專利名稱：一種植物根表生防細(xì)菌的快速、高效篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。是一種為拮抗植物病原真菌的植物根表生防 細(xì)菌快速、高效篩選方法。
背景技術(shù)：
全國(guó)各地每年都會(huì)因植物病害引起植株矮小、瘦弱、黃化等不同癥狀，嚴(yán)重 時(shí)全株死亡，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其中有80%病害屬于真菌病害。在防治方面， 化學(xué)防治雖然見(jiàn)效快，但易造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染，對(duì)人們身體健康產(chǎn)生潛在 的威脅；同時(shí)化學(xué)農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用，病原菌也易對(duì)其產(chǎn)生抗藥性因而導(dǎo)致防治效 果下降。細(xì)菌存在范圍廣，種類多，數(shù)量大，繁殖快，它們中有的能產(chǎn)生拮抗性 物質(zhì)，抑制病原菌，并且促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，所以利用細(xì)菌防治植物病害，尤其是 土傳病害，具有很大的潛力。隨著人們生活水平的提高，對(duì)食品安全性要求也在 不斷地提高，篩選出可替代化學(xué)藥劑防治植物病害的生防制劑成為迫切需要。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者研究證明，有許多種拮抗性細(xì)菌具有防治植物病害尤其是土 傳病害的能力，常見(jiàn)的有以下一些屬芽孢桿菌屬CBa"7/M)、腸桿菌屬 (五"fera》"efer)、歐文氏菌屬(￡>147'"/")、黃桿菌屬(F/ozoto"OT'謂)、哈夫尼菌屬 (i/a/"/a)、小單孢菌屬(M/'crcw ompora)、假單胞菌屬(尸sew. fifew/o"as)、固氮菌屬 (v4加to6acfer)、根瘤菌屬(朋/zo6z力w)、沙雷氏菌屬(&rraft.a)、鏈霉菌屬(5Vre/ to附y(tǒng)ces)和黃單胞菌屬(ZaW/;omowaO。有的生防細(xì)菌不僅具有防病作用，同時(shí)還可以提高種子的發(fā)芽率，還有明顯的增產(chǎn)效應(yīng)。目前，生防細(xì)菌的篩選普遍采用的步驟是，首先將植物組織研磨采用稀 釋涂布平板法分離組織內(nèi)能培養(yǎng)的絕大多數(shù)細(xì)菌，取單個(gè)菌落在平板上不斷 劃線純化后，與病原真菌平板對(duì)峙培養(yǎng)進(jìn)行篩選。如果從土壤中分離，則先 稀釋土壤懸浮液采用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法分離土壤中適合該 培養(yǎng)基的所有細(xì)菌，純化后進(jìn)行平板一一對(duì)峙培養(yǎng)或點(diǎn)接法培養(yǎng)進(jìn)行篩選。 工作量較大，重復(fù)工作較多，試驗(yàn)過(guò)程中需要的培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿量大，篩選
到有生防效果的細(xì)菌概率較小，即耗時(shí)耗材。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是高效篩選防治植物真菌病害尤其是土傳病害的植物根表生 防細(xì)菌，以達(dá)到縮短生防細(xì)菌的篩選階段，加快生防細(xì)菌的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，使農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)實(shí)踐中植物病害得到很好的控制。本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是對(duì)已有的傳統(tǒng)分離、 篩選方法，進(jìn)行了改進(jìn)，采用改進(jìn)的TY培養(yǎng)基，稀釋平板法分離細(xì)菌，在另一 Ch+TY平板上均勻地涂上病原真菌懸浮液，然后接種菌落形狀、大小和顏色不 同的IO個(gè)細(xì)菌菌落進(jìn)行培養(yǎng)，觀察真菌周圍是否有抑菌帶出現(xiàn)，有抑菌帶出現(xiàn) 的即為目標(biāo)細(xì)菌。