專利名稱：親和顆粒和親和分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親和顆粒和親和分離方法。更具體的說，涉及利用了無機顆粒的親和顆粒和可高精度且容易地分離目標物質(zhì)的親和分離方法。對于可高精度且容易地檢測目標物質(zhì)的免疫沉淀法、膠乳凝集法等為代表的各種分離、純化、檢測方法也極為有用。
背景技術(shù)：
以往，生物體物質(zhì)的分離純化是采用柱層析。但是，柱分離中有以下(1)-(3)所示的致命的問題。
(1)為了獲得目標物質(zhì)，必須使用多種柱，純化效率差。
(2)必須進行確認實驗，以確認分離成分中是否含有目標物質(zhì)，因此純化需要較多時間。
(3)純化時的損失大，需要大量的樣品。
為解決上述問題，在目標物質(zhì)的分離純化中采用了擔載有配體的親和柱或親和顆粒(專利文獻1、專利文獻2)。
但是，通過親和柱進行分離純化有以下的問題。
(1)所需目標物質(zhì)無法選擇性分離。即，除被配體捕獲的目標物質(zhì)之外，不希望的目標物質(zhì)也吸附在柱上。
(2)捕捉效率低，需要大量的液體試樣。
另外，在將親和顆粒分散在液體試樣中進行分離的親和分離方法中，要使用瓊脂糖等(非專利文獻1)，這有以下問題。
(1)所需目標物質(zhì)無法選擇性分離。即，除被配體捕獲的目標物質(zhì)之外，不希望的目標物質(zhì)也吸附于親和顆粒上。
(2)比重輕，難以分離親和顆粒。
(3)容易發(fā)生載體的崩解，耐久性低。
另一方面，由于無機顆粒比有機顆粒吸附更多的物質(zhì)，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員并沒有想到利用無機顆粒作為親和顆粒。
專利文獻1日本特公平8-26076號公報專利文獻2日本特表2002-511141號公報非專利文獻1Bioconjugate Chem.；2002；13(2)；163-166發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明提供具有劃時代意義的親和分離方法，該方法通過利用了便宜的無機顆粒的親和顆粒，可簡便且高精度地分離目標物質(zhì)。另外，對于以可高精度且容易地檢測目標物質(zhì)的免疫沉降法、膠乳凝集法等為代表的各種分離、純化、檢查方法極為有用。
解決課題的方法即，本發(fā)明提供親和顆粒，其特征在于無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示磷酰膽堿基。
本發(fā)明還提供親和顆粒，其特征在于無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基，無機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有可與對某種目標物質(zhì)具有特異親和性的配體結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
本發(fā)明又提供親和顆粒，其特征在于無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基，無機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有與某種目標物質(zhì)具有特異親和性的配體。
本發(fā)明還提供上述親和顆粒，其特征在于上述無機顆粒為選自二氧化硅、氧化鈦、鋅白、氧化鋁、氧化鐵、滑石粉、云母、絹云母、膠體金的一種或多種無機顆粒，其平均粒徑為20nm-500μm，比重為1.0g/cm2以上。
本發(fā)明又提供上述親和顆粒，其特征在于上述配體為選自各種抗體、抗原、酶、底物、受體、凝集素、肽、DNA、RNA、核酸配體、蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物、各種金屬離子的一種或多種配體。
本發(fā)明還提供通過無機顆粒進行的目標物質(zhì)的親和分離方法，其特征在于包含以下步驟(1)使權(quán)利要求1或2的親和顆粒與任意的配體結(jié)合的第1步驟，(2)使第1步驟中制造的親和顆粒分散于液體試樣中的第2步驟，其中液體試樣含有被任意的配體選擇性捕獲的目標物質(zhì)，(3)回收由親和顆粒捕獲的目標物質(zhì)的第3步驟。
本發(fā)明又提供通過無機顆粒進行的目標物質(zhì)的親和分離方法，其特征在于包含以下步驟(1)使權(quán)利要求3的親和顆粒分散于液體試樣中的第1步驟，其中所述液體試樣含有被任意的配體選擇性捕獲的目標物質(zhì)，(2)回收由親和顆粒捕獲的目標物質(zhì)的第2步驟。將本發(fā)明的親和顆粒應(yīng)用于免疫沉淀法或膠乳凝集法等抗體或蛋白的檢測時，不需要(2)的回收步驟，可通過目視，通過其分散狀態(tài)的變化容易地進行確認。
發(fā)明效果本發(fā)明的親和顆粒通過配體只捕獲某種目標物質(zhì)(希望分離的目標物質(zhì))，并抑制其它物質(zhì)吸附于顆粒上，因此分離選擇性極高。由于其優(yōu)異的分散性和極容易從液體試樣中分離，通過利用了便宜的無機粉末顆粒的親和顆粒，即可簡便且高精度地分離目標物質(zhì)。
也就是說，本發(fā)明的目標物質(zhì)的分離方法可以在短時間且有效、簡便地分離以分離為目的的目標物質(zhì)。通常，物質(zhì)具有吸附異物的性質(zhì)，以往的親和顆粒難以有效地只分離目標物質(zhì)，但通過用磷酰膽堿基修飾顆粒表面，可極有效地防止其它物質(zhì)與親和顆粒的非特異性吸附，可提高純化效率。
另外，磷酰膽堿基具有極高的親水性，在含有水的液體試樣中，也具有使親和顆粒的分散性提高的功能。
并且，通常的顆粒具有因鹽而凝集的傾向，例如要從血清中分離目標物時，由于血清中的各種鹽而發(fā)生凝集，純化效率降低，但本發(fā)明的親和顆粒在鹽存在下也很少凝集，可有效地回收目標物質(zhì)。
本發(fā)明使用的親和顆粒由無機顆粒構(gòu)成，因此比重高，通過靜置或輕度離心即可容易地回收。另外將該顆粒作為載體裝柱，也可以以親和柱的形式用于目標物質(zhì)的回收。
附圖簡述
圖1是表示本發(fā)明的親和顆粒與以往的親和顆粒在捕獲蛋白質(zhì)時的選擇性的差異的模式圖。
圖2是合成例1制造的化合物的結(jié)構(gòu)式和NMR波譜。
圖3是合成例2制備的化合物的結(jié)構(gòu)式和NMR波譜。
圖4是使用合成例5制備的PC顆粒(A)、(B)、(C)和合成例6制備的Af顆粒(A)、(B)、(C)進行P定量的結(jié)果。
圖5是參考例1制備的PC顆粒(A)的31P-CPMAS波譜。
圖6是參考例1制備的PC顆粒(A)的FT-IR波譜。
圖7是參考例3制備的PC顆粒(C)的13C-CPMAS波譜。
圖8是對參考例1、2、3制備的PC顆粒(A)、(B)、(C)抑制蛋白質(zhì)非特異吸附的評價。
圖9是實施例1中進行的使用Af顆粒(A)的對抗牛白蛋白抗體、抗人血紅蛋白的選擇性的評價。
圖10是實施例2中進行的使用Af顆粒(B)的對抗牛白蛋白抗體、抗人血紅蛋白的選擇性的評價。
