專(zhuān)利名稱(chēng)：：色譜基體的制造技術(shù)色譜基體的制造
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及色譜基體的制造，更具體地，涉及制造陽(yáng)離子交換劑的優(yōu)良方法。本發(fā)明還包括包含所述基體的色譜柱及其在純化工藝中的應(yīng)用。背景需要從液體或從其它固體物質(zhì)中分離出一種化合物，如污染物或所期望的分子的例子很多。在很多領(lǐng)域內(nèi)都利用基于電荷-電荷的相互作用來(lái)俘獲并因此而分離帶電或可帶電的化合物。在清潔劑工業(yè)中，已存在從紡織物分離出化合物，如泥土和污垢的方法和清潔劑。常見(jiàn)的實(shí)例是洗衣工業(yè)，在這里，一般把帶電調(diào)節(jié)劑和清潔劑摻進(jìn)洗衣粉，以從被洗滌材料分離出污垢。這種帶電調(diào)節(jié)劑，也稱(chēng)為增效劑(benefitagent),用來(lái)直接從紡纖中剝離污垢；或者改性纖維以促進(jìn)清潔過(guò)程；利用的是污垢與調(diào)節(jié)劑之間的吸引力。為提高它們的效率，已提出以如下形式提供調(diào)節(jié)劑在其中，它們被取代到另一種化學(xué)部分上，以提高它們對(duì)擬除去化合物的親合力。WO03/040279涉及洗衣應(yīng)用的聚合物，更具體地，涉及在紡織物洗滌期間用取代多糖結(jié)構(gòu)來(lái)促進(jìn)污垢剝離。適用的多糖包括聚合度大于40,優(yōu)選50~100000的多糖。已公開(kāi)的多糖結(jié)構(gòu)已被通過(guò)酯或醚鍵偶聯(lián)到多糖上的烷基，如羥烷基、羧烷基或磺烷基或其鹽所取代。平均取代度，即重復(fù)糖單元上官能團(tuán)的平均取代數(shù)，優(yōu)選為0.1~3,更優(yōu)選0.1~1。按照WO03/040279,可以用具有oc-或P-連接骨架，優(yōu)選P-1,4-連接骨架的多糖。由于本領(lǐng)域已認(rèn)識(shí)到纖維素基材料能粘結(jié)到棉纖維上，所以?xún)?yōu)選的多糖是纖維素。在化學(xué)和生物
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)，常需要把目標(biāo)化合物，如藥品或侯選藥品與源自制造過(guò)程的污染物分離開(kāi)來(lái)。例如，由重組宿主細(xì)胞的表達(dá)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)藥品或侯選藥品將需要與，例如，宿主細(xì)胞和可能的細(xì)胞碎片、其它宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA、RNA和來(lái)自發(fā)酵肉湯的殘?jiān)琨}類(lèi)分離開(kāi)來(lái)。由于其多樣性和其對(duì)目標(biāo)化合物的敏感性，在目前所用的很多生物技術(shù)純化程序中包含至少一步色譜技術(shù)。術(shù)語(yǔ)色語(yǔ)技術(shù)包括一類(lèi)密切相關(guān)的分離法，它們?nèi)蓟谑?個(gè)彼此不混溶的相接觸的原理。更具體地，是把目標(biāo)化合物引進(jìn)流動(dòng)相，而使流動(dòng)相與固定相接觸。然后目標(biāo)化合物將隨著被流動(dòng)相攜帶通過(guò)該體系而經(jīng)歷一系列固定相與流動(dòng)相之間的相互作用。這些相互作用利用樣品各組分在物理或化學(xué)性質(zhì)方面的差別。色譜分析中的固定相由其上已偶聯(lián)了配體的固體載體組成，所述配體是能與目標(biāo)化合物發(fā)生相互作用的官能團(tuán)。因此，配體將使載體具有實(shí)現(xiàn)分離、鑒定和/或純化所感興趣的分子的能力。液相色語(yǔ)法一般按分離化合物所利用的相互作用原理命名。例如，離子交換色諳技術(shù)基于電荷-電荷相互作用；疏水相互作用色譜技術(shù)(HIC)利用疏水相互作用；以及親合色譜技術(shù)基于特定的生物親合性。如眾所周知，離子交換基于帶電荷目標(biāo)化合物與帶相反電荷的色譜基體之間的可逆相互作用。洗脫最常用的方法是增加鹽濃度，但改變pH荷的i標(biāo):合物:々陽(yáng)離子交口換劑和用帶正電荷的色4基體k吸附帶負(fù)電荷的目標(biāo)化合物的陰離子交換劑。術(shù)語(yǔ)"強(qiáng)"離子交換劑用來(lái)指在寬闊pH范圍內(nèi)荷電的離子交換劑，而"弱"離子交換劑是在一定pH值下可荷電的。常用的強(qiáng)陽(yáng)離子交換劑包含稱(chēng)為S基的磺酸酯配體。在有些情況下，這類(lèi)陽(yáng)離子交換劑是根據(jù)官能團(tuán)及其與載體的連接物所形成的基團(tuán)命名；如SP陽(yáng)離子交換劑，在其中S基通過(guò)丙基連接在載體上。已偶聯(lián)了配體的載體的性能也會(huì)影響色譜基體的分離性能。取決于擬用的色譜技術(shù)方式，可優(yōu)選基本親水或疏水的載體。