改目前的先稀釋平板法分離然后多次重復(fù)一一對(duì)峙培養(yǎng)篩選為 病原真菌與植物根表細(xì)菌直接對(duì)峙培養(yǎng)法篩選，使生防細(xì)菌對(duì)病原真菌的拮抗能 力明顯增強(qiáng)，并且時(shí)間短，根表生防細(xì)菌的篩選可縮短30d左右。該方法耗材少， 工作量小，僅用傳統(tǒng)方法的四分之一的材料，五分之一的工作量，篩選到的細(xì)菌 田間應(yīng)用防治效果明顯提高。具體方法如下1.細(xì)菌分離和初篩Ch+TY培養(yǎng)基的配制(適合多數(shù)真菌和細(xì)菌生長(zhǎng))Nutrient agar 4gYeast Extract 0.2gBacto-Agar 2g Lactalbumin hydrolysate0.1 gDistilled H20 200ml高壓滅菌 15min 步驟1) 用酒精將剪子和鑷子表面消毒；2) 剪3cm左右的不同植物干根；3) 在無(wú)菌室將剪下的不同植物干根置于Ch+TY平板上;4) 然后挑取病原真菌，在植物根平行的位置劃線；5) 于25"C真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天左右觀察抑菌情況。2. 純化發(fā)現(xiàn)植物根周圍有大量細(xì)菌，細(xì)菌周圍出現(xiàn)抑菌帶(不長(zhǎng)真菌)或菌絲長(zhǎng)得 較短、產(chǎn)生較少孢子或沒(méi)有孢子產(chǎn)生，即為目標(biāo)細(xì)菌。但此時(shí)細(xì)菌為混合菌，需 小心挑出，劃線純化，于28'C細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 一天即可觀察，如果發(fā)現(xiàn)仍 有形狀、大小和顏色不同的細(xì)菌菌落，則需分別挑取進(jìn)一步純化，直至每皿呈現(xiàn) 形狀、大小和顏色均相同菌落。3. 復(fù)篩方法將己純化的細(xì)菌與病原真菌于Ch+TY平板上劃平行線對(duì)峙培養(yǎng)，或于 Ch+TY平板中心點(diǎn)接入病原真菌，真菌周圍約等距離四點(diǎn)接入細(xì)菌。于25"C真 菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天可測(cè)定抑菌帶寬，計(jì)算抑菌率。4. 保存將已純化的細(xì)菌接到試管斜面中，蛇形劃線28'C培養(yǎng)一天后，儲(chǔ)存4"C冰箱 中，或?qū)⑸谰尤胫睆綖?cm的Ch+TY培養(yǎng)皿中心，28。C培養(yǎng)一天后，儲(chǔ)存 4"C冰箱中。所用儀器設(shè)備DHP-9162A恒溫培養(yǎng)相(天津泰斯特)、DL-CJ-IN超級(jí)潔凈工作臺(tái)(北京東聯(lián))、Y60368微量移液器(上海雷勃)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明是中國(guó)科學(xué)院重大創(chuàng)新工程項(xiàng)目"東北地區(qū)農(nóng)業(yè)水土資源優(yōu)化調(diào)控 機(jī)制與技術(shù)體系研究"專題作物病、蟲(chóng)、草害生物生態(tài)控制關(guān)鍵技術(shù)研究(編 號(hào)KZCX1-SW-19-4-03)和黑龍江省"十五"重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目"主要農(nóng)作物病 蟲(chóng)害可持續(xù)控制技術(shù)研究"專題大豆根腐病生物防治(編號(hào)GB01B201)中的 主要內(nèi)容。我們于2002年1月至2006年12月在中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生 態(tài)研究所按以上步驟進(jìn)行了生防細(xì)菌的篩選和中式生產(chǎn)，田間防治大豆根腐病效 果非常好，解決了生產(chǎn)實(shí)踐中大豆根腐病生物防治的難題。