專利名稱:用于分離物體的電泳方法和裝置的制作方法
專利說(shuō)明用于分離物體的電泳方法和裝置 本發(fā)明涉及用于在流體中對(duì)物體實(shí)施電泳分離的方法和裝置。所述技術(shù)消除條帶擴(kuò)散,并且實(shí)現(xiàn)快速、高分辨率的分離。
電泳表示在電場(chǎng)影響下帶電物體穿過(guò)流體而移動(dòng)。此現(xiàn)象可用于根據(jù)物體電學(xué)性質(zhì)與流體力學(xué)性質(zhì)來(lái)分離物體,而且許多利用此現(xiàn)象的技術(shù)被廣泛應(yīng)用。待分離的物體,通常是蛋白質(zhì)或者其它生物分子,通常懸浮在流體比如緩沖溶液或凝膠中。將一小段含有物體的溶液置于含流體或凝膠的分離通道的起始位置,接著沿通道產(chǎn)生恒定電場(chǎng)。在該電場(chǎng)影響下所述物體開(kāi)始朝通道的對(duì)側(cè)運(yùn)動(dòng)。在它們穿過(guò)流體遷移時(shí),根據(jù)它們的形狀和大小,它們受到差異性流體動(dòng)力。由于施加于它們的不同流體動(dòng)力,根據(jù)它們各自的特征,物體以不同的終速度移動(dòng),并因此而分離和形成“條帶”。由于它們不同的終速度,條帶之間的距離隨時(shí)間增加。
條帶基本是一組具有相似電學(xué)和流體力學(xué)性質(zhì)的物體。電泳的一個(gè)關(guān)鍵缺點(diǎn)是這種事實(shí),當(dāng)條帶以其終速度移動(dòng)時(shí)發(fā)生熱擴(kuò)散。這使得條帶隨時(shí)間而變寬,從而降低了分離的分辨率。
在“Cyclic electrophoretic and chromatographic separationmethods”,Eijkel et al,Electrophoresis 2004,25,243-252中對(duì)各種已知電泳方法做了綜述。
也有許多傳統(tǒng)電泳方法的改型用以嘗試限制熱擴(kuò)散。
這些方法之一是等電聚焦(IEF),其在分離通道中設(shè)置pH梯度。當(dāng)物體在恒定電場(chǎng)影響下穿過(guò)流體移動(dòng)時(shí),由于沿通道的pH值改變,物體表觀電荷發(fā)生改變。根據(jù)它的電荷性質(zhì),每個(gè)物體一直移動(dòng)到其表觀電荷為零的點(diǎn)。這個(gè)點(diǎn)叫做“等電點(diǎn)”。在此點(diǎn)物體停止移動(dòng),因?yàn)樗竭_(dá)了平衡位置。每個(gè)具有不同電荷特征的物體停止在沿通道的不同點(diǎn)上,因此物體發(fā)生分離。然后,可以對(duì)物體的條帶進(jìn)行檢測(cè)和研究,例如通過(guò)成像。
此方法的優(yōu)點(diǎn)在于消除了熱擴(kuò)散,而缺點(diǎn)是pH梯度的精確性有限制。另一個(gè)缺點(diǎn)是增加了分離時(shí)間(典型的是數(shù)小時(shí))。
另一種電泳改型在US-A-2002/0043462中公開(kāi)。通過(guò)施加由于穿過(guò)腔室的緩沖液流動(dòng)而產(chǎn)生的第一力來(lái)分離顆粒,其中液流方向與電場(chǎng)梯度相反。靜電場(chǎng)的形狀使得顆粒沿腔室分離成條帶。這些條帶代表平衡位置,在此位置上每個(gè)分子受到的凈作用力為零。一旦條帶形成,可改變所施加的電場(chǎng)以對(duì)條帶進(jìn)行操作,例如移動(dòng)感興趣條帶至退出點(diǎn)(exit point)。但是與其它已知系統(tǒng)的情況一樣,此裝置依賴于緩沖液穿過(guò)腔室的恒定流動(dòng),以向每個(gè)顆粒施加適當(dāng)?shù)牧黧w動(dòng)力,并因此而實(shí)現(xiàn)成功分離。這導(dǎo)致了許多問(wèn)題。
首先,需要泵和監(jiān)測(cè)系統(tǒng)來(lái)達(dá)到高度準(zhǔn)確的穿過(guò)通道的液體流動(dòng),這導(dǎo)致了可能昂貴且復(fù)雜的基礎(chǔ)設(shè)施。結(jié)果,系統(tǒng)通常昂貴且可能不可靠,包含了許多復(fù)雜的機(jī)械組件。緩沖液流動(dòng)的準(zhǔn)確性對(duì)于裝置的準(zhǔn)確度和分辨率來(lái)說(shuō)是必需的。
其次,與使用流動(dòng)液體相關(guān)的并且在壓力驅(qū)動(dòng)流動(dòng)的高效液相色譜(HPLC)中十分嚴(yán)重的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題是,液體與通道壁相互作用。結(jié)果,液體不以恒定速度穿過(guò)通道截面,而是在通道壁附近移動(dòng)較慢,在通道中央移動(dòng)較快。這形成了一個(gè)拋物線形的速度前沿,其直接影響所分離分子的條帶形狀。距離恒定速度前沿偏離越多,條帶就變得越寬,因此降低了裝置的分辨率??赏ㄟ^(guò)增加緩沖液流速來(lái)加速分離過(guò)程。這是由于分子到達(dá)其平衡位置所耗費(fèi)的時(shí)間縮短,因此分離將更快完成。在第一種方法中,增加流速也應(yīng)使得靜止條帶(stationaryband)變窄,因?yàn)樗┘拥牧黧w動(dòng)力和電場(chǎng)力更大。這將會(huì)提高分辨率。
但是,隨著流速增加,拋物線流形更加嚴(yán)重,傾向于抵消預(yù)期的分辨率提高。
傳統(tǒng)電泳經(jīng)常涉及使用凝膠作為分離流體。相對(duì)高粘度減少了擴(kuò)散,于是提高了分辨率。但是,將凝膠與需要緩沖液流動(dòng)的技術(shù)(比如以上兩種方法)一起使用,若非不可能,也是困難的,因?yàn)槟z通常不易于流動(dòng)。
需要的是這樣的技術(shù),其有效控制熱擴(kuò)散,并且不需要分離流體穿過(guò)裝置的恒定流動(dòng)。此種方法應(yīng)實(shí)現(xiàn)快速分離和高分辨率。
根據(jù)本發(fā)明,在分離通道所含流體中分離物體的電泳方法包括 沿分離通道施加電場(chǎng),所述電場(chǎng)具有一定的場(chǎng)分布,從而使至少一些物體相對(duì)于流體移動(dòng); 改變所施加電場(chǎng)以調(diào)節(jié)相對(duì)于分離通道的電場(chǎng)分布,從而使物體在由于電場(chǎng)的電場(chǎng)力和由于流體的流體動(dòng)力的聯(lián)合影響下分離成條帶。
另外,根據(jù)本發(fā)明,用于分離物體的電泳裝置包含 分離通道,使用時(shí)其含有流體和待分離物體; 沿分離通道施加電場(chǎng)的裝置,所述電場(chǎng)具有一定的場(chǎng)分布,從而使分離通道中的物體相對(duì)于流體移動(dòng); 適用于施加和改變所施加電場(chǎng)以相對(duì)于分離通道來(lái)調(diào)節(jié)電場(chǎng)分布的控制器,由此使得分離通道中的物體在由于電場(chǎng)的電場(chǎng)力和由于流體的流體動(dòng)力的聯(lián)合影響下分離成條帶。
應(yīng)了解,術(shù)語(yǔ)“流體”在此用于描述任何適宜的分離介質(zhì)。例如,流體可以是液體、凝膠、篩分介質(zhì)或者對(duì)移動(dòng)中物體可產(chǎn)生摩擦力或流體動(dòng)力的任何其它材料。
通過(guò)從基本上分離過(guò)程一開(kāi)始(與條帶形成以后相反)就相對(duì)于分離通道來(lái)改變所施加的電場(chǎng),可以不需要流體穿過(guò)分離通道流動(dòng)而將物體分離成條帶。所施加的電場(chǎng)建立了一個(gè)隨時(shí)間變化的場(chǎng)分布,其通過(guò)使顆粒穿過(guò)流體移動(dòng)而實(shí)現(xiàn)電泳分離,因此流體自身可以靜止。應(yīng)注意的是,電場(chǎng)沿至少一部分場(chǎng)分布是非恒定的(相對(duì)于通道)。換句話說(shuō),施加了(非零的)隨時(shí)間變化的電場(chǎng)梯度。結(jié)果,物體分離成不隨時(shí)間變寬的移動(dòng)條帶。
這避免了對(duì)復(fù)雜而昂貴的泵設(shè)備的需要,并且消除了與傳統(tǒng)系統(tǒng)中所遇到的拋物線形速度前沿相關(guān)的問(wèn)題。另外,所述技術(shù)可良好地適用于以凝膠或篩分基質(zhì)作為分離流體,因?yàn)椴恍枰黧w流動(dòng)。具體電場(chǎng)及其變化將根據(jù)待分離物體的類型以及用作分離介質(zhì)的流體來(lái)決定。但優(yōu)選的是,電場(chǎng)變化方式使得場(chǎng)分布相對(duì)于分離通道移動(dòng)。
當(dāng)其移動(dòng)時(shí),場(chǎng)分布可以改變其形狀和/或強(qiáng)度,但更優(yōu)選的是,當(dāng)其相對(duì)于分離通道移動(dòng)時(shí)場(chǎng)分布保持不變(即保持其形狀和強(qiáng)度不變)。典型地,將條帶沿通道分離是方便的,因此以電場(chǎng)分布沿分離通道變化的方式來(lái)改變電場(chǎng)是優(yōu)選的。
根據(jù)待分離的物體,維持一定程度的流體穿過(guò)通道的流動(dòng)是有利的。但是,如上所述,如果可以消除流體流動(dòng)則通常是有利的,因此,優(yōu)選流體和分離通道相對(duì)于對(duì)方基本保持靜止。
所施加電場(chǎng)的具體形狀將根據(jù)期望的裝置輸出來(lái)選擇。但是,典型地,電場(chǎng)分布的形狀使得每個(gè)物體所受到的凈作用力應(yīng)致使每個(gè)分離條帶的寬度隨時(shí)間基本保持恒定,這種凈作用力來(lái)自于由電場(chǎng)產(chǎn)生的電場(chǎng)力和由流體產(chǎn)生的流體動(dòng)力的聯(lián)合作用。優(yōu)選地,場(chǎng)分布使得條帶獲得有限寬度(典型地是沿分離通道),每個(gè)條帶中物體的擴(kuò)散是受約束的或受限制的,使得只要實(shí)驗(yàn)條件保持相同,條帶寬度不隨時(shí)間改變。在下文中,其被稱為“受限擴(kuò)散”(bound diffusion)。
一旦物體被分離成條帶,電場(chǎng)可以被撤去。然而,有利的是繼續(xù)施加和改變電場(chǎng),使得一旦物體已分離成條帶,則每個(gè)條帶以相對(duì)于分離通道的非零終速度運(yùn)動(dòng)。因?yàn)槌掷m(xù)移動(dòng)的條帶不隨時(shí)間擴(kuò)散,所以這樣保持了高分辨率。
