專利名稱：分離植物和動物來源的藥理學(xué)活性成分的方法
分離植物和動物來源的藥理學(xué)活性成分的方法本發(fā)明涉及從動物或植物來源分離和純化藥理學(xué)上令人關(guān)注的天 然化合物的方法。更具體地，本發(fā)明涉及以與無機(jī)酸軛合的形式例如硫酸酯形式或 以糖基化形式存在于所述來源中的親水性和水溶性化合物的提取。該方法包括將含有所述化合物的來源吸附在高親脂性樹脂上，然后 解吸附并回收洗脫物?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法獲得的化合物的優(yōu)選實(shí)例包括具有各種治療 或預(yù)防性藥理學(xué)活性如抗氧化和抗腫瘤活性的植物雌激素(異黃酮)、完 全與動物或植物來源的甾體、多酚結(jié)構(gòu)軛合的雌激素?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法以高純度和重現(xiàn)性獲得的化合物可用于制備 藥物或食品補(bǔ)充劑，用于治療原發(fā)性病變?nèi)缱訉m和前列腺腫瘤和急性或慢性炎癥和源自異常生理狀況(paraphysiological condition)的病變?nèi)缃?jīng) 前期綜合征和與衰老和/或激素改變有關(guān)的緊張、骨質(zhì)疏松和動脈粥樣 硬化。技術(shù)背景存在許多基于植物治療提取物的食品補(bǔ)充劑，根據(jù)所使用的提取技 術(shù)，其組成和重現(xiàn)性有顯著變化。這些變化主要涉及與所需產(chǎn)物不同的 產(chǎn)物的存在。因而，所述提取物不能用作藥物，因?yàn)樗鼈儾粷M足組成一 致和不存在其它組分的強(qiáng)制要求。WO 93/23069、 WO 99/43335和EP 1174144公開了含有染料木素、 大豆黃素、刺芒柄花素和鷹嘴豆芽素A混合物的大豆或三葉草提取物。EP 1174144要求保護(hù)提取異黃酮苷元(isoflavone aglycone)的方法， 特別是從紅車軸草(7V7/o/Zww / r"^is&)中提取異黃酮苷元的方法，該方
法是在水中浸漬干燥的、粉碎細(xì)的植物原料，然后通過加入水可混溶 性溶劑(通常為乙醇)進(jìn)行提??；分離植物殘余物；用脂肪族烴處理水溶 液以除去蠟和脂肪；分離各相并取出烴相；在真空中蒸餾水可混溶性有 機(jī)溶劑，得到固體(水不溶性異黃酮苷元)，將其過濾并干燥。用HPLC 測定的苷元含量為19.5%至38% w/w,而基于起始原料的產(chǎn)率為0.6% 至2.2%,WO 93/23069公開了富集異黃酮植物雌激素的組合物，其是通過用 水:水溶性有機(jī)溶劑(例如乙醇)混合物提取干燥的植物原料、分離水-有 機(jī)提取液、蒸餾除去有機(jī)溶劑并濃縮水相而獲得的。WO 99/43335公開了含有異黃酮的三葉草提取物的制備，該提取物 的特征在于存在"芳族生色團(tuán)"(染料木素、大豆黃素、刺芒柄花素和鷹 嘴豆芽素A)。提取操作方法基本上與WO 93/2306中所述的相同，但是 含有用HPLC進(jìn)一步純化/分離異黃酮的步驟。在動物生理流體如來自妊娠動物的尿的情況下，描述的制備軛合雌 激素混合物的方法是使用不同的半極性的但是顯著親水的非離子吸附 樹月旨如Amberlites 、 Diaion Sepabeads⑧或HPD-500 。例如，US 5723454公開了從妊娠母馬尿中提取軛合雌激素的方法，其中預(yù)先通過 砂床過濾、通過離心或通過超濾被澄清的尿被暴露(通過在混懸液中接 觸或通過在柱上滲濾)于具有中等極性(偶極矩為1.5至2.0德拜)和 400-500m2/g的比表面積的Amberlites⑧非離子樹脂(交聯(lián)聚丙烯酸酯， 例如Rohm & Haas的XAD-7)。