既獲得了經(jīng)濟(jì)效益， 又獲得了生態(tài)效益。本發(fā)明的使用材料較普遍，價(jià)格便宜，成本低，所需時(shí)間短，篩選的細(xì)菌生 防效果好，達(dá)到了高效的目的。廣泛應(yīng)用防治由鐮孢菌屬F"WA^m引起的多種 植物根部腐爛病害。本發(fā)明將縮短生防細(xì)菌的分離和篩選所需時(shí)間，進(jìn)一步保證 細(xì)菌的生防效果，加快生防細(xì)菌的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，促進(jìn)我國(guó)生物防治的發(fā)展。
權(quán)利要求
1.一種植物根表生防細(xì)菌的快速、高效篩選方法，其特征在于采用改進(jìn)的TY培養(yǎng)基，稀釋平板法分離細(xì)菌，在另一Ch+TY平板上均勻地涂上病原真菌懸浮液，然后接種菌落形狀、大小和顏色不同的10個(gè)細(xì)菌菌落進(jìn)行培養(yǎng)，觀察真菌周圍是否有抑菌帶出現(xiàn)，有抑菌帶出現(xiàn)的即為目標(biāo)細(xì)菌；其方法及具體步驟如下a.細(xì)菌分離和初篩用酒精將剪子和鑷子表面消毒后，剪3cm左右的不同植物干根，在無(wú)菌室將剪下的不同植物干根置于Ch+TY平板上，然后用接種針挑取病原真菌，在植物根平行的位置劃線，于25℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天左右觀察抑菌情況，發(fā)現(xiàn)植物根周圍有大量細(xì)菌，細(xì)菌周圍出現(xiàn)抑菌帶(不長(zhǎng)真菌)或菌絲長(zhǎng)得較短、產(chǎn)生較少孢子或沒(méi)有孢子產(chǎn)生，即為目標(biāo)細(xì)菌；b.純化此時(shí)細(xì)菌為混合菌，需小心用接菌環(huán)挑出細(xì)菌，劃線純化，于28℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一天后即可觀察，如果發(fā)現(xiàn)仍有形狀、大小和顏色不同的細(xì)菌菌落，則需分別挑取進(jìn)一步純化，直至每皿呈現(xiàn)形狀、大小和顏色均相同菌落；c.復(fù)篩方法將已純化的細(xì)菌與病原真菌于Ch+TY平板上劃平行線對(duì)峙培養(yǎng)，或于Ch+TY平板中心點(diǎn)接入病原真菌，真菌周圍約等距離四點(diǎn)接入細(xì)菌，于25℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天可測(cè)定抑菌帶寬，計(jì)算抑菌率；d.保存將已純化的細(xì)菌接到試管斜面中，蛇形劃線28℃培養(yǎng)一天后，儲(chǔ)存4℃冰箱中，或?qū)⑸谰尤胫睆綖?cm的Ch+TY培養(yǎng)皿中心，28℃培養(yǎng)一天后，儲(chǔ)存4℃冰箱中。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，是一種快速篩選植物真菌病害尤其是土傳病害生防細(xì)菌的方法。改目前的先稀釋平板法分離然后多次重復(fù)一一對(duì)峙培養(yǎng)篩選為病原真菌與植物根表細(xì)菌直接對(duì)峙培養(yǎng)法篩選，明顯提高了生防細(xì)菌篩選的效率，并且生防效果增強(qiáng)。本發(fā)明的使用材料與傳統(tǒng)方法基本相同，價(jià)格便宜，方法快捷。廣泛應(yīng)用于多種植物真菌病害生防細(xì)菌篩選，適用于從不同植物組織及其器官表面分離篩選生防細(xì)菌。本發(fā)明將縮短生防細(xì)菌的分離和篩選所需時(shí)間，加快生防細(xì)菌的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用，促進(jìn)我國(guó)生物防治的發(fā)展。
文檔編號(hào)C12N1/20GK101148648SQ200710056059
公開(kāi)日2008年3月26日 申請(qǐng)日期2007年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日
發(fā)明者于澤波, 李春杰, 許艷麗 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所