圖11是實施例3中進行的使用Af顆粒(C)的對抗牛白蛋白抗體、抗人血紅蛋白的選擇性的評價。
圖12是實施例1、3中進行的使用Af顆粒(A)、(C)的對山羊抗血清的選擇性的評價。
圖13是實施例1、3中進行的使用Af顆粒(A)、(C)的對山羊血清中抗人血紅蛋白的選擇性評價。
圖14是比較例1中進行的使用氨基顆粒的對抗牛白蛋白抗體、抗人血紅蛋白的選擇性的評價。
實施發(fā)明的最佳方式以下詳細說明本發(fā)明。
“無機顆粒”本發(fā)明中，對于構(gòu)成親和顆粒的無機顆粒沒有特別限定。無機顆粒通常是指平均粒徑為20nm-500μm左右的無機物體。具體的顆粒例如有滑石粉、高嶺土、云母、絹云母、白云母、金云母、合成云母、紅云母、黑云母、蛭石、碳酸鎂、碳酸鈣、硅酸鋁、硅酸鋇、硅酸鈣、硅酸鎂、硅酸鍶、鎢酸金屬鹽、鎂、二氧化硅、沸石、硫酸鋇、燒結(jié)硫酸鈣(燒石膏)、磷酸鈣、氟化磷灰石、羥基磷灰石、陶瓷粉末、金屬皂(例如肉豆蔻酸鋅、棕櫚酸鈣、硬脂酸鋁)、氮化硼、氧化鈰、膠體金等無機顆粒。
特別優(yōu)選的顆粒是二氧化硅、氧化鈦、鋅白、氧化鋁、氧化鐵、滑石粉、云母、絹云母、膠體金等。與多孔質(zhì)的無機顆粒相比，優(yōu)選無孔質(zhì)的無機顆粒。
上述(1)式的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團通過共價鍵導(dǎo)入顆粒表面，因此優(yōu)選其表面具有氨基的顆粒。
還優(yōu)選無機顆粒的平均粒徑為20nm-500μm，比重為1.0g/cm2以上。
例如有二氧化硅、氧化鈦、鋅白、氧化鋁、氧化鐵、滑石粉、云母、絹云母、膠體金等。
“配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團”只要配體可結(jié)合即可，沒有特別限定。例如共價鍵形態(tài)中，優(yōu)選酰胺、酯、聚氨酯、醚、仲胺、脲鍵、二硫鍵等。因此，優(yōu)選配體可以形成這些共價鍵形態(tài)的反應(yīng)基團，優(yōu)選氨基、羥基、羧基、硫醇基、醛基等。吸附形態(tài)優(yōu)選抗生物素蛋白-生物素、金屬-螯形化合物等。因此優(yōu)選配體可以形成這些吸附形態(tài)的吸附基團，優(yōu)選抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物等。
“配體”本發(fā)明中，配體是與某種目標物質(zhì)特異性結(jié)合的物質(zhì)，是各種抗體、抗原、酶、底物、受體、肽、DNA、RNA、核酸配體、蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白、生物素、螯形化合物、各種金屬離子等。例如，各種抗體有IgG、IgM、IgA、IgD、IgE、IgY，抗原有蛋白質(zhì)、多糖類，酶有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，底物有谷胱甘肽，受體有激素受體、細胞因子受體，螯形化合物有氮川三乙酸、各種金屬離子有Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+、Fe3+。
“本發(fā)明的親和顆粒的制造方法”無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有式(1)所示的磷酰膽堿基，無機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式直接存在可以與對某種目標物質(zhì)具有特異親和性的配體結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，這是本發(fā)明的本質(zhì)，因此其制備方法沒有限定，可以通過任何方法結(jié)合。
不過，如上所述，使用預(yù)先具有磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團的聚合物、沒有化學鍵、只是被覆在顆粒表面的方案不包含在本發(fā)明中。這是由于被覆的聚合物可能發(fā)生剝離，出現(xiàn)由于被覆聚合物產(chǎn)生的影響。
本發(fā)明的親和顆粒可通過下述方法等制備。
步驟1向顆粒導(dǎo)入下述式(1)所示的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。對反應(yīng)基團或吸附基團沒有限定，可以是氨基或羥基、羧基、醛基等。
步驟2對于使式(1)所示的磷酰膽堿基和配體與導(dǎo)入顆粒的反應(yīng)基團或吸附基團結(jié)合。在磷酰膽堿基或配體與反應(yīng)基團或吸附基團之間存在的化學結(jié)構(gòu)(間隔基團)是任意的。例如任意的間隔基團除亞甲基鏈、氧乙烯基鏈等之外，還可以是含有一個或多個氨基的亞烷基鏈。
“存在于顆粒表面的反應(yīng)基團或吸附基團為氨基時”步驟1可通過公知的方法或今后開發(fā)的方法將氨基導(dǎo)入任意的顆粒中。氨基可直接導(dǎo)入顆粒表面。氨基為伯胺或仲胺。
步驟2由甘油磷酰膽堿的氧化性開裂反應(yīng)得到醛體或水合物，將其與具有氨基的顆粒進行還原性氨基化反應(yīng)，將磷酰膽堿基直接附加于顆粒表面。
不使磷酰膽堿基與全部氨基結(jié)合(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，殘留的氨基成為配體可結(jié)合的取代基。
或者，由甘油磷酰膽堿的氧化開裂反應(yīng)得到羧基體，將其與具有氨基的顆粒進行酰胺化反應(yīng)，將磷酰膽堿基直接附加于顆粒表面。
不使磷酰膽堿基與全部氨基結(jié)合(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，殘留的氨基成為配體可結(jié)合的取代基。
“顆粒表面導(dǎo)入氨基的方法”將氨基導(dǎo)入顆粒的公知的方法(步驟1)如下所述。
1.通過等離子體處理的表面反應(yīng)導(dǎo)入氨基在氮氣氣氛下，通過低溫等離子體向顆粒表面導(dǎo)入氨基。具體來說，將顆粒裝入等離子體反應(yīng)容器內(nèi)，用真空泵將反應(yīng)容器內(nèi)抽真空，然后導(dǎo)入氮氣。接著可通過輝光放電向顆粒表面導(dǎo)入氨基。也可以將經(jīng)等離子體處理的無機材粒進行機械制粒。關(guān)于等離子體處理的文獻如下所示。