在傳統(tǒng)電泳分離中,不同條帶以不同的終速度移動(dòng)。換句話說(shuō),當(dāng)它們穿過(guò)緩沖液或凝膠移動(dòng)時(shí),它們互相之間分離的越來(lái)越開(kāi)。假定相對(duì)距離的增加比擴(kuò)散引起的條帶變寬更快,隨著分離長(zhǎng)度更大(即分離通道更長(zhǎng))時(shí)電泳的分辨率增加。但是,由于擴(kuò)散的原因,信號(hào)隨時(shí)間減弱,并且非常大的分離通道是不實(shí)際的。因此,實(shí)踐中,當(dāng)條帶到達(dá)通道末端時(shí)會(huì)發(fā)生“條帶丟失”。相對(duì)而言,在本發(fā)明中,優(yōu)選條帶以基本相等的終速度移動(dòng)。因此分離效率不依賴于分離通道的長(zhǎng)度,而取決于所施加的隨時(shí)間變化的電場(chǎng)的性質(zhì)、以及分離緩沖液的性質(zhì)。優(yōu)選地,每個(gè)條帶的終速度基本相同,因此維持相互之間的間隔。更優(yōu)選地,終速度隨時(shí)間保持恒定。
有利的是,所施加的電場(chǎng)是根據(jù)公式 E(x,t)=E((x-kt)n) 其中x是空間坐標(biāo),典型的是沿分離通道,t是時(shí)間坐標(biāo),n和k都是實(shí)數(shù)且n不是零。換句話說(shuō),E(x,t)可以是x-kt的任何函數(shù),包括線性、指數(shù)或n次冪多項(xiàng)式。另外,如果至少一部分電場(chǎng)相對(duì)于沿通道的距離(x)是單調(diào)的,則這是有利的。這有助于樣品分子的分離以及條帶擴(kuò)散的限制。
方便地,所述方法進(jìn)一步包括以下步驟將待分離物體與流體混合以及將混合物置于分離通道中。作為替代,可將流體置于分離通道中,然后再將樣品插入其中,樣品包含至少待分離物體。樣品還可包含流體,其可以與分離通道中已有流體相同或不相同。這些步驟可在施加電場(chǎng)之前進(jìn)行或者在設(shè)立電場(chǎng)時(shí)立即進(jìn)行。在樣品加載的一些方面,可在電場(chǎng)開(kāi)啟時(shí)將樣品加入通道內(nèi)。這對(duì)于閉環(huán)分離尤其有用。例如,在DNA測(cè)序中,在單次分離實(shí)驗(yàn)中發(fā)生四次分離開(kāi)的注入。在許多應(yīng)用中,順序注入可以是有用的,通常這些發(fā)生時(shí),電場(chǎng)已預(yù)先打開(kāi)。
優(yōu)選地,所述方法還包括檢測(cè)條帶的步驟。典型地,對(duì)條帶成像。成像或者檢測(cè)可發(fā)生在分離完成以后或者在分離過(guò)程中。有用的結(jié)論實(shí)際上可以來(lái)自作為時(shí)間函數(shù)的條帶的“增加分布”(risingprofile)。具體地,為了將那些條帶與既定注入相關(guān)聯(lián),例如在DNA測(cè)序中,相對(duì)于順序注入的條帶增加分布可以是非常有用的。
有利地,所述方法還包括在物體已分離成條帶之后改變電場(chǎng)的步驟,以調(diào)節(jié)條帶之間的間隔、條帶定位或條帶分辨率。例如,這可通過(guò)改變電場(chǎng)分布的形狀、強(qiáng)度或其沿分離通道的位置來(lái)實(shí)現(xiàn)。例如,這可用于觀察不同范圍的條帶、沿分離通道移動(dòng)條帶到特定點(diǎn)、或者調(diào)節(jié)可分辨的條帶的數(shù)目。具體地,可通過(guò)改變其時(shí)間依賴性和/或其強(qiáng)度來(lái)改變電場(chǎng)。
一些應(yīng)用包括從樣品混合物中除去某些已分離的物體。在這種情形下,所述方法優(yōu)選還包括在物體已被分離之后從分離通道中提取感興趣條帶的步驟。
有利地,所述方法還包括振蕩電場(chǎng)的步驟,使得條帶向相反方向移動(dòng),因此條帶沿分離通道前后移動(dòng)。這允許每個(gè)條帶被重復(fù)成像或者檢測(cè),因此可增加裝置對(duì)于低濃度組分的敏感度。使條帶在圍繞閉環(huán)分離通道的回路中運(yùn)動(dòng)也可實(shí)現(xiàn)此目的。
在另一些實(shí)施方案中,分離通道是閉合環(huán),在這種情形下,優(yōu)選所施加電場(chǎng)圍繞該環(huán)是周期性的。在所有的實(shí)施方案中,施加電場(chǎng)的手段可以包括任何已知的電場(chǎng)形狀控制裝置(field shapingapparatus),例如沿通道的可變電阻。然而,施加電場(chǎng)的手段優(yōu)選地包括沿分離通道間隔分布的很多電極。此技術(shù)允許準(zhǔn)確且復(fù)雜地控制電場(chǎng)形狀,并且這可通過(guò)單獨(dú)改變施加于每個(gè)電極上的電壓來(lái)方便地控制。電極優(yōu)選地與分離通道的內(nèi)部隔開(kāi),使得電流不通過(guò)電極和流體之間。這樣避免了電流穿過(guò)分離流體,從而防止過(guò)多焦耳熱,其可導(dǎo)致系統(tǒng)的無(wú)規(guī)律行為。方便地,所述電極包含導(dǎo)電油墨,其印在分離通道上或其鄰近位置。
有利地是,所述電極中至少一部分與分離通道內(nèi)部由電阻材料層分隔開(kāi)。以此方式,通道內(nèi)所建立的電場(chǎng)更平滑,更少被電極的局部效應(yīng)所扭曲。電阻材料優(yōu)選半導(dǎo)體或摻雜半導(dǎo)體,更優(yōu)選摻雜硅。
分離通道優(yōu)選是毛細(xì)管。其尺度允許在通道截面上準(zhǔn)確控制電場(chǎng),使得即使低濃度的樣品也能有良好分辨的條帶。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,分離通道是直線形。作為替代,分離通道可以是閉合環(huán)的形式。這可以基本上是圓形或者,優(yōu)選地具有線形區(qū)段。
分離通道方便地在基底比如玻璃板中刻出。這提供了在非常小規(guī)模執(zhí)行所述裝置的方便方法。該裝置優(yōu)選是微流體學(xué)裝置。
有利的是,所述裝置包含很多分離通道,每個(gè)分離通道帶有施加電場(chǎng)的工具和控制器。可根據(jù)每個(gè)通道中待分離的物體單獨(dú)選擇施加于每個(gè)分離通道上的電場(chǎng)。但是,優(yōu)選每個(gè)分離通道施加的電場(chǎng)是相同的。方便地由同一控制器控制施加于每個(gè)分離通道上的電場(chǎng)。待分離物體優(yōu)選包含生物分子、蛋白質(zhì)、聚合物、DNA、RNA或者生物細(xì)胞。
將參考以下附圖對(duì)根據(jù)本發(fā)明的電泳裝置和方法的實(shí)例進(jìn)行描述。
圖1表示電泳裝置的代表性示意圖; 圖2a、b和c描述示例性電場(chǎng)分布及其隨時(shí)間的變化; 圖3a和3b是舉例說(shuō)明顆粒所受的力的示意圖; 圖4表示分離過(guò)程中示例性分子的速度隨時(shí)間的收斂; 圖5是舉例說(shuō)明相同顆粒的共遷移(co-migration)的示意圖; 圖6表示用于分離物體的電泳裝置中一部分的第一實(shí)施方案; 圖7表示用于分離物體的電泳裝置中一部分的第二實(shí)施方案; 圖8表示用于分離物體的電泳裝置中一部分的第三實(shí)施方案; 圖9表示用于分離物體的電泳裝置的第四實(shí)施方案中分離通道的配置; 圖10舉例說(shuō)明無(wú)速度校正的彎曲通道中的條帶分離; 圖11舉例說(shuō)明有速度校正的彎曲通道中的條帶分離; 圖12是舉例說(shuō)明雙電場(chǎng)梯度的示意圖; 圖13表示第一示例性電極配置; 圖14表示第二示例性電極配置; 圖15表示第三示例性電極配置; 圖16表示第四示例性電極配置; 圖17是圖16中所示配置實(shí)例沿線Q-Q`的截面視圖; 圖18A示意性表示第五示例性電極配置一部分的俯視圖; 圖18B表示對(duì)第五示例性電極配置計(jì)算的電場(chǎng)線; 圖18C表示沿圖18A所示通道中央的電壓分布; 圖18D表示沿圖18A所示通道中央的電場(chǎng)分布; 圖19A示意性表示第六示例性電極配置一部分的俯視圖; 圖19B表示對(duì)第六示例性電極配置計(jì)算的電場(chǎng)線; 圖19C表示沿圖19A所示通道中央的電壓分布;和 圖19D表示沿圖19A所示通道中央的電壓分布; 圖20表示用于與用來(lái)分離物體的電泳裝置一起使用的檢測(cè)器的第一實(shí)施方案; 圖21表示用于與用來(lái)分離物體的電泳裝置一起使用的檢測(cè)器的第二實(shí)施方案; 圖22示意性表示使用常規(guī)技術(shù)將樣品導(dǎo)入分離通道的步驟; 圖23和24表示兩種將樣品導(dǎo)入分離通道的方法,其在使用如本文所公開(kāi)的電泳裝置中可以利用; 圖25至28舉例說(shuō)明示例性DNA鏈的測(cè)序; 圖29a、b和c表示在常規(guī)毛細(xì)管電泳條件下分離的兩條DNA條帶的示意圖; 圖30a、b和c表示在使用如本文所公開(kāi)裝置的相似條件下分離的兩條DNA條帶的示意圖;和 圖31a、b和c表示在使用如本文所公開(kāi)裝置的相似條件下分離的代表更長(zhǎng)分子的兩條DNA條帶的示意圖。
電泳裝置1包含分離通道2,用于沿分離通道2施加電場(chǎng)的裝置3和用于控制至少所述電場(chǎng)的控制器4,例如分離通道2可在毛細(xì)管或微流體芯片中實(shí)現(xiàn)。分離通道2包含流體9,例如其可以是所選的緩沖液或者凝膠。待分離物體10被懸浮在分離通道2中的流體9中。裝置1可另外帶有檢測(cè)器6,其可分別與控制器4、以及輸入和輸出端口7和8通信,其也可被控制器4控制??刂破?進(jìn)而產(chǎn)生輸出5。
如下文更詳細(xì)的描述,分離通道2可采取任何形狀,包括線形或曲線形。在一些實(shí)施方案中,分離通道可形成閉合環(huán)。電場(chǎng)施加裝置3可包含,例如場(chǎng)成形電極或沿通道2的可變電阻。待分離物體通常包括至少一些帶電體,典型地包含聚合物比如蛋白質(zhì)、DNA分子或RNA分子或其它類型的生物分子比如生物細(xì)胞。具體分離流體9的選擇取決于待分離物體10。例如,流體可以是液體或氣體,例如緩沖液。作為替代,流體可以是凝膠或者其它篩分介質(zhì)。后者是可具有孔的材料,所分離的物體在移動(dòng)時(shí)必須穿過(guò)所述孔。這導(dǎo)致了施加摩擦力,所述摩擦力是物體形狀/大小的函數(shù)。摩擦力與流體動(dòng)力相似但不相同,因?yàn)樗鼈兎牟煌姆▌t。實(shí)際上,可以選擇能對(duì)遷移中物體(如大分子)產(chǎn)生摩擦力或流體動(dòng)力的任何流體、凝膠基質(zhì)或其它篩分材料。有利地是,可以使用凝膠作為分離介質(zhì),還由于其粘度增加而減小了所分離物體的不希望的擴(kuò)散。這一點(diǎn)通常在需要恒定流體流的常規(guī)系統(tǒng)中是不可能的。
在操作中,通過(guò)電場(chǎng)成形裝置3沿分離通道2施加電場(chǎng)E。控制器4包含模塊4a,其控制電場(chǎng)施加裝置3,使得在分離通道2及其內(nèi)容物上誘導(dǎo)隨時(shí)間變化的電場(chǎng)。電場(chǎng)在每個(gè)物體10上產(chǎn)生力Fe,其與物體電荷q成比例。這使得物體10相對(duì)于流體9移動(dòng),其導(dǎo)致對(duì)物體的流體動(dòng)力(摩擦力)FT。例如,圖1示意性顯示三個(gè)這樣的物體以及它們每個(gè)所受的力。