將樹脂用堿水反復(fù)洗滌，然后通過用堿 水:可混溶性有機(jī)溶劑混合物洗脫回收雌激素混合物，通過在真空中濃 縮并干燥以固體形式獲得雌激素混合物。US 2005/0014738、 US 2003/0105344和US 2004/0072812 7>開了相 同的輒合雌激素的吸附/解吸附方法，也使用了中等極性、主要親水的 樹脂如Dowex XAD2、 Dowex 、 Optipore。 US 2002/0156303描述了 也具有中等極性的Diaion HP-20和Sepabeads SP-700 (Mitsubishi) 樹脂的應(yīng)用。CN 1308038利用了具有相似特性的Hebej CangzhouChemical Factory生產(chǎn)的半極性樹脂HPD-500。吸附的物質(zhì)的接觸和提 取步驟也相似。所有所述方法均基于使用非離子的中等極性的主要親水的樹脂，其 具有差的吸附選擇性，因此產(chǎn)生軛合和非軛合雌激素以及顯著量的曱酚 衍生物的混合物。這涉及在吸附后的一系列純化步驟，由于非軛合雌激 素或其它多酚雜質(zhì)的含量不可接受，有時甚至淘汰掉已處理的批次。因此，顯然需要具有重現(xiàn)性的方法以克服以上提及的問題，使得動 物和植物來源的軛合物的組成恒定且不含非軛合產(chǎn)物或其它雜質(zhì)。發(fā)明內(nèi)容現(xiàn)已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)使用面積為600m2/g、體積為1.3ml/g(干重)、 孔大小約200埃、以兩種聚合物組分中的一種的溴化為特征的高度多孔 的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物可以以高產(chǎn)率純化上文提及的化合物，并且發(fā)現(xiàn)了其在制藥領(lǐng)域中的用途。獲得的粗制起始液體或固體提取物的"初級提取物"，也可應(yīng)用于生理流 體。植物來源的產(chǎn)物的實(shí)例包括以單糖-軛合的水溶性形式存在于各種 植物來源中的異黃酮或木脂素類，如染料木素、大豆黃素、刺芒柄花 素、鷹嘴豆芽素A、擬雌內(nèi)酯、阿魏酸和異阿魏酸?？蓮纳砹黧w提取的產(chǎn)物的實(shí)例包括甾體雌激素如妊娠雌性的尿 中存在的雌酮和雌二醇，其中它們與無機(jī)酸輒合。具體地，妊娠母馬的 尿提供輒合雌激素鹽的混合物，其包含雌酮、馬烯雌酮、A"-脫氫雌酮、 17a-雌二醇；17a-二氫馬烯雌酮、17p-二氫馬烯雌酮、17p-雌二醇、馬 萘雌酮、17a-二氫馬萘雌酮；17p-二氫馬萘雌酮，任選地還有一種或多 種來自17fi-A8，9-脫氫雌二醇；17 a-A8，9-脫氬雌二醇；6-OH 17a-二氬馬 萘雌酮；6-OH馬萘雌酮；6-OH 17(i-二氫馬萘雌酮的軛合鹽和/或其它 硫酸化的甾體代謝物。鹽優(yōu)選為鈉鹽，而輒合的主要是硫酸酯。