1.M.Muller，C.oehrPlasma aminofunctionalisation of PVDF microfiltration membranescomparison of the in plasma modifications with a grafting method usingESCA and an amino-selective fluorescent probeSurface and Coatings Technology 116-119(1999)802-8072.Lidij a Tusek，Mirko Nitschke，Carsten Werner，Karin Stana-Kleinschek，Volker RibitschSurrace characterization of NH3 plasma treated polyamide 6 foilsColloids and Surfaces APhysicochem.Eng.Aspects 195(2001)81-953.Fabienne Poncin-Epaillard，Jean-Claude Brosse，Thierry FalherReactivity of surface groupsformed onto a plasma treated poly(propylene)filmMacromol.Chem.Phys.200.989-996(1999)
2.通過表面改性劑導(dǎo)入氨基使用具有氨基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氨烷等表面改性劑，對含有硅烷醇的顆粒等無機顆粒表面進行處理。
例如，通過具有伯氨基的3-氨基丙基三甲氧基硅烷，對二氧化硅顆粒進行處理，導(dǎo)入氨基。具體來說，將二氧化硅浸入水-2-丙醇混合液中，添加3-氨基丙基三甲氧基硅烷，然后加熱至100℃，反應(yīng)6小時。冷卻至室溫后，用甲醇將二氧化硅洗滌，干燥，可得到氨基直接導(dǎo)入到二氧化硅表面的顆粒。優(yōu)選所處理的顆粒除二氧化硅以外，還有玻璃、氧化鋁、滑石粉、粘土、云母、石棉、氧化鈦、鋅白、氧化鐵等顆粒。
3.通過有機硅氣相處理導(dǎo)入氨基(參照日本特公平1-54379號公報、日本特公平1-54380號公報、日本特公平1-54381號公報)首先通過1，3，5，7-四甲基環(huán)四硅氧烷對顆粒表面進行處理，使導(dǎo)入到表面的Si-H基與具有氨基的單體反應(yīng)，得到氨基化的表面。例如，將云母和1，3，5，7-四甲基環(huán)四硅氧烷裝入干燥器中，用吸氣機進行脫氣。在80℃下反應(yīng)16小時，然后取出云母，在120℃下干燥。將所得云母分散于乙醇中，添加烯丙胺，接著添加氯鉑酸的乙醇溶液，在60℃下攪拌2小時，反應(yīng)終止后過濾，用乙醇洗滌，減壓干燥，得到氨基化云母。這適合對各種無機顆粒(云母、滑石粉、高嶺土、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋅、氧化鐵、各種無機顏料)進行處理。
本方法中使用的單體可以使用胺系單體。胺系單體不限于烯丙胺，只要具有氨基和可聚合的乙烯基、丙烯基等反應(yīng)性部位即可。氨基可被丁氧基羰基、芐氧基羰基等保護。
另外，即使不是胺系單體，如環(huán)氧基那樣，也可以是具有例如通過與二胺的反應(yīng)可簡單地導(dǎo)入氨基的官能團的單體。
“向具有氨基的顆粒導(dǎo)入磷酰膽堿基的方法”下面，如下表示向氨基化顆粒表面導(dǎo)入磷酰膽堿基的方法(步驟2)。
將顆粒浸泡于甲醇中，添加磷脂酰甘油醛，在室溫下放置6小時。然后在0℃下添加氰基硼酸鈉，加熱攪拌過夜，向氨基加成磷酰膽堿基。將顆粒用甲醇洗凈后，干燥，可得到表面直接具有磷酰膽堿基的顆粒。反應(yīng)溶劑除甲醇外，只要是乙醇、2-丙醇等質(zhì)子性溶劑均可使用，使用甲醇時的導(dǎo)入率較高。
使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷作為表面改性劑，將氨基導(dǎo)入二氧化硅、接著導(dǎo)入磷酰膽堿基(簡稱PC)的方法的方案如下所示。
如上所述，制備具有氨基的顆粒，由甘油磷酰膽堿的氧化性開裂反應(yīng)得到醛體或水合物，通過其與具有氨基的顆粒的還原性氨基化反應(yīng)，可以制備磷酰膽堿基直接附加在顆粒表面的顆粒。
該方法具有磷酰膽堿基的導(dǎo)入率高，而且可以修飾各種無機顆粒的表面的優(yōu)點。
上述含有醛的化合物，是通過公知的方法將公知的甘油磷酰膽堿進行氧化性開裂得到的，是極簡單的步驟。例如使用高碘酸、高碘酸鹽或三氧化鉍等氧化劑，對1，2-二醇進行氧化，使鍵開裂，得到醛體。反應(yīng)通常在水中或含有水的有機溶劑中進行，反應(yīng)溫度為0℃至室溫。醛體在水中經(jīng)過平衡反應(yīng)可成為水合物，這對于接下來的與胺的反應(yīng)沒有影響。以下表示制備含有磷酰膽堿基的單官能醛體的方案的一個例子。
使由甘油磷酰膽堿的氧化性開裂反應(yīng)得到的醛體(或水合物)與顆粒的氨基結(jié)合的還原性氨基化反應(yīng)可通過將兩者在溶劑中攪拌而容易地進行。該反應(yīng)是將兩者溶解或分散于水或醇中(可以混合第三成分的有機溶劑)，形成亞胺，然后通過還原劑將其還原，得到仲胺。還原劑優(yōu)選氰基硼酸鈉等溫和的還原劑，只要磷酰膽堿穩(wěn)定，也可以使用其它還原劑。反應(yīng)通常在0℃至室溫下進行，也可以根據(jù)情況加熱。
可以使式(2)所示的化合物以任意的量、按照常規(guī)方法與上述氨基反應(yīng)，也可以將殘留的氨基作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
n＝1-12的整數(shù)具體方法如下例如可將式(2)的化合物與亞硫酰氯在N，N’-二甲基甲酰胺中反應(yīng)，制成酰氯化物，在N，N’-二甲基甲酰胺中與具有氨基的顆粒反應(yīng)，通過酰胺鍵導(dǎo)入式(1)所示的磷酰膽堿基。
式(2)的化合物可通過下述方案合成。
“關(guān)于配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團”上述反應(yīng)中，不使磷酰膽堿基與全部氨基結(jié)合(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，殘留的氨基成為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。該顆粒為權(quán)利要求2的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團直接存在于無機顆粒的表面的顆粒。配體與該殘留的氨基結(jié)合的顆粒是權(quán)利要求3的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體直接存在于無機顆粒的表面的顆粒。
權(quán)利要求2的親和顆粒是使用者根據(jù)要捕獲的物質(zhì)(目標物質(zhì))，可使其與任意的配體結(jié)合的制品形式。權(quán)利要求3的親和顆粒是預(yù)先與使其與配體結(jié)合了的制品形式。權(quán)利要求1的親和顆粒是至少式(1)的磷酰膽堿基存在于顆粒表面的親和顆粒，不管有否配體或可與其結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，使用者根據(jù)要捕獲的物質(zhì)(目標物質(zhì))，可以使其與任意的配體結(jié)合的制品形式。只要至少式(1)所示的磷酰膽堿基存在于顆粒表面，則包含任何形式的親和顆粒，例如也包含權(quán)利要求2和權(quán)利要求3的形式。
