專(zhuān)利名稱(chēng)：制備色譜基質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及目標(biāo)化合物，例如生物分子的分離和純化，更具體地，涉及色譜基質(zhì)，和制備其的新方法。本發(fā)明還包括該基質(zhì)在液相色譜中的用途和用基質(zhì)填充的色譜柱。
背景技術(shù)：
近年來(lái)在生物技術(shù)領(lǐng)域的進(jìn)步要求用于回收、純化和分析生物學(xué)和生物化學(xué)物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)的更快和更準(zhǔn)確的技術(shù)，電泳和色譜法是兩種常用的該類(lèi)技術(shù)。
在電泳技術(shù)中，帶電的微粒通過(guò)在電場(chǎng)中遷移分離。更具體地，將樣品放置在軟的固體支撐介質(zhì)，例如瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠厚片上，隨后將其放置在兩個(gè)電極，正電荷陽(yáng)極和負(fù)電荷陰極之間。在電流接通時(shí)，樣品的每個(gè)組分將以由其凈電荷和分子量決定的特定速率遷移。良好運(yùn)轉(zhuǎn)的電泳法的一種基本性質(zhì)是它的熔融點(diǎn)，它影響由分離的凝膠斑中選取遷移的目標(biāo)化合物的能力。因此，低熔融點(diǎn)凝膠通常是有利的，天然瓊脂糖通常用于電泳凝膠，但它們也被提及包含某些問(wèn)題。例如，盡管天然瓊脂糖的粗糙孔結(jié)構(gòu)對(duì)拆分大的大分子是杰出的，但必須制備用于較小分子的較小分子量瓊脂糖，這通常通過(guò)增加凝膠的瓊脂糖含量得到，然而產(chǎn)生了溶液的高粘度，致使凝膠的澆鑄困難。為克服此類(lèi)問(wèn)題和其它問(wèn)題，人們建議將改性瓊脂糖用于電泳凝膠電泳法在US3956273(Guiseley)中討論，它涉及用于電泳法或擴(kuò)散相互反應(yīng)，并且還用作增稠劑的瓊脂糖或瓊脂化合物。該類(lèi)化合物用烷基和烯基改性以降低其形成凝膠和熔融溫度，和與未改性的物質(zhì)相比的增加其透明。更具體地，首先將瓊脂或瓊脂糖溶解在強(qiáng)堿中，隨后加入合適的試劑以提供改性?？墒褂秒p官能團(tuán)試劑，例如表氯醇，但僅在預(yù)防交聯(lián)的條件下。
電泳法還在US5,143,646(Nochumson等)中討論，它涉及電泳解析凝膠組合物，其含有多糖水凝膠，例如瓊脂糖，它已被足夠地衍生和解聚以降低其澆鑄有效的粘度。公開(kāi)的組合物不需要任何交聯(lián)或聚合試劑。
此外，US 5,541,255(Kozulic)涉及用于電泳法的凝膠，更具體地，涉及交聯(lián)的線性多糖聚合物。凝膠通過(guò)將多糖溶解在溶劑，例如水中，加入不帶電荷，并且在與水接觸時(shí)也不變成帶電荷的交聯(lián)劑，在靜止?fàn)顟B(tài)下培養(yǎng)混合物以同時(shí)使多糖與交聯(lián)劑反應(yīng)和凝膠化產(chǎn)物成厚片而形成。根據(jù)US 5,541,255，現(xiàn)有技術(shù)的電泳凝膠不能重新溶解在水中，而US 5,541,255發(fā)明提供了水不可溶解的凝膠。這些性質(zhì)是由于同時(shí)交聯(lián)和凝膠化產(chǎn)生的，同時(shí)還由于交聯(lián)劑與多糖的高比率。
在色譜法中，使兩種互相不能溶解的相互相接觸。更具體地，將目標(biāo)化合物引入移動(dòng)相，它與固定相接觸，目標(biāo)化合物隨后在由移動(dòng)相攜帶通過(guò)系統(tǒng)時(shí)在固定和移動(dòng)相之間進(jìn)行一系列的相互作用。相互作用充分利用了樣品中組分的物理或化學(xué)性質(zhì)的差異。在液相色譜中，液體樣品，任選與合適的緩沖劑混合構(gòu)成移動(dòng)相，它與稱(chēng)為分離基質(zhì)的固定相接觸。通?；|(zhì)包含結(jié)合了配位體的載體，配位體是能夠與目標(biāo)化合物相互作用的基團(tuán)。
分離基質(zhì)通?；谟蔁o(wú)機(jī)材料，例如二氧化硅或有機(jī)材料，例如合成或天然聚合物等制成的載體。合成聚合物，例如苯乙烯和二乙烯基苯通常用作載體，它們顯示某些疏水性，例如大小排除色譜法、疏水相互作用色譜法(HIC)和逆相色譜法(RPC)。此外，合成聚合物由于其流動(dòng)性有時(shí)優(yōu)選于天然聚合物，合成聚合物由于通常比常用的天然聚合物載體更堅(jiān)硬和耐壓，因而是更有利的。
天然聚合物，通常是多糖類(lèi)，例如瓊脂糖，作為分離基質(zhì)的載體已經(jīng)使用了十年，由于存在羥基，天然聚合物的表面通常是親水的，基本上與蛋白質(zhì)發(fā)生非特異相互作用。天然聚合物的另一優(yōu)點(diǎn)是其無(wú)毒性，這在純化用于人體內(nèi)使用的藥物或診斷分子中是尤其重要的。瓊脂糖在升溫下可溶解在水中，并隨后在冷卻到一定溫度(凝膠點(diǎn))時(shí)形成多孔凝膠。在加熱時(shí)，凝膠將在某一溫度(熔融點(diǎn))下再次熔融。凝膠化作用包括多糖聚合物的螺旋體-螺旋體聚集，有時(shí)稱(chēng)為物理交聯(lián)。為最佳化目標(biāo)物質(zhì)的傳輸速率和目標(biāo)相互作用的區(qū)域，通常需要增加載體的多孔性，這可通過(guò)改變瓊脂糖濃度實(shí)現(xiàn)。然而，另一考慮的基本參數(shù)是載體的流動(dòng)性質(zhì)?；|(zhì)通常以微粒(球形或非球形)的填充床形式使用，當(dāng)移動(dòng)相被強(qiáng)制通過(guò)床層時(shí)，床層的背壓由微粒之間的空隙通道控制。在低流量時(shí)，微?？杀灰曌鞑荒軌嚎s的，因而背壓隨流量線性增加。在較高流量下，微粒在液體靜力學(xué)壓力下開(kāi)始變形，導(dǎo)致空隙通道的直徑逐漸縮小，和背壓的迅速增加。根據(jù)基質(zhì)的剛性，在一定流量下，床層將倒塌，背壓接近無(wú)窮大，除非由色譜法體系自動(dòng)關(guān)閉。為改善剛性和瓊脂糖的流動(dòng)性質(zhì)，它通常被交聯(lián)，該交聯(lián)在可獲得的羥基之間發(fā)生，可用例如表氯醇得到。