對(duì)載體的進(jìn)一步考慮是其官能化的容易程度。取決于適用于偶聯(lián)配體的化學(xué)，載體可以被活化，即轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)性更高的形式。這類(lèi)活化法是本領(lǐng)域周知的，如烯丙基化諸如葡聚糖或瓊脂糖之類(lèi)的親水載體的羥基。共價(jià)配體連接一般利用固態(tài)支持基體上的反應(yīng)性官能團(tuán)，如羥基、羧基、硫醇、氨基等來(lái)實(shí)現(xiàn)。為了提高基體的結(jié)合能力，常在配體與載體之間提供簡(jiǎn)稱(chēng)為連接物的連接臂。這類(lèi)連接物將使配體與載體之間物理地隔開(kāi)，從而允許目標(biāo)化合物與配體相互作用受基體的干擾最小。但是，在色譜基體合成中用連接物要求使用下述的功能試劑其含至少一個(gè)能與基體表面官能團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵的的官能團(tuán)；和至少一個(gè)能與配體上的官能團(tuán)反應(yīng)而形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)。US5,789，578(MasseyUniversity)涉及制備包含具有能結(jié)合其上已通過(guò)包括硫化物、亞砜或砜官能團(tuán)的連接基團(tuán)共價(jià)連接的目標(biāo)化合物的配體的支撐基體的色譜基體的方法。用亞硫酸氫鹽作為提供S基的試劑。更具體地，US5,789,578用烯丙基縮水甘油醚、烯丙基鹵或炔丙基鹵和傳統(tǒng)方法，在有堿存在下生成其上懸掛有烯類(lèi)不飽和實(shí)體的載體。具體地，卣化物或縮水甘油基與基體羥基在堿性pH下反應(yīng)。在這些條件下，估計(jì)烯丙基團(tuán)與基體或反應(yīng)溶液中所用的水只有有限的反應(yīng)性。然后在自由基條件下烯類(lèi)不飽和基與含硫醇配體反應(yīng)，以使它們共價(jià)連接。但是，如上述US5,789,578中所公開(kāi)，引進(jìn)烯丙基和S基的隨后偶聯(lián)將在載體上留下一部分烯丙基未反應(yīng)，而另一部分將引進(jìn)連位磺酸酯-亞磺酸酯基團(tuán)。此外，活化試劑也將不可避免地產(chǎn)生不希望發(fā)生的交聯(lián)反應(yīng)的危險(xiǎn)。顯然工藝中，如藥品制造工藝中，加進(jìn)的任何步驟，都將使該工藝成本更高，因此在化學(xué)加工中的一般目標(biāo)是要使任何工藝盡可能簡(jiǎn)便。因此，在該領(lǐng)域內(nèi)目前顯然需要以更快和更穩(wěn)鍵的途徑使多糖載體官能化的改進(jìn)方法，優(yōu)選避免一個(gè)或多個(gè)上述缺點(diǎn)。發(fā)明概述在一個(gè)發(fā)明點(diǎn)中，本發(fā)明提供一種制造包含陽(yáng)離子交換基團(tuán)的色譜基體的新方法。在另一個(gè)發(fā)明點(diǎn)中，本發(fā)明涉及一種制造包含與多糖載體偶聯(lián)的S基團(tuán)的色譜基體的方法，該方法有利于生成比先有技術(shù)方法更均勻的陽(yáng)離子交換劑。在再一個(gè)發(fā)明點(diǎn)中，本發(fā)明涉及一種能以比先有技術(shù)基體更強(qiáng)的能力結(jié)合一種或多種免疫球蛋白的色譜基體。從隨后的詳述及權(quán)利要求書(shū)，本發(fā)明的其它細(xì)節(jié)和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。定義術(shù)語(yǔ)"目標(biāo)化合物"，在本文中是指希望從水溶液中分離出來(lái)的任何化合物、分子或其它實(shí)體。目標(biāo)化合物可以是所期望的產(chǎn)物或液態(tài)產(chǎn)污染物。術(shù)語(yǔ)"多糖"，如本文所用，包括天然多糖、合成多糖、多糖衍生物、改性多糖以及它們的任何混合物。術(shù)語(yǔ)"配體，，，在本文中，按其在色譜技術(shù)中的傳統(tǒng)意義用來(lái)指包含能與目標(biāo)化合物發(fā)生相互作用的官能團(tuán)的實(shí)體。配體基團(tuán)的實(shí)例是帶正電荷或可帶正電荷的基團(tuán)(陰離子交換配體)；帶負(fù)電荷或可帶負(fù)電荷的基團(tuán)(陽(yáng)離子交換配體)；疏水基團(tuán)；對(duì)目標(biāo)化合物具有特定生物親合性，如抗原對(duì)抗體的親合性，的基團(tuán)(親合配體)等。術(shù)語(yǔ)"增充劑"，在本文中，是指已被束縛在載體表面且因此而起擴(kuò)展配體與載體之間距離的作用的聚合物。這種增充劑的一個(gè)主要作用是通過(guò)下列機(jī)理提高目標(biāo)分子的結(jié)合能力和質(zhì)量輸運(yùn)增加有效表面積；提供柔性聚合物鏈以加快表面擴(kuò)散和類(lèi)似過(guò)程。