上述反應(yīng)中，使氨基殘留以作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，這可通過使3-氨基丙基三甲氧基硅烷和導(dǎo)入了磷酰膽堿基的3-氨基丙基三甲氧基硅烷進行競爭反應(yīng)的方法或調(diào)節(jié)反應(yīng)量等來進行。
也可以使任意的具有官能團的化合物與該氨基反應(yīng)，使該官能團成為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。例如可以是戊二醛、二亞氨酸烷基酯、?；B氮基類、異氰酸酯類等。
在使用3-氨基丙基三甲氧基硅烷作為上述表面改性劑時的方案中，調(diào)節(jié)表面改性劑的反應(yīng)量，使存在于顆粒表面的羥基(OH)殘留，可以利用殘留的OH基作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
“配體與具有氨基的顆粒的結(jié)合方法”配體為蛋白質(zhì)時，可以使戊二醛的一個醛基與無機顆粒上的氨基反應(yīng)，使蛋白質(zhì)中的氨基與另一個醛基反應(yīng)，從而結(jié)合蛋白質(zhì)。
“存在于顆粒表面的反應(yīng)基團或吸附基團為羥基時”大多數(shù)無機顆粒的表面存在羥基，因此無需新導(dǎo)入象上述氨基那樣的配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，可直接利用存在于顆粒表面的羥基(OH)，導(dǎo)入磷酰膽堿基以及配體或配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。本發(fā)明的親和顆粒優(yōu)選通過該方法制備。
“向具有羥基的顆粒導(dǎo)入磷酰膽堿基的方法”從下述式(3)或(4)的化合物的Si-OMe脫水，與顆粒表面的羥基形成化學鍵。該化學反應(yīng)通過在幾乎所有的有機溶劑中進行加熱·回流來進行，可極容易地定量進行。通過該脫水反應(yīng)，可以導(dǎo)入化學性、物理性極其穩(wěn)定的磷酰膽堿基，因而優(yōu)選。下述式(3)或式(4)所示的含有磷酰膽堿基的化合物為新型化合物。
[化12] 式中，m為2-6，n為1-4。OMe可以是OEt、Cl。另外與Si結(jié)合的OMe或OEt或Cl中最多兩個可以是甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基。
“式(3)的含磷酰膽堿基化合物的制備方法”將下述式(5)所示的磷酰膽堿衍生物溶解于蒸餾水。下述式(5)的磷酰膽堿衍生物為公知的化合物，可購自市場。
將式(5)的化合物的水溶液在冰水浴中冷卻，加入高碘酸鈉，攪拌5小時。減壓濃縮反應(yīng)液，減壓干燥，通過甲醇萃取下述式(6)所示的具有醛基的磷酰膽堿衍生物。
接著，向式(6)的甲醇溶液中添加0.5當量的3-氨基丙基三甲氧基硅烷。將該混合溶液在室溫下攪拌規(guī)定時間，然后冰冷卻，適量添加氰基硼氫化鈉，回復(fù)至室溫，攪拌16小時。其間繼續(xù)向反應(yīng)容器中通入干燥氮氣。過濾沉淀后，得到式(3)和/或(4)的甲醇溶液。
即使式(3)或(4)所示化合物中的m、n改變，也按照上述順序完全同樣地進行。這里所示的順序是m＝3、n＝2的情況。對反應(yīng)溶劑沒有特別限定，除上述甲醇之外，可以使用水、乙醇、丙醇、丁醇等醇，DMF或DMSO等非質(zhì)子性溶劑。不過，為防止反應(yīng)中的聚合，優(yōu)選脫水溶劑，其中優(yōu)選脫水甲醇。
(3)或(4)中的甲氧基(OMe)為乙氧基(OEt)時，可以將甲醇改為乙醇進行反應(yīng)，為Cl時，可只變更為二甲基甲酰胺或二甲基亞砜。
并且，與Si結(jié)合的OMe或OEt或Cl中，2個或1個被甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基的其中之一取代時，也可以與上述方法完全同樣地制備。
“式(4)的含磷酰膽堿基化合物的制備方法”將下述式(5)所示的磷酰膽堿衍生物溶解于蒸餾水和乙腈的混合液中。下述式(5)的磷酰膽堿衍生物是公知的化合物，可從市場購入。
將式(5)的化合物的水溶液在冰水浴中冷卻，添加高碘酸鈉和三氯化釕，攪拌3小時。減壓濃縮反應(yīng)液，減壓干燥，通過甲醇萃取下述式(7)所示的具有羧基的磷酰膽堿衍生物。
接著，在N，N’-二甲基甲酰胺中向式(7)中添加亞硫酰氯，制成酰氯化物，接著添加0.5當量3-氨基丙基三甲氧基硅烷和2當量三乙胺。將該混合溶液在室溫下攪拌規(guī)定時間，得到式(4)的N，N’-二甲基甲酰胺溶液。
即使式(4)中所示的化合物中的m、n改變，也完全按照上述順序同樣地進行。這里所示的順序是m＝3、n＝2的情況。對反應(yīng)溶劑沒有特別限定，除上述N，N’-二甲基甲酰胺之外，還可以使用乙腈，四氫呋喃、二甲基亞砜等非質(zhì)子性溶劑。為防止反應(yīng)中的聚合，優(yōu)選脫水溶劑。
另外，與Si結(jié)合的OMe或OEt或Cl中2個或1個被甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基其中之一取代時，也可以與上述方法完全同樣地制備。
“關(guān)于配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團”上述反應(yīng)中，不使磷酰膽堿基與所有的羥基反應(yīng)(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，則殘留的羥基成為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。該顆粒為權(quán)利要求2的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團直接存在于無機顆粒表面的顆粒。使該殘留的羥基與配體結(jié)合得到的顆粒則是權(quán)利要求3的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體直接存在于無機顆粒的表面的顆粒。
權(quán)利要求2的親和顆粒是使用者根據(jù)要捕獲的物質(zhì)(目標物質(zhì))，可使其與任意的配體結(jié)合的制品形式。權(quán)利要求3的親和顆粒是預(yù)先與配體結(jié)合了的制品形式。權(quán)利要求1的親和顆粒是至少式(1)的磷酰膽堿基存在于顆粒表面的親和顆粒，是不管有否配體或配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，使用者根據(jù)要捕獲的蛋白質(zhì)(某種目標物質(zhì))，可使其與任意的配體結(jié)合的制品形式。另外，只要是至少式(1)的磷酰膽堿基存在于顆粒表面，則本發(fā)明包含任何形式的親和顆粒，例如也包含權(quán)利要求2和權(quán)利要求3的形式。