US 4,973,683(Lindgren)涉及多孔多糖凝膠的交聯(lián)，更具體地涉及改善剛性而減小多孔多糖凝膠的非特異相互作用的方法。方法包含提供瓊脂糖凝膠和表示“單官能團(tuán)”的試劑，它包含一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，例如鹵素基團(tuán)或環(huán)氧化物基團(tuán)和一個(gè)雙鍵。試劑與凝膠經(jīng)其反應(yīng)基團(tuán)鍵合，雙鍵隨后被活化為環(huán)氧化物或表鹵醇，它最終與瓊脂糖上的羥基反應(yīng)產(chǎn)生交聯(lián)。
US 5,135,650(Hjerten等)涉及高可壓縮色譜法固定相微粒，例如瓊脂糖珠，它們對(duì)HPLC是足夠剛性的，并無(wú)孔至溶質(zhì)不可滲透的程度。更具體地，該珠狀物由多孔瓊脂糖珠產(chǎn)生，它與有機(jī)溶液接觸到倒塌多孔性，隨后在倒塌孔內(nèi)的珠表面被交聯(lián)以孔固定于其倒塌狀態(tài)?；蛘撸闋钗锿ㄟ^(guò)用可聚合的物質(zhì)填充孔隙，其接枝與孔表面，進(jìn)行接枝聚合。公開(kāi)的發(fā)明的一項(xiàng)所述優(yōu)點(diǎn)是一種固定相在高壓下是有效的，在低壓下也能夠使用。
US 6,602,990(Berg)涉及制備多孔交聯(lián)多糖凝膠的方法，其中將雙官能交聯(lián)劑加入多糖溶液中，使其經(jīng)活性位置與多糖的羥基結(jié)合，隨后由溶液形成多糖凝膠，然后將交聯(lián)劑的失活位置活化，進(jìn)行凝膠的交聯(lián)。因此，與如上討論的將交聯(lián)劑加入多糖凝膠的方法相反，交聯(lián)劑被引入多糖溶解中。雙官能團(tuán)著色劑包括一個(gè)活性位置，即能夠與多糖的羥基反應(yīng)的位置，例如鹵化物和環(huán)氧化物，以及一個(gè)失活位置，即在活性位置反應(yīng)的條件下不發(fā)生反應(yīng)的基團(tuán)，例如烷基。因此，現(xiàn)在的雙官能團(tuán)交聯(lián)劑相應(yīng)于用于上述討論的US 4,973,683(Lindgren)中的“單官能團(tuán)試劑”。由得到的凝膠組成的微粒顯示出存在改善的承受高流量和背壓的能力。采用US 6,602,990方法的缺點(diǎn)是需要使用溴活化交聯(lián)劑。
最后，US 5,998,606(Grandics)涉及合成色譜法介質(zhì)的方法，其中基質(zhì)的交聯(lián)和官能團(tuán)化同時(shí)發(fā)生。更具體地，在聚合碳水化合物基質(zhì)的表面提供的雙鍵在金屬催化劑存在下用表鹵醇、羧基或磺酸鹽活化以交聯(lián)基質(zhì)和官能團(tuán)化。通過(guò)與含有鹵素原子或環(huán)氧化物和雙鍵的活化劑接觸在基質(zhì)表面提供雙鍵。因此，US 5,998,606活化劑相應(yīng)于US 4,973,683的單官能團(tuán)試劑和US 6,602,990的雙官能團(tuán)交聯(lián)劑。
因此，即使存在許多可用于生產(chǎn)交聯(lián)多糖分離基質(zhì)的方法，由于不同的應(yīng)用將對(duì)基質(zhì)提出不同的需求，因而在此領(lǐng)域仍需要可供選擇的方法。
發(fā)明簡(jiǎn)述在本發(fā)明的一個(gè)方面，其提供剛性交聯(lián)多糖色譜基質(zhì)的方法。
在發(fā)明的另一方面，其提供制備高孔隙交聯(lián)多糖色譜基質(zhì)的方法。
在發(fā)明的具體方面，其提供制備剛性交聯(lián)多糖色譜基質(zhì)的方法，該方法利用不同的材料和/或原料。在具體方面，提供了其中避免使用鹵素，例如溴的方法。
在發(fā)明的另一方面，提供色譜基質(zhì)，它由交聯(lián)多糖微粒組成，可承受高流量和/或背壓。
此外，在另一方面，提供含有交聯(lián)多糖基質(zhì)的一次性系統(tǒng)，本發(fā)明的一次性系統(tǒng)包含用微?；蚰こ涮畹纳V柱，基本上是無(wú)菌的，可包含綜合入方法所需的細(xì)節(jié)。
這些和其它目的可如所附的權(quán)利要求中所定義實(shí)現(xiàn)，本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)由如下詳細(xì)描述將是明顯的。
定義術(shù)語(yǔ)分離“基質(zhì)”是指由多孔或非多孔的連接了配位體的固體載體組成的材料，在色譜法領(lǐng)域，基質(zhì)有時(shí)稱(chēng)為樹(shù)脂或介質(zhì)。
術(shù)語(yǔ)“目標(biāo)化合物”是指在方法中是所需目標(biāo)的任何化合物或其它實(shí)體。
術(shù)語(yǔ)“配位體”以其常規(guī)方式用于本文，即對(duì)于化學(xué)實(shí)體，它們能夠與目標(biāo)化合物相互作用，例如能夠與帶相反電荷的目標(biāo)化合物在離子交換過(guò)程中相互作用的帶電基團(tuán)。