計(jì)算電場(chǎng)隨時(shí)間的變化,使得推動(dòng)分離通道2中的物體10開(kāi)始遷移,并聚集成沿分離通道2遷移而不擴(kuò)散(變寬)的條帶??赏ㄟ^(guò)與另一控制模塊4b通信的檢測(cè)器6對(duì)遷移條帶進(jìn)行成像、或者檢測(cè)。如果需要,可通過(guò)退出端口8從分離通道2中提取選定的感興趣條帶,這也受控制器4的模塊4c的控制。
根據(jù)待分離物體10的類型以及分離流體9的性質(zhì)來(lái)選擇電場(chǎng)的具體形狀和特征。但是,在所有情形中,電場(chǎng)將具有一定的場(chǎng)分布。換句話說(shuō),電場(chǎng)值沿分離通道長(zhǎng)度的至少一部分發(fā)生變化,即應(yīng)用隨時(shí)間變化的電場(chǎng)梯度。典型地,根據(jù)下式向通道2施加隨時(shí)間變化的電場(chǎng)E (1.1)E(x,t)=E((x-kt)n),
且n≠0,
其中x是空間坐標(biāo)(典型地為沿分離通道2的距離),t代表時(shí)間,n和k是常實(shí)數(shù)
應(yīng)理解,所述電場(chǎng)可以是線性或非線性,例如指數(shù)型或者n次冪多項(xiàng)式型。線性和非線性場(chǎng)的示例分布如圖2a、2b和2c所示。優(yōu)選場(chǎng)分布的至少一部分是單調(diào)的,也就是說(shuō),它的一階導(dǎo)數(shù)(對(duì)于沿通道的距離)不改變符號(hào)。這促進(jìn)樣品分子的分離,并且限制條帶擴(kuò)散。優(yōu)選地,單調(diào)部分相對(duì)于參數(shù)k應(yīng)取正確符號(hào)(correctsign)。更優(yōu)選地,電場(chǎng)沿場(chǎng)分布的至少一部分應(yīng)是連續(xù)的,即電場(chǎng)沒(méi)有突然的躍變。另外應(yīng)注意的是,場(chǎng)分布可沿分離通道在兩個(gè)方向上(+x或-x)移動(dòng)。
作為舉例,我們將研究當(dāng)n=1時(shí)最簡(jiǎn)單的線性場(chǎng)分布的例子(α和c作為常量被引入) (1.2)E(x,t)=α(x-kt+c),
這種場(chǎng)形狀對(duì)于一系列增加的時(shí)間t1、t2和t3示意性表示于圖2a。應(yīng)注意場(chǎng)分布沿x軸有效移動(dòng)。
對(duì)于帶有電荷q的顆?;蛭矬w10,電場(chǎng)力Fe為 (1.3)Fe(x,t)=qE(x,t) 在本發(fā)明中顆粒10將在流體9中移動(dòng),因此將有摩擦力(流體動(dòng)力)FT,對(duì)抗其移動(dòng)。此作用力在一般性最簡(jiǎn)化情形下為如下形式 (1.4)FT(x,t)=fv(x,t),f>0且
其中v(x,t)表示顆粒10的速度,f是描述摩擦強(qiáng)度的系數(shù),其取決于顆粒10的形狀和大小。當(dāng)受到這兩個(gè)力的作用時(shí),每個(gè)物體10將試圖遷移到它的平衡(最低能量)位置,在此處Fe-FT=0。這在圖3a中表示為x*,且它以速度k移動(dòng)。例如,假定兩個(gè)同樣的顆粒在位置x1和x2(圖3b)出發(fā)。在x1,電場(chǎng)力大于在x*處的電場(chǎng)力,x*處電場(chǎng)力進(jìn)而又大于在x2處的電場(chǎng)力。這導(dǎo)致差別的速度,其中v1>k>v2。
因此,在x1出發(fā)的物體移動(dòng)速度大于k,并且追上移動(dòng)點(diǎn)X*(其以速度k移動(dòng))。物體在追趕x*時(shí),它相對(duì)地向較低值的電場(chǎng)力分布移動(dòng),因此它減速直至達(dá)到速度k。然后它相對(duì)于電場(chǎng)力分布的位置保持不變,因此它從此以恒定的終速度k移動(dòng)。
圖3b表示兩個(gè)同樣的顆粒如何獲得排序后(sorted)速度,使得最終以速度k共遷移。
現(xiàn)在目標(biāo)是計(jì)算速度v(x,t)(相對(duì)于分離通道)。對(duì)于顆粒10的既定初始條件組合,只有一個(gè)坐標(biāo)是獨(dú)立的,即t。因此,我們需要計(jì)算v(t)和x(t)。物體10的加速取決于電場(chǎng)力和摩擦力共同作用的凈作用力,其中電場(chǎng)力與摩擦力典型地互相對(duì)抗(見(jiàn)圖1)。由此給出 其中m是顆粒10的質(zhì)量。通過(guò)代入,上式變?yōu)? 通過(guò)將以上方程對(duì)t求導(dǎo)(改變記號(hào)),我們得到 (1.7) mv”(t)=qα[x’(t)-k]-fv’(t) 其中x’(t)=v(t)。因此上面的方程變?yōu)槎A線性微分方程 (1.8)mv”(t)+fv’(t)-qαv(t)+qαk=0 其有如下解 其中A和B是取決于初始條件的常數(shù)。第一項(xiàng)在t→∞時(shí)是潛在離散的。但是如果滿足以下條例件 (1.10) (1.9)的左邊項(xiàng)在t→∞時(shí)變?yōu)榱恪?br>
對(duì)于t=0我們可選擇速度為v0 v(0)=v0 (1.11) ∴k+A+B=v0 _B=v0-k-A 我們需要另外的初始條件來(lái)確定A。通過(guò)對(duì)方程(1.9)求導(dǎo),t=0時(shí)我們得到 根據(jù)定義x=x0和方程(1.6),在t=0時(shí)得到 通過(guò)使(1.12)和(1.13)相等,我們可解出A 代入方程(1.11)我們得到B的最終解 現(xiàn)在我們已根據(jù)初始條件{t=0,x=x0&v=v0}計(jì)算出參數(shù)A和B, 因此現(xiàn)在我們從方程(1.9)已知速度v(t)。
假設(shè)條件(1.10)不變,我們可得到 因此顆粒10的速度會(huì)聚在等于場(chǎng)參數(shù)k的終速度上。另外,從方程(1.16)中我們觀察到,速度將會(huì)聚到k而與f、α、q和m的值無(wú)關(guān)。換句話說(shuō),所有形狀、大小和電荷(倘若如條件(1.10)所需,電荷符號(hào)正確匹配到電場(chǎng))的所有顆粒將會(huì)聚到相同的終速度k。
圖4顯示將運(yùn)動(dòng)方程應(yīng)用于具有任意特征的分子。速度會(huì)聚到一個(gè)穩(wěn)定值,其為終速度。
為了區(qū)分條帶,必須將具有不同形狀和電荷特征的顆粒物理性分離開(kāi),并形成明顯區(qū)分的條帶。簡(jiǎn)而言之,所有的物體10(因此以及條帶)應(yīng)達(dá)到相同的終速度,其應(yīng)為恒定的。如果所有的顆粒10達(dá)到相同的終速度并且以疊加的形式共遷移,則裝置不是有效的。顆粒10的空間位置是 (1.17) dx=v(t)dt 代入方程(1.9)到上式并積分,我們得到 以及因此 一旦顆粒10到達(dá)終速度,指數(shù)項(xiàng)是非常小的,方程(1.19)變?yōu)? 這意味著每個(gè)顆粒10將移動(dòng)一定距離,該距離由它的終速度加上取決于顆粒的電荷、質(zhì)量和摩擦特征的固定量來(lái)決定。因此不同顆粒將以相同速度遷移,但是相互之間的固定距離不相同。
如果起點(diǎn)x0不同,相同顆粒也共遷移。這可通過(guò)考慮從兩個(gè)不同位置x1、x2出發(fā)的兩個(gè)相同顆粒來(lái)證明。通過(guò)對(duì)兩個(gè)顆粒的方程(1.20)相減,我們得到 (1.21)x1(t,m,q,f,x1)-x2(t,m,q,f,x2)=0,t→+∞ 因此即使相同顆粒在沿著分離通道的不同起點(diǎn)上出發(fā),它們也將共遷移。圖5使用兩對(duì)相同的顆粒證明了這一點(diǎn)。顆粒(1)和(4)共有相似的電學(xué)和流體力學(xué)特征,物體(2)和(3)也是。一對(duì)中的各個(gè)顆粒在沿x軸的不同位置上出發(fā)。通過(guò)施加適當(dāng)?shù)碾S時(shí)間變化的電場(chǎng),顆粒沿著使相同顆粒共遷移的軌跡。不同的物體對(duì)以相同速度移動(dòng),但相互距離不同。通過(guò)控制場(chǎng)參數(shù)k和強(qiáng)度α,可調(diào)節(jié)裝置的分辨率(即條帶寬和/或沿x軸的間距)。也可對(duì)于給定長(zhǎng)度的分離通道2調(diào)節(jié)裝置的動(dòng)態(tài)范圍(待分辨的電荷、質(zhì)量和摩擦特征的范圍)。
應(yīng)注意的是,上述情形,包括所施加電場(chǎng)的性質(zhì)及作用于物體10的流體動(dòng)力的性質(zhì),僅僅是示例性的,并試圖非限制性地舉例說(shuō)明本發(fā)明的原理。實(shí)踐中,可選擇對(duì)待分離顆粒適宜的電場(chǎng)分布的形狀。根據(jù)這個(gè)形狀,可規(guī)定在給定通道長(zhǎng)度中以給定分辨率進(jìn)行分離的物體的動(dòng)態(tài)范圍(關(guān)于電荷和摩擦系數(shù))。
例如,如果樣品含有的物體中大尺寸的(大的摩擦和電荷)比小尺寸的(小的摩擦和電荷)更稀疏,則選擇“下凹型”場(chǎng)分布,比如圖2b中所示的那樣,將“壓縮”較大尺寸的使彼此更接近,而較為緊密分布的小尺寸將較分散。這使得當(dāng)需要時(shí)在較密集區(qū)域中實(shí)現(xiàn)較高的分辨率,允許用戶“放大”條帶串中的特定部分。哪些部分被壓縮以及哪些被擴(kuò)展取決于場(chǎng)分布曲率的符號(hào)。
但是,所有實(shí)施方案共同的是應(yīng)用隨時(shí)間而相對(duì)于分離通道2調(diào)節(jié)的電場(chǎng)分布。這使得帶電物體10連續(xù)受到電場(chǎng)力,使得它們相對(duì)于流體9運(yùn)動(dòng)。結(jié)果,流體連續(xù)施加流體動(dòng)力。這些力的共同作用導(dǎo)致高效的分離,并且,重要的是,使條帶不隨時(shí)間而擴(kuò)散。
在優(yōu)選實(shí)施方案中,流體9沒(méi)有穿過(guò)通道2流動(dòng)。這消除之前討論過(guò)的與拋物線形速度前沿有關(guān)的問(wèn)題,并且允許裝置達(dá)到明顯更高的分辨率。也消除了對(duì)昂貴的泵網(wǎng)絡(luò)的需要。但是,設(shè)想替代性實(shí)施方案中有一些流體流過(guò)通道。在電場(chǎng)必須以不可能實(shí)現(xiàn)的快速改變以達(dá)到有效分離的情況下,這一點(diǎn)可以是有利的。但是,在大多數(shù)情況下,預(yù)期消除流體流動(dòng)有更大的益處。
也就是說(shuō),可通過(guò)電滲流(“EOF”)在通道中建立(有意的或無(wú)意的)流體流動(dòng)。這是所施加電場(chǎng)以及流體和分離通道內(nèi)表面的電學(xué)性質(zhì)的共同作用所造成的現(xiàn)象。如在傳統(tǒng)電泳系統(tǒng)中,通過(guò)選擇合適的表面化學(xué)來(lái)停止EOF或?qū)⑵淇刂圃谧顑?yōu)值(其可以是零)。通過(guò)對(duì)通道壁進(jìn)行處理來(lái)在化學(xué)上控制通道壁與流體之間的相互作用。也可改變電場(chǎng)的設(shè)置來(lái)使得EOF發(fā)揮作用。