“配體與具有羥基的顆粒的結(jié)合方法”配體為蛋白質(zhì)時，使用溴化氰活化顆粒上的羥基。使蛋白質(zhì)中的氨基與其反應(yīng)，以此結(jié)合蛋白質(zhì)。
使任何具有官能團的化合物與該羥基反應(yīng)，可以使該官能團成為配體可以結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
“導(dǎo)入到顆粒中的反應(yīng)基團或吸附基團為羧基時”步驟1通過公知的方法或今后開發(fā)的方法將羧基導(dǎo)入任意顆粒中。羧基可直接導(dǎo)入顆粒表面。
步驟2通過常規(guī)方法使下述式(2)所示的含有磷酰膽堿的化合物與具有羧基的顆粒反應(yīng)，使磷酰膽堿基形成酰胺鍵，使殘留的羧基作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
不使磷酰膽堿基與所有羧基結(jié)合(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，則殘留的羧基成為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
“向顆粒表面導(dǎo)入羧基的方法”向顆粒中導(dǎo)入羧基的公知的方法(步驟1)如下所述。
1.通過表面改性劑導(dǎo)入羧基使用具有羧基的烷氧基硅烷、氯硅烷、硅氨烷等表面改性劑，對含有硅氨醇的顆粒等無機顆粒表面進行處理。
例如通過三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐對二氧化硅顆粒進行處理，導(dǎo)入羧基。具體來說，將三乙氧基甲硅烷基丙基琥珀酸酐溶解于N，N-二甲基甲酰胺，添加蒸餾水和4-甲基氨基吡啶，在室溫下攪拌16小時，得到下述式(3)所示的具有羧酸的硅烷偶聯(lián)劑。本反應(yīng)是通過4-二甲基氨基吡啶進行的琥珀酸酐的水解反應(yīng)。
通過具有羧酸的硅烷偶聯(lián)劑，對二氧化硅顆粒進行處理，導(dǎo)入羧基。具體來說，將二氧化硅浸泡在水-2-丙醇混合液中，添加具有羧酸的硅烷偶聯(lián)劑，然后加熱至100℃，反應(yīng)6小時。冷卻至室溫，然后用甲醇洗滌二氧化硅，干燥，可得到羧基直接導(dǎo)入到二氧化硅表面的顆粒。優(yōu)選采取該處理的顆粒除二氧化硅之外，還有玻璃、氧化鋁、滑石粉、粘土、云母、石棉、氧化鈦、鋅白、氧化鐵等顆粒。
2.通過有機硅氣相處理導(dǎo)入羧基(參照日本特公平1-54379號公報、日本特公平1-54380號公報、日本特公平1-54381號公報)首先通過1，3，5，7-四甲基環(huán)四硅氧烷對顆粒表面進行處理，使導(dǎo)入到表面的Si-H基與具有羧基的單體反應(yīng)，得到羧基化表面。優(yōu)選對各種無機顆粒(云母、滑石粉、高嶺土、氧化鋁、氧化鈦、氧化鋅、氧化鐵、各種無機顏料)進行處理。
本方法中使用的單體可以使用羧基系單體。羧基系單體只要具有羧基和可聚合的乙烯基、丙烯基等反應(yīng)性部位即可。
“向具有羧基的顆粒中導(dǎo)入磷酰膽堿基的方法”接著，以下表示向羧基化顆粒表面導(dǎo)入磷酰膽堿基的方法(步驟2)。
將表面具有羧基的顆粒浸泡在N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺的溶液中，顆粒的表面被活性酯基覆蓋。向其中加入式(7)所示的具有氨基的磷酰膽堿衍生物溶液，導(dǎo)入磷酰膽堿基。
“關(guān)于配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團”上述反應(yīng)中，不使磷酰膽堿基與全部的羧基結(jié)合(調(diào)節(jié)反應(yīng)量)，則殘留的羧基成為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。該顆粒為權(quán)利要求2的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團直接存在于無機顆粒表面的顆粒。該配體與該配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團結(jié)合，則成為權(quán)利要求3的親和顆粒，是式(1)所示的磷酰膽堿基和配體直接存在于無機顆粒的表面的顆粒。
權(quán)利要求2的親和顆粒是使用者根據(jù)要捕獲的物質(zhì)(目標物質(zhì))，可使其與任意的配體結(jié)合的制品形式。權(quán)利要求3的親和顆粒是事先與配體結(jié)合的制品形式。權(quán)利要求1的親和顆粒是顆粒表面至少存在式(1)的磷酰膽堿基的親和顆粒，是不管有否配體或配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，使用者根據(jù)要捕獲的物質(zhì)(目標物質(zhì))，可以使其與任何配體結(jié)合的制品形式。只要是顆粒表面存在至少式(1)的磷酰膽堿基，則本發(fā)明包含任何形式的親和顆粒，例如也包含權(quán)利要求2和權(quán)利要求3的形式。
上述反應(yīng)中，使羧基作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團殘留，這可通過調(diào)節(jié)導(dǎo)入到磷酰膽堿基中的具有羧酸的硅烷偶聯(lián)劑的反應(yīng)量來進行。
使任意具有官能團的化合物與該羧基反應(yīng)，該官能團可以作為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
“配體與具有羧基的顆粒的結(jié)合方法”配體為蛋白質(zhì)時，無機顆粒上的羧基浸泡在N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亞胺的溶液中，使顆粒表面形成活性酯。使蛋白質(zhì)中的氨基與其反應(yīng)，以此結(jié)合蛋白質(zhì)。使任意的具有官能團的化合物與該羥基反應(yīng)，則該官能團可以作為蛋白質(zhì)可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。
“目標物質(zhì)的親和分離方法”使用上述所得本發(fā)明的親和顆粒，可以進行本發(fā)明的目標物質(zhì)的親和分離方法。
本發(fā)明方法利用無機顆粒，可簡便的進行高精度的分離，從這點來講，是具有劃時代意義的目標物質(zhì)的分離純化方法。
本發(fā)明的方法包含以下三個步驟。當為配體預(yù)先結(jié)合的親和顆粒時(權(quán)利要求2)，第1步驟已經(jīng)進行，因此省略。
