欧美在线观看视频网站,亚洲熟妇色自偷自拍另类,啪啪伊人网,中文字幕第13亚洲另类,中文成人久久久久影院免费观看 ,精品人妻人人做人人爽,亚洲a视频

用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質及其制備方法

文檔序號:5022872閱讀:589來源:國知局
專利名稱:用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質及其制備方法
技術領域
本發(fā)明涉及一種用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質及其制備方法,屬于用 于分離純化免疫球蛋白的色譜介質技術。
背景技術
近些年來,抗體被廣泛地應用于醫(yī)學診斷和疾病治療中。2006年FDA批準的20余 種抗體類藥物全球銷售額超過170億美元04w歷o^/mo/丄a6, 24(8): 8 (2006))??贵w藥物制 備通常采用沉淀、離子交換色譜、疏水性相互作用色譜、親和色譜等方法完成,其過程成 本約占生產成本的30%~40%。以目前廣泛應用的親和蛋白A色譜為例,盡管蛋白A與抗 體的Fc片段間專一性的識別使經由蛋白A色譜分離得到的抗體具有較高的純度,但其高 昂的價格、脆弱的結構及牽強人意的偶聯(lián)方法和洗脫條件嚴重影響其產業(yè)化的進程 9: 211 (2000); /C/wwatogr A 1122: 144 (2006))。近來,受到以追求產物高 收率為目標的高密度細胞培養(yǎng)技術發(fā)展的影響,抗體純化成本有更加增大的趨勢。
針對以上問題,Biosepra公司公布了以含巰基的雜環(huán)化合物為配基的擬親和色譜介質 用于抗體的分離(US Patent 5719269A1)。該介質通過與免疫球蛋白間的選擇性作用吸附目 標蛋白。在電導率低于100mS/cm的范圍內,該色譜介質的動態(tài)吸附量與電導率無關并維 持在30mg/mL作用,顯示出很好的耐鹽特性,更加適應高密度細胞培養(yǎng)液的處理(細胞 培養(yǎng)液的電導率在13-16 mS/cm)。同時色譜介質因采用了價格較蛋白A便宜的化學配基 而更加穩(wěn)定,使用周期長。Upfront Chromatography A/S報道了以含有羧基的芳香或雜環(huán)化 合物為配基的色譜介質(US Patent 6498236B1),其對抗體的吸附效率達到80-100%(吸附效 率定義為吸附前后液相中蛋白濃度差與吸附前液相中蛋白濃度之比)。但這種較高的吸附 效率通常出現(xiàn)在低鹽和少量親水性有機溶劑存在的條件下。GE Healthcare于2007年5月' 公開了一種分離抗體的多模式配基色譜介質,通過電子受體-供體間相互作用實現(xiàn)免疫球 蛋白的吸附(USPatent2007112178Al)。該色譜介質由帶有碳、硫或氧原子的芳香或雜環(huán)芳 香化合物構成,如3-氨基-4-丙磺酰基-2-羧基噻吩等。在牛血清白蛋白存在條件下,單克 隆抗體在色譜介質上的動態(tài)吸附量可達40 mg/mL。隨著抗體藥物在近年來的興起,作為 抗體制備關鍵技術的抗體色譜也受到了日益廣泛地關注。目前抗體色譜雖初步實現(xiàn)了在較 寬離子強度范圍內目標產物的高容量吸附,但昂貴的配基價格、相對苛刻的洗脫條件等仍 然制約著抗體色譜的推廣和應用。因此,尋找并開發(fā)廉價、穩(wěn)定及洗脫條件相對溫和的配 基是當前抗體色譜發(fā)展中急待解決的問題,其對抗體藥物的產業(yè)化所要求的大規(guī)模制備技 術的實現(xiàn)具有重要的經濟和技術價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于開發(fā)一種用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質及制備方 法。所述的分離純化色譜介質具有吸附量大的特點,其制備方法過程簡單,價格低廉。