圖6、7和8顯示了三種優(yōu)選的實(shí)現(xiàn)方案??商峁┰S多不同形式的分離通道2,盡管在每種情況下都優(yōu)選設(shè)置成基本上水平的(即通道2應(yīng)處于一個(gè)水平面中)。這避免了重力干擾流體過(guò)程。在圖6的實(shí)施方案中,分離通道2是毛細(xì)管,其在使用時(shí)容納有流體9和包含待分離物體10的樣品。分離通道2的一部分被一系列環(huán)形電極3a到3e環(huán)繞,其提供了沿通道2施加電場(chǎng)的裝置3。每個(gè)電極3a到3e上的電壓受控制器4(圖1)的控制。應(yīng)注意的是,圖中所顯示的電極的數(shù)量只是用于舉例說(shuō)明。
圖7顯示第二個(gè)實(shí)施方案,其中以在襯底12上刻劃通道的方式提供微流體學(xué)分離通道2。襯底12可以是例如玻璃、石英或聚二甲基硅氧烷(PDMS)板或半導(dǎo)體芯片。一系列電極3a、3b、3c等沿分離通道2布置,并構(gòu)成沿分離通道2的至少一部分施加電場(chǎng)的裝置3???和8提供輸入和輸出端口,用以將樣品引入分離通道2和/或從通道2提取它的一部分。下文將對(duì)此進(jìn)行更詳細(xì)描述。
電極3a、3b、3c等受控制器4的控制,使得提供時(shí)間依賴性的電場(chǎng)。分離通道內(nèi)的物體分離開(kāi)并在分離通道內(nèi)形成以(優(yōu)選)恒定速度移動(dòng)的條帶。在上文描述的線形實(shí)施方案中,可讓電場(chǎng)振蕩以使得條帶沿通道2前后運(yùn)動(dòng),從而允許對(duì)同一條帶的多次檢測(cè)。這可以增加對(duì)低濃度組分的靈敏度。
作為線形實(shí)施方案的替代,可提供閉合環(huán)形式的分離通道2,其一個(gè)實(shí)例如圖8所示。所述環(huán)可以是圓形的(即具有如圖8中所示的圓形俯視圖),但是如果通道2有直形截面,尤其在檢測(cè)區(qū)域,實(shí)際上可能是有利的。在通道2周?chē)g隔提供電極3a、3b、3c......3p,從而構(gòu)成電場(chǎng)發(fā)生裝置3。通常,電極如圖8所示以對(duì)稱形式放置。所施加的電壓也可是對(duì)稱的,如圖8所示的值V0到V8。
當(dāng)施加隨時(shí)間變化的電場(chǎng)時(shí),在左邊半圓或右邊半圓的物體10(假設(shè)它們帶有相同符號(hào)電荷)發(fā)生分離,以順時(shí)針或逆時(shí)針?lè)较蜻\(yùn)動(dòng)。相反半圓中的分子不發(fā)生分離,但是以不規(guī)則形式運(yùn)動(dòng),直到進(jìn)入另一個(gè)半圓。這是因?yàn)樵谝粋€(gè)半圓中的分子將受到一種電場(chǎng)梯度,該電場(chǎng)梯度與時(shí)間依賴性矢量k非適當(dāng)性匹配。給定的一組電場(chǎng)參數(shù)將只允許一定范圍內(nèi)的電荷和摩擦值在給定分離長(zhǎng)度上得到分離。當(dāng)落在這個(gè)范圍內(nèi)的遷移分子完成了一整圈,所有這些分子同步運(yùn)動(dòng),并分離成條帶。所得的條帶串列持續(xù)圍繞通道2旋轉(zhuǎn),可對(duì)其重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)。
分離通道2可以是直的或彎曲的或兩者的結(jié)合。相同的原理應(yīng)用于任一裝置上,此外還有彎曲通道所需的速度修正(見(jiàn)下文)。圖9顯示一個(gè)同時(shí)具有直形和彎曲通道的實(shí)施方案的網(wǎng)絡(luò)示例。在此例中,分離發(fā)生在圓形通道13、14中。一種分離策略可以是有在多個(gè)點(diǎn)流體相連的許多同心圓(或許多平行的線形通道)。外圓13(或第一線形通道)13的場(chǎng)參數(shù)設(shè)置成給定的初始條件,以實(shí)現(xiàn)此通道中的初始分離,該通道可能顯示大圖(寬的摩擦電荷空間)。然后在此空間的個(gè)別窗口緊挨傳送通道15通過(guò)時(shí),切下它們(見(jiàn)圖9),然后將它們傳送到相鄰的分離通道13’,其具有不同的電場(chǎng)設(shè)置,以使分離集中于所選擇的摩擦電荷窗口。以這種形式,可選擇許多窗口并將其傳送到不同的分離通道,這些分離通道具有對(duì)樣品中此特定部分分離進(jìn)行優(yōu)化的場(chǎng)設(shè)置。例如DNA測(cè)序可自動(dòng)地切成各個(gè)堿基對(duì)范圍,并以非常高的堿基對(duì)讀取速度分開(kāi)測(cè)序。
其它策略可涉及不同的大分子。例如一些環(huán)16可標(biāo)記為儲(chǔ)存環(huán),在此分離蛋白質(zhì)被傳送并儲(chǔ)存在期望的緩沖環(huán)境中。另一些環(huán)17可用作混合通道。也可有“反應(yīng)環(huán)”(或通道),在此所傳送的大分子暴露于期望的化學(xué)試劑,它們?cè)谘胤蛛x通道移動(dòng)的同時(shí)發(fā)生反應(yīng)?;瘜W(xué)反應(yīng)的產(chǎn)物可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)分離原理自動(dòng)與母分子分離,并在反應(yīng)發(fā)生過(guò)程中實(shí)時(shí)顯示。
另外,溫度和其它環(huán)境參數(shù)也可以在每個(gè)環(huán)(通道)中受控,以獲得受控的反應(yīng)。例如,蛋白質(zhì)折疊可通過(guò)在分離蛋白質(zhì)的通道中逐漸增加溫度來(lái)監(jiān)測(cè)。在給定溫度下,蛋白質(zhì)將去折疊,在它們沿分離通道移動(dòng)時(shí),那些蛋白質(zhì)的電動(dòng)性質(zhì)將發(fā)生改變,由此而觀察到這一事件。
為了以下目的(以及其它),樣品收集和注入孔可置于沿分離通道或環(huán)的選定位置用凝膠或緩沖液填充通道,用化學(xué)劑沖洗通道,樣品注入,樣品收集和其它。
在彎曲形分離通道中(例如圓形),沿通道外周移動(dòng)的分子必須比沿內(nèi)周移動(dòng)的分子速度更快,以使得它們保持同相和形成連貫的條帶。如果沒(méi)有施加這樣的速度修正,靠近外周移動(dòng)的分子變得與內(nèi)周分子不同相,條帶形成擴(kuò)展的螺旋形(圖10)。這可通過(guò)在環(huán)形通道的任一側(cè)設(shè)置電極來(lái)阻止??刂齐妶?chǎng)施加裝置3,使得外部電極將產(chǎn)生隨時(shí)間變化的場(chǎng),其具有比內(nèi)部電極所產(chǎn)生kinner稍高的參數(shù)kouter。在大多數(shù)情況下,如果外部和內(nèi)部電極在相同的角位置是同相的,即它們?cè)谌我庖粋€(gè)時(shí)刻下都帶有相同電壓,這就是充分的。在內(nèi)部和外部電極上不同電壓施加的情況下,由于外部和內(nèi)部電極之間的距離小,細(xì)微不同的電場(chǎng)將在兩個(gè)電極之間插入,對(duì)于外周和內(nèi)周之間的位置產(chǎn)生中間場(chǎng)值,導(dǎo)致如圖11所示的連貫條帶。
應(yīng)注意的是,如果電極度放射狀擴(kuò)展(即布置每個(gè)電極使得其與分離通道的內(nèi)周和外周相交,并指向彎曲的中心),也可實(shí)現(xiàn)對(duì)k的自動(dòng)修正。這是因?yàn)殡姌O上的電壓串列將在給定時(shí)間段內(nèi)完成一整個(gè)循環(huán),而無(wú)論放射的位置。
應(yīng)了解,對(duì)于在分離通道上建立電場(chǎng)分布(如上文所述)需要非線性電壓分布。為了在每個(gè)上述實(shí)施方案里實(shí)現(xiàn)此點(diǎn),建議通過(guò)一系列電極3a、3b、3c等沿分離通道施加隨時(shí)間變化的電場(chǎng)分布。電極可與分離緩沖液非電接觸,但是與其非常接近。這樣的一系列電極將在分離通道內(nèi)部產(chǎn)生靜態(tài)電場(chǎng)。這種設(shè)置的好處在于,首先因?yàn)殡姌O之間沒(méi)有電流,功率源的功率消耗非常低。其次,可放置電極使之與分離通道有一段(很小)距離,使得電極陣列的離散性而造成的對(duì)電場(chǎng)的局部效應(yīng)變的平滑。實(shí)際上,電極離分離通道越遠(yuǎn),通道中的電場(chǎng)越平滑。
但是,這種設(shè)置有一個(gè)缺點(diǎn)。對(duì)極性電介質(zhì)比如水性緩沖液施加靜電場(chǎng)將被介電系數(shù)阻尼,其中對(duì)于水溶液,介電系數(shù)通常為80左右。為在流體內(nèi)部有效產(chǎn)生電場(chǎng),必須考慮場(chǎng)變化速率、介電常數(shù)、介質(zhì)的電導(dǎo)率。典型地,由相同電荷在水中所產(chǎn)生的電場(chǎng)比在空氣中(介電系數(shù)1)產(chǎn)生的電場(chǎng)小80倍。這意味著在所述裝置的一些設(shè)置中,需要施加非常高的電壓。這需要特殊的HV供應(yīng)和仔細(xì)考慮植入電極處的介電材料,以避免介電擊穿和在電極間形成火花。這個(gè)問(wèn)題可通過(guò)使用與分離緩沖液電接觸的電極來(lái)避免。通過(guò)在導(dǎo)電的分離緩沖液中產(chǎn)生電流來(lái)產(chǎn)生高電場(chǎng)要容易的多。
為改進(jìn)電場(chǎng)產(chǎn)生,可配置外部(非接觸)和內(nèi)部電極的組合。例如,如圖12所示,在大多數(shù)情況中,在任意時(shí)刻沿通道的電場(chǎng)梯度由常量和變量部分組成。恒定場(chǎng)E0(大多數(shù)情況下顯然是最大的)可通過(guò)在兩個(gè)位于分離通道相反兩端的電極3X和3Y之間施加電壓來(lái)實(shí)現(xiàn)。接著,如圖13和14所示可通過(guò)沿分離通道的外部電極陣列添加梯度En。在圖14中,電極3a、3b、3c等等是外部的,即與流體接近卻不接觸,而電極3’a、3’b、3’c等等是內(nèi)部的,即與流體電接觸。
在圓形通道的情況下,并不清楚哪兒是分離的“末端”。事實(shí)上,兩個(gè)相對(duì)的內(nèi)部電極必須圍繞通道與分離同相旋轉(zhuǎn)。因此,在這種情況下,需要內(nèi)部電極陣列。應(yīng)注意在理論上并且在每個(gè)時(shí)刻只有兩個(gè)內(nèi)部電極攜帶電壓。那兩個(gè)電極可在沿直徑相對(duì)的位置。圖15顯示了交替的內(nèi)部和外部電極的這樣一種設(shè)置。外部電極產(chǎn)生時(shí)間依賴性的靜電場(chǎng)梯度,并形成了該裝置的特殊分離原理。靜電場(chǎng)被添加到內(nèi)部電極產(chǎn)生的恒定電場(chǎng)之上。
圖14顯示,沿微流體通道的交替的內(nèi)部和外部電極的布置。應(yīng)注意,內(nèi)部和外部電極都可布置在沿分離通道的任一側(cè),或者可以密封地圍繞它以實(shí)現(xiàn)沿通道最平滑可能的電場(chǎng)。