1.使任意的配體與親和顆?；瘜W結(jié)合的第1步驟，其中，親和顆粒的特征在于無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有式(1)所示的磷酰膽堿基的親和顆粒，或者無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有式(1)所示的磷酰膽堿基且無機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有配體，該配體與某種目標物質(zhì)具有特異親和性。
例如，無機顆粒的表面具有式(1)所示的磷酰膽堿基和配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團，其中前者以共價鍵結(jié)合，后者以共價鍵或吸附形式結(jié)合，將這樣的親和顆粒和1ml任意的配體PBS溶液裝入2ml微量離心管中，在4℃下緩慢振蕩30分鐘。以5000rpm離心5分鐘，傾去上清。為了清洗，加入1ml PBS溶液，緩慢振蕩，以5000rpm離心5分鐘，傾去上清。將該清洗操作重復(fù)三次。
2.將第一步驟中制備的親和顆粒分散于液體試樣中的第2步驟，其中所述液體試樣含有可通過任意的配體選擇性捕獲的目標物質(zhì)。
例如，將第1步驟中制備的親和顆粒分散于液體試樣中，其中液體試樣含有可通過任意的配體選擇性地捕獲的目標物質(zhì)，在4℃下緩慢振蕩30分鐘。以5000rpm離心5分鐘，傾去上清。為了清洗，加入1ml PBS溶液，緩慢振蕩，以5000rpm離心5分鐘，傾去上清。將該清洗操作重復(fù)三次。
3.從分離出的親和顆粒中回收捕獲的目標物質(zhì)的第3步驟。
例如，為了從親和顆粒中回收捕獲的目標物質(zhì)，加入1ml洗脫緩沖液，在4℃下緩慢振蕩30分鐘，從顆粒中洗脫目標物質(zhì)，回收上清。加入1ml洗脫緩沖液，緩慢振蕩，以5000rpm離心5分鐘，回收上清。將該操作重復(fù)兩次。
圖1是表示通過本發(fā)明的親和顆粒與以往的親和顆粒捕獲目標物質(zhì)的選擇性的差異的模式圖。
實施例下面根據(jù)實施例進一步詳細說明本發(fā)明。本發(fā)明不受這些實施例的限定。導(dǎo)入到顆粒表面的磷酰膽堿基可通過FT-IR和元素分析進行確認、定量。
“合成例1”“含有磷酰膽堿基的醛化合物”將6.29g 1-α-甘油磷酰膽堿溶解于210ml蒸餾水，在冰水浴中冷卻。添加10.23g高碘酸鈉，攪拌5小時。減壓濃縮反應(yīng)液，減壓干燥，通過甲醇萃取目標物。下述化合物(6)表示其結(jié)構(gòu)。
式(6)的化合物在重水中的1H NMR波譜如圖2所示。式(6)的化合物在水中與式(9)成平衡狀態(tài)，因此實際的波譜反應(yīng)了式(6)和式(9)雙方。
[化19] “合成例2”“含有磷酰膽堿基的羧酸化合物”在200ml燒瓶內(nèi)加入5g甘油磷酰膽堿、17g高碘酸鈉、81mg三氯化釕·n水合物以及70％離子交換水、30g乙腈。在室溫下攪拌2小時，然后過濾，從濾液中除去溶劑。用甲醇從所得固體物質(zhì)中萃取目標化合物，接著通過除去甲醇得到目標化合物(7)。
式(7)的化合物在重水中的1H NMR波譜如圖3所示。
“合成例三”“式(10)的化合物”使5.0g合成例1的化合物溶解于55ml脫水甲醇中，用干燥氮氣置換容器內(nèi)氣體。接著向化合物1的甲醇溶液中添加2.84g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷。將該混合溶液在室溫下攪拌過夜，然后冰冷卻，添加1.39g氰基硼氫化鈉，回復(fù)至室溫，攪拌5小時。其間反應(yīng)容器中繼續(xù)通入干燥氮氣。過濾沉淀，然后得到含有作為目標物質(zhì)的下述式(10)的甲醇溶液。
“合成例4”“式(11)的化合物”使9.0g合成例4的化合物分散于300ml N，N’-二甲基甲酰胺中，用干燥氮氣置換容器內(nèi)氣體。接著添加4.5g亞硫酰氯，攪拌15分鐘，然后添加2.84g 3-氨基丙基三甲氧基硅烷、9.5g三乙胺。將該混合溶液在室溫下攪拌過夜，過濾沉淀，然后得到含有目標物質(zhì)——下述式(11)的化合物的N，N’-二甲基甲酰胺溶液。
“參考例1”“無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有磷酰膽堿基的磷酰膽堿顆粒(PC顆粒(A))”取97.7μl含有50μmol合成例3中制備的式(10)的化合物的甲醇溶液，加入47.5ml甲醇、2.5ml蒸餾水，再添加5g平均粒徑為1.5μm、比表面積為6m2/g的硅膠。使該顆粒分散溶液在80℃下回流過夜，進行偶聯(lián)。回流后用甲醇離心清洗，得到權(quán)利要求1的PC顆粒(以下稱為PC顆粒(A))。按照以上順序、用合成例3的表面改性劑處理的PC顆粒(A)的P定量測定如圖4所示。由此求出的PC導(dǎo)入量為3.1μmol/g的顆粒，可以確認PC基團導(dǎo)入了顆粒表面。
“參考例2”“無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有磷酰膽堿基的磷酰膽堿顆粒(PC顆粒(B))”取27.8μl含有50μmol合成例4中制備的式(11)的化合物的二甲基甲酰胺溶液，加入50ml二甲基甲酰胺，再添加5g平均粒徑為1.5μm、比表面積為6m2/g的硅膠。使該顆粒分散溶液在160℃下回流過夜，進行偶聯(lián)?；亓骱笥眉状茧x心清洗，得到權(quán)利要求1的PC顆粒(以下稱為PC顆粒(B))。按照以上順序，用合成例4的表面改性劑處理的PC顆粒(B)的P定量測定如圖4所示。由此求出的PC導(dǎo)入量為3.4μmol/g的顆粒，可以確認PC基團導(dǎo)入了顆粒表面。
“參考例3”“無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有磷酰膽堿基的磷酰膽堿顆粒(PC顆粒(C))”取27.8μl含有50μmol合成例4中制備的式(11)的化合物的二甲基甲酰胺溶液，加入47.5ml二甲基甲酰胺、2.5ml蒸餾水，再添加5g平均粒徑為1.5μm、比表面積為6m2/g的硅膠。使該顆粒分散溶液在160℃下回流過夜，進行偶聯(lián)?；亓骱笥眉状茧x心清洗，得到權(quán)利要求1的PC顆粒(以下稱為PC顆粒(C))。按照以上順序，用合成例4的表面改性劑處理的PC顆粒(C)的P定量測定如圖4所示。由此求出的PC導(dǎo)入量為7.3μmol/g的顆粒，可以確認PC基團導(dǎo)入了顆粒表面。
參考例1的PC顆粒(A)的13C-CPMAS波譜和13C-PSTMAS波譜如圖5所示。PSTMAS波譜是選擇性地獲得自由運動的分子鏈的波譜的方法，是廣泛用于顆粒表面的修飾鏈分析的方法。圖5中，在54.2ppm處觀測到來自磷酰膽堿基的碳的波譜。
圖6所示的參考例1的PC顆粒(A)的31P-CPMAS波譜中，在作為對象進行測定的NaH2PO4幾乎相同的化學位移值處檢測出峰值，由此可以確認磷酸基的存在。以上結(jié)果可以認為可以將磷酰膽堿基導(dǎo)入載體硅膠表面。
圖5中在9ppm、23ppm附近觀測到來自間隔基團丙基的碳的波譜，在60ppm、69ppm附近觀測到來自磷酰膽堿內(nèi)的乙基的波譜。由以上可知式(10)和(11)的結(jié)構(gòu)未被破壞即可導(dǎo)入到硅膠中。