增充劑也叫做，例如，"柔性臂，，、"觸手"和有時(shí)稱(chēng)作"絨毛，，。正如技術(shù)人員將理解，前述連接物也提供一定程度的擴(kuò)展，但連接物包含的原子數(shù)一般少于較長(zhǎng)的聚合物增充劑。發(fā)明詳述因此，本發(fā)明涉及一種制造磺酸酯-官能化載體的改進(jìn)方法。更具體地，在第一個(gè)發(fā)明點(diǎn)中，本發(fā)明涉及一種制造色譜基體的方法，包括提供包含有效羥基(OH基)的多糖載體；和使所述羥基與磺酸乙烯基酯反應(yīng)，以生成磺酸酯-官能化(S-官能化)陽(yáng)離子交換劑。在本文內(nèi)容中，應(yīng)理解，術(shù)語(yǔ)"有效，，是指對(duì)反應(yīng)有效。在一個(gè)實(shí)施方案中，反應(yīng)中所用的羥基是原來(lái)存在于多糖中的羥基。因此本發(fā)明有利地避免了對(duì)烯丙基化多糖預(yù)活化步驟的需要。因此，本發(fā)明提供了更快和從而成本更低的方法，在其中發(fā)生上述副反應(yīng)的危險(xiǎn)被大大減小了。因此，本方法導(dǎo)致相當(dāng)均勻的產(chǎn)物。應(yīng)理解，在本文內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)"磺酸乙烯基酯"，如本文所用，包括如通式(I)所定義的未取代磺酸乙烯基酯CH2=CH-S03(I)和以下通式(II)所定義的磺酸取代乙烯基酯CHR產(chǎn)CR2-S03(II)其中，&和R2中至少之一可以是不會(huì)與色語(yǔ)基體發(fā)生任何不希望相互作用的任何合適取代基。因此，在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，羥基與以上通式(I)所定義的未取代磺酸乙烯基酯反應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，羥基與以上通式(n)所定義的磺酸cc-取代或p-取代乙烯基酯反應(yīng)。適用的磺酸乙烯基酯可購(gòu)自商品，如ClariantGmbH。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，反應(yīng)將是邁克爾加成，在其中，親核羥基將進(jìn)攻磺酸乙烯基酯中的P碳原子。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，由本方法所獲得的S-官能化陽(yáng)離子交換劑可以示意地描述為載體-連接物-0-CH2-CHrS如眾所周知，在邁克爾加成中，常用氫氧離子或烷氧化物離子作為催化劑。反應(yīng)時(shí)間最長(zhǎng)可達(dá)10h,例如46h,以及溫度可以是20-80。C之間的任何溫度。在本方法中，反應(yīng)優(yōu)選在含水溶劑，如水，中進(jìn)行。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明超過(guò)先有技術(shù)方法的另一項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)是，它避免了需要使用揮發(fā)性和毒性化學(xué)物品。在一個(gè)有利實(shí)施方案中，載體包含交聯(lián)多糖。在特定實(shí)施方案中，多糖載體已用提高其剛性和因此改善其流量-壓力性能的方法制成，剛性多糖有時(shí)也叫做"高流量"多糖，例如，高流量瓊脂糖。因此，本發(fā)明的第一個(gè)發(fā)明點(diǎn)也包括一種提供如上所述的磺基烷基官能化色譜基體的方法，在其中，載體從由提高其剛度的方法制備的任何可凝膠化的多糖制成，該方法將在下面更詳細(xì)地討論。因此，在本方法中，交聯(lián)載體可通過(guò)如下方法提供(a)提供多糖水溶液并取代所述多糖的部分羥基；(b)凝膠化多糖溶液，以生成載體；和(c)通過(guò)使多糖的羥基反應(yīng)而交聯(lián)獲自(b)的多糖凝膠。在第一個(gè)實(shí)施方案中，多糖剛性的提高是通過(guò)用不易受親核進(jìn)攻的任何合適基團(tuán)，也稱(chēng)為"非-反應(yīng)性基團(tuán)"，進(jìn)行取代而實(shí)現(xiàn)的。通過(guò)用非反應(yīng)性基團(tuán)取代，多糖的穩(wěn)定性將得到提高，而且更易控制隨后的交聯(lián)步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，非-反應(yīng)性基團(tuán)選自醚、酯、酰胺和黃原酸酯。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多糖剛性的提高是通過(guò)用在本文內(nèi)容中屬"反應(yīng)性，，的基團(tuán)，如親電基或容易轉(zhuǎn)化為親電性的基團(tuán)，如都很易與羥基反應(yīng)的烯丙基、環(huán)氧化物、卣代醇、oc,P-不飽和羰基取代而實(shí)現(xiàn)的。