可以單獨(dú)通過(guò)內(nèi)部電極陣列產(chǎn)生所述電場(chǎng)。但是,與分離緩沖液電接觸的電極預(yù)期使沿通道的每個(gè)電極位置處的電場(chǎng)產(chǎn)生顯著變形。分離分子在非常接近電極的地方(接觸)通過(guò),“感受”到電場(chǎng)變形。這將降低分辨率。在通過(guò)在通道的任一端只使用兩個(gè)電極而只產(chǎn)生恒定電場(chǎng)的情況下(傳統(tǒng)電泳),不存在同樣的問(wèn)題,這是因?yàn)榉肿釉陔姌O之間分離,并且永不會(huì)靠近它們。
事實(shí)上,因?yàn)殡妶?chǎng)沿通道變化非常敏銳,在一些情況下,內(nèi)部電極陣列造成的變形對(duì)此處所公開(kāi)系統(tǒng)的分離原理造成顯著影響。另外,電極的徑向尺寸可起到重要作用。例如,如果我們假定大約100微米長(zhǎng)(沿通道)的平電極,兩個(gè)帶有相同電壓的相對(duì)電極之間的電場(chǎng)將為零。這是因?yàn)殡妷涸谙鄬?duì)電極之間的空間沒(méi)有徑向(沿通道)變化,因此電場(chǎng)在該區(qū)域趨向于降為零。這加劇了內(nèi)部電極造成的局部變形。
但是,如上文所討論的,考慮到需要更簡(jiǎn)單的電路和更低的電壓,使用內(nèi)部電極有顯著優(yōu)勢(shì)。
降低內(nèi)部電極導(dǎo)致的局部變形的一種方法是在分離通道中電極和凝膠之間設(shè)置電阻性介質(zhì)。因此,在另一個(gè)實(shí)施例中,可沿通道布置多個(gè)電極點(diǎn),與帶有電阻的材料相連接。在每個(gè)點(diǎn)上施加電壓陣列,并且所述點(diǎn)之間的電阻插入兩點(diǎn)之間的電場(chǎng),使得電場(chǎng)更平滑。圖16顯示此種設(shè)置的一個(gè)實(shí)施例,其中使用兩個(gè)半導(dǎo)體層11來(lái)代替通道2的側(cè)壁。電極3”a1、3”a2、3”b1、3”b2等放置在這些電阻層11的外側(cè),其具有使分離通道2內(nèi)部所產(chǎn)生電場(chǎng)變平滑的作用。電阻材料11可以是摻雜硅或者在電阻率和介電常數(shù)方面具有期望性質(zhì)的任何其它介質(zhì)。由于其電阻率可跨多個(gè)數(shù)量級(jí)進(jìn)行控制,摻雜半導(dǎo)體是具有吸引力的。另外,這樣的材料通常趨向于生物相容性(即化學(xué)惰性),并且尤其對(duì)于硅,用于建立微觀結(jié)構(gòu)的可用技術(shù)不昂貴且廣泛可用。
圖17顯示圖16中舉例說(shuō)明的結(jié)構(gòu)沿著線Q-Q’的構(gòu)造的截面。在截面中央顯示了包含分離介質(zhì)9的分離通道2,其任一側(cè)設(shè)置有電阻材料層11。內(nèi)部和外部電極3”a1和3”a2位于電阻層11的外側(cè),使得電阻材料位于電極3”a1、3”a2和分離通道2之間。
我們使用了有限元算法來(lái)計(jì)算場(chǎng)形狀及其在有和沒(méi)有電阻層11時(shí)的平滑度。在第一個(gè)實(shí)例中,將鉑電極置于沒(méi)有電阻層11的分離通道2的側(cè)壁。電極之間的距離是1毫米,并且它們的徑向(z方向)尺寸是100微米。圖18A顯示這種方案的俯視圖,舉例說(shuō)明了凝膠填充的分離通道2和三對(duì)與凝膠9電接觸的電極3”a1、3”a2等。圖18B顯示分離通道2的一個(gè)截面內(nèi)按照有限元算法計(jì)算的電場(chǎng)矢量。顯而易見(jiàn),在電極附近從徑向上電場(chǎng)有顯著偏差。
圖18C顯示沿通道2中央的電壓分布(沿位于通道2截面中央且與x方向平行的線)。電壓范圍與電極上施加值的范圍(0到700V)相一致。線的形狀符合方程 (2.1)V=1/2kx2+cx 其給出了線性場(chǎng) (2.2)E=-kx-c 但是,圖18D描述了沿通道的相應(yīng)徑向電場(chǎng)分布,顯示電場(chǎng)變形在電極附近非常明顯。
在第二個(gè)實(shí)例中,如圖19A中的俯視圖所示,將1mm厚的電阻層11置于分離通道2的側(cè)面,其實(shí)際上形成了通道2的壁。在本實(shí)例中材料的電阻率是80Ωm。電極3”a1、3”a2是20μm寬(沿z方向),并且它們沿電阻材料的外壁以1mm間隔放置。圖19B顯示對(duì)于此設(shè)置計(jì)算出的電場(chǎng)矢量??梢?jiàn),電場(chǎng)變形局限在電阻層11內(nèi),并且分離通道2內(nèi)的電場(chǎng)矢量主要沿z方向指向。圖19C顯示沿位于通道2中央與x方向平行的線的電壓分布。此外,電壓范圍與電極電壓相一致,且電壓分布遵從二次冪法則。圖19D顯示電場(chǎng)形狀,現(xiàn)在其沒(méi)有圖18所示設(shè)置產(chǎn)生的強(qiáng)振蕩。
內(nèi)部電極也可置于靠近傳送通道的策略性位置,用以將蛋白質(zhì)或DNA條帶從分離通道轉(zhuǎn)移出來(lái),并將它們傳送至分離環(huán)的相鄰?fù)ǖ?。例如,在圖15所示的結(jié)構(gòu)中,相同的內(nèi)部電極陣列可用于以下雙重目的,施加恒定場(chǎng)以及將條帶從分離環(huán)轉(zhuǎn)移到傳送通道并進(jìn)而到達(dá)另一個(gè)環(huán)或收集孔。
電場(chǎng)施加裝置3可由沿分離通道2(或電阻層11)固定的導(dǎo)線組成。作為替代,可使用與電子PCB板相似的蝕刻法或使用導(dǎo)電墨制作電極。后一種方法尤其具有吸引力,因?yàn)榭稍趶?fù)雜的結(jié)構(gòu)中印刷非常細(xì)小的電極。也可通過(guò)沿通道的變化電阻施加電場(chǎng)。還可以提供可移動(dòng)的電極陣列或者可受控制以使其相對(duì)于分離通道2移動(dòng)的其它電場(chǎng)生成裝置。
在以上所描述的每一個(gè)實(shí)施方案中,可向電泳裝置提供檢測(cè)器6,用于在分離物體條帶一旦形成后對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)。典型地,檢測(cè)器6產(chǎn)生已分離條帶的圖象??梢杂卸喾N更適合于不同需要例如成本、準(zhǔn)確度和不同樣品的成像系統(tǒng)。跑無(wú)標(biāo)記(不染色)樣品的可能性通常是更有吸引力的選擇,因?yàn)樵谀撤N任何程度上它保持樣品不修飾。另外,使用染料是不期望的,因?yàn)榻Y(jié)合在DNA或蛋白質(zhì)上的物質(zhì)也會(huì)結(jié)合在使用者上。另外,因?yàn)槿サ袅艘粋€(gè)準(zhǔn)備步驟,所以成本更低。因?yàn)橥瑯拥脑蛞步档土藴?zhǔn)備時(shí)間。
現(xiàn)在將描述兩種無(wú)標(biāo)記的檢測(cè)方法。圖20和21分別顯示了實(shí)行UV吸收和激光誘導(dǎo)熒光(LIF)技術(shù)的實(shí)例。應(yīng)注意的是,對(duì)于成像也可設(shè)置涉及熒光檢測(cè)染色樣品的其它結(jié)構(gòu)。通常,不論來(lái)自吸收還是熒光,光模式都可通過(guò)光電二極管、像素檢測(cè)器(例如CCD)或者光電倍增管(PMT)來(lái)檢測(cè)。
圖20顯示UV吸收裝置。UV光源20發(fā)出光,其穿過(guò)匯聚透鏡21、聚焦透鏡23和成像透鏡25。所述光被干涉濾光器22濾過(guò),并聚焦在微流體通道24上。用光電二極管或像素檢測(cè)器26檢測(cè)吸收?qǐng)D像,并由PC 27進(jìn)行數(shù)字化。
圖21顯示激光誘導(dǎo)熒光(LIF)裝置。激光30以UV波長(zhǎng)30’照在微流體通道34上,并造成分離條帶中的大分子以一定波長(zhǎng)發(fā)出熒光。干涉濾光器32調(diào)整到此波長(zhǎng)窗口。光電二極管31以相對(duì)于激光束的一個(gè)角度放置。光學(xué)器件33允許光電二極管檢測(cè)所述熒光的錐形部分。發(fā)射出的信號(hào)由PC 35進(jìn)行數(shù)字化。
在每種情形下,信號(hào)傳送至包含負(fù)責(zé)信號(hào)數(shù)字化的模擬-數(shù)字轉(zhuǎn)換器(ADC)的計(jì)算機(jī)27或35??刂坪头治鲕浖?shí)時(shí)對(duì)圖像進(jìn)行分析。
在如上文所提及的傳統(tǒng)電泳中,條帶之間的相對(duì)距離隨時(shí)間而增加,這是因?yàn)樗鼈円圆煌慕K速度移動(dòng)。因此,邏輯上只對(duì)分離的最后部分進(jìn)行成像,在此所述條帶達(dá)到了它們最大的相對(duì)距離。相對(duì)而言,所提議方法很早就實(shí)現(xiàn)了分離,因此成像可在沿分離通道的任意點(diǎn)進(jìn)行,或者甚至,可以使用沿分離通道徑向布置的像素檢測(cè)器對(duì)沿通道的許多點(diǎn)進(jìn)行成像。檢測(cè)器可被讀出電子器件(可包括在控制器4中)每秒多次訪問(wèn),因此給出精確描述條帶沿通道運(yùn)動(dòng)的幀陣列(an array of frames)。在大多數(shù)實(shí)施方案中,沿分離通道有很多像素不是必需的,但是在一些場(chǎng)合,獲得連續(xù)分離的動(dòng)態(tài)圖像可能是有利的。在另一些實(shí)施方案中,可使用CCD對(duì)多通道微流體或毛細(xì)管系統(tǒng)的更大區(qū)域進(jìn)行成像??梢源朔绞桨仓脵z測(cè)器和成像光學(xué)器件,使得對(duì)多個(gè)同時(shí)進(jìn)行分離的分離通道同時(shí)成像。這使得在實(shí)時(shí)或者在分離完成以后,對(duì)于不同通道之間的對(duì)比分析變得更簡(jiǎn)單。使用這種光學(xué)器件和檢測(cè)器方案的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以只涉及一個(gè)讀出電路,從而幫助降低了多個(gè)電路時(shí)對(duì)成像所誘導(dǎo)的系統(tǒng)噪音。
輸入端口7典型地以孔的形式提供,其設(shè)置為接收注入的樣品。輸出端口8典型地包含配備電極的孔,所述電極可被控制器4激活,從而在樣品的選定部分經(jīng)過(guò)退出點(diǎn)時(shí),將期望組分從分離通道中拉出并進(jìn)入輸出端口。
還可以設(shè)想,可向所述設(shè)備提供多于一個(gè)分離通道2。在此情況下,將向每個(gè)通道提供用于沿通道施加電場(chǎng)的裝置3和控制該電場(chǎng)的控制器。方便地,一個(gè)控制器可控制多個(gè)(或者全部)通道,并且通道之間還可以共享電場(chǎng)施加裝置。如前文所述,可向每個(gè)通道提供檢測(cè)器和輸入輸出端口。
可對(duì)每個(gè)通道進(jìn)行控制使之經(jīng)歷相同的電場(chǎng)變化。但是,如果每個(gè)通道的內(nèi)容物不同,對(duì)每個(gè)通道上所施加的電場(chǎng)單獨(dú)控制可能是有利的。