樹脂溴化涉及微粒比重的增加(其尤其使得可在柱中通過直接滲濾 和膨脹床進(jìn)行操作)，誘導(dǎo)更少的聚合物水合，因此誘導(dǎo)比迄今為止所 用的其它非溴化的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物更低的極性電荷和高得多的親脂性。具有這樣特性的溴化樹脂由Mitsubishi Chem. Co.生產(chǎn)，例 如Diaion SP 207 、 Diaion SP 205 、 Diaion SP 206 。鑒于待純化產(chǎn)物的顯著親水性和降低的親脂性特性，本發(fā)明獲得的 結(jié)果是出乎意料的。因此，這些產(chǎn)物在對親脂性分子更具特異性的主要 親脂的樹脂如上述樹脂上的吸附方面的行為是令人驚奇的和出乎意料的。烯-二乙烯基苯聚合物上，結(jié)果導(dǎo)致活性成分或其混合物和任何雜質(zhì)的 吸附；在散裝處理的情況下，分離并擠壓(通過在真空中過濾或離心)吸附 固相的液體，將其棄去；利用水:水可混溶性溶劑梯度(凹型或凸型)和任選地pH梯度在柱中 將吸附的產(chǎn)物、活性成分和雜質(zhì)選擇性解吸附；回收洗脫物并在真空中干燥；任選的將固體殘余物進(jìn)一步純化和/或結(jié)晶的步驟。樹脂與流體或初級提取物之間的接觸可以將非均質(zhì)物料保持在緩 慢攪拌下(以避免樹脂粉碎)散裝完成或通過滲濾或膨脹床技術(shù)在色譜柱 中完成。方法的選擇取決于所處理的產(chǎn)物的類型和量。在散裝技術(shù)的情況 下，優(yōu)選的攪拌器是葉片式攪拌器(bladestirrer)。樹脂的用量將取決于 待加工的流體或初級提取物的性質(zhì)和通過常規(guī)分析(HPLC， GC)測定的 活性成分的含量，但是，通常生產(chǎn)性能(productionperformance)相同， 該量為上述半極性樹脂的約60-75%。在散裝處理的情況下，使用用于
柱的三-至四-倍的量。待吸附的溶液可以用已知技術(shù)澄清，例如通過在 砂床上過濾或在合適設(shè)備中離心來澄清，以便通過超濾回收流體。在散 裝處理的情況下，回收吸附的樹脂，通過在真空中過濾擠出過量的流體，放入配有多孔隔膜和冷卻夾套的柱中。用水:可混溶性溶劑混合物(例如 70-30 v/v水-乙醇)洗脫被吸附物，用氫氧化鈉調(diào)至11-13、優(yōu)選11-12.5 的堿性pH。然后將任選濃縮的粗制洗脫物在用于初級提取物的相同的 溴化樹脂上或在其它溴化樹脂上通過色鐠法進(jìn)行純化，然后進(jìn)行針對色 語直接處理所描述的操作方法。散裝方法對于制備植物來源的衍生物特 別有利。在用色謙技術(shù)處理的情況下(對于動物來源的流體優(yōu)選用色鐠技術(shù) 處理)，通過滲濾或膨脹床使任選濃縮的初級溶液在樹脂床上通過。后 一技術(shù)對于高比重的溴化樹脂微粒而言是有利的，其有利地將溶液暴露 于更大吸附表面，因?yàn)檩p微的超壓即可將多孔微珠相互分離，相反的是 當(dāng)使用直接滲濾(direct percolation)時其形成更緊密的床。給提供的溶 液施加輕孩i的超壓增加吸附產(chǎn)率并減少操作時間?？捎迷谖竭^程中的 樹脂是高度多孔的溴化的苯乙烯-二乙烯基苯聚合物，如Mitsubishi Chemical Co.生產(chǎn)的Diaion SP 207 、 Diaion SP 205@和Diaion SP 206 。優(yōu)選Diaion SP207 。樹脂與待處理溶液的比可以為1體積份樹 脂/25份溶液至l份樹脂/200份溶液，取決于所用的SP類型和待提取的 活性成分的性質(zhì)。更具體地，在Diaion SP 207的情況下，所述比可以 為25至150。用270至280nm的UV檢測監(jiān)視洗脫。在柱的空間中用 于移除吸附溶液的洗滌液體的體積通常為1.8至2-倍柱床。洗滌液體的 組成根據(jù)雜質(zhì)的性質(zhì)和量以及吸附產(chǎn)物的類型而變化。溫度為0°C至 35。C,優(yōu)選0°C至5°C。優(yōu)選的洗滌液體是水，但是還可以存在小量 (1-5%)的水-可混溶性溶劑(例如丙酮或乙醇)。用水:水-可混溶性溶劑(例如酮、低分子醇、水溶性醚或酯)混合物 洗脫吸附的產(chǎn)物，其組成可以為100%至0.10%水/溶劑，取決于雜質(zhì)的 性質(zhì)和原料的來源。用氫氧化鈉將混合物調(diào)節(jié)至pH 11-13，優(yōu)選11-12.5。
