專利名稱：一種用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磷酸化肽段的分離純化，具體的說是一種用于富集磷酸化 肽段的聚合物材料的制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)的鑒定是目前蛋白組學(xué)研究中重要挑戰(zhàn)之一，磷 酸化修飾是蛋白翻譯后最重要的修飾之一。因?yàn)榭赡娴牡鞍琢姿峄揎椃?應(yīng)在細(xì)胞的信號傳導(dǎo)，新陳代謝等方面調(diào)節(jié)著蛋白的活性功能。最近，質(zhì) 譜技術(shù)在蛋白磷酸化的定性中，已經(jīng)發(fā)展成為重要的工具之一。在磷酸化 蛋白酶解產(chǎn)物的磷酸化肽段質(zhì)譜分析中，由于酶解產(chǎn)物中存在大量的非磷 酸化肽段，這些肽段在離子化過程中產(chǎn)生的離子信號會淹沒磷酸化肽段的 離子信號，另一方面因?yàn)榱姿峄亩卧谫|(zhì)譜檢測中相對較低的離子化效率， 這些因素導(dǎo)致了磷酸化肽段在質(zhì)譜中很難被檢測。從磷酸化蛋白的酶解混 合物中分離和富集磷酸化肽段是目前進(jìn)行磷酸化研究的比較理想的方法， 也是成功實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜分析最關(guān)鍵的一步。為了提高對磷酸化肽段的檢測，親 和技術(shù)被應(yīng)用到從復(fù)雜的混合樣品中純化和富集磷酸化肽段。最常用的親
和技術(shù)是固定化金屬離子螯合親和色譜(IMAC)，磷酸肽在IMAC上的保留 是基于其與固定相的螯合離子之間的螯合作用。常用的金屬離子是鐵(Fe,
和鎵(Ga3、 一般利用亞氨基二乙酸(IDA)為螯合基團(tuán)將金屬離子固載在 色譜介質(zhì)上。雖然基于鐵和鎵的IMAC很常用，但是其特異性不強(qiáng)， 一些 酸性肽也會保留從而干擾磷酸肽的檢測。
基于利用鋯離子和磷酸基團(tuán)之間的強(qiáng)烈相互作用，最近我們發(fā)展 出了基于磷酸酯鋯的新IMAC方法(Zr"-IMAC)。與常規(guī)IMAC相比， 該方法對磷酸化肽有更好的特異性。不同于 一 般的IMAC,在Zr4+-IMAC 中所用的螯合基團(tuán)也是磷酸基團(tuán)。在使用中首先將鋯離子固載于磷酸基 團(tuán)修飾的介質(zhì)表面上形成磷酸酯鋯表面，磷酸化肽由于其磷酸基團(tuán)與 鋯離子之間的強(qiáng)相互作用而獲得特異性保留。為了制備這種帶有磷酸基 團(tuán)的色譜吸附材料，需要對材料表面進(jìn)行改性，這需要多步化學(xué)反應(yīng)，因 此比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本發(fā)明提供了一種更為簡單的制備這種材料的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于富集磷酸化肽段的吸附材料的制備方 法。該方法利用帶磷酸基團(tuán)的單體進(jìn)行聚合反應(yīng)形成帶磷酸基團(tuán)的聚合物， 該聚合物敖合Zr"后，可用于磷酸化肽的高特異性富集。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制備方法，采用帶有烯鍵和磷酸基團(tuán)的化合物單體，進(jìn)行聚合反應(yīng)，形成磷酸基團(tuán)聚合物，該材料經(jīng) 與鋯離子作用后生成磷酸酯鋯基團(tuán)，可用于富集磷酸化肽段等帶有磷酸基
團(tuán)白勺化合物。
所述帶有烯鍵和磷酸基團(tuán)的化合物具有如式(I)結(jié)構(gòu)，
<formula>formula see original document page 4</formula>
(i)
R為CH2、 CH2CH2、 CH2CH2CH2之一，磷酸基團(tuán)以磷酸酯鍵存在于 單體中，為磷酸一酯。 具體過程為，
1) 以采用帶有烯鍵和磷酸基團(tuán)的化合物為功能單體、亞甲基雙丙烯酰 胺作為交聯(lián)劑，加入有機(jī)致孔劑，形成反應(yīng)物料，進(jìn)行熱引發(fā)聚合反應(yīng)， 形成磷酸基團(tuán)聚合物；
功能單體與交聯(lián)劑的質(zhì)量比為75-85: 55-65，致孔劑的加入量為反應(yīng) 物料體積的75~85%;反應(yīng)溫度為50 80 °C;
2) 將磷酸基團(tuán)聚合物與10-lOOmM鋯離子溶液接觸，生成磷酸酯鋯基 團(tuán)，其可用于富集磷酸化肽段或帶有磷酸基團(tuán)的化合物。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)