因此，在另一個(gè)實(shí)施方案中，取代可進(jìn)行如下在多糖溶液中加入含一個(gè)活性部位和一個(gè)非活性部位的雙官能交聯(lián)劑并使多糖的羥基與交聯(lián)劑的活性部位反應(yīng)；在步驟(b)的凝膠化后，活化交聯(lián)劑的非活性部位；然后使活化部位與多糖凝膠的羥基反應(yīng)以交聯(lián)該凝膠。因此，在該實(shí)施方案中，制造色譜基體的方法包括a)在多糖溶液中加入含一個(gè)活性部位和一個(gè)非活性部位的雙官能交聯(lián)劑并允許多糖的羥基與交聯(lián)劑上的活性部位反應(yīng)；b)通過(guò)使多糖溶液凝膠化，例如通過(guò)冷卻，形成載體；c)活化交聯(lián)劑上的非活性部位；d)使由此獲得的活化部位與多糖凝膠上的羥基反應(yīng)，以交聯(lián)該凝膠；e)使剩下的羥基與磺酸乙烯基酯反應(yīng)，以生成磺酸酯-官能化(S-官能化)陽(yáng)離子交換劑。在本方法中所用的雙官能交聯(lián)劑將包含一個(gè)活性部位和一個(gè)非活性部位。在本文內(nèi)容中，術(shù)語(yǔ)"活性部位"是指能與多糖上的羥基反應(yīng)的所有基團(tuán)。這類(lèi)基團(tuán)的實(shí)例是鹵化物、環(huán)氧化物和羥曱基。術(shù)語(yǔ)"非活性部位"是指在與反應(yīng)性部位相同的反應(yīng)條件下不是反應(yīng)性的但隨后能被活化到與多糖的羥基反應(yīng)的基團(tuán)。因此，適用的交聯(lián)劑選自烯丙基縮水甘油基醚和烯丙基卣，如烯丙基溴；N-羥曱基丙烯酰胺；乙烯基千基氯；和肉桂酰氯。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙官能交聯(lián)劑選自烯丙基縮水甘油基醚、烯丙基溴和表氯醇。由此交聯(lián)的凝膠還可以用目前技術(shù)狀況所已知的傳統(tǒng)方法進(jìn)一步交聯(lián)。關(guān)于上述方法中步驟(a)~(d)的更詳細(xì)的內(nèi)容，可以如US6，602,990(Berg)所提供，該文獻(xiàn)引于此供參考。為了在色譜技術(shù)中獲得盡可能高的結(jié)合能力，本方法中所用載體應(yīng)具有盡可能大的與目標(biāo)化合物結(jié)合的有效面積。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，載體是多孔的。在本文中，應(yīng)理解，對(duì)反應(yīng)有效的基團(tuán)常存在于載體的外表面和具有足夠尺寸的孔的表面上。提高色譜載體表面積的另一條或又一條途徑是在載體與配體之間提供一種或多種增充劑。親水增充劑可包含選自下列的官能團(tuán)羥基、羧基、氨基、重復(fù)的氧化乙烯(-CH2-CH2-0-)和酰胺基。在一個(gè)實(shí)施方案中，增充劑包含親水聚合物，如多糖。多糖增充劑的典型實(shí)例是淀粉；纖維素，如纖維素醚，例如，羥乙基纖維素；葡聚糖，如MesenteroidB-512;和瓊脂糖。多羥基官能聚合物，如多糖，因其親水性和供束縛和連接配體的豐富反應(yīng)性羥基而成為優(yōu)選增充劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，增充劑是選自下列的多糖纖維素醚、葡聚糖；淀粉和淀粉衍生物；半纖維素；果膠；植物種籽膠(例如，剌槐豆膠或瓜膠)；植物滲出膠(如阿拉伯樹(shù)膠)；短醒霉多糖；硬葡聚糖；和黃原膠。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法中所用的載體已接枝了葡聚糖以形成增充劑，在這種情況下，對(duì)反應(yīng)有效的羥基將至少部分源自葡聚糖。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本方法包括在與磺酸乙烯基酯反應(yīng)之前提供含增充劑的多糖凝膠這一步。葡聚糖作為商品很易得到，例如，獲自GEHealthcare(Uppsala,Sweden),而且可按熟知方法偶聯(lián)到多糖載體上。葡聚糖最適用的分子量將取決于其它條件，如載體的孔尺寸，且可以在10500kDalton(kDa),如2070kD范圍內(nèi)。在一個(gè)有利實(shí)施方案中，葡聚糖已衍生自腸系膜樣明串抹菌，且分子量為約40kD。在一個(gè)實(shí)施方案中，葡聚糖是中等支化的，意味著約5%葡萄糖殘基是支化點(diǎn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，增充劑包含合成聚合物。這類(lèi)合成聚合物可選自聚乙烯醇；聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酰胺；Ficoll(蔗糖-表氯醇分子)；聚乙烯基醚，如羥基官能聚乙烯基醚；聚合甘油；羥基官能聚丙烯酰胺；羥基官能聚曱基丙烯酸酯；聚縮水甘油；和乙氧基化多元醇。