專(zhuān)利名稱(chēng)：一種測(cè)定咪唑立賓血藥濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測(cè)定方法。具體涉及一種測(cè)定咪唑立賓血藥濃度的方法。
背景技術(shù)：
咪唑立賓(mizoribine，MZR)是一種嘌呤核苷合成抑制劑，能特異性地抑制快速增長(zhǎng)的淋巴細(xì)胞，從而產(chǎn)生免疫抑制作用。近年來(lái)在臨床上用于抑制腎移植時(shí)的排斥反應(yīng)，同時(shí)也用于治療狼瘡性腎炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及腎病綜合征等自身免疫性疾病。該藥的個(gè)體間藥動(dòng)學(xué)差異大，臨床上須進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)以調(diào)整個(gè)體化給藥方案。
目前關(guān)于生物樣本中MZR的測(cè)定方法，僅國(guó)外有相關(guān)報(bào)道?，F(xiàn)有的技術(shù)方法存在靈敏度低(最低定量限為0.25mg·L-1)、操作繁瑣費(fèi)時(shí)、效率低、分析成本高等種種缺陷，不適合常規(guī)治療藥物濃度監(jiān)測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服已有技術(shù)的缺陷，提供一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的測(cè)定體內(nèi)咪唑立賓血藥濃度的方法。
本方法無(wú)需昂貴的設(shè)備和試劑，具有操作簡(jiǎn)便、快速、血漿用量少、成本低等優(yōu)點(diǎn)，適合常規(guī)血藥濃度監(jiān)測(cè)。
本方法的技術(shù)方案是待測(cè)樣品預(yù)處理后，經(jīng)酸性流動(dòng)相在色譜柱分離，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。
包括下述步驟1)樣品預(yù)處理取待測(cè)樣品，加入定量的有機(jī)溶媒蛋白沉淀劑進(jìn)行蛋白沉淀，所述的有機(jī)溶媒蛋白沉淀劑選自甲醇、乙腈或甲醇和乙腈的混合物；2)樣品分離與分析采用通用型的液相色譜柱，其填料為Phenomenex Luna NH2，高效液相系統(tǒng)采用通用型的紫外檢測(cè)器以及高壓泵，采用甲醇、乙腈和酸性水溶液(pH＝2.1～2.5)的混合液作為流動(dòng)相，等度洗脫；本方法流動(dòng)相優(yōu)選甲醇-乙腈-0.1％三氟乙酸(85±2∶5±1∶10±1)混合液；采用紫外檢測(cè)器280±1nm檢測(cè)MZR的峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程換算成濃度。
本方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1.預(yù)處理方法簡(jiǎn)便一步有機(jī)溶媒蛋白沉淀法，適用于常規(guī)檢測(cè)。
2.專(zhuān)屬性強(qiáng)采用填料為Phenomenex Luna NH2的色譜柱作為固定相，甲醇、乙腈和酸性水溶液的混合液作為流動(dòng)相，等度洗脫，12分鐘完成測(cè)定，內(nèi)源性物質(zhì)和常用合并用藥不干擾上述藥物的測(cè)定。
3.靈敏度高最低定量限為0.1mg·L-1，優(yōu)于文獻(xiàn)報(bào)道的0.25mg·L-1。本發(fā)明方法快速準(zhǔn)確、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、成本低、適合于臨床常規(guī)血藥濃度監(jiān)測(cè)。MZR的線(xiàn)性范圍為0.1～10mg·L-1。平均方法回收率分別為98.7％，日內(nèi)和日間精密度RSD均小于9％。


圖1是典型色譜圖，其中，A未服用咪唑立賓的腎移植患者血漿；B空白血漿+標(biāo)準(zhǔn)品咪唑立賓(濃度0.1mg·L-1)；1咪唑立賓。
圖2是服用咪唑立賓的腎移植患者色譜圖(濃度0.26mg·L-1)，其中，1咪唑立賓。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1色譜條件色譜柱Phenomenex Luna NH2(4.6mm×250mm，5μm，美國(guó)Phenomenex公司)；流動(dòng)相∶乙腈-甲醇-0.1％三氟乙酸(85∶5∶10)；流速1.5mL·min-1；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)，280nm。
血漿樣品預(yù)處理取血漿樣品100μL，加入乙腈液100μL，渦旋混合20s，4℃條件下12000×g離心10min，取上清液20μL進(jìn)樣。外標(biāo)法以峰面積定量。
專(zhuān)屬性取不同來(lái)源的10名未服用MZR的腎移植患者血樣，按照上述樣品預(yù)處理和測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，未發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)上述測(cè)定組分有干擾。取常用合并用藥和非處方藥物對(duì)照品溶液進(jìn)樣，結(jié)果顯示，環(huán)孢素、強(qiáng)的松、他莫克司、西羅莫斯、更昔洛韋、倍他洛克、對(duì)乙酰氨基酚、硝苯地平、布洛芬、阿昔洛韋等均不干擾樣品測(cè)定。其典型保留時(shí)間為7.6min。整個(gè)色譜分析過(guò)程時(shí)間為12min。
