環(huán)素和博來(lái)霉素不能分離。
實(shí)施例2頭孢唑林鈉、頭孢噻肟鈉、頭孢曲松鈉、頭孢他啶、頭孢拉定5種抗生素，分別配制成50mg/ml水溶液。5種抗生素的水溶液各取100μl，混合后進(jìn)樣。固定相用強(qiáng)酸性1×2型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，0.1mol/L丙氨酸-乙酸緩沖液∶乙醇(V∶V)＝40∶60洗脫，pH從3.0梯度升高到8.8。在電層析時(shí)，抗生素依次從柱中流出，得到分離。
實(shí)施例3從茶多酚粗提物中純化分離酯型兒茶素(L-表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，L-EGCG)。將茶多酚粗提物配制成40mg/ml水溶液，取0.5ml進(jìn)樣。固定相為MCI-Gel大孔吸附樹(shù)脂，0.02mol/L丙氨酸-乙酸緩沖液(pH 6.5)∶乙醇(V∶V)＝80∶20洗脫。電層析分離出兩個(gè)峰，前面是酯型兒茶素，后面是雜質(zhì)。如果不通電，在同樣條件下層析，只有一個(gè)峰流出，酯型兒茶素和雜質(zhì)不能分離。
實(shí)施例4樣品為0.5ml牛血清白蛋白(50mg/ml)和0.5ml牛血紅蛋白(20mg/ml)的混合物。固定相為DEAE-Sepahdex A-50葡聚糖凝膠，0.05mol/L Tris-HCl(pH8.3)平衡后，用0.05mol/L Tris-HCl(pH8.3，含0.1mol/L NaCl)洗脫。通電時(shí)兩種蛋白分開(kāi)成兩個(gè)峰。如果不通電，在同樣條件下層析，只有一個(gè)峰流出，兩種蛋白沒(méi)有分離開(kāi)。
實(shí)施例5樣品為20ml人血清。固定相為DEAE-Sepahdex A-50葡聚糖凝膠，0.05mol/LTris-HCl(pH8.3，含0.1mol/L NaCl)平衡后，用0.05mol/L Tris-HCl(pH8.3，含0.2mol/L NaCl)洗脫。電層析分離出10余個(gè)峰。用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)每個(gè)峰中所含的蛋白種類，每個(gè)峰內(nèi)含1～3種蛋白質(zhì)。如果不通電，用同樣的柱、同樣的固定相和同樣的進(jìn)樣量作層析分離，緩沖液為0.01mol/L Tris-HCl(pH8.3，NaCl濃度從0.2mol/L線性增加到0.7mol/L)，僅分離出5個(gè)峰，每個(gè)峰內(nèi)含1～5種蛋白質(zhì)。
權(quán)利要求
1.一種電層析分離制備生物物質(zhì)的方法，其特征是，用制備規(guī)模的電層析方法分離生物物質(zhì)，具體步驟如下(1)裝柱，將處理好的固定相加入電層析柱中；(2)平衡電層析柱，向電層析柱中注入緩沖液，直到進(jìn)入柱內(nèi)和流出柱外的緩沖液的pH及組成相同；(3)加樣，將需要分離的樣品加入電層析柱中；(4)電層析，向電層析柱中加入緩沖液，開(kāi)啟與柱兩端的電極相連接的高壓電源，收集流出液，進(jìn)行分析或進(jìn)一步純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電層析分離制備生物物質(zhì)的方法，其特征是，所述的電層析柱內(nèi)裝填各種固定相。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的電層析分離制備生物物質(zhì)的方法，其特征是，所述的固定相的顆粒大小為10-1000μm，固定相體積為1-4000ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的電層析分離制備生物物質(zhì)的方法，其特征是，所述的固定相為離子交換樹(shù)脂、吸附樹(shù)脂、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電層析分離制備生物物質(zhì)的方法，其特征是，所述的緩沖液為無(wú)機(jī)鹽或有機(jī)鹽及酸、堿配制成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或者5所述的電層析分離制備生物物質(zhì)的方法，其特征是，所述的緩沖液，包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽、乙酸鹽、三羥甲基氨基甲烷、氨基酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或者5所述的電層析分離制備生物物質(zhì)的方法，其特征是，所述的緩沖液，緩沖液中加入乙醇、甲醇、丙酮水溶性有機(jī)溶劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或者5所述的電層析分離制備生物物質(zhì)的方法，其特征是，所述的緩沖液，緩沖液中鹽類濃度范圍為0.01-0.50mol/L，pH范圍為2-10，有機(jī)溶劑含量為0％-60％。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電層析分離制備生物物質(zhì)的方法，其特征是，所述的需要分離的樣品，是水溶性的離子性生物產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或者9所述的電層析分離制備生物物質(zhì)的方法，其特征是，所述的需要分離的樣品，在電層析柱的進(jìn)口處加入需要分離的樣品，加樣量為0.1-2000mg。
全文摘要
一種電層析分離制備生物物質(zhì)的方法。用制備規(guī)模的電層析方法分離生物物質(zhì)，具體步驟如下(1)裝柱，將處理好的固定相加入電層析柱中；(2)平衡電層析柱，向電層析柱中注入緩沖液，直到進(jìn)入柱內(nèi)和流出柱外的緩沖液的pH及組成相同；(3)加樣，將需要分離的樣品加入電層析柱中；(4)電層析，向電層析柱中加入緩沖液，開(kāi)啟與柱兩端的電極相連接的高壓電源，收集流出液，進(jìn)行分析或進(jìn)一步純化。本發(fā)明具有層析法選擇性好、電泳法分辨率高的優(yōu)點(diǎn)；成本低；樣品處理量大，可做制備用；可由操作者手工裝柱；通用性強(qiáng)，適用范圍廣。
文檔編號(hào)B01D15/08GK1706536SQ20051002507
公開(kāi)日2005年12月14日 申請(qǐng)日期2005年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月14日
發(fā)明者趙鳳生, 錢(qián)秀萍, 馮蕾 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)