本發(fā)明利用帶磷酸酯基團(tuán)的單體進(jìn)行聚合反應(yīng)直接形成帶磷酸基團(tuán)的 聚合物，其聚合物材料可以制備成整體柱模式，也可以制備成顆粒狀態(tài)。
該方法通過聚合反應(yīng)的方法直接制備出帶有磷酸基團(tuán)的吸附材料，不 用對材料進(jìn)行額外的化學(xué)反應(yīng)，因而具有簡單、方便的特點(diǎn)。


圖1為單體2—(甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯與交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰 胺聚合反應(yīng)的化學(xué)表達(dá)式。
圖2為聚合物吸附材料富集和檢測磷酸肽的過程。
圖3為聚合物整體材料對磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。
圖4為聚合物整體材料對磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。
圖5為聚合物顆粒材料對磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。
圖6為聚合物顆粒材料對磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明通過利用帶磷酸酯基團(tuán)的單體與交聯(lián)劑聚合反應(yīng)生成帶有磷酸基團(tuán)的聚合物，該聚合物敖合21"4+后可用于磷酸化肽的富集。為了制備聚合 物材料，首先需要配制聚合物反應(yīng)液。單體和交聯(lián)劑是反應(yīng)液的主要成份， 它們發(fā)生聚合反應(yīng)后形成聚合物骨架。為了調(diào)節(jié)聚合物的物理化學(xué)性質(zhì)， 可以使用多種單體，但其中必須包括一種帶有磷酸基團(tuán)的單體。多孔材料 有更大的表面積，因此有更高的吸附容量。為了制備多孔的聚合物，需要 在反應(yīng)液中加入一定比例的致孔劑。致孔劑是一些有機(jī)溶劑，它們不參與 聚合反應(yīng)，在聚合反應(yīng)發(fā)生后它們所占據(jù)的空間將形成孔。通過調(diào)節(jié)致孔 劑在反應(yīng)液中的比例可以很方便的調(diào)節(jié)聚合物中孔的大小和機(jī)械強(qiáng)度。此 外， 一般還需要加入少量的引發(fā)劑來引發(fā)聚合反應(yīng)。獲得帶有磷酸基團(tuán)的
聚合物后，將聚合物浸泡在Zr"的溶液(如ZrOCl2溶液)中，Zr"離子由于與 聚合物上的磷酸基團(tuán)有強(qiáng)相互作用而固載在聚合物材料上，形成磷酸酯鋯 修飾的表面。磷酸酯鋯修飾的聚合物材料可以用于選擇性提取蛋白質(zhì)酶解 液中的磷酸肽。
單體2—(甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯與交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺聚合 反應(yīng)生成的聚合物具有很好的親水性，因此非特異性很小，是親和色譜良 好的載體。以下兩實(shí)施例均采用上述體系，但本發(fā)明并不局限于上述體系。
實(shí)施例l聚合物整體柱的制備
整體柱是一種特殊的液相色譜柱，它是將聚合物反應(yīng)液灌入柱管中通 過原位聚合的方法形成多孔的、連續(xù)的聚合物。聚合物整體柱由于有很多 通孔而柱壓很低，由于對流傳質(zhì)而傳質(zhì)阻力很小，非常適合用于樣品預(yù)處 理。本實(shí)施例制備了帶磷酸基團(tuán)的聚合物整體毛細(xì)管柱并將其用于磷酸肽 的富集。
1) 毛細(xì)管預(yù)處理
首先用0.1M NaOH溶液沖洗毛細(xì)管空柱1 h,再用去離子水沖洗毛細(xì) 管至流出液體pH值為7.0,然后用甲醇溶液沖洗毛細(xì)管柱10min,用氮?dú)獯?干。往毛細(xì)管中注入甲醇與甲基丙烯酰氧丙基一三甲氧基硅烷的混合物。 在20度至70度溫度下反應(yīng)5—24小時(shí)。然后用甲醇及水沖洗。最后用氮 氣歡干待用。
2) 聚合物整體柱的制備