本發(fā)明是通過下述技術方案加以實現(xiàn)的, 一種用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色 譜介質,其特征在于,該色譜介質是在平均粒徑為30-300 ym的瓊脂糖凝膠顆粒的介質 表面偶聯(lián)烯丙基的間隔臂,在間隔臂的末端偶聯(lián)咪唑和苯的雙環(huán)化合物D為介質的配基。 色譜介質的結構表達形式如下
其中R3、 R4、 R5、 R6、 R7中的一個基團必為氨基或甲基氨,其余的基團及R1、 R2 為氫原子和含有1-4個碳原子的短鏈垸烴一種。
上述的咪唑和苯的雙環(huán)化合物D選自2-(咪唑-l-基)苯胺、4-(咪唑-l-基)苯胺、3-(咪 唑-l-基)苯胺、4-咪唑-l-基-2-甲基-苯胺、4-咪唑-l-基-苯甲胺、2-咪唑-l-基-苯甲胺和3-甲基_4-(咪唑-1-基)苯胺。
上述用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質的制備方法,其特征在于包括以下 過程
1.介質的烯丙基化反應
將平均粒徑為30-300 pm的瓊脂糖凝膠顆粒的介質,加入二甲基亞砜中形成介質的懸 浮液,二甲基亞砜的體積用量為介質體積量的0.05-2倍,繼而向介質懸浮液中加入體積用
其中,咪唑和苯的雙環(huán)化合物D結構式如I式所示:
量為介質體積量的0.05-1倍、濃度為0.5-6 mol/L氫氧化鈉溶液,混合均勻,制得混合懸 浮液,再向混合懸浮液中加入體積用量為介質體積量的0.02-1倍的烯丙基溴后,置于4-50 。C的恒溫水浴中活化3-36小時,之后用去離子水沖洗介質至無游離烯丙基溴,制得含烯 丙基的色譜介質。
2. 介質的活化反應
將烯丙基色譜介質加入到二甲基亞砜和水的體積比為0. 1-4的混合溶液中,二甲基亞 砜和水的混合溶液的體積用量為烯丙基色譜介質體積量的1-8倍,再向二甲基亞砜和水及 烯丙基色譜介質的懸浮液中按每毫升烯丙基色譜介質加入0. 05-2g N-溴代琥珀酰亞胺后, 將該懸浮液置于15-5(TC水浴中反應0. 3-5小時,反應后以去離子水沖洗介質制得活化色 譜介質;
3. 活化色譜介質的配基偶聯(lián)
按每克活化色譜介質用雙環(huán)化合物D為0. 05-2 mmol標準計,再將活化色譜介質懸浮 于含有雙環(huán)化合物D的二甲基亞砜的反應液中,反應液的體積用量為活化色譜介質體積量 的0.2-5倍,反應液的pH值為9.0-13.0,再將該懸浮有活化色譜介質的反應液置于 25-60° C恒溫水浴中,經3-36小時進行偶聯(lián)反應,偶聯(lián)反應后的偶聯(lián)配基介質以去離子 水、體積濃度25%乙醇-水溶液和0.5mol/L的氯化鈉溶液進行交替沖洗,得到用于免疫 球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質。
上述的介質烯丙基化過程,采用的二甲基亞砜的體積用量為介質體積量的0.1-0.7 倍,氫氧化鈉溶液的濃度為1-5 mol/L,體積用量為介質體積量的0.2-0.8倍,烯丙基溴 的體積用量為介質體積量的0.05-0.5倍;上述的介質活化反應過程,采用的混合溶液中 二甲基亞砜和水的體積比為0.3_1.2,該混合溶液體積用量為烯丙基色譜介質體積量的 3-6倍,混合溶液中N-溴代琥珀酰亞胺按每毫升烯丙基色譜介質用量為0. l-lg比例加入; 上述的介質偶聯(lián)配基過程,偶聯(lián)懸浮反應液中雙環(huán)化合物D的用量按每克活化色譜介質用 量為0.3-1.0 mmol加入,偶聯(lián)懸浮反應液二甲基亞砜體積用量為活化色譜介質體積量的 l-3倍;反應液的pH值10. 0-13. 0,反應時間為15-30小對。