如技術(shù)人員所理解，優(yōu)化增充劑的長(zhǎng)度(尺寸)將取決于數(shù)個(gè)因素，如與載體的連接點(diǎn)數(shù)目、增充劑的性質(zhì)、配體的結(jié)構(gòu)和尺寸及其在每個(gè)增充劑分子上的數(shù)目。本增充劑的分子量可以在500D以上，優(yōu)選1000D以上，最優(yōu)選在5500kD范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，增充劑是包含配體能按熟知方法連接的反應(yīng)性基團(tuán)的聚合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，配體在被束縛到載體表面之前連接在增充劑上，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易把增充劑連接到載體上，見(jiàn)，例如，US6,428,707(AmershamPharmaciaBiotechAB),該文獻(xiàn)引于此供參考。如上所述，多糖載體包含對(duì)化學(xué)反應(yīng)有效的羥基。因此，在提供載體時(shí)，多糖可以是能形成凝膠的任何多糖，如瓊脂糖、瓊脂、纖維素、葡聚糖、淀粉、果膠、脫乙酰殼多糖、魔芋、角叉萊膠、胞外多糖、藻酸鹽等。在一個(gè)實(shí)施方案中，多糖載體選自葡聚糖和瓊脂糖。在一個(gè)有利實(shí)施方案中，多糖載體是瓊脂糖。在特定實(shí)施方案中，載體由其上已偶聯(lián)了葡聚糖增充劑的瓊脂糖凝膠組成。在另一個(gè)特定實(shí)施方案中，載體由其上已偶聯(lián)了葡聚糖增充劑的葡聚糖凝膠組成。瓊脂糖構(gòu)成載體，載體的孔隙率將增加可用于配體偶聯(lián)的表面積，這是色譜
技術(shù)領(lǐng)域：
內(nèi)周知的。因此選擇色譜載體所基于的判據(jù)將與適用于清潔劑工業(yè)中所用的上述產(chǎn)物的那些不同，在清潔劑工業(yè)中，選擇起荷電基團(tuán)的載體作用的化學(xué)部分是為了增加對(duì)紡織材料的總吸引力。多糖載體已能用本領(lǐng)域內(nèi)熟知的任何傳統(tǒng)方法制成。非官能化色譜載體有商品可購(gòu),如SepharoseTM(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)。多糖載體可以呈任何合適的形狀，如顆粒，優(yōu)選基本球狀顆粒、整塊、膜、過(guò)濾用多孔物質(zhì)、碎片、毛細(xì)管或任何其它形式。在本方法的一個(gè)實(shí)施方案中，載體由凝膠顆粒，如基本球狀顆粒，組成。因此，在以上方法中，(b)包括制備顆粒，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易用瓊脂糖溶液在有機(jī)相中的懸浮凝膠化作用實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易用習(xí)用方法制備這類(lèi)顆粒，見(jiàn)，例如,SHjert6n:BiochimBiophysActa79(2),393~398(1964)。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，顆粒的平均直徑小于約400]um,如小于約200)iim。因此，顆粒直徑的典型范圍為10~100(am,如20~80jam,例如，30~50|nm或50~70)um。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多孔載體包含膜。本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易制造多糖膜，見(jiàn)，例如，S.T.Johnston,W.M.Deen:J.Membr.Sci.153(1999)271~179。在第二個(gè)發(fā)明點(diǎn)中，本發(fā)明涉及如上所述制成的色譜基體。本發(fā)明者已給出這樣的基體以示在結(jié)合能力方面的意外性能。在第四個(gè)發(fā)明點(diǎn)中，本發(fā)明涉及液相色譜柱，它包含由磺酸乙烯基酯與多糖的羥基反應(yīng)而制成的磺酸酯-官能化(S-官能化)多糖載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，該柱包含如上所述制成的磺酸酯-官能化(S-官能化)陽(yáng)離子交換劑。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，本色譜柱包含如上所述制成的色i普基體。該柱可以由任何傳統(tǒng)材料制造，如生物相容的塑料，例如，聚丙烯；鋼，如不銹鋼；或玻璃。色語(yǔ)柱可具有適用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；虼笠?guī)模純化的尺寸。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的色譜柱配有l(wèi)uer適配器、管接頭和圓蓋形螺母。色譜基體可填裝在柱內(nèi)或作為流化床提供。