Kav是凝膠過(guò)濾參數(shù)(大小排除色譜法)，定義為(Ve-Vo)/(Vt-Vo)，其中Ve是測(cè)試分子峰的洗脫體積，Vo是柱的空隙體積，Vt是總床層體積。Kav是具體測(cè)試分子可達(dá)到的固定相部分的數(shù)量。
Kav DX是葡聚糖分子的KAV。在實(shí)施例中，可使用分子量為110kD、500kD和1000kD的葡聚糖。
術(shù)語(yǔ)“凝膠熔融點(diǎn)”有時(shí)在本文表示“凝膠溫度”，是指溶液的聚合物物理相互作用形成固體凝膠的溫度。術(shù)語(yǔ)“可凝膠化”是指能夠形成物理凝膠。
用于本文的術(shù)語(yǔ)“交聯(lián)劑”包括能夠在聚合物之間形成交聯(lián)鏈的化學(xué)實(shí)體；以及在合適的試劑，例如γ射線和電子轟擊存在下能夠提供聚合物鏈交聯(lián)的試劑。
術(shù)語(yǔ)“基本上無(wú)菌”在本文中是指基本上沒(méi)有可存活的微生物存在。
術(shù)語(yǔ)“殺菌”在本文中是指制備沒(méi)有可存活的微生物的物體的方法。
發(fā)明詳述在一方面，本發(fā)明涉及制備交聯(lián)多糖色譜基質(zhì)的方法，該方法包括(a)提供至少一種可凝膠的多糖的水溶液，其中至少部分羥基被對(duì)親核攻擊不敏感的基團(tuán)取代；(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；(c)形成取代的多糖溶液的凝膠；和(d)交聯(lián)凝膠。
在具體實(shí)施方案中，方法包括(a)提供至少一種可凝膠的多糖的水溶液，在水溶液中用對(duì)親核攻擊不敏感的基團(tuán)取代多糖的至少部分羥基；(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；(c)形成取代的多糖溶液的凝膠；和(d)交聯(lián)凝膠。
在上述方法中，“對(duì)親核攻擊不敏感的”是指在取代后多糖中得到的基團(tuán)的性質(zhì)。
因此，在第一實(shí)施方案中，原料是聚取代的多糖，而在具體實(shí)施方案中，發(fā)明還包括取代多糖的羥基。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那樣，在多糖的所有表面上存在可得到的羥基，因此取代基將存在于孔隙表面以及基質(zhì)的內(nèi)表面上。更具體地，提供的多糖已經(jīng)用對(duì)親核攻擊不敏感的基團(tuán)取代。因此，該基團(tuán)不與羥基反應(yīng)，因而有時(shí)本文表示為“非反應(yīng)基團(tuán)”或簡(jiǎn)單地為取代基。相對(duì)種類(lèi)的基團(tuán)，即在本文中是“反應(yīng)的”基團(tuán)是親核基團(tuán)或是易于轉(zhuǎn)化成親核基團(tuán)的基團(tuán)，例如烷基(易于環(huán)氧化)、環(huán)氧化物、表鹵醇、α，β-不飽和羰基，它們均易于羥基反應(yīng)。通過(guò)使用非反應(yīng)基團(tuán)，取代基的聚合物的穩(wěn)定性被改善，更容易控制隨后的交聯(lián)步驟。在本發(fā)明中多糖中取代的羥基的部分為約10％，例如約5％，更具體地為約2％。因此，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，被取代的羥基部分為1-20％，例如2-10％，更具體地為2-5％。
在本發(fā)明方法的一項(xiàng)實(shí)施方案中，非反應(yīng)取代基選自醚、酯、酰胺和黃酸鹽。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，在多糖上存在的取代基是醚，例如烷基醚，例如甲基、乙基、丙基和丁基醚；羥基醚，例如羥基丙基和羥基丁基醚；甘油；低聚甘油(oligoglycerol)；低聚乙二醇或上述任何一種的聚醚。在有利的實(shí)施方案中，多糖的部分羥基被羥基乙基醚基團(tuán)取代。
在另一實(shí)施方案中，在多糖中存在的非反應(yīng)取代基是酯，例如烷基酯和羥基烷基酯。
在另一實(shí)施方案中，在多糖上存在的非反應(yīng)取代基是酰胺，例如尿素或尿素衍生物。
在另一實(shí)施方案中，在多糖上存在的非反應(yīng)取代基是黃酸鹽或黃酸酯。
聚取代的多糖是商業(yè)上可得到的，例如由Cambrex Biopro-ducts，USA。在本發(fā)明的最佳實(shí)施方案中，取代的多糖是羥基乙基瓊脂糖。改性多糖的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易獲得的，參見(jiàn)例如US3,956,273，它涉及含有該取代的多糖的電泳凝膠。如US 3,956,273中所討論的那樣，多糖的取代降低了其凝膠溫度，這被預(yù)期干擾產(chǎn)物的孔結(jié)構(gòu)分布，顯然是減弱結(jié)合的信號(hào)。然而，本發(fā)明顯示相反的結(jié)果，與相應(yīng)的由非取代的多糖制備的交聯(lián)產(chǎn)物相比，本發(fā)明制備的色譜基質(zhì)顯示改善的流動(dòng)性，參見(jiàn)如下實(shí)驗(yàn)部分。
所得到的凝膠的交聯(lián)可用本領(lǐng)域任何已知的方法進(jìn)行，例如加入與多糖的羥基反應(yīng)的交聯(lián)劑。