通過270至280nm的UV吸收監(jiān)測洗脫。分析級分，將含有所需化合 物的那些級分合并并在真空中濃縮。下列實(shí)施例詳細(xì)地舉例說明本發(fā)明。實(shí)施例1通過直接提取紅車軸草制備軛合異黃酮 在攪拌下，于室溫下，將500g干燥的研細(xì)的紅車軸草用2000ml蒸 餾水處理10小時。然后過濾固體，用HPLC分析溶液的軛合和非軛合 異黃酮的含量。軛合異黃酮的總含量為約500mg，基本上不存在游離苷 元。將溶液在真空中濃縮至250ml，進(jìn)一步過濾，然后滲濾到直徑l-1.5cm 裝有10g S印abeads 207 Mitsubishi的柱上，收集級分并在270nm通過 UV監(jiān)測洗脫。在完成滲濾后，將柱用約兩倍空體積的蒸餾水洗滌，然 后用含有5%乙醇的水(2001111)洗滌。合并含有軛合異黃酮(HPLC分析) 的級分。過濾溶液，將殘余物在真空中干燥(約420mg)，然后用千燥丙 酮吸收，得到固體殘余物，基于起始的水性提取物的產(chǎn)率約84%。殘余 物由鷹嘴豆芽素A、刺芒柄花素、大豆黃素和染料木素的糖苷組成，純 度98%。實(shí)施例2通過提取紅車軸草水性提取物制備異黃酮 將20g根據(jù)EP 1174144(實(shí)施例l)獲得的游離異黃酮含量約20%且 軛合異黃酮含量約30。/。(HPLC)的千燥提取物分散在500ml水中；在真 空中過濾該混懸液。HPLC分析顯示軛合苷元的含量為約28%,非軛合 苷元的含量為約1%,基于起始干重(由于它們不溶于水，除去非軛合苷 元以及其它組分)。通過在真空中蒸餾將溶液濃縮至200ml,用80g吸附 劑Sepabeads SP加7(Mitsubishi)處理。繼續(xù)攪拌2小時。然后在真空 中過濾吸附的樹脂，擠壓，放在配有多孔隔膜的柱上。然后向1.8體積 的柱床中加入預(yù)先在0-5。C下冷卻的蒸餾水。之后，向2.5倍床體積中 加入95/5水乙醇混合物，收集洗脫物，將其在不超過40。C的溫度下真 空蒸餾至干。將固體殘余物用丙酮吸收，然后用丙酮/乙醚吸收并研磨， 在真空中蒸餾除去溶劑，回收固體。HPLC分析顯示產(chǎn)物由染料木素、 大豆黃素、芒柄花異黃酮和鷹嘴豆芽素A組成，并且基本上不含雜質(zhì) (軛合異黃酮的含量90-95%)?；谄鹗继崛∥?，產(chǎn)率為80至85%。實(shí)施例3 從妊娠母馬尿中提取軛合雌激素 將20L妞娠母馬尿首先在約10cm的砂床上過濾，然后通過0.2n的膜 過濾。用HPLC或GC測定輒合雌激素的含量。通過加入濃氬氧化鈉調(diào)節(jié) pH至約12.5-13.5。將全部物料在氮?dú)庀卤３衷跈C(jī)械攪拌下約1-2小時。然 后用無機(jī)酸、優(yōu)選HC1或三氟乙酸調(diào)節(jié)pH至中性(pH 7.5-8.5，優(yōu)選8)。 將該溶液進(jìn)一步在砂上真空過濾，然后在膜上過濾。通過滲濾或膨脹床使 澄清的濾液在裝有150-180g Sepabeads 207 Diaion (Mitsubishi)的直徑 7.5至10cm的柱上通過，施加輕微的超壓以便在膨脹床的情況下樹脂床高 度增加不超過3-5%和當(dāng)使用直接滲濾時不誘導(dǎo)樹脂結(jié)塊。在膨脹床的情 況下，柱床必須至少30-50cm。