專利名稱：微流孔芯片電泳分離檢測小而密低密度脂蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種小而密低密度脂蛋白的檢測方法。
背景技術：
脂蛋白是納米大小的球形顆粒，膽固醇酯和甘油三酯組成疏水性的內殼，載脂蛋白、磷脂及游離膽固醇組成親水性的外殼。超速離心法將血漿脂蛋白分為乳糜微粒(CM)、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。低高密度脂蛋白膽固醇血癥和高低密度脂蛋白膽固醇血癥作為冠心病傳統(tǒng)的危險因素，已得到人們的公認。近年來研究發(fā)現(xiàn)，低密度脂蛋白具有明顯的異質性，小顆粒致密LDL(small dense low density lipoprotein，sLDL)與大而輕LDL(large buoyant low density lipoprotein，LDL1)相比具有強烈的致動脈粥樣硬化的作用，sLDL更易遭受氧化或修飾，是冠心病重要的危險因素，已成為倍受關注的新研究熱點。超速離心法是目前分離sLDL的參考方法，但由于需昂貴的設備、操作復雜、費時且技術要求高，不易在普通實驗室開展。至今沒有一種簡便、易行、快速、準確的分離sLDL的方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種能簡便、易行、快速、準確的分離檢測小而密低密度脂蛋白的微流孔芯片電泳分離檢測小而密低密度脂蛋白的方法。
本發(fā)明的技術解決方案是一種微流孔芯片電泳分離檢測小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是包括下列步驟(1)標本預處理將5μl血清樣本溶于15μl去離子水中，然后用0.5mg/ml的NBD C6-ceramide 10μl預染1分鐘后加入pH9.8樣本Tricine緩沖液，樣本Tricine緩沖液由40mol/l的Tricme、40mol/l的泛影葡胺、0.2mmol/l的SDS組成，得待測樣本；(2)采用十字交叉形通道的微流孔芯片；將微流孔芯片的試樣池、試樣廢液池、緩沖液池、緩沖液廢液池及通道用1mol/lNaOH浸洗1分鐘，然后用去離子水清洗1分鐘，在試樣廢液池、緩沖液池、緩沖液廢液池中分別加入8μl pH9.8分離緩沖液，分離緩沖液由40mmol/l的Tricine、40mmol/l的泛影葡胺、0.02mmol/l的SDS組成，在試樣池中加入6μl待測樣本；然后用微流孔芯片電泳裝置進行電泳，電泳時采用夾流進樣方式，在進樣階段，試樣廢液池接地，試樣池+750v，緩沖液池+300v，緩沖液廢液池+450v，在分離階段，緩沖液廢液池0v，緩沖液池+3000v，試樣池和試樣廢液池均施加+300v.在高脂蛋白血癥患者的樣本中分離出小而密低密度脂蛋白。
本發(fā)明能有效分離HDL、LDL1、sLDL，能簡便、易行、快速、準確的分離檢測小而密低密度脂蛋白，從樣本預染到結果分析只需6分鐘，芯片的使用可達數(shù)千次，而且操作簡單。


下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。
圖1是本發(fā)明微流孔芯片的結構示圖。
圖2是圖1中十字交叉口的掃描電鏡圖。
圖3是健康體檢者脂蛋白分離圖譜。
圖4是II型高脂蛋白血癥患者的血清脂蛋白電泳圖譜。
圖中Relative fluorescence為相對熒光強度，Time(min)為時間(分)，detection point為檢測點。