在第一實(shí)施方案中，交聯(lián)是使用交聯(lián)劑的已知兩步法，交聯(lián)劑含有一個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，例如環(huán)氧化物，和一個(gè)可活化的基團(tuán)，例如烯丙基，如例如參見(jiàn)在上述討論的US 4,973,683中所描述的。
在另一實(shí)施方案中，交聯(lián)在單一步驟中進(jìn)行，加入含有兩個(gè)反應(yīng)基團(tuán)的交聯(lián)劑。因此，在該實(shí)施方案中，不需要活化交聯(lián)劑。
如上所述使用的常用交聯(lián)劑的實(shí)例包括異氰酸酯、環(huán)氧化物、甲醇基化合物、表鹵醇、烷基鹵化物或Michael加成接受劑(例如乙烯基磺酸酯)。用于本方法的交聯(lián)劑是易于由商業(yè)來(lái)源獲得的。
正如已知的那樣，γ-射線或電子轟擊可用于活化交聯(lián)劑的可活化基團(tuán)，在具體實(shí)施方案中，γ-射線或電子轟擊用于提供多糖聚合物的交聯(lián)。
在一種實(shí)施方案中，非反應(yīng)取代基，即對(duì)親核攻擊不敏感的基團(tuán)在交聯(lián)后斷裂，應(yīng)當(dāng)理解，斷裂該基團(tuán)的方式取決于基團(tuán)的性質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地選擇用于每種情況的合適條件。在有利的實(shí)施方案中，非反應(yīng)取代基是酯基，它隨后通過(guò)水解斷裂。如下文所討論，多糖的可獲得的羥基隨后進(jìn)一步官能團(tuán)化至色譜基質(zhì)的所需種類(lèi)。
然而，即使在本方法中多糖的非反應(yīng)取代基的主要作用是使得多糖溶液形成存在如實(shí)驗(yàn)部分所示改善的流動(dòng)性質(zhì)的特定交聯(lián)凝膠，但它們也可用于進(jìn)一步的官能團(tuán)化。在一種有利的實(shí)施方案中，非反應(yīng)取代基和任何殘留的非取代的羥基均被官能團(tuán)化。該官能團(tuán)化可用進(jìn)入離子交接基質(zhì)的帶電基團(tuán)、顯示生物學(xué)親和力進(jìn)入親和力基質(zhì)的基團(tuán)、進(jìn)入固定金屬親和力色譜法(IMAC)基質(zhì)的螯合基團(tuán)或進(jìn)入疏水相互作用色譜法(HIC)基質(zhì)的疏水基團(tuán)提供。在具體實(shí)施方案中，官能團(tuán)是離子交接配位體，其選自季銨(Q)、二乙基氨基乙基(DEAE)、二乙基氨基丙基(ANX)、磺基丙基(SP)和羧基甲基(CM)。因此，在另一實(shí)施方案中，非反應(yīng)取代基在隨后的步驟中用于連接色譜法配位體，在該實(shí)施方案中，取代基有利的是醚基。將該官能團(tuán)連接于載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包含在先的取代基烯丙基化和使用標(biāo)準(zhǔn)試劑和條件(參見(jiàn)例如Immobilized Affinity Ligand Techniques，Hermanson等，Greg T.Hermanson，A.Krishna Mallia和Paul K.Smith，Academic Press，INC，1992)。在特定實(shí)施方案中，非反應(yīng)取代基構(gòu)成配位體，例如通過(guò)提供與目標(biāo)物質(zhì)的疏水相互作用。在該HIC色譜法中，舉例性的取代基可以是烷基醚基。
在具體實(shí)施方案中，用于隔開(kāi)配位體與凝膠表面的基團(tuán)在上述配位體偶合之前的步驟中偶合至多糖。該間隔基團(tuán)稱(chēng)為延伸劑、柔性臂、觸角等，可以是直鏈或支鏈的。適用于多糖基基質(zhì)的常用親水延伸劑是葡聚糖，它在商業(yè)上以各種分子量得到。另一種延伸劑基于合成聚合物或共聚物。技術(shù)人員可容易地用已知方法將配位體經(jīng)延伸劑連接于本發(fā)明的色譜基質(zhì)。此外，色譜基質(zhì)可含有刺激響應(yīng)聚合物，它是已知在物理刺激，例如光、磁場(chǎng)、溫度、pH等下發(fā)生物理或化學(xué)改變的聚合物，參見(jiàn)例如US6,641,735(Japan Chemical InnovationInstitute)。正如已知的那樣，該改變可用于影響或改善配位體的結(jié)合和/或釋放。
此外，本領(lǐng)域已知多糖的凝膠點(diǎn)可通過(guò)在多糖聚合物中加入官能團(tuán)改性。因此，在具體實(shí)施方案中，多糖的非反應(yīng)取代基被官能團(tuán)化以改變多糖的凝膠點(diǎn)。官能團(tuán)化可加入如上所述的任何已知的基團(tuán)，非反應(yīng)取代基和任何殘留的未取代羥基的任一或兩者均官能團(tuán)化到此目的。本發(fā)明包含通過(guò)本發(fā)明改性得到的多糖凝膠，例如瓊脂糖的任何新形式。
多糖可選自瓊脂糖、瓊脂、纖維素、葡聚糖、膠質(zhì)、淀粉、殼聚糖、konjac、凝膠多糖、角叉膠、gellan和藻酸鹽。在本發(fā)明方法的有利實(shí)施方案中，多糖是瓊脂糖。在本文中，應(yīng)當(dāng)理解術(shù)語(yǔ)“瓊脂糖”包含可能提供本發(fā)明牟改善剛性凝膠的任何衍生物或改性瓊脂糖。在具體實(shí)施方案中，本方法利用兩種或多種如上舉例的多糖的混合物。
在具體實(shí)施方案中，多糖的熔融點(diǎn)和/或凝膠溫度比相應(yīng)的未取代多糖低至少約1℃。