圖7表示參考例3的PC顆粒(C)的FT-IR波譜。在1650cm-1附近可觀測到酰胺鍵特有的吸收。
“磷酰膽堿顆粒與蛋白質(zhì)的非特異吸附評價”分別取25mg參考例1中使用的未導(dǎo)入磷酰膽堿基、未處理的硅膠顆粒(簡稱未處理顆粒)和參考例1、2、3中制備的PC顆粒(A)、(B)、(C)，加入1ml蒸餾水，進行1分鐘超聲波處理。離心除去蒸餾水，加入1ml 100μg/ml白蛋白或100μg/ml溶菌酶，在室溫下反應(yīng)1小時，用PBS進行5次離心·純化(5000g)，洗滌。接著加入1ml1％SDS，在室溫下反應(yīng)1小時，離心(5000g)，用MICRO BCA法對上清進行定量，其結(jié)果如圖8所示。與未處理顆粒相比，用磷酰膽堿基處理的PC顆粒(A)強烈抑制白蛋白、溶菌酶的吸附。PC顆粒(B)、(C)與未處理顆?；騊C顆粒(A)相比，白蛋白、溶菌酶均進一步被抑制吸附。
“實施例1”“無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有磷酰膽堿基和氨基的親和顆粒(Af顆粒(A))”取87.9μl含有45μmol合成例3中制備的式(10)的化合物的甲醇溶液和50μl含有5μmol 3-氨基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液，加入47.5ml甲醇、2.5ml蒸餾水，再添加5g平均粒徑為1.5μm、比表面積為6m2/g的硅膠。使該顆粒分散溶液在80℃下回流過夜，進行偶聯(lián)?；亓骱笥眉状茧x心清洗，得到權(quán)利要求1的親和顆粒(以下稱為Af顆粒(A))。按以上的順序，用合成例3的表面改性劑進行處理的Af顆粒(A)的P定量測定如圖4所示。由此求出PC導(dǎo)入量為2.7μmol/g的顆粒，可以確認PC基團導(dǎo)入了顆粒表面。
“實施例2”“無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有磷酰膽堿基和氨基的親和顆粒(Af顆粒(B))”取250μl含有45μmol合成例4中制備的式(11)的化合物的二甲基甲酰胺溶液和50μl含有5μmol 3-氨基丙基三甲氧基硅烷的二甲基甲酰胺溶液，再添加5g平均粒徑為1.5μm、比表面積為6m2/g的硅膠。使該顆粒分散溶液在160℃下回流過夜，進行偶聯(lián)?；亓骱笥眉状茧x心清洗，得到權(quán)利要求1的親和顆粒(以下稱為Af顆粒(B))。按以上的順序，用合成例4的表面改性劑處理的Af顆粒(B)的P定量測定如圖4所示。由此求出的PC導(dǎo)入量為3.3μmol/g的顆粒，可以確認PC基團導(dǎo)入了顆粒表面。
“實施例3”“無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有磷酰膽堿基和氨基的親和顆粒(Af顆粒(C))”取250μl含有45μmol合成例4中制備的式(11)的化合物的二甲基甲酰胺溶液和50μl含有5μmol 3-氨基丙基三甲氧基硅烷的二甲基甲酰胺溶液，加入47.5ml二甲基甲酰胺、2.5ml蒸餾水，再添加5g平均粒徑為1.5μm、比表面積為6m2/g的硅膠。使該顆粒分散溶液在160℃下回流過夜，進行偶聯(lián)?；亓骱笥眉状茧x心清洗，得到權(quán)利要求1的親和顆粒(以下稱為Af顆粒(C))。按以上的順序，用合成例4的表面改性劑處理的Af顆粒(C)的P定量測定如圖4所示。由此求出的PC導(dǎo)入量為6.3μmol/g的顆粒，可以確認PC基團導(dǎo)入了顆粒表面。
“親和顆粒的選擇性評價1”接著給出權(quán)利要求6中所示的親和分離方法。向25mg實施例1、2、3中制備的Af顆粒(A)、(B)、(C)中加入1ml蒸餾水，進行1分鐘超聲波處理。通過離心除去蒸餾水，加入1ml 8％戊二醛溶液和10mg用于穩(wěn)定席夫堿的氰基硼氫化鈉(シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム)，在室溫下反應(yīng)5小時，用MQ水離心·純化(5000g)5次。得到戊二醛為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團的權(quán)利要求2的親和顆粒。接著加入1ml 1mg/ml牛白蛋白或1mg/ml人血紅蛋白和10mg硼氫化鈉，在室溫下反應(yīng)1天，用PBS進行4次離心·純化(5000g)。該牛白蛋白或人血紅蛋白為配體。以下是權(quán)利要求7所示的親和分離方法。為了使殘留的戊二醛基失活，加入1ml乙醇胺鹽酸鹽(0.5M、pH 7.1)和10mg硼氫化鈉(トリヒドロホウ酸ナトリウム)，在室溫下反應(yīng)1小時，用PBS進行4次離心·純化(5000g)，得到權(quán)利要求3的親和顆粒。接著加入1ml HRP標記抗牛白蛋白抗體(10μg/ml)或HRP標記抗人血紅蛋白抗體(10μg/ml)，在室溫下反應(yīng)1小時，用PBS離心·純化(5000g)5次。再加入1ml PBS，攪拌，將10μl轉(zhuǎn)移至96孔板，用底物TMBZ進行顯色實驗，用450nm進行測定。其結(jié)果如圖9、圖10、圖11所示。Af顆粒(A)對人血紅蛋白-HRP標記抗人血紅蛋白抗體具有選擇性。Af顆粒(B)、Af顆粒(C)對牛白蛋白-HRP標記抗牛白蛋白抗體、人血紅蛋白-HRP標記抗人血紅蛋白抗體均具有選擇性。
“親和顆粒的選擇性評價2”使用抗人血紅蛋白的山羊抗血清進行選擇性實驗。向25mg實施例1、3中制備的Af顆粒(A)、(C)中加入1ml蒸餾水，進行1分鐘超聲波處理。離心除去蒸餾水，加入1ml 8％戊二醛溶液和10mg用于穩(wěn)定席夫堿的氰基硼氫化鈉，在室溫下反應(yīng)5小時，用MQ水離心·純化(5000g)，清洗5次。得到戊二醛為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團的權(quán)利要求2的親和顆粒。接著加入1ml 1mg/ml人血紅蛋白和10mg硼氫化鈉，在室溫下反應(yīng)1天，用PBS離心·純化(5000g)4次。該人血紅蛋白為配體。以下為權(quán)利要求7所示的親和分離方法。為了使殘留的戊二醛基失活，加入1ml乙醇胺鹽酸鹽(0.5M、pH7.1)和10mg硼氫化鈉，在室溫下反應(yīng)1小時，用PBS進行4次離心·純化(5000g)，得到權(quán)利要求3的親和顆粒。接著加入1ml稀釋為100倍的山羊抗血清，在室溫下反應(yīng)1小時。接著離心(5000g)，得到上清(上清組分)。用PBS進行5次離心·純化(5000g)。接著加入1mlGly-HCl緩沖液(0.2M、pH 2.5)，在室溫下反應(yīng)1小時，洗脫抗人血紅蛋白抗體，離心(5000g)，得到上清(洗脫組分)。將該上清組分和洗脫組分過SDS-PAGE，進行銀染，結(jié)果如圖12所示。對于Af顆粒(A)、(C)，都可見色深的洗脫組分中抗體的重鏈條帶，未見其它條帶，因此可知是高選擇性地捕獲抗體的顆粒。