在完成洗脫后，通過在0°-5。C下進(jìn)行液體 冷卻器循環(huán)冷卻樹脂，然后用在0°-5°C下的至少1.8-2/5空體積的蒸餾水 洗滌被吸附物。然后用通過加入濃NaOH使pH為11.5-13.0的溫度5。-10。C 的水(2和4倍樹脂體積)滲濾(或膨脹)柱床。然后用30:70最小比的水:水可 混溶性溶劑(丙酮、乙醇、THF)混合物洗脫軛合雌激素復(fù)合物，然后通過 加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH 10-13，優(yōu)選12.5-13。回收洗脫物，中和并在真空 中干燥，得到活性成分。
權(quán)利要求
1.從植物水性提取物或生理流體中回收和純化軛合形式的天然親水性水溶性產(chǎn)物的方法，該方法是通過將所述提取物或流體吸附在親脂性樹脂上、然后解吸附并回收洗脫物來實(shí)現(xiàn)的，該方法特征在于樹脂是面積600m2/g、體積1.3ml/g(干重)、孔大小約200埃的在苯乙烯和/或二乙烯基苯部分上被溴化的多孔苯乙烯-二乙烯基苯聚合物。
2. 權(quán)利要求l所述的方法，其中天然產(chǎn)物包括異黃酮、抗氧化劑或 軛合雌激素或它們的混合物。
3. 權(quán)利要求2所述的方法，其中異黃酮是從大豆或紅車軸草 (7>!7*。//"附/7fflZms7力中提取的。
4. 權(quán)利要求3所述的方法，其中異黃酮包括染料木素、大豆黃素、 刺芒柄花素、鷹嘴豆芽素A。
5. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其用于從妊娠哺乳動物流體中純化 和回收輒合雌激素。
6. 權(quán)利要求5所述的方法，生理流體的鹽混合物是妊娠母馬尿。
7. 權(quán)利要求6所述的方法，其用于制備軛合雌激素混合物鹽混合 物，其包含雌酮、馬烯雌酮、A"-脫氫雌酮、17a-雌二醇；17a-二氫馬 烯雌酮、17|5-二氫馬烯雌酮、17(J-雌二醇、馬萘雌酮、17a-二氫馬萘雌 酮；17p-二氫馬萘雌酮。
8. 權(quán)利要求7所述的方法，其用于制備還含有一種或多種選自 17卩-A8，9-脫氫雌二醇、17a-A8，9-脫氫雌二醇、6-OH17a-二氫馬萘雌酮、 6-OH馬萘雌酮、6-OH 17 P-二氫馬萘雌酮的軛合鹽和/或其它硫酸化的 甾體代謝物的混合物。
9. 權(quán)利要求6-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中軛合物是硫酸酯，鹽 是鈉鹽。
10. 權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中樹脂選自可以以商 品名Diaion SP 207 、 Diaion SP 205@和Diaion SP 206⑧商購獲得的那 些。
全文摘要
從植物水性提取物或生理流體中回收和純化軛合形式的天然親水性水溶性產(chǎn)物的方法，該方法是通過將所述提取物或流體吸附在親脂性樹脂上、然后解吸附并回收洗脫物來實(shí)現(xiàn)的，該方法特征在于樹脂是面積600m²/g、體積1.3ml/g(干重)、孔大小約200埃的在苯乙烯和/或二乙烯基苯部分上被溴化的多孔苯乙烯-二乙烯基苯聚合物。
文檔編號B01D15/00GK101160160SQ200680012898
公開日2008年4月9日 申請日期2006年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月29日
發(fā)明者A·安扎尼, G·馬佐拉 申請人:埃武爾蒂斯股份有限公司