ii在一個(gè)實(shí)施方案中，按照本發(fā)明的色譜柱屬于稱(chēng)做有限使用色譜柱的那類(lèi)，在本文中，這是指最宜使用有限次數(shù)，如1-10次的裝填色譜柱。這類(lèi)有限使用產(chǎn)品在商業(yè)上稱(chēng)為"一次性使用產(chǎn)品"。在另一個(gè)發(fā)明點(diǎn)中，本發(fā)明涉及一種分離一種或多種目標(biāo)化合物的方法，它包括讓包含目標(biāo)化合物的液體通過(guò)由磺酸乙烯基酯與瓊脂糖的羥基反應(yīng)而制成的多孔磺酸酯-官能化(S-官能化)瓊脂糖色譜基體以吸附目標(biāo)化合物；然后通過(guò)使色譜基體與洗脫劑接觸而回收所述目標(biāo)化合物。因此，本方法是陽(yáng)離子交換色譜法。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，色譜基體如上所述。陽(yáng)離子交換色譜分析的原理是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。優(yōu)選色譜基體將在吸附和洗脫之間進(jìn)行洗滌。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，傳統(tǒng)的緩沖劑和條件將適用于該工藝。關(guān)于色譜法的綜述，見(jiàn)，例如，ProteinPurification-Principles,HighResolutionMethodandApplications(J,C.JansonandL.Ryd6n,1989VCHPublishers,Inc.)上述方法可用于分離，如分離或純化目標(biāo)化合物，如生物分子，如蛋白質(zhì)，例如，單克隆或多克隆抗體；肽，如二肽或低聚肽，肽核酸；病毒；細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；蛋白質(zhì)感染病毒等。在一個(gè)有利實(shí)施方案中，目標(biāo)化合物是蛋白質(zhì)以及本方法提供基本純蛋白質(zhì)。在最有利的實(shí)施方案中，目標(biāo)化合物是免疫球蛋白，如IgG?；蛘?，該方法也可用來(lái)分離陽(yáng)離子有機(jī)分子，如侯選藥物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本方法用來(lái)鑒定任何一種上述目標(biāo)化合物，例如，為診斷目的。在又再一個(gè)實(shí)施方案中，本方法用于純化食品和飲料工業(yè)產(chǎn)品，如源自乳清、糖和增甜劑溶液、含氨基酸的溶液的各種蛋白質(zhì)。因此，本方法的產(chǎn)物可以是藥物或藥物目標(biāo)，如抗體-基藥物或診斷劑；用于治療的媒介物，如用于基因治療的質(zhì)?；虿《?；食品添加劑，如功能化食品；診斷劑等。按照本發(fā)明純化的分子的特定應(yīng)用是作為供個(gè)體化用藥的藥品。實(shí)驗(yàn)部分下列實(shí)施例僅為說(shuō)明目的而提供，且無(wú)意限制如所附權(quán)利要求所定義的本發(fā)明。實(shí)施例1:S基與流量/壓力性能已提高的瓊脂糖的偶聯(lián)實(shí)施例la:按照本發(fā)明的磺酸乙烯基酯偶聯(lián)在本實(shí)施例中，起始材料是按US6，602,990(Berg)所述制成的瓊脂糖凝膠顆粒，即流量/壓力性能已提高的瓊脂糖。用磺酸乙烯基酯的偶聯(lián)法:把7ml排出的凝膠放在玻璃過(guò)濾器上并用15ml30Q/o乙烯基磺酸(VSA)(Fluka)水溶液洗滌3次。最后一次洗過(guò)后，把凝膠轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器中，加進(jìn)VSA溶液，到總體積為9ml。然后，加入7ml50%(18M)氫氧化鈉儲(chǔ)備溶液。攪拌該反應(yīng)漿料并加熱到5(TC恒溫6h,然后通過(guò)從反應(yīng)溶液過(guò)濾出凝膠并用數(shù)份水洗滌凝膠而使反應(yīng)停止。實(shí)施例lb〖對(duì)比)傳統(tǒng)的亞石克酸氫鈉偶聯(lián)起始材料是如以上實(shí)施例la中定義的瓊脂糖凝膠顆粒。烯丙基化:混合100ml瓊脂糖顆粒與12ml50%NaOH水溶液和0.5gNaBH4。在50。C攪拌該混合物1h。加入烯丙基縮水甘油醚(60ml)并在劇烈攪拌下保持該懸浮液在50。C又18h。在連續(xù)加入5MAcOH而中和到pH值為7之后，過(guò)濾該混合物并依次用0.5L乙醇、1L蒸餾水、200ml0.2M乙酸和500ml蒸餾水洗滌凝膠。烯丙基含量為0.14mmol/mL。用亞硫酸氪鈉進(jìn)行SP偶聯(lián):在總體積為130mL的上述烯丙基化瓊脂糖顆粒在水中的攪拌漿料內(nèi)，加入28g亞石危酸氫鈉并用NaOH控制pH值。在室溫下，以連續(xù)空氣鼓泡通過(guò)漿料的方法攪拌該反應(yīng)混合物18h，然后用蒸餾水洗滌。離子能力(ioncapacity)為0.11mmol/mL。結(jié)果實(shí)施例1的結(jié)果示于下表1。