本發(fā)明的另一方面是制備交聯(lián)多糖色譜基質(zhì)的方法，該方法包括(a)提供至少一種可凝膠的多糖的水溶液，其中部分羥基被烯丙基化；(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；
(c)形成取代的多糖溶液的凝膠；和(d)交聯(lián)凝膠，期間步驟(a)的烯丙基不參與。
因此本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解交聯(lián)通過(guò)利用不在步驟(a)中不被烯丙基化的羥基提供，優(yōu)選通過(guò)與上述合適的交聯(lián)劑反應(yīng)。因此，本文中的術(shù)語(yǔ)“部分”羥基理解為是指“某些但不是全部”。上述的交聯(lián)方法同行地適用于此實(shí)施方案。通過(guò)進(jìn)行僅交聯(lián)凝膠的步驟(d)，得到與常規(guī)交聯(lián)基質(zhì)相比存在本文的改善剛性?xún)?yōu)點(diǎn)的色譜基質(zhì)。
因此，這方面不同于如上討論的US 6,602,990(Berg)，其中將雙官能團(tuán)交聯(lián)劑加入多糖溶液，使其經(jīng)活性位置結(jié)合于多糖的羥基。由US 6,602,990，顯然上述雙官能團(tuán)交聯(lián)劑是例如烯丙基基團(tuán)。
然而，根據(jù)本發(fā)明的此方面，在凝膠前加入的烯丙基不用于凝膠的交聯(lián)，而是在凝膠后有利于轉(zhuǎn)化為親水基團(tuán)，例如羥基。因此，烯丙基可以在單獨(dú)的步驟，例如通過(guò)與硫代甘油或巰基乙醇反應(yīng)轉(zhuǎn)化為羥基，在交聯(lián)后除去。該反應(yīng)是在游離基條件下的加成，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易進(jìn)行的已知反應(yīng)。
在另一實(shí)施方案中，在凝膠后在多糖上提供烯丙基，這不用于隨后的交聯(lián)，烯丙基可如上述非反應(yīng)取代基中所述被官能團(tuán)化。
在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，除了烯丙基，可凝膠的多糖包含被不對(duì)親核攻擊敏感的基團(tuán)。
因此，本發(fā)明的通常概念是在液滴形成和凝膠前將基團(tuán)加入多糖，加入的基團(tuán)提供具有與不加入該基團(tuán)的相應(yīng)產(chǎn)物不同性質(zhì)的最終產(chǎn)物。由上述方面，該基團(tuán)是醚基團(tuán)，它不對(duì)親核攻擊敏感，烯丙基基團(tuán)或它們的組合。
在本方法的一項(xiàng)實(shí)施方案中，色譜基質(zhì)由多孔的，基本上球形的微粒組成，微粒的平均粒徑可以是10-300μm，優(yōu)選30-200μm或更優(yōu)選45-165μm，例如約45μm直徑。該多孔的多糖載體容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如逆懸浮凝膠法(S HjertenBiochimBiophys Acta 79(2)，393-398(1964))。例如，在制備瓊脂糖時(shí)，通過(guò)首先在高于特定多糖的熔融點(diǎn)以上的溫度下將瓊脂糖溶解或分散在含水溶劑，例如水或任何其它常用溶劑中得到多糖溶液的基本上球形的液滴。如果需要，可加入porogen以確保產(chǎn)物的所需多孔性。在未取代多糖的情況下，它隨后如上所述被取代。溶解的取代的多糖隨后用常用有機(jī)溶劑，例如甲苯或庚烷在攪拌下乳化，隨后降低溫度至低于多糖的凝膠化點(diǎn)，例如室溫。所生產(chǎn)的微粒可洗滌以除去任何痕量溶劑和如上所述交聯(lián)。因此，在本方法的一項(xiàng)實(shí)施方案中，溶解在取代多糖在有機(jī)溶劑中乳化。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)將在含水介質(zhì)中的熱凝膠化聚合物組合物噴灑到常溫空氣中，使霧狀的組合物在空氣中凝膠化得到多糖溶液的基本上球形液滴，如US 6,248,268(FMCCorporation)中所公開(kāi)，該文獻(xiàn)列為本文參考文獻(xiàn)。在具體實(shí)施方案中，多糖的水溶液通過(guò)加熱提供，通過(guò)降低溫度形成凝膠。
在本方法的一項(xiàng)實(shí)施方案中，在凝膠化前加入porogen以提供合適的孔徑，合適的porogens是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在本文中，色譜基質(zhì)可顯示至少約90％的孔隙率，例如約94％，更具體地為約96％。
本發(fā)明還包含提供用交聯(lián)多糖色譜基質(zhì)填充的基本上無(wú)菌柱的方法。更具體地，本方法包括(a)提供至少一種可凝膠化多糖的水溶液；(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；(c)形成取代的多糖溶液的凝膠；(d)交聯(lián)凝膠；(e)在色譜柱中填充交聯(lián)凝膠；和(f)通過(guò)輻射、蒸汽或高壓鍋消毒填充的柱。