現(xiàn)在將描述根據(jù)上述任意實(shí)施方案的電泳裝置的操作。在接下來(lái)的描述中,術(shù)語(yǔ)“樣品”用于描述待分離物體10與一定體積的分離流體9的混合物。典型地,通過(guò)將待分離物體與所述流體相混合來(lái)制備樣品,然后將它們用于填充分離通道2。典型的待分離物體包括大分子、生物分子或者聚合物比如蛋白質(zhì)、DNA分子或者生物細(xì)胞。分離流體可以是緩沖液(其組成例如是N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、牛血清白蛋白和n-辛基葡萄糖苷)或者凝膠比如聚丙烯酰胺。
本裝置超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)電泳和色譜技術(shù)的另一優(yōu)點(diǎn)是這種事實(shí)不需要樣品注入栓。例如在傳統(tǒng)毛細(xì)管電泳中,當(dāng)進(jìn)行樣品注入時(shí),首先將毛細(xì)管的一端沒(méi)入容納DNA或蛋白質(zhì)溶液的容器中。然后電極也沒(méi)入樣品容器和廢物容器,而形成通過(guò)毛細(xì)管的閉合回路。所形成的電場(chǎng)將一定量的DNA或蛋白質(zhì)拉入毛細(xì)管。停止施加電壓,將樣品容器替換成只裝有鹽溶液的容器。然后再施加電壓,在毛細(xì)管入口處形成的小樣品栓40(圖22)開(kāi)始移動(dòng)并發(fā)生分離。這是樣品注入的標(biāo)準(zhǔn)方法。應(yīng)注意,分離條帶41直接受到樣品栓初始寬度的影響。另外,熱擴(kuò)散進(jìn)一步增加這一寬度。
然而,本發(fā)明裝置不需要這種樣品栓。DNA或蛋白質(zhì)可與篩分凝膠或緩沖液在引入毛細(xì)管之前相混合(圖23)。作為替代,分離通道2可預(yù)先充滿流體9,待分離物體10或樣品在稍后階段并且在分離過(guò)程開(kāi)始之前再引入。樣品滴43可隨機(jī)引入沿分離通道的任意位置(圖24)。樣品滴43經(jīng)區(qū)域44擴(kuò)散進(jìn)入流體9。隨時(shí)間變化的電場(chǎng)將“收集”所有樣品分子,并且將它們高分辨率地分選并形成沿所述通道的條帶42。這種“隨機(jī)-不連貫的”注入在傳統(tǒng)色譜或電泳過(guò)程中是無(wú)效的。原因在于如果從不連貫開(kāi)始其沒(méi)有一個(gè)形成連貫條帶的機(jī)制。事實(shí)上,注入栓的尺寸是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題,因?yàn)樗苯佑绊懥朔直媛省?br>
例如,目前的商品裝置使用了電動(dòng)注入(如上文所描述,圖22)或者壓力注入(使用壓力以取代使用電壓來(lái)拉動(dòng)栓)。使用兩種不同方法的原因恰恰在于每種方法在不同構(gòu)造中帶來(lái)略好的分辨率。
此處所公開(kāi)的裝置不依賴于任何此種注入栓。這就是為什么與標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)相比它允許使用替代注入方法的原因??赏ㄟ^(guò)使之與分離緩沖液(或篩分凝膠)預(yù)先混合,或者通過(guò)將其壓力注入進(jìn)入孔,而將所述樣品加到分離通道中。作為替代,可將樣品置于孔內(nèi)或容器內(nèi),并使用標(biāo)準(zhǔn)電動(dòng)注入法將其注入分離通道。這意味著,一個(gè)電極沒(méi)入容納有樣品的孔中,而傳送通道的另一端有一個(gè)電極。通過(guò)在電極之間施加合適的電壓,樣品受電力吸引而離開(kāi)孔,通過(guò)傳送通道,進(jìn)入分離通道。
一種替代性注入方法將利用所述裝置的特殊性質(zhì),其不需要連貫的注入栓。通過(guò)沿分離通道的任意點(diǎn)處的注射器樣儀器,將樣品滴簡(jiǎn)單地置于緩沖液或篩分凝膠的表面上(見(jiàn)圖24)。接著,所述滴將不相干地?cái)U(kuò)散進(jìn)入靠近注入點(diǎn)的緩沖液區(qū)域44。一旦所述滴被置于緩沖液上,當(dāng)它透過(guò)緩沖液擴(kuò)散時(shí),變化電場(chǎng)將立刻影響所述分子,并且分離過(guò)程也被啟動(dòng)。
可手動(dòng)或者依靠受專門(mén)軟件控制的機(jī)械臂自動(dòng)地將注射器類型的儀器轉(zhuǎn)移到分離通道的露出部分。
通過(guò)電場(chǎng)生成裝置3沿分離通道2施加具有合適形狀及強(qiáng)度場(chǎng)分布的電場(chǎng)。控制器4改變所述電場(chǎng),使得產(chǎn)生相對(duì)于分離通道來(lái)調(diào)節(jié)電場(chǎng)的時(shí)間依賴性,并由此使分子如前文所述分離成條帶。然后可通過(guò)檢測(cè)器6對(duì)條帶成像,或者進(jìn)行檢測(cè),并且所述裝置產(chǎn)生相應(yīng)的輸出5。檢測(cè)或者成像可以發(fā)生在條帶形成以后或者分離過(guò)程中。信號(hào)隨時(shí)間的演化給出了額外的信息,其中一個(gè)例子是“反應(yīng)時(shí)間”。例如,如果聚合物樣品被加入緩沖環(huán)境中,在此發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并有另外條帶形成,然后所述另外條帶(反應(yīng)產(chǎn)物)的“出現(xiàn)時(shí)間”可給出關(guān)于此反應(yīng)特征的信息。另外,“蛋白質(zhì)折疊”是一個(gè)時(shí)間依賴性事件,因此在它發(fā)生時(shí)可被有效的監(jiān)測(cè)。
一旦物體10被分離成條帶,可通過(guò)進(jìn)一步調(diào)節(jié)電場(chǎng)對(duì)所述條帶自身進(jìn)行操縱。通過(guò)調(diào)節(jié)所述場(chǎng)的時(shí)間依賴性和強(qiáng)度,以及電場(chǎng)分布的形狀,可根據(jù)需要來(lái)調(diào)節(jié)條帶的分辨率與間距。所述條帶也可重新定位,例如,允許感興趣的具體條帶在一個(gè)退出端口被提取。
在一些應(yīng)用中,對(duì)所施加電場(chǎng)以使條帶(或分離物體)反復(fù)通過(guò)檢測(cè)器的方式進(jìn)行控制是有用的。傳統(tǒng)電泳或色譜方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是條帶只能在它們通過(guò)給定檢測(cè)器前方時(shí)成像一次。然而,在本技術(shù)中相同條帶可以多次成像,從而為吸收成像增加“光程”。吸收成像非常方便,因?yàn)闂l帶中的分子不需要用熒光標(biāo)記染色。所述方法也不昂貴,因?yàn)槠胀║V光源例如D2燈或汞燈是非常節(jié)省成本的。但是,吸收成像嚴(yán)重受到靈敏度的困擾。這是因?yàn)?,為了降低焦耳熱,分離通道必須有小截面,以實(shí)現(xiàn)較好的散熱。但是,小截面意味著短光程,因此每個(gè)條帶有小的吸收。在本發(fā)明裝置中,可通過(guò)對(duì)每個(gè)條帶反復(fù)成像消除光程限制。與之相反,每個(gè)循環(huán)增加一定量的光程。例如,這可通過(guò)振蕩所施加電場(chǎng)以使物體前后移動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn),或者通過(guò)使物體圍繞閉合環(huán)狀分離通道多次循環(huán)來(lái)達(dá)到。
在另一個(gè)實(shí)施方案中,所述裝置可進(jìn)行改造以適應(yīng)于通過(guò)輸入端口7連續(xù)或半連續(xù)地接收樣品。所施加的電場(chǎng)受到控制,以使得將物體分離成條帶,并且移動(dòng)一個(gè)或多個(gè)感興趣條帶到或經(jīng)過(guò)一個(gè)或多個(gè)輸出端口8。每次當(dāng)條帶到達(dá)時(shí),輸出端口可被激活,使得可以幾乎連續(xù)地將感興趣組分從分離通道提取出來(lái)。以這種方式,所述裝置可具有純化系統(tǒng)的功能。
如已經(jīng)描述過(guò)的,我們提供了預(yù)計(jì)可實(shí)現(xiàn)對(duì)物體進(jìn)行快速高效且高分辨率的分離的電泳裝置和方法。所述技術(shù)可有利地與微流體技術(shù)相結(jié)合或以其作為接口,以實(shí)現(xiàn)小型化、超高分辨率、超快速的分離裝置。它的生產(chǎn)應(yīng)是不昂貴的,因?yàn)椴恍枰F重的額外部件。所公開(kāi)的裝置不需要流體流動(dòng),因此不需要昂貴的泵網(wǎng)絡(luò)。因?yàn)樗赏ㄟ^(guò)改變電場(chǎng)來(lái)控制,所以分辨率大大提升,并且因此可任意提高(在過(guò)熱限制的范圍內(nèi))。消除了時(shí)間依賴性的顆粒擴(kuò)散,其限制了傳統(tǒng)裝置的分辨率。分辨率的這種進(jìn)步也允許裝置在相對(duì)于已知系統(tǒng)施加較低電流的情況下運(yùn)轉(zhuǎn)良好,因此降低了焦耳熱效應(yīng)。
現(xiàn)在將描述所述裝置的一個(gè)應(yīng)用例。具體地,描述一種實(shí)施DNA測(cè)序的方法。這里將不描述第一步驟,即從生物中提取DNA,以及可能的PCR擴(kuò)增和消化,這些如Sanger方法等中所描述。測(cè)序過(guò)程從四種反應(yīng)(A、T、G和C)可用的點(diǎn)開(kāi)始。首先,根據(jù)前文所述的加樣方法,將A反應(yīng)放入含篩分凝膠(例如聚丙烯酰胺)的分離通道中。然后,啟動(dòng)時(shí)間依賴性電場(chǎng),發(fā)生DNA分子的分離。對(duì)分子條帶成像,結(jié)果如圖25所示看起來(lái)像一系列峰。接著,注入T反應(yīng),T峰如圖24所示出現(xiàn)。接著(此時(shí)A和T反應(yīng)已經(jīng)分離并沿通道移動(dòng))依次注入G和C反應(yīng)(圖27和28)。
在通常測(cè)序過(guò)程中,四個(gè)反應(yīng)需要用不同顏色進(jìn)行化學(xué)染色,以便同時(shí)在同一通道中分離所有四個(gè)反應(yīng)。但是,此處所公開(kāi)的裝置通過(guò)在前一反應(yīng)之后延遲一段時(shí)間再將另一反應(yīng)注入同一分離通道并且不使用化學(xué)染料(無(wú)標(biāo)記)而克服了這一點(diǎn)。
通過(guò)實(shí)施這些連續(xù)的注入,與DNA條帶相應(yīng)的成像“峰”以時(shí)間順序形成。首先,“A”反應(yīng)峰出現(xiàn),并自動(dòng)地被成像軟件記錄下來(lái)。然后“T”峰逐漸出現(xiàn)。相似地,G和C峰隨時(shí)間進(jìn)一步延遲而出現(xiàn)。峰的時(shí)間性是哪個(gè)峰屬于哪個(gè)反應(yīng)的良好指標(biāo),因此測(cè)序可在單個(gè)微流體通道中進(jìn)行,并且不使用對(duì)DNA分子的染色。