實(shí)施例2:S基通過(guò)增充劑與流量/壓力性能已提高的瓊脂糖的偶聯(lián)實(shí)施例2a:按照本發(fā)明的磺酸乙烯基酯偶聯(lián)起始材料是如以上實(shí)施例la中定義的瓊脂糖凝膠顆粒。環(huán)氧基-活化步驟排出55g瓊脂糖凝膠并在溫控反應(yīng)器內(nèi)與15mL蒸餾水一起攪拌。加入8.5mL50。/oNaOH和20mgNaBH4，并在攪拌5min后，加入14mL表氯醇。在30。C攪拌該反應(yīng)漿料2h，然后在玻璃過(guò)濾漏斗內(nèi)用蒸餾水多次洗滌。葡聚糖偶聯(lián)步驟:才巴21gDextranT40(AmershamBiosciences,Uppsala，Sweden)溶于25mL蒸餾水中。加入50g排出的瓊脂糖凝月交顆粒，其如實(shí)施例la所述制成并已如上所述經(jīng)過(guò)環(huán)氧基-活化，并在3(TC攪拌lh。加入2.5mL50。/oNaOH并在3(rC下攪拌該漿料18h,然后在玻璃過(guò)濾漏斗內(nèi)用蒸餾水多次洗滌。用磺酸乙烯基酯的偶聯(lián)步驟:如上實(shí)施例la所述使用磺酸乙烯基酯把S基偶聯(lián)到按照本發(fā)明的高交聯(lián)瓊脂糖增充劑上。實(shí)施例2b(對(duì)比)傳統(tǒng)的亞硫酸氬鈉偶聯(lián)在該實(shí)施例中，對(duì)以上實(shí)施例la中所定義的瓊脂糖凝膠顆粒進(jìn)行環(huán)氧基-活化并如以上實(shí)施例2a所述供給葡聚糖增充劑。用亞硫酸氪鈉的SP偶聯(lián):反應(yīng)如以上實(shí)施例lb所述進(jìn)行。結(jié)果實(shí)施例2的結(jié)果示于下表1。實(shí)施例3:葡聚糖增充劑的作用實(shí)施例3a:S基通過(guò)增充劑與瓊脂糖偶聯(lián)商品交聯(lián)瓊脂糖顆粒(Sepharose)獲自AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden。環(huán)氧基-活化、葡聚糖增充劑的偶聯(lián)和用磺酸乙烯基酯的S基偶聯(lián)如以上實(shí)施例2a所述進(jìn)行。實(shí)施例3b:無(wú)增充劑時(shí)S基與瓊脂糖的偶聯(lián)起始材料是以上實(shí)施例3a中所述的商品瓊脂糖。用磺酸乙烯基酯的S基偶聯(lián)如以上實(shí)施例la所述進(jìn)行。結(jié)果實(shí)施例3的結(jié)果示于下表2。實(shí)施例4:離子能力和蛋白質(zhì)結(jié)合按下述方法試驗(yàn)獲自以上實(shí)施例1~3的產(chǎn)物。結(jié)果示于表l(實(shí)施例1和2)和表2(實(shí)施例3)。葡聚糖含量測(cè)定對(duì)實(shí)施例2a、2b和3a中的產(chǎn)物試驗(yàn)葡聚糖含量如下。取出1.0mL葡聚糖改性的凝膠并在配置有加熱設(shè)備的分析天平上于12(TC干燥。用相應(yīng)的環(huán)氧基-活化凝膠作為參比物并用與葡聚糖改性凝膠相同的方法分析。把參比凝膠與葡聚糖偶聯(lián)凝膠之間的重量差看成是偶聯(lián)葡聚糖的含量，以mg/mL凝膠為單位表示。離子能力測(cè)定用滴定法測(cè)定氯化物離子交換能力。用0.5MHC1處理凝膠的漿料3min，然后用1mMHCl徹底洗滌。取出1.0mL凝膠樣品。把該樣品轉(zhuǎn)移至滴定容器并加入5mL水。然后用0.1MNaOH滴定該樣品到pH值為7.0。蛋白質(zhì)能力測(cè)定穿透能力(breakthroughcapacity)在安裝到AKTATM(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden)10/100上的HR5/5柱子內(nèi)測(cè)定，溶菌酶的流率為1mL/min,而多克隆免疫球蛋白(IgG)的流率為0.5mL/min,在50mMpH值為4.75的乙酸酯中。測(cè)定穿透能力的蛋白質(zhì)溶液的濃度約為4.0mg/ml。動(dòng)態(tài)蛋白質(zhì)結(jié)合能力以穿透曲線(xiàn)測(cè)定，能力是10%最大UV280吸收處的讀數(shù)。穿透能力法進(jìn)行如下把吸附緩沖劑泵過(guò)色譜體系的旁路位置直至達(dá)到穩(wěn)定基線(xiàn)。進(jìn)行自動(dòng)調(diào)零并把約10ml蛋白質(zhì)溶液(經(jīng)由上環(huán)路進(jìn)入)泵過(guò)體系，以獲得穩(wěn)定的100%信號(hào)。該步驟的流率與分析期間的相同，即300cm/h(lm1/min)。在穿透能力法中，設(shè)定100%信號(hào)的20%處所示的吸收。在用吸附緩沖劑達(dá)到穩(wěn)定基線(xiàn)后，再在旁路位置開(kāi)始前沿分析。該方法始于以10ml吸附緩沖劑(約5個(gè)柱體積)通過(guò)位于體系內(nèi)的柱子的柱平衡。然后進(jìn)行自動(dòng)調(diào)零并在柱內(nèi)加入蛋白質(zhì)溶液直至達(dá)到20%穿透。