本發(fā)明提供了的用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質,該色譜介質具有如下 顯著的特點:色譜介質在離子強度從0.02mol/L到2mol/L的范圍內對抗體均有較強的吸附, 表現(xiàn)出優(yōu)良的耐鹽吸附特性,顯示出該配基為非鹽依賴性配基;因此,原料液可無需預處 理,直接經色譜分離而獲得目標產物,簡化了操作步驟;作為主要雜蛋白的牛血清白蛋白 在色譜介質上的吸附量隨著離子強度的增加顯著下降,采用高離子強度緩沖液可洗脫白蛋 白,提高目標產物的純度;色譜介質在特定離子強度下(如含有0.5 mol/LNaCl的20mmol/L 磷酸鹽緩沖液,pH8.0)選擇性地吸附免疫球蛋白的同時,避免了雜蛋白的共吸附和共洗脫, 從而獲得純度在90%以上的目標產品;配基的解離常數(shù)pif。幾近中性,從而可根據目標蛋
白和雜蛋白等電點的差異,選擇合適的洗脫pH,獲得高純度的產品;該制備方法過程簡 單,價格低廉。


圖1為以本發(fā)明實施例1所制備的瓊脂糖凝膠色譜介質在20mmol/L磷酸鹽緩沖溶液 (pH 8.0)中不同氯化鈉濃度下抗體和牛血清白蛋白的動態(tài)吸附量比較圖。圖中深色柱代表 抗體的動態(tài)吸附量;淺色柱代表牛血清白蛋白的動態(tài)吸附量。
圖2為本發(fā)明實施例1所制備的瓊脂糖凝膠色譜介質在含0.5 mol/L氯化鈉的20 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)中分離抗體與白蛋白混合溶液的色譜圖。圖中1為含50%乙二醇的 20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 5.0)的洗脫峰;2為20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 4.0) 的洗脫峰;3為0.1mol/LHCl的洗脫峰。
圖3為本發(fā)明實施例1所制備的瓊脂糖凝膠色譜介質在含0.13 mol/L氯化鈉的20 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中分離抗體與白蛋白混合溶液的色譜圖。圖中1為含1.0mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH8.0)的洗脫峰;2為含50%乙二醇的20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH 5.0)的洗脫峰;3為20mmol/LNaAc-HAc緩沖液(pH 4.0)的洗脫峰; 4為0.1mol/LHCl的洗脫峰。
圖4為本發(fā)明實施例1所制備的瓊脂糖凝膠色譜介質從成牛血清中分離抗體的色譜 圖。其中l(wèi)為20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH5.5)的洗脫峰;2為20mmol/L NaAc-HAc 緩沖液(pH5.0)的洗脫峰;3為20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH4.5)的洗脫峰;4為20mmol/L NaAc-HAc緩沖液(pH4.0)的洗脫峰;5為0.1 mol/L鹽酸的洗脫峰。
具體實施例方式
下面的實例將對本發(fā)明的方法予以進一步的說明。 實施例1
稱取1.0g經砂濾漏斗沖洗抽干、平均粒徑為90 nm的瓊脂糖凝膠介質Sepharose CL-6B 置于50mL錐形瓶中后,依次加入0.2mL 二甲基亞砜,0.5mL 4mol/L氫氧化鈉溶液和0.3mL 烯丙基溴;混合均勻后,凝膠懸浮液置于水浴搖床在25"C下反應24小時,得到帶有烯丙 基的Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠介質。烯丙基色譜介質以去離子水沖洗除去游離的烯丙 基溴。烯丙基色譜介質的烯丙基修飾密度為200 pmol/mL。