“親和顆粒的選擇性評價3”使用混合了抗人血紅蛋白的山羊抗血清進行選擇性實驗。向25mg實施例1、3中制備的Af顆粒(A)、(C)中加入1ml蒸餾水，進行1分鐘超聲波處理。離心除去蒸餾水，加入1ml 8％戊二醛溶液和10mg用于穩(wěn)定席夫堿的氰基硼氫化鈉，在室溫下反應(yīng)5小時，用MQ水離心·純化(5000g)，清洗5次。得到戊二醛為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團的權(quán)利要求2的親和顆粒。接著加入1ml 1mg/ml人血紅蛋白和10mg硼氫化鈉，在室溫下反應(yīng)1天，用PBS離心純化(5000g)4次。該人血紅蛋白為配體。以下為權(quán)利要求7所示的親和分離方法。為了使殘留的戊二醛基失活，加入1ml乙醇胺鹽酸鹽(0.5M、pH7.1)和10mg硼氫化鈉，在室溫下反應(yīng)1小時，用PBS進行4次離心·純化(5000g)，得到權(quán)利要求3的親和顆粒。接著加入1ml混合了50μg抗人血紅蛋白的稀釋為100倍的山羊血清，在室溫下反應(yīng)1小時。接著離心(5000g)，得到上清(上清組分)。用PBS進行5次離心·純化(5000g)。接著加入1ml Gly-HCl緩沖液(0.2M、pH 2.5)，在室溫下反應(yīng)1小時，洗脫抗人血紅蛋白抗體，離心(5000g)，得到上清(洗脫組分)。將該上清組分和洗脫組分過SDS-PAGE，進行銀染，結(jié)果如圖13所示。對于Af顆粒(A)、(C)，都可見色深的洗脫組分中抗體的重鏈條帶，其它只可見色淺的條帶，因此可知是高選擇性地捕獲抗體的顆粒。從條帶的濃度看，抗體捕獲量為10-20μg左右。通過夾層ELISA確認洗脫組分的抗體活性，可知Af顆粒(A)為13.0μg、Af顆粒(C)為10.1μg左右的活性。
“比較例1”“無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有氨基的親和顆粒(氨基顆粒)”取500μl含有50μmol 3-氨基丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液，加入47.5ml甲醇、2.5ml蒸餾水，再添加5g平均粒徑為1.5μm、比表面積為6m2/g的硅膠。使該顆粒分散溶液在80℃下回流過夜，進行偶聯(lián)?；亓骱笥眉状茧x心清洗，得到氨基顆粒。向25mg該氨基顆粒中加入1ml蒸餾水，進行1分鐘超聲波處理。通過離心除去蒸餾水，加入1ml 8％戊二醛溶液和10mg用于穩(wěn)定席夫堿的氰基硼氫化鈉，在室溫下反應(yīng)5小時，用MQ水離心·純化(5000g)，清洗5次。戊二醛為配體可結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團。接著加入1ml1mg/ml牛白蛋白或1mg/ml人血紅蛋白和10mg硼氫化鈉，在室溫下反應(yīng)1天，用PBS進行4次離心·純化(5000g)。該牛白蛋白或人血紅蛋白為配體。為使殘留的戊二醛基失活，加入1ml乙醇胺鹽酸鹽(0.5M、pH 7.1)和10mg硼氫化鈉，在室溫下反應(yīng)1小時，用PBS進行4次離心·純化(5000g)，得到權(quán)利要求3的親和顆粒。接著加入1ml10μg/ml的HRP標記抗牛白蛋白抗體或10μg/ml的HRP標記抗人血紅蛋白抗體，在室溫下反應(yīng)1小時，用PBS進行5次離心·純化(5000g)。再加入1ml PBS，攪拌，將10μl轉(zhuǎn)移至96孔板，使用底物TMBZ進行顯色實驗，用450nm進行測定。其結(jié)果如圖14所示。蛋白質(zhì)的非特異性吸附多，選擇性低。
產(chǎn)業(yè)實用性本發(fā)明的親和顆粒只捕獲要分離的目標蛋白質(zhì)，因此選擇性極高。另外分散性優(yōu)異，極容易從液體試樣中分離。通過利用了便宜的無機顆粒的親和顆粒，可簡便且高精度地分離目標物質(zhì)，因此可用作要求高精度分離目標物質(zhì)的生物體相關(guān)產(chǎn)業(yè)。
權(quán)利要求
1.一種親和顆粒，其特征在于無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基[化1]
2.一種親和顆粒，其特征在于無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基，無機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有可與對某種目標物質(zhì)具有特異親和性的配體結(jié)合的反應(yīng)基團或吸附基團[化2]
3.一種親和顆粒，其特征在于無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基，無機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有與某種目標物質(zhì)具有特異親和性的配體[化3]
4.權(quán)利要求1-3中任一項的親和顆粒，其特征在于上述無機顆粒為選自二氧化硅、氧化鈦、鋅白、氧化鋁、氧化鐵、滑石粉、云母、絹云母、膠體金的一種或多種無機顆粒，其平均粒徑為20nm-500μm，比重為1.0g/cm2以上。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的親和顆粒，其特征在于上述配體為選自各種抗體、抗原、酶、底物、受體、凝集素、肽、DNA、RNA、核酸配體、蛋白A、蛋白G、抗生物素蛋白、生物素、螯合化合物、各種金屬離子的一種或多種配體。
6.一種通過無機顆粒進行的目標物質(zhì)的親和分離方法，其特征在于包含以下步驟(1)使權(quán)利要求1或2的親和顆粒與任意的配體結(jié)合的第1步驟，(2)使第1步驟中制造的親和顆粒分散于液體試樣中的第2步驟，其中液體試樣含有被任意的配體選擇性捕獲的目標物質(zhì)，(3)回收由親和顆粒捕獲的目標物質(zhì)的第3步驟。
7.一種通過無機顆粒進行的目標物質(zhì)的親和分離方法，其特征在于包含以下步驟(1)使權(quán)利要求3的親和顆粒分散于液體試樣中的第1步驟，其中所述液體試樣含有被任意的配體選擇性捕獲的目標物質(zhì)，(2)回收由親和顆粒捕獲的目標物質(zhì)的第2步驟。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供親和顆粒，其特征在于無機顆粒的表面以共價鍵的形式具有下述式(1)所示的磷酰膽堿基，無機顆粒的表面以共價鍵或吸附的形式具有與某種目標物質(zhì)具有特異親和性的配體。本發(fā)明的目的還在于提供親和分離方法，該方法通過利用了便宜的無機顆粒的親和顆粒，可簡便且高精度地分離目標物質(zhì)。
文檔編號B01J20/281GK1956779SQ20058001655
公開日2007年5月2日 申請日期2005年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月24日
發(fā)明者石原一彥, 前野克行, 宮澤和之, 石洼章 申請人:株式會社資生堂, 石原一彥