結(jié)果表1<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>權(quán)利要求1.一種制造色譜基體的方法，包括提供至少一種包含有效羥基的多糖載體；和使所述羥基與磺酸乙烯基酯反應(yīng)，以生成磺酸酯-官能化(S-官能化)陽(yáng)離子交換劑。2.按照權(quán)利要求l的方法，其中所述多糖是交聯(lián)的。3.按照權(quán)利要求2的方法，其中載體由下列步驟提供(a)提供多糖水溶液并取代所述多糖的部分羥基；(b)凝膠化多糖溶液，以提供載體；和(c)通過(guò)使多糖的羥基反應(yīng)而交聯(lián)獲自(b)的多糖凝膠。4.按照權(quán)利要求3的方法，其中如(a)中定義的所述取代羥基的方法如下在多糖溶液中加入至少一種有一個(gè)活性部位和一個(gè)非活性部位的雙官能交聯(lián)劑，并使這種活性部位與多糖的部分羥基反應(yīng)；其中，所述加入的交聯(lián)劑的非活性部位在如(b)中定義的凝膠化后被活化；以及其中，由此活化的部位與多糖凝膠的羥基反應(yīng)而提供如(c)中定義的交聯(lián)。5.按照前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中多糖選自瓊脂糖和葡聚糖。6.按照權(quán)利要求5的方法，其中多糖是瓊脂糖。7.按照前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中與磺酸乙烯基酯反應(yīng)以生成S-官能化陽(yáng)離子交換劑的羥基已通過(guò)增充劑偶聯(lián)到載體表面。8.按照權(quán)利要求7的方法，其中增充劑包含至少一種多羥官能聚合物，如葡聚糖。9.按照前述權(quán)利要求中任何一項(xiàng)的方法，其中載體是多孔的。10.按照權(quán)利要求1~9中任何一項(xiàng)的方法，其中載體由基本球狀的凝月交顆粒構(gòu)成。11.按照權(quán)利要求1~9中任何一項(xiàng)的方法，其中載體是膜。12.由用權(quán)利要求1~10中任何一項(xiàng)的方法制成的磺酸酯-官能化(S-官能化)瓊脂糖顆粒構(gòu)成的色譜基體。13.—種液相色譜柱，其包含的基體由通過(guò)磺酸乙烯基酯與瓊脂糖的羥基反應(yīng)而成的多孔磺酸酯-官能化(S-官能化)瓊脂糖顆粒組成。14.一種液相色譜柱，其包含的基體包含由磺酸乙烯基酯與偶聯(lián)在瓊脂糖上的增充劑，如一種或多種多羥基官能聚合物，所提供的羥基反應(yīng)而成的多孔磺酸酯-官能化(S-官能化)瓊脂糖顆粒。15.按照權(quán)利要求13或14的色譜柱，它包含如權(quán)利要求1~10中任何一項(xiàng)所定義的方法制成的磺酸酯-官能化(S-官能化)陽(yáng)離子交換劑。16.—種分離一種或多種目標(biāo)化合物的方法，包括使包含目標(biāo)化合物的液體通過(guò)由磺酸乙烯基酯與瓊脂糖的羥基反應(yīng)而成的多孔磺酸酯-官能化(S-官能化)瓊脂糖色譜基體，以吸附目標(biāo)化合物；然后通過(guò)使色i普基體與洗脫液接觸而回收所述的目標(biāo)化合物。17.—種分離一種或多種目標(biāo)化合物的方法，包括使包含目標(biāo)化合物的液體通過(guò)由磺酸乙烯基酯與偶聯(lián)在瓊脂糖上的增充劑所提供的羥基反應(yīng)而制成的多孔磺酸酯-官能化(S-官能化)瓊脂糖色譜基體，以吸附目標(biāo)化合物；然后通過(guò)使色譜基體與洗脫液接觸而回收所述的目標(biāo)化合物。18.按照權(quán)利要求16或17的方法，其中色語(yǔ)基體由基本球狀的凝膠顆粒構(gòu)成。19.按照權(quán)利要求15-18中任何一項(xiàng)的方法，其中至少一種目標(biāo)化合物是蛋白質(zhì)。20.按照權(quán)利要求19的方法，其中至少一種目標(biāo)化合物是免疫球蛋白，優(yōu)選IgG。21.如權(quán)利要求111中任何一項(xiàng)所定義的方法制成的色譜基體在液相色譜技術(shù)中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及一種制造色譜基體的方法，包括提供包含有效羥基的多糖載體；和使所述羥基與磺酸乙烯基酯反應(yīng)以生成磺酸酯-官能化(S-官能化)陽(yáng)離子交換劑。載體的羥基可以是瓊脂糖聚合物的羥基；或者它們也可以由增充劑，如多羥基官能聚合物提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，載體由具有改善的流量-壓力性能的瓊脂糖制成。文檔編號(hào)B01J20/289GK101252986SQ200680031465公開(kāi)日2008年8月27日申請(qǐng)日期2006年8月30日優(yōu)先權(quán)日2005年8月31日發(fā)明者A·拉森,A·阿克森,G·格拉德,H·伊爾,N·諾曼申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司