通過(guò)觀察條帶的形成可獲得另外的信息。例如,如果已經(jīng)發(fā)生第二次注入,由于這第二次注入形成的條帶將逐漸在第一次注入的條帶之間形成。這種增加分布可以非常有用。作為替代,一旦來(lái)自第二次注入的條帶完全形成,就進(jìn)行成像,然后可與之前在此通道中只有一次注入時(shí)的分離模式進(jìn)行比較。但是,此增加分布在對(duì)給定條帶成像和定量中可以是消除系統(tǒng)誤差的非常有用的工具。例如,通過(guò)對(duì)給定條帶的信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)于時(shí)間作圖,可獲得信號(hào)真實(shí)大小的更可靠測(cè)量值。
依次注入不同樣品的方法可用作設(shè)計(jì)復(fù)雜樣品或多種樣品的分離方案的工具。在考慮注入順序時(shí),可考慮樣品組分之間或者組分與緩沖液之間的化學(xué)反應(yīng)。另外,其它參數(shù)比如溫度、緩沖液pH變化可以是操作方案的一部分??蓪l帶從一個(gè)分離通道中提取出來(lái),并傳送到另一個(gè)施加不同化學(xué)或環(huán)境條件的通道??蓪⒘硗獾姆肿訌耐獠坎⒁来巫⑷胨鲂路蛛x通道。
為了評(píng)價(jià)裝置的預(yù)期分辨率,我們應(yīng)用在線性聚丙烯酰胺凝膠的標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管電泳中DNA條帶的試驗(yàn)測(cè)量遷移率,并應(yīng)用Lamm方程推導(dǎo)出所提議發(fā)明的預(yù)期分辨率。這里將不提供詳細(xì)的分析,但是本技術(shù)允許比較預(yù)期分辨率與傳統(tǒng)技術(shù)所達(dá)到的分辨率。
我們已研究了文獻(xiàn)中標(biāo)準(zhǔn)毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)的DNA遷移率。條件假定為6%線性聚丙烯酰胺凝膠和時(shí)間依賴性的電場(chǎng)。圖29a到c顯示了一個(gè)1000bp和一個(gè)1001bp的兩個(gè)DNA條帶的標(biāo)準(zhǔn)CGE試驗(yàn)的預(yù)期分辨率。圖29a顯示檢測(cè)點(diǎn)(30cm分離長(zhǎng)度)的預(yù)期條帶形狀(鐘形)。如我們所見(jiàn)的,條帶非常接近。圖29b顯示兩個(gè)信號(hào)的總和,在此情況下,總和剛剛能顯示兩個(gè)不同條帶的存在。對(duì)于這種長(zhǎng)度的DNA和DNA在聚丙烯酰胺凝膠中CGE分離的已知分辨率,這正如預(yù)期。
我們可預(yù)測(cè)此處所公開(kāi)裝置對(duì)于相同DNA條帶(1000+1001bp)的分辨率。圖30a顯示兩個(gè)條帶。很清楚,以FWHM單位,它們相比于標(biāo)準(zhǔn)CGE(圖29a到c)被進(jìn)一步分離。圖30b顯示兩個(gè)可以清晰分辨的信號(hào)的總和,圖30c顯示大約250V/cm的時(shí)間依賴性電場(chǎng)。該值對(duì)于這種凝膠是非常現(xiàn)實(shí)的。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)CGE,為實(shí)現(xiàn)最佳分辨率,最佳值是在50V/cm以下。更高的電場(chǎng)造成分辨率的下降,因?yàn)槎喾N原因增加了DNA條帶的分散。但是,對(duì)于所提議的裝置,相同的規(guī)則不適用,這是因?yàn)榉稚⒈惶厥獾姆蛛x條件所限制。因此,通過(guò)施加更高電場(chǎng)來(lái)提高分辨率是非常合理的。
對(duì)于兩個(gè)更長(zhǎng)的DNA片段,8000和8001bp,我們使用了相同的數(shù)據(jù)。圖31a顯示了預(yù)測(cè)的分辨率。這兩個(gè)條帶被明確分辨開(kāi),這意味著所提議的裝置能夠提供高達(dá)>8000堿基對(duì)DNA的空前的分辨率,這對(duì)于工業(yè)和科研有重大意義。
對(duì)于一個(gè)給定的分離通道,可在給定的摩擦-電荷參數(shù)范圍內(nèi)對(duì)分辨率進(jìn)行優(yōu)化。在實(shí)踐中,這將意味著對(duì)于例如在一個(gè)通道中的DNA,可以降低電場(chǎng)的參數(shù)“α”。這樣的作用在于,電場(chǎng)梯度對(duì)于x的斜率降低,但是條帶的實(shí)際寬度卻不按比例增加。這進(jìn)而造成條帶在給定的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)相互之間進(jìn)一步遷移而分離的更開(kāi),但是條帶變寬并沒(méi)有抵消距離的增加。這意味著分辨率的有效增加,并且由于α的降低,可容易地在給定動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)調(diào)整分辨率。對(duì)此的原因是因?yàn)樵贚amm分析中,含f的項(xiàng)線性依賴于x,但是含α的項(xiàng)依賴于x2。然而f與擴(kuò)散系數(shù)D成反比,因此與給定條帶的寬度成反比。因?yàn)閒和α對(duì)于x的這種差異依賴性,可有效地調(diào)節(jié)分辨率。
對(duì)于調(diào)節(jié)分辨率的另一個(gè)有用的因素是參數(shù)k。通過(guò)增加此參數(shù),分辨率將大大增加。但是,這是有一定成本的。發(fā)生分離的電場(chǎng)范圍隨著k的增加而增加,因此對(duì)于給定的HV供應(yīng)(成本)以及芯片材料電介質(zhì)的電壓擊穿特征,在分離通道中實(shí)際可產(chǎn)生的電場(chǎng)大小是有限制的。
權(quán)利要求
1.一種用于在分離通道所含流體中分離物體的電泳方法,所述方法包括
沿分離通道施加電場(chǎng),所述電場(chǎng)具有一定場(chǎng)分布,并由此使得至少一些物體相對(duì)于流體移動(dòng);
改變所施加電場(chǎng),以相對(duì)于分離通道來(lái)調(diào)節(jié)所述場(chǎng)分布,從而使得物體在由于電場(chǎng)的電場(chǎng)力和由于流體的流體動(dòng)力的共同影響下分離成條帶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用于分離物體的電泳方法,其中電場(chǎng)沿至少一部分場(chǎng)分布相對(duì)于分離通道而發(fā)生變化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用于分離物體的電泳方法,其中至少一部分電場(chǎng)分布具有非零梯度。
4.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其中電場(chǎng)以場(chǎng)分布相對(duì)于分離通道移動(dòng)的方式發(fā)生變化。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的用于分離物體的電泳方法,其中當(dāng)場(chǎng)分布相對(duì)于分離通道移動(dòng)時(shí),場(chǎng)分布在其它方面保持不變。
6.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其中電場(chǎng)以電場(chǎng)分布沿分離通道平移的方式發(fā)生變化。
7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其中流體和分離通道相對(duì)于對(duì)方基本是靜止的。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其中電場(chǎng)分布的形狀使得每個(gè)物體所受的凈作用力使得每個(gè)分離條帶的寬度隨時(shí)間基本保持恒定,所述凈作用力是由于電場(chǎng)所施加的電場(chǎng)力和流體所施加的流體動(dòng)力的共同作用所致。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其中所施加電場(chǎng)發(fā)生變化,使得一旦物體已分離成條帶時(shí),每個(gè)條帶以相對(duì)于分離通道的非零終速度移動(dòng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的用于分離物體的電泳方法,其中每個(gè)條帶的終速度基本相同。
11.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其中所施加電場(chǎng)是如下形式
E(x,t)=E((x-kt)n)
其中x是空間坐標(biāo),典型地是沿分離通道的空間坐標(biāo),t是時(shí)間坐標(biāo),n和k都是實(shí)數(shù)且n不是零。
12.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其中至少一部分電場(chǎng)相對(duì)于沿通道的距離是單調(diào)的。
13.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其還包括將待分離物體與流體相混合并將混合物置于分離通道中的步驟。
14.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳方法,其還包括將流體置于分離通道中和將樣品插入分離通道的步驟,所述樣品至少包含待分離物體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的用于分離物體的電泳方法,其中樣品還包含流體。
16.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其還包括檢測(cè)條帶的步驟。
17.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其還包括在物體已分離成條帶之后改變電場(chǎng)以調(diào)節(jié)條帶間距、條帶位置或條帶分辨率的步驟。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的用于分離物體的電泳方法,其中通過(guò)對(duì)電場(chǎng)的時(shí)間依賴性和/或其強(qiáng)度的變化來(lái)改變電場(chǎng)。
19.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其還包括在物體被分離之后從分離通道提取感興趣條帶的步驟。
20.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其還包括振蕩所述電場(chǎng)使得條帶的移動(dòng)倒轉(zhuǎn)方向從而使條帶沿分離通道往返移動(dòng)的步驟。