在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括一個(gè)步驟，其中將本發(fā)明得到的交聯(lián)色譜基質(zhì)填充在色譜柱中。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，填充的柱隨后進(jìn)行消毒。在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，本方法包括單獨(dú)的多糖色譜基質(zhì)的消毒和無(wú)菌填充入消毒過(guò)的填充柱中。根據(jù)此方面的色譜柱是一種通常稱(chēng)為一次性柱或有時(shí)稱(chēng)為“單用色譜柱”，對(duì)醫(yī)學(xué)和/或診斷產(chǎn)品是尤其有利的。在本文中，應(yīng)理解術(shù)語(yǔ)“單用”是指一次或有限數(shù)量的使用，例如1-3次使用。
在另一實(shí)施方案中，在本發(fā)明的方法中，步驟(b)被提供多糖膜的步驟替代。在具體實(shí)施方案中，膜被消毒，適用于單用色譜法。
本發(fā)明的第二方面是如上所述生產(chǎn)的色譜基質(zhì)。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，色譜基質(zhì)由基本上球形的微粒組成，對(duì)110kDa的葡聚糖，顯示至少約0.4，優(yōu)選＞0.5的Kav值。
在另一實(shí)施方案中，色譜基質(zhì)包含膜或過(guò)濾器。在另一實(shí)施方案中，色譜基質(zhì)包含整體。在另一實(shí)施方案中，色譜基質(zhì)包含表面、碎片、纖維等。
在具體方面，本發(fā)明的色譜基質(zhì)根據(jù)上述步驟(a)-(f)制備。
本發(fā)明的第三方面是用如上所述制備的基質(zhì)填充的色譜柱。在有利的實(shí)施方案中，柱由任何常規(guī)材料，例如生物適用的塑料，例如聚丙烯或玻璃制造。柱可以是適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模或大規(guī)模純化的尺寸。在具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的柱用luer適配器、管狀連接器和半球形帽組成。因此，本發(fā)明還包括由在單獨(dú)間隔內(nèi)的如上所述用色譜基質(zhì)填充的色譜柱、至少一個(gè)緩沖器和用于純化目標(biāo)化合物的書(shū)面說(shuō)明組成的成套用具。本發(fā)明還包括包含在任何其它形式中的色譜基質(zhì)，例如在柱或容器、在間歇容器中的微粒的流化床或施用于表面，例如膜或碎片。
如上明顯的是，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法得到基本上無(wú)菌的填充色譜柱。因此，本發(fā)明色譜柱的具體實(shí)施方案是一次性或單一使用形式，其是基本上無(wú)菌。無(wú)菌或基本上無(wú)菌形式用于醫(yī)藥工業(yè)方法，例如其中純度是至關(guān)重要的藥物的純化中是尤其有利的。
其它實(shí)施方案是成套裝置，其包括本發(fā)明的色譜柱。成套裝置可包括填充的色譜柱、管和緩沖器，裝置可以基本上無(wú)菌形式提供，其中部件可以是預(yù)先裝配的。
目標(biāo)可以是任何生物學(xué)化合物，其選自肽、蛋白質(zhì)，例如受體和抗體、核酸，例如DNA，例如質(zhì)料，RNA和寡核苷酸、病毒、prions、細(xì)胞，例如原核或真核細(xì)菌、碳水化合物和其它有機(jī)分子，例如藥物候選等。在具體實(shí)施方案中，目標(biāo)是診斷標(biāo)記。因此，用本色譜基質(zhì)純化的目標(biāo)化合物可以是例如醫(yī)學(xué)化合物，例如蛋白質(zhì)和抗體藥物、診斷化合物，例如抗原或診斷抗體，和用于治療的細(xì)胞，例如干細(xì)胞。
本發(fā)明的最后方面是如上所述制備的色譜基質(zhì)在由液體中純化、分離或除去一種或多種目標(biāo)化合物的用途。因此，這方面是如上所述的液體色譜法的方法，包括吸附目標(biāo)化合物至本發(fā)明的色譜基質(zhì)，和任選地選擇性脫附目標(biāo)的隨后步驟，通常稱(chēng)為梯度洗提。如果需要，在吸附和洗提之間提供一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟。此外，本用途是用于目標(biāo)化合物的延遲，在此情況下，與其它組分相比，目標(biāo)化合物選擇性地在柱上延遲。在此情況下，不需要洗提步驟以釋放目標(biāo)，除非柱被再生用于其它用途。如色譜法領(lǐng)域已知的那樣，通過(guò)填充床的壓降會(huì)是主要問(wèn)題，尤其是在大規(guī)模制備性色譜柱的操作中。因素，例如填充床的形狀和長(zhǎng)寬比，以及色譜基質(zhì)的流動(dòng)性將影響壓降。本發(fā)明顯示與根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法制備的相應(yīng)基質(zhì)相比，根據(jù)本發(fā)明制備的瓊脂糖色譜基質(zhì)允許明顯增加的流速。因此，在本用途的一項(xiàng)實(shí)施方案中，至少約300cm/h的液體流用于由對(duì)110kDa的葡聚糖顯示至少約0.4的Kav值的基本上球形微粒組成的基質(zhì)。
本發(fā)明的另一方面是本色譜基質(zhì)在食品工業(yè)中用于純化和/或分離目標(biāo)化合物的用途。因此，該用途可以是例如包含由乳水中純化乳蛋白質(zhì)。與常規(guī)色譜基質(zhì)相比，使用本發(fā)明色譜基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是改善基質(zhì)的剛性，它允許以經(jīng)濟(jì)流速和成本通常需要的大體積操作。