線(xiàn)性試驗(yàn)精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解成系列工作液，再加入適量空白人血漿，制成含MZR 0.1、0.5、2.5、5、7.5、10mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)血樣。取血漿100μL，按”血漿樣品預(yù)處理”方法操作。外標(biāo)法以MZR峰面積(x)和MZR濃度(y)作加權(quán)(1/x)線(xiàn)性回歸，得線(xiàn)性回歸方程為y＝9171-3·x-21.6，(r＝0.9996)。MZR血漿濃度在0.1～10mg·L-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。最低定量濃度為0.1mg·L-1。
準(zhǔn)確度和精密度精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解，空白血漿稀釋定容，制成含MZR 0.2，4，8mg·L-1的低、中、高質(zhì)控血樣。取血漿100μL，按“血漿樣品預(yù)處理”方法操作，考察日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度。根據(jù)線(xiàn)性回歸方程計(jì)算其實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算每種濃度的實(shí)測(cè)平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，(C實(shí)測(cè)/C理論)×100％即為回收率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物的測(cè)定。且上述待測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰形對(duì)稱(chēng)、分離良好。表1為咪唑立賓的日內(nèi)、日間精密度和方法回收率。
同時(shí)，本方法已在實(shí)際患者血藥濃度的測(cè)定中得到了驗(yàn)證。
表1

實(shí)施例2色譜條件色譜柱Phenomenex Luna NH2(4.6mm×250mm，5μm，美國(guó)Phenomenex公司)；流動(dòng)相∶乙腈-甲醇-0.1％三氟乙酸(85∶5∶10)；流速1.5mL·min-1；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)，280nm。
血漿樣品預(yù)處理取血漿樣品100μL，加入乙腈和甲醇的混合液(1∶1，V/V)100μL，渦旋混合20s，4℃條件下12000×g離心10min，取上清液20μL進(jìn)樣。外標(biāo)法以峰面積定量。
專(zhuān)屬性取10名未服用MZR的腎移植患者血樣，按照上述樣品預(yù)處理和測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。另取常用合并用藥和非處方藥物對(duì)照品溶液進(jìn)樣。結(jié)果顯示內(nèi)源性物質(zhì)、環(huán)孢素、強(qiáng)的松、他莫克司、西羅莫斯、更昔洛韋、倍他洛克、對(duì)乙酰氨基酚、硝苯地平、布洛芬、阿昔洛韋等均不干擾樣品測(cè)定。其典型保留時(shí)間為7.6min。整個(gè)色譜分析過(guò)程時(shí)間為12min。
線(xiàn)性試驗(yàn)精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解成系列工作液，再加入適量空白人血漿，制成含MZR 0.1、0.5、2.5、5、7.5、10mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)血樣。取血漿100μL，按”血漿樣品預(yù)處理”方法操作。外標(biāo)法以MZR峰面積(x)和MZR濃度(y)作加權(quán)(1/x)線(xiàn)性回歸，得線(xiàn)性回歸方程為y＝9082.4·x-19.1，(r＝0.9996)。MZR血漿濃度在0.1～10mg·L-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。最低定量濃度為0.1mg·L-1。最低檢測(cè)濃度為0.3mg·L-1。
準(zhǔn)確度和精密度精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解，空白血漿稀釋定容，制成含MZR 0.2，4，8mg·L-1的低、中、高質(zhì)控血樣。取血漿100μL，按”血漿樣品預(yù)處理”方法操作，考察日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度(n＝6)。根據(jù)線(xiàn)性回歸方程計(jì)算其實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算每種濃度的實(shí)測(cè)平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，(C實(shí)測(cè)/C理論)×100％即為回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明方法的日內(nèi)和日間精密度均小于10％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8％。
實(shí)施例3色譜條件色譜柱Phenomenex Luna NH2(4.6mm×250mm，5μm，美國(guó)Phenomenex公司)；流動(dòng)相∶乙腈-甲醇-0.1％三氟乙酸(85∶5∶10)；流速1.5mL·min-1；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)，280nm。