稱取1.0 g烯丙基色譜介質置于4mL體積比為1:3的二甲基亞砜和水的混合溶液中; 然后,加入0.6gN-溴代琥珀酰亞胺,經充分混勻并置于水浴搖床在25'C下反應1小時; 反應后的介質經去離子水沖洗和抽干處理后,置于1.2mL 二甲基亞砜溶液中,溶液中4(咪 唑-l-基)苯胺的含量為0.8 mmol;用2mol/L的氫氧化鈉將溶液pH調節(jié)至12,置于50°C
水浴搖床中反應24小時。得到的瓊脂糖凝膠介質用去離子水、體積濃度25%乙醇-水溶液 和0.5mol/L氯化鈉溶液交替沖洗干凈,即可得到用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜 介質,色譜介質中4 (咪唑-l-基)苯胺偶聯(lián)密度為90pmol/mL。 實施例2
稱取1.0g經砂濾漏斗沖洗抽干、平均粒徑為90 nm的瓊脂糖凝膠介質Sepharose CL-6B 置于50mL錐形瓶中后,依次加入0.2mL二甲基亞砜,0.5mL4mol/L氫氧化鈉溶液和0.3mL 烯丙基溴;混合均勻后,凝膠懸浮液置于水浴搖床在25r下反應24小時,得到含烯丙基 的Sepharose CL-6B瓊脂糖凝膠介質。烯丙基色譜介質以去離子水沖洗除去游離的烯丙基 溴。烯丙基色譜介質的烯丙基修飾密度為200 mol/mL。
稱取1.0g烯丙基色譜介質置于4mL體積比為1:3的二甲基亞砜和水的混合溶液中; 然后,加入0.5gN-溴代琥珀酰亞胺,經充分混勻并置于水浴搖床在25'C下反應1小時; 反應后的介質經去離子水沖洗和抽干處理后,置于1.2mL二甲基亞砜溶液中,溶液中3-(咪 唑-l-基)苯胺的含量為0.5 mmol;用2mol/L的氫氧化鈉將溶液pH調節(jié)至10,置于37°C 水浴搖床中反應24小時。得到的瓊脂糖凝膠介質用去離子水、體積濃度25%乙醇-水溶液 和0.5mol/L氯化鈉溶液交替沖洗干凈,即可得到用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜 介質,色譜介質中3-(咪唑-l-基)苯胺偶聯(lián)密度為32 u mol/mL。 實施例3
實施例l中N-溴代琥珀酰亞胺加入量1.2 g,溶液中4-(咪唑-l-基)苯胺的含量提高 到1.6 mmol;其他條件不變的情況下,可得到用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介 質中4-咪唑-l-基)苯胺偶聯(lián)密度為123umol/mL。 實施例4
實施例2中N-溴代琥珀酰亞胺加入量1.8g,溶液中3-(咪唑-l-基)苯胺的含量提高到 1.5 mmol;其他條件不變的情況下,可得到用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質中 3-(咪唑-l-基)苯胺偶聯(lián)密度為73 P mol/mL。 實施例5
取1.0 mL實施例1制備的色譜介質裝填于TricornTM5/50色譜柱中,分別用含有不同 濃度氯化鈉(0、 0.2、 0.5、 lmol/L)的20mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)平衡后,以迎頭分 析模式上樣考察免疫球蛋白和牛血清白蛋白的動態(tài)吸附量(在10%穿透點下計算的動態(tài) 吸附量)。結果顯示,免疫球蛋白的動態(tài)吸附量介于36-55mg/mL柱體積(如圖1所示); 而牛血清白蛋白的動態(tài)吸附量分別為53.4、 27.2、 7.4、 3.8mg/mL柱體積,隨離子強度的 增加吸附量顯著下降。 實施例6
配制免疫球蛋白濃度為1 mg/mL、牛血清白蛋白濃度為4 mg/mL的蛋白質混合溶液