最后，根據(jù)本發(fā)明得到的色譜基質(zhì)的另一具體用途是由加工液體中除去少量污染物，例如病毒或朊病毒。在此實(shí)施方案中，色譜基質(zhì)可以是微?；蚰ぃ瑑?yōu)選單一使用的種類(lèi)以能夠安全處置使用的基質(zhì)的污染物。
最后，在一項(xiàng)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法制備的基質(zhì)用作細(xì)胞培養(yǎng)的載體。在有利的實(shí)施方案中，所述載體是基本上球形載體微粒的形式，它適用于固定于表面的懸浮培養(yǎng)。如此培養(yǎng)的細(xì)胞可用作，例如在細(xì)胞治療方案中的醫(yī)學(xué)物質(zhì)?；|(zhì)的其它用途是用于將酶固定以生產(chǎn)生物催化劑。
實(shí)驗(yàn)部分提供實(shí)施例僅用于舉例說(shuō)明用途，不構(gòu)成對(duì)所附的權(quán)利要求中定義的本發(fā)明的限制。如下和在說(shuō)明書(shū)其它部分給出的所有參考文獻(xiàn)列為本文參考文獻(xiàn)。
材料/研究單元表氯醇硼氫化鈉硫酸鈉方法實(shí)施例1交聯(lián)瓊脂糖珠的制備將7g羥基乙基瓊脂糖(NuSieveTMGTG，Cambrex)在沸水浴中在攪拌下溶解于200ml蒸餾水中30分鐘。將溶液加入保持在60℃的1.5L平底玻璃容器中，容器含有2g三甘油于二異硬脂酸酯(PrisorineTM3700，Uniqema)在300ml甲苯中的溶液。在加入過(guò)程中攪拌速率(40mm渦輪攪拌器)為400rpm，隨后增加到650rpm 20分鐘，和800rpm 20分鐘。隨后通過(guò)在30分鐘時(shí)間內(nèi)將容器由60℃冷卻到20℃凝膠化羥基乙基瓊脂糖液滴。加入1L乙醇，容器中的物質(zhì)攪拌15分鐘，隨后放置以沉降。傾析上清液，小珠在G3玻璃過(guò)濾漏斗中用乙醇和水洗滌。回收小珠的模式直徑用Malvern Mastersizer光衍射裝置測(cè)量為99μm。
將285g上述得到的小珠加入燒瓶中，用雙槳攪拌器在200rpm下攪拌。加入137g硫酸鈉，通過(guò)在200rpm攪拌下加熱到50℃溶解。持續(xù)攪拌30分鐘，隨后達(dá)到目標(biāo)溫度50℃。加入10.7ml 50％NaOH，隨后加入0.4g硼氫化鈉。隨后在7h內(nèi)用DosimatTM泵(進(jìn)料速率50％NaOH-0.129ml/min，表氯醇0.190ml/min)泵送54ml 50％NaOH和80ml表氯醇。反應(yīng)混合物以200rpm在50℃攪拌過(guò)夜。隨后凝膠漿料用60％乙酸中和至pH 5.1，凝膠在玻璃過(guò)濾器中用水洗滌。最終將小珠通過(guò)40-160μm篩篩分。
實(shí)施例2交聯(lián)瓊脂糖珠的制備含有取代瓊脂糖的凝膠形式的小珠根據(jù)實(shí)施例1制備。
小珠隨后根據(jù)實(shí)施例1中的相同方法交聯(lián)，只是溫度始終保持在70℃。
實(shí)施例3壓力流動(dòng)性能將上述得到的小珠填充到HR 5/5柱(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)中，柱連接于P-900泵(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。將50％的乙醇溶液以0.5ml/min的最初流量泵送通過(guò)柱，流量隨后以每30s 0.5ml/min的步驟增加直至觀察到急劇的背壓增加。在觀察到壓力增加前的最高流量為所測(cè)凝膠的最大流量，結(jié)果在如下表1中說(shuō)明。
實(shí)施例4孔隙率測(cè)定將小珠填充入HR10柱中，得到15cm的床層高度。將柱安裝在帶有LCC Plus/FPLC Director、P-500泵和MV-7 UV-M檢測(cè)器的FPLC系統(tǒng)中。注射入染色的葡聚糖樣品(0.1％溶液，0.2ml)，用0.05Mtris 0.15M NaCl，pH 8,0以0.2ml/min(15cm/h)流量洗脫。作為參考，柱填充(Amersham Bioscience，Uppsala，Sweden)，以相同方式評(píng)價(jià)。結(jié)果在如下表1中說(shuō)明。
結(jié)果表1

*Kav值根據(jù)Gel Filtration Principles and Methods，Pharmacia LKBBiotechno-logy 1991(ISBN 91-97-0490-2-6)測(cè)定。
根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的小珠具有比參考瓊脂糖基質(zhì)SepharoseTM4FF較大的孔，允許相當(dāng)高的流量。
權(quán)利要求
1.制備交聯(lián)多糖色譜基質(zhì)的方法，該方法包括(a)提供至少一種可凝膠的多糖的水溶液，其中至少部分羥基被對(duì)親核攻擊不敏感的基團(tuán)取代；(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；(c)形成取代的多糖溶液的凝膠；和(d)交聯(lián)凝膠。
2.制備交聯(lián)的多糖色譜基質(zhì)，該方法包括(a)提供至少一種可凝膠的多糖的水溶液，在水溶液中用對(duì)親核攻擊不敏感的基團(tuán)取代多糖的至少部分羥基；(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；(c)形成取代的多糖溶液的凝膠；和(d)交聯(lián)凝膠。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中對(duì)親核攻擊不敏感的基團(tuán)選自醚、酯、酰胺和黃酸鹽。