具體實施例方式一種微流孔芯片電泳分離檢測小而密低密度脂蛋白的方法，包括下列步驟(1)標本預處理將5μl血清樣本溶于15μl去離子水中，然后用0.5mg/ml的NBD C6-ceramide 10μl預染1分鐘后加入pH9.8樣本Tricine緩沖液，樣本Tricine緩沖液由40mol/l的Tricine、40mol/l的泛影葡胺、0.2mmol/l的SDS組成，得待測樣本；(2)采用十字交叉形微流孔芯片；芯片采用石英玻璃為制作材料，經(jīng)光刻、濕法腐蝕、低溫鍵合而成，整個芯片大小為63.5mm×31.75mm，芯片微管道寬100μm，深約30μm，芯片進樣池到十字交叉點長28mm，有效分離長度為45mm，儲液池的直徑為2mm。將微流孔芯片的試樣池1、試樣廢液池2、緩沖液池3、緩沖液廢液池4及通道用1mol/lNaOH浸洗1分鐘，然后用去離子水清洗1分鐘，在試樣廢液池、緩沖液池、緩沖液廢液池中分別加入8μl pH 9.8分離緩沖液，分離緩沖液由40mmol/l的Tricine、40mmol/l的泛影葡胺、0.02mmol/l的SDS組成，在試樣池中加入6μl待測樣本；然后用微流孔芯片電泳裝置進行電泳，電泳時采用夾流進樣方式，在進樣階段，試樣廢液池接地，試樣池+750v，緩沖液池+300v，緩沖液廢液池+450v，在分離階段，緩沖液廢液池0v，緩沖液池+3000v，試樣池和試樣廢液池均施加+300v。在高脂蛋白血癥患者的樣本中分離出小而密低密度脂蛋白。
微流控芯片毛細管電泳儀器激光誘導熒光檢測系統(tǒng)(Laser InducedFluorescence Detector，LIF)，367型氬離子激光器(南京電子管廠)發(fā)出波長為488nm的激光束，經(jīng)半反半透鏡(Omega Optical公司)反射至物鏡(Rolyn Otics公司)，將光束對準芯片檢測窗口；當泳道內帶有熒光基團的脂蛋白分離組分經(jīng)過檢測窗口時，激發(fā)出的熒光由物鏡收集，通過半反半透鏡(520nm)，經(jīng)光電倍增管(Photo Multiplier Tube，PMT)后轉換為模擬信號，經(jīng)過低通濾波和放大后，經(jīng)模數(shù)(Analog toDigital，A/D)轉換為數(shù)字信號，由計算機對信號進行采集和處理。實驗所得數(shù)據(jù)用Microsoft excel和Origin 6.0進行處理，轉換為熒光強度與遷移時間的關系。
權利要求
1.一種微流孔芯片電泳分離檢測小而密低密度脂蛋白的方法，其特征是包括下列步驟(1)標本預處理將5μl血清樣本溶于15μl去離子水中，然后用0.5mg/ml的NBD C6-ceramide10μl預染1分鐘后加入pH 9.8樣本Tricine緩沖液，樣本Tricine緩沖液由40mol/l的Tricine、40mol/l的泛影葡胺、0.2mmol/l的SDS組成，得待測樣本；(2)采用十字交叉形通道的微流孔芯片；將微流孔芯片的試樣池、試樣廢液池、緩沖液池、緩沖液廢液池及通道用1mol/1NaOH浸洗1分鐘，然后用去離子水清洗1分鐘，在試樣廢液池、緩沖液池、緩沖液廢液池中分別加入8μlpH9.8分離緩沖液，分離緩沖液由40mmol/l的Tricine、40mmol/l的泛影葡胺、0.02mmol/l的SDS組成，在試樣池中加入6μl待測樣本；然后用微流孔芯片電泳裝置進行電泳，電泳時采用夾流進樣方式，在進樣階段，試樣廢液池接地，試樣池+750v，緩沖液池+300v，緩沖液廢液池+450v，在分離階段，緩沖液廢液池0v，緩沖液池+3000v，試樣池和試樣廢液池均施加+300v.在高脂蛋白血癥患者的樣本中分離出小而密低密度脂蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微流孔芯片電泳分離檢測小而密低密度脂蛋白的方法，包括標本預處理微流孔芯片、電泳裝置進行電泳，在高脂蛋白血癥患者的樣本中分離出小而密低密度脂蛋白。本發(fā)明能簡便、易行、快速、準確的分離檢測小而密低密度脂蛋白，從樣本預染到結果分析只需6分鐘，芯片的使用可達數(shù)千次，而且操作簡單。
文檔編號B01D57/02GK101017176SQ200710019778
公開日2007年8月15日 申請日期2007年2月8日 優(yōu)先權日2007年2月8日
發(fā)明者王惠民, 汪驊, 孫承龍, 張志泉, 褚少朋 申請人:南通大學附屬醫(yī)院