10mL。色譜柱經含0.5 mol/L氯化鈉的20 mmol/L磷酸緩沖液(pH8.0)平衡后,以迎頭 分析模式進樣直至穿透;色譜柱依次用平衡緩沖液和含50%乙二醇20mmol/L的 NaAc-HAc緩沖液(pH5.0)洗脫,免疫球蛋白收率為80%,經聚丙烯酰胺電泳分析,該產品 的純度為98% (如圖2所示)。 實施例7
分別稱取10 mg免疫球蛋白和40 mg牛血清白蛋白溶于10 mL含0.13mol/L氯化鈉的 磷酸緩沖液(pH7.4)中;色譜柱用經含0.13mol/L氯化鈉的磷酸緩沖液(pH7.4)平衡后, 連續(xù)進樣直至穿透;然后,依次采用樣品緩沖液和含lmol/L氯化鈉的磷酸緩沖液(pH7.4) 沖洗色譜柱,洗脫吸附于色譜柱上的白蛋白;最后,經含50%乙二醇的20mmol/L的 NaAc-HAc緩沖液(pH5.0)洗脫,免疫球蛋白收率為70%,經聚丙烯酰胺電泳分析,該產品 的純度為95% (如圖3所示)。 實施例8
原料液為標準成牛血清,其中免疫球蛋白含量約為2.15% (電泳分析)。用含有氯化 鈉的磷酸緩沖液分別調節(jié)成牛血清的離子強度至40-50mS/cm和溶液的pH值至8.0;用0.22 ^m的濾膜過濾后,取20mL此原料液進樣,流出液中的主要成分是白蛋白和一些雜蛋白, 這說明所發(fā)明的色譜介質能夠選擇性吸附免疫球蛋白G;在pH4.5條件下洗脫,經聚丙烯 酰胺電泳分析,該產品的純度為80%,沒有檢測到白蛋白被洗脫,表明所發(fā)明的色譜介質: 能夠有效地排斥白蛋白的共吸附。
權利要求
1.一種用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質,其特征在于,該色譜介質是在平均粒徑為30-300μm的瓊脂糖凝膠顆粒的介質表面偶聯(lián)烯丙基的間隔臂,在間隔臂的末端偶聯(lián)咪唑和苯的雙環(huán)化合物D為介質的配基,色譜介質的結構表達形式如下id="icf0001" file="S2007100595765C00011.gif" wi="45" he="33" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中,咪唑和苯的雙環(huán)化合物D結構式如I式所示id="icf0002" file="S2007100595765C00012.gif" wi="48" he="34" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中R3、R4、R5、R6、R7中的一個基團必為氨基或甲基氨,其余的基團及R1、R2為氫原子和含有1-4個碳原子的短鏈烷烴一種。
2. 按權利要求l所述的用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質,其特征在于, 咪唑和苯的雙環(huán)化合物D選自2-(咪唑-l-基)苯胺、4-(咪唑-1-基)苯胺、3-(咪唑-1-基) 苯胺、4-咪唑-1-基-2-甲基-苯胺、4-咪唑-1-基-苯甲胺、2-咪唑-1-基-苯甲胺和3-甲基 -4-(咪唑-1-基)苯胺。
3. —種制備權利要求1所述的用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質的方法, 其特征在于包括以下過程1).介質的烯丙基化反應將平均粒徑為30-300 pm的瓊脂糖凝膠顆粒的介質,加入二甲基亞砜中形成介質的懸 浮液,二甲基亞砜的體積用量為介質體積量的0.05-2倍,繼而向介質懸浮液中加入體積用 量為介質體積量的0.05-1倍、濃度為0.5-6 mol/L氫氧化鈉溶液,混合均勻,制得混合懸 浮液,再向混合懸浮液中加入體積用量為介質體積量的0.02-1倍的烯丙基溴后,置于4-50 。C的恒溫水浴中活化3-36小時,之后用去離子水沖洗介質至無游離烯丙基溴,制得含烯丙基的色譜介質;2) .介質的活化反應將烯丙基色譜介質加入到二甲基亞砜和水的體積比為0. 