4.制備交聯(lián)多糖色譜基質(zhì)的方法，該方法包括(a)提供至少一種可凝膠的多糖的水溶液，其中部分羥基被烯丙基化；(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；(c)形成取代的多糖溶液的凝膠；和(d)交聯(lián)凝膠，期間步驟(a)的烯丙基不參與。
5.權(quán)利要求4的方法，其中步驟(a)的烯丙基在步驟(c)前轉(zhuǎn)化或脫除。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中除烯丙基外，可凝膠的多糖含有被對(duì)親核攻擊不敏感的基團(tuán)取代的羥基。
7.權(quán)利要求6的方法，其包含如權(quán)利要求1-3的任何一項(xiàng)定義的步驟。
8.上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中溶解的取代多糖在有機(jī)溶劑中乳化。
9.上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中在凝膠化前加入porogen。
10.上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中多糖的水溶液通過(guò)加熱得到，通過(guò)降溫形成凝膠。
11.上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中多糖是瓊脂糖。
12.上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中多糖的凝膠點(diǎn)比相應(yīng)的未取代多糖低至少約1℃。
13.上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中交聯(lián)步驟包括加入交聯(lián)劑。
14.上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其中對(duì)親核攻擊不敏感的基團(tuán)在交聯(lián)后斷裂。
15.權(quán)利要求14的方法，其中對(duì)親核攻擊不敏感的基團(tuán)是通過(guò)水解斷裂的酯基。
16.上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其包括在交聯(lián)后連接色譜法配位體和凝膠多糖的羥基的隨后步驟。
17.上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法，其包括連接色譜法配位體和凝膠多糖的烯丙基的隨后步驟。
18.制備基本上無(wú)菌的交聯(lián)多糖色譜基質(zhì)的方法，該方法包括(a)提供至少一種可凝膠化多糖的水溶液；(b)提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；(c)形成取代的多糖溶液的凝膠；(d)交聯(lián)凝膠；(e)在色譜柱中填充交聯(lián)凝膠；和(f)通過(guò)輻射、蒸汽或高壓鍋消毒填充的柱。
19.制備基本上無(wú)菌的色譜柱的方法，其包括根據(jù)權(quán)利要求1-18的任何一項(xiàng)的方法，隨后將所得到的交聯(lián)色譜基質(zhì)填充到色譜柱中，隨后進(jìn)行消毒。
20.權(quán)利要求1-17的任何一項(xiàng)的方法，其中步驟(b)被提供取代的多糖溶液的多糖膜的步驟替代。
21.制備基本上無(wú)菌的多糖膜的方法，其包括權(quán)利要求20的方法，隨后消毒。
22.根據(jù)上述權(quán)利要求的任何一項(xiàng)的方法定義生產(chǎn)的，含有基本上球形微粒的多孔交聯(lián)多糖色譜基質(zhì)。
23.權(quán)利要求22的基質(zhì)，其中在微粒中對(duì)110kD的葡聚糖，Kav是至少約0.5。
24.用如權(quán)利要求1-18的任何一項(xiàng)定義制備的或在權(quán)利要求22-23中定義的色譜基質(zhì)填充的色譜柱。
25.權(quán)利要求22或23的色譜柱用于由液體中純化、分離或除去目標(biāo)化合物的用途。
26.權(quán)利要求25的用途，其中至少約300cm/h的液體流用于由對(duì)110kDa的葡聚糖顯示至少約0.5的Kav值的基本上球形微粒組成的基質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及制備交聯(lián)多糖色譜基質(zhì)的方法，該方法包括提供至少一種可凝膠的多糖的水溶液，其中部分羥基被對(duì)親核攻擊不敏感的基團(tuán)取代；提供取代的多糖溶液的基本上球形的液滴；形成取代的多糖溶液的凝膠；和交聯(lián)凝膠。本發(fā)明還包括用所制備的基質(zhì)填充的色譜柱及其在例如蛋白質(zhì)純化中的用途。
文檔編號(hào)B01J20/281GK101031356SQ200580031649
公開(kāi)日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日
發(fā)明者H·伯格, M·布蘭恩霍爾曼, D·布克利, A·哈格瓦爾, E·霍爾姆格倫, H·伊哈里, A·拉森, D·林德斯特羅姆 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司