21.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其中分離通道是閉合環(huán),并且所施加電場(chǎng)是圍繞環(huán)周期性的。
22.根據(jù)上述任一權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其中通過(guò)沿分離通道設(shè)置的大量電極來(lái)施加電場(chǎng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的電泳方法,其中所述大量電極中至少一些通過(guò)電阻材料層而與分離通道內(nèi)部隔開(kāi)。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的電泳方法,其中電阻材料是半導(dǎo)體。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的電泳方法,其中半導(dǎo)體是摻雜半導(dǎo)體。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的電泳方法,其中電阻材料是摻雜硅。
27.根據(jù)權(quán)利要求22至26中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳方法,其中所述大量電極與分離通道的內(nèi)部隔開(kāi),使得電極與流體之間不傳導(dǎo)電流。
28.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的用于分離物體的電泳方法,其中待分離物體包含生物分子、蛋白質(zhì)、聚合物、DNA、RNA或生物細(xì)胞。
29.用于分離物體的電泳裝置,所述裝置包含
分離通道,在使用時(shí)其含有流體及待分離的物體;
用于沿分離通道施加電場(chǎng)的裝置,所述電場(chǎng)具有一定場(chǎng)分布,由此使得分離通道中的物體相對(duì)于流體移動(dòng);
適于用來(lái)施加和改變所施加電場(chǎng)的控制器,以相對(duì)于分離通道來(lái)調(diào)節(jié)電場(chǎng)分布,從而使得分離通道中的物體在由于電場(chǎng)的電場(chǎng)力和由于流體的流體動(dòng)力的共同影響下分離成條帶。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的用于分離物體的電泳裝置,其中電場(chǎng)沿至少一部分場(chǎng)分布相對(duì)于分離通道發(fā)生變化。
31.根據(jù)權(quán)利要求29或30的用于分離物體的電泳裝置,其中至少一部分電場(chǎng)分布具有非零梯度。
32.根據(jù)權(quán)利要求29至31中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中控制器進(jìn)一步適于相對(duì)于分離通道移動(dòng)電場(chǎng)分布。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的用于分離物體的電泳裝置,其中控制器進(jìn)一步適于在場(chǎng)分布相對(duì)于分離通道移動(dòng)時(shí)保持場(chǎng)分布不變。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33的用于分離物體的電泳裝置,其中控制器進(jìn)一步適于使電場(chǎng)分布沿分離通道平移。
35.根據(jù)權(quán)利要求29至34中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中,在使用時(shí),分離通道中所含流體相對(duì)于分離通道基本上靜止。
36.根據(jù)權(quán)利要求29至35中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中控制器進(jìn)一步適于施加電場(chǎng)分布,該電場(chǎng)分布的形狀使得每個(gè)物體所受的凈作用力使得每個(gè)分離條帶的空間擴(kuò)散基本為零,所述凈作用力是由于電場(chǎng)所施加的電場(chǎng)力和流體所施加的流體動(dòng)力的共同作用。
37.根據(jù)權(quán)利要求29至36中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中控制器進(jìn)一步適于改變所施加電場(chǎng),使得一旦物體已分離成條帶,每個(gè)條帶以相對(duì)分離通道的非零終速度移動(dòng)。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的用于分離物體的電泳裝置,其中每個(gè)條帶的終速度基本相同。
39.根據(jù)權(quán)利要求29至38中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中所施加電場(chǎng)是如下形式
E(x,t)=E((x-kt)n)
其中x是空間坐標(biāo),典型地是沿分離通道的空間坐標(biāo),t是時(shí)間坐標(biāo),n和k都是實(shí)數(shù)且n不是零。
40.根據(jù)權(quán)利要求29至39中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中至少一部分電場(chǎng)相對(duì)于沿通道的距離是單調(diào)的。
41.根據(jù)權(quán)利要求29至40中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中施加電場(chǎng)的裝置包含沿分離通道設(shè)置的大量電極。
42.根據(jù)權(quán)利要求41的用于分離物體的電泳裝置,其中所述大量電極中至少一部分通過(guò)電阻材料層與分離通道內(nèi)部隔開(kāi)。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的用于分離物體的電泳裝置,其中電阻材料是半導(dǎo)體。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的用于分離物體的電泳裝置,其中半導(dǎo)體是摻雜半導(dǎo)體。
45.根據(jù)權(quán)利要求44的用于分離物體的電泳裝置,其中電阻材料是摻雜硅。
46.根據(jù)權(quán)利要求41至45中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中所述電極與分離通道的內(nèi)部隔開(kāi),使得電極與流體之間不傳導(dǎo)電流。
47.根據(jù)權(quán)利要求41至46中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中電極包含印刷在分離通道或電阻材料之上或鄰近處的導(dǎo)電墨。
48.根據(jù)權(quán)利要求29至47中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中分離通道是毛細(xì)管。
49.根據(jù)權(quán)利要求29至48中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中分離通道是直線的。
50.根據(jù)權(quán)利要求29至49中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中分離通道是閉合環(huán)的形式。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的用于分離物體的電泳裝置,其中分離通道是圓形的。
52.根據(jù)權(quán)利要求29至51中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中分離通道被刻在襯底上。
53.根據(jù)權(quán)利要求29至52中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中所述裝置是微流體裝置。
54.根據(jù)權(quán)利要求29至53中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其進(jìn)一步包含適于檢測(cè)分離通道中條帶的檢測(cè)器。
55.根據(jù)權(quán)利要求54的用于分離物體的電泳裝置,其中檢測(cè)器適于對(duì)分離通道中的條帶成像。
56.根據(jù)權(quán)利要求29至55中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中所述分離通道提供有至少一個(gè)用于將樣品插入分離通道的輸入端口,所述樣品至少包含待分離物體。
57.根據(jù)權(quán)利要求29至56中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其中所述分離通道提供有至少一個(gè)用于將物體條帶從分離通道提取出來(lái)的退出端口。
58.根據(jù)權(quán)利要求29至57中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置,其包含大量分離通道,每個(gè)分離通道帶有施加電場(chǎng)的裝置和控制器。
59.根據(jù)權(quán)利要求58的用于分離物體的電泳裝置,其中施加到每個(gè)分離通道上的電場(chǎng)是相同的。
60.根據(jù)權(quán)利要求58或59的用于分離物體的電泳裝置,其中施加到每個(gè)分離通道上的電場(chǎng)受相同控制器控制。
61.根據(jù)權(quán)利要求29至60中任一項(xiàng)的用于分離物體的電泳裝置的應(yīng)用,其中待分離物體包含生物分子、蛋白質(zhì)、聚合物、DNA、RNA或生物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于在分離通道所含流體中分離物體的電泳方法。所述方法包括沿分離通道施加電場(chǎng),所述電場(chǎng)具有場(chǎng)分布特征,并因此使得至少一些物體相對(duì)于流體移動(dòng);改變所施加電場(chǎng)以便相對(duì)于分離通道調(diào)節(jié)電場(chǎng)分布特征,因此使得物體在由電場(chǎng)引起的電場(chǎng)力和由流體引起的流體動(dòng)力的聯(lián)合作用下分離成條帶。
文檔編號(hào)B01L7/00GK101124477SQ200580048557
公開(kāi)日2008年2月13日 申請(qǐng)日期2005年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月31日
發(fā)明者迪米特里奧斯·賽德里斯 申請(qǐng)人:迪米特里奧斯·賽德里斯