1-4的混合溶液中,二甲基亞 砜和水的混合溶液的體積用量為烯丙基色譜介質體積量的1-8倍,再向二甲基亞砜和水及 烯丙基色譜介質的懸浮液中按每毫升烯丙基色譜介質加入0. 05-2g N-溴代琥珀酰亞胺后, 將該懸浮液置于15-50"C水浴中反應0. 3-5小時,反應后以去離子水沖洗介質制得活化色 譜介質;3) .活化介質的配基偶聯(lián)按每克活化色譜介質用雙環(huán)化合物D為0. 05-2 mmol標準計,再將活化色譜介質懸浮 于含有雙環(huán)化合物D的二甲基亞砜的反應液中,反應液的體積用量為活化色譜介質體積量 的0.2-5倍,反應液的pH值為9.0-13.0,再將該懸浮有活化色譜介質的反應液置于 25-60° C恒溫水浴中,經3-36小時進行偶聯(lián)反應,偶聯(lián)反應后的偶聯(lián)配基介質以去離子 水、體積濃度25%乙醇-水溶液和0.5mol/L的氯化鈉溶液進行交替沖洗,得到用于免疫 球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質。
4.按權利要求3所述的用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜介質的制備方法, 其特征在于,介質烯丙基化過程,采用的二甲基亞砜的體積用量為介質體積量的0.1-0.7 倍,氫氧化鈉溶液的濃度為1-5 mol/L,體積用量為介質體積量的0.2-0.8倍,烯丙基溴 的體積用量為介質體積量的0.05-0.5倍;上述的介質活化反應過程,采用的混合溶液中 二甲基亞砜和水的體積比為0.3_1.2,該混合溶液體積用量為烯丙基色譜介質體積量的 3-6倍,混合溶液中N-溴代琥珀酰亞胺按每毫升烯丙基色譜介質用量為0. 1-lg比例加入; 上述的介質偶聯(lián)配基過程,偶聯(lián)懸浮反應液中雙環(huán)化合物D的用量按每克活化色譜介質用 量為0.3-1.0 mmol加入,偶聯(lián)懸浮反應液二甲基亞砜體積用量為活化色譜介質體積量的 1-3倍;反應液的pH值10. 0-13. 0,反應時間為15-30小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于免疫球蛋白類蛋白質分離純化的色譜及其制備方法,屬于用于分離純化免疫球蛋白的色譜介質的制備技術。該色譜介質為間隔臂末端偶聯(lián)含有咪唑基團和苯環(huán)的雙環(huán)化合物分子作為色譜介質配基。其制備方法為采用烯丙基色譜介質與N-溴代琥珀酰亞胺的溴化醇化反應獲得活化色譜介質,該活化介質在二甲基亞砜溶液中與雙環(huán)化合物中的氨基反應完成配基的偶聯(lián)。該色譜介質在離子強度0.02-2.0mol/L的范圍內對抗體均有較高的動態(tài)吸附量,直接用于料液中抗體的回收;同時介質具有更溫和的洗脫條件;可用于從血清、腹水、細胞培養(yǎng)上清液或其它含有抗體的料液中純化抗體。該色譜介質在抗體制備過程中具有廣闊的應用前景。
文檔編號B01J20/281GK101185881SQ20071005957
公開日2008年5月28日 申請日期2007年9月12日 優(yōu)先權日2007年9月12日
發(fā)明者史清洪, 彥 孫, 姝 白, 征 程, 董曉燕 申請人:天津大學
網友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1
神木县| 隆安县| 余江县| 西峡县| 呼玛县| 乌鲁木齐市| 新平| 互助| 富锦市| 安龙县| 东兴市| 丹阳市| 隆昌县| 定日县| 东辽县| 平武县| 乐山市| 贵州省| 平远县| 诏安县| 保靖县| 杭州市| 克什克腾旗| 洛浦县| 迁安市| 中卫市| 彭泽县| 新干县| 夏津县| 苍南县| 河西区| 武功县| 奈曼旗| 当涂县| 沧源| 上思县| 花垣县| 凯里市| 德昌县| 大邑县| 莱阳市|