血漿樣品預(yù)處理取血漿樣品100μL，加入甲醇液200μL，渦旋混合20s，4℃條件下12000×g離心10min，取上清液30μL進(jìn)樣。外標(biāo)法以峰面積定量。
專(zhuān)屬性取10名未服用MZR的腎移植患者血樣，按照上述樣品預(yù)處理和測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。另取常用合并用藥和非處方藥物對(duì)照品溶液進(jìn)樣。結(jié)果顯示內(nèi)源性物質(zhì)、環(huán)孢素、強(qiáng)的松、他莫克司、西羅莫斯、更昔洛韋、倍他洛克、對(duì)乙酰氨基酚、硝苯地平、布洛芬、阿昔洛韋等均不干擾樣品測(cè)定。其典型保留時(shí)間為7.6min。整個(gè)色譜分析過(guò)程時(shí)間為12min。
線(xiàn)性試驗(yàn)精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解成系列工作液，再加入適量空白人血漿，制成含MZR 0.1、0.5、2.5、5、7.5、10mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)血樣。取血漿100μL，按”血漿樣品預(yù)處理”方法操作。外標(biāo)法以MZR峰面積(x)和MZR濃度(y)作加權(quán)(1/x)線(xiàn)性回歸，得線(xiàn)性回歸方程為y＝9174.8·x-27.6，(r＝0.9994)。MZR血漿濃度在0.1～10mg·L-1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。最低定量濃度為0.1mg·L-1。最低檢測(cè)濃度為0.3mg·L-1。
準(zhǔn)確度和精密度精密稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)適量，用蒸餾水溶解，空白血漿稀釋定容，制成含MZR 0.2，4，8mg·L-1的低、中、高質(zhì)控血樣。取血漿100μL，按”血漿樣品預(yù)處理”方法操作，考察日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度(n＝6)。根據(jù)線(xiàn)性回歸方程計(jì)算其實(shí)測(cè)濃度，計(jì)算每種濃度的實(shí)測(cè)平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，(C實(shí)測(cè)/C理論)×100％即為回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明方法的日內(nèi)和日間精密度均小于10％，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8％。
權(quán)利要求
1.一種測(cè)定咪唑立賓血藥濃度的方法，其特征是待測(cè)樣品預(yù)處理后，經(jīng)酸性流動(dòng)相在色譜柱上分離，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，包括下述步驟1)樣品預(yù)處理取待測(cè)樣品，加入定量的有機(jī)溶媒蛋白沉淀劑進(jìn)行蛋白沉淀；2)樣品分離與分析采用通用型液相色譜柱，其填料為Phenomenex Luna NH2，高效液相系統(tǒng)采用通用型的紫外檢測(cè)器以及高壓泵，流動(dòng)相采用甲醇-乙腈-0.1％三氟乙酸水溶液的混合液，等度洗脫；3)紫外檢測(cè)器檢測(cè)測(cè)峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程換算濃度。
2.按權(quán)利要求1所述的測(cè)定咪唑立賓血藥濃度的方法，其特征是所述步驟1)的有機(jī)溶媒蛋白沉淀劑選自甲醇、乙腈或甲醇和乙腈的混合物。
3.按權(quán)利要求1所述的測(cè)定咪唑立賓血藥濃度的方法，其特征是所述的有機(jī)溶媒蛋白沉淀劑是乙腈。
4.按權(quán)利要求1所述的測(cè)定咪唑立賓血藥濃度的方法，其特征是所述步驟2)的流動(dòng)相混合液其中甲醇∶乙腈∶0.1％三氟乙酸水溶液為85±2∶5±1∶10±1。
5.按權(quán)利要求1所述的測(cè)定咪唑立賓血藥濃度的方法，其特征是所述的步驟3)的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。
全文摘要
本發(fā)明屬醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及體內(nèi)藥物的分析測(cè)定方法，具體涉及一種測(cè)定人血漿中咪唑立賓濃度的方法。本發(fā)明方法對(duì)待測(cè)樣品經(jīng)蛋白沉淀預(yù)處理后，在酸性流動(dòng)相條件下等度洗脫，經(jīng)色譜柱分離后，用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。本方法樣品取樣量少，預(yù)處理方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏，無(wú)需昂貴的設(shè)備和試劑，適用面廣，成本低，適合于臨床常規(guī)血藥濃度的監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)B01J20/281GK1804615SQ20061002338
公開(kāi)日2006年7月19日 申請(qǐng)日期2006年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月16日
發(fā)明者焦正, 張明, 鐘明康, 陸福明 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院