以2— (甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯為功能單體，亞甲基雙丙烯酰胺 為交聯(lián)劑，十二醇，二甲基亞砜和N,N-二甲基甲酰胺為致孔劑，單體、交 聯(lián)劑、致孔劑按質(zhì)量百分比分別為13%、 10%和77%均勻混合，所加引發(fā) 劑的用量為聚合物單體用量的1%，將混合液用超聲振蕩15min后，將反應(yīng) 液吸入已經(jīng)預(yù)處理過的空毛細(xì)管中，將毛細(xì)管的兩端用橡膠小塞封口并浸 于6(TC水浴中反應(yīng)8-24h。反應(yīng)完成后，以甲醇為流動(dòng)相，用液相色譜泵 沖洗毛細(xì)管柱約2h，去除床層內(nèi)的致孔劑、殘留反應(yīng)試劑以及反應(yīng)產(chǎn)生的 一些低聚合度物質(zhì)；
如圖1所示，單體、引發(fā)劑及致孔劑在反應(yīng)開始前構(gòu)成穩(wěn)定的均相反應(yīng)體系，當(dāng)溫度升高到一定值時(shí)，引發(fā)劑分解產(chǎn)生自由基引發(fā)聚合反應(yīng)。 當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到一定的程度時(shí)，聚合物鏈從溶液中沉降出來形成穩(wěn)定的分散
體系，經(jīng)進(jìn)一步聚合、交聯(lián)硬化形成直徑約為1 pm左右的小顆粒。這些顆
粒以化學(xué)鍵互相連接形成較大的"簇"，這些"簇"最終堆積形成一個(gè)完整的聚 合物體系。由于所采用的單體，2— (甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯，有一個(gè) 磷酸基團(tuán)，該基團(tuán)在聚合反應(yīng)過程中不發(fā)生反應(yīng)，從而使產(chǎn)生的聚合物材 料表面帶有磷酸基團(tuán)。該材料敖合鋯離子后，形成對磷酸肽有特異性吸附 作用的磷酸酯鋯吸附材料。
3) 鋯離子的固載
用20mM二氯氧鋯溶液沖洗毛細(xì)管，使聚合物柱床上的磷酸基團(tuán)與鋯 形成穩(wěn)定的配合物，然后用pH為2的甲酸溶液沖洗，備用。
4) 磷酸肽的選擇性富集
樣品溶液的制備1 mg的a-酪蛋白和|3-酪蛋白的分別溶解在lmL, 50 mM的碳酸氫胺溶液中(pH8.2)，按照與胰蛋白酶的質(zhì)量比40:1的比例加 入胰蛋白酶進(jìn)行酶解反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為16h,酶解溫度控制在37t:。獲得 的蛋白酶解溶液置于-3(TC冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 磷酸化肽段的富集用甲酸調(diào)節(jié)-酪蛋白酶解液的pH為2，取2pmol含 50%乙腈的酶解液通過15cm的整體柱，依次用含200 mM氯化鈉pH 2的 甲酸溶液，pH2的甲酸溶液，沖洗毛細(xì)管，最后用pH 10的氨水溶液沖洗 毛細(xì)管，使富集的磷酸化肽段洗脫到離心管中，冷凍干燥后，經(jīng)基質(zhì)輔助 激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI)檢測，獲得的譜圖見圖3，圖中 序號1的[M+H;T為2061.83，其所對應(yīng)的肽段上帶有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)；
序號2的[M+H]+為2352.85，其所對應(yīng)的肽段上帶有4個(gè)磷酸
化位點(diǎn)；
序號3的[M+H廣為2966.16，其所對應(yīng)的肽段上帶有4個(gè)磷酸
化位點(diǎn)；
在圖3中的強(qiáng)峰均為磷酸肽的峰，這說明磷酸肽在磷酸酯鋯修飾的整 體柱中獲得了特異性富集。用整體柱富集ot-酪蛋白酶解液樣品同-酪 蛋白，所獲得的譜圖見附圖4，
圖中序號1的[M+Hr為1237.5，其所對應(yīng)的肽段上帶有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)； 序號2的,+司+為1331.53，其所對應(yīng)的肽段上帶有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)； 序號3的[M+H]"為1411.5，其所對應(yīng)的肽段上帶有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)； 序號4的[M+H]"為1466.61，其所對應(yīng)的肽段上帶有1磷酸化位點(diǎn)； 序號5的[M+Hf為1539，其所對應(yīng)的肽段上帶有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)； 序號6的[M+Hf為1594.7，其所對應(yīng)的肽段上帶有1磷酸化位點(diǎn)； 序號7的[M+Hf為1660.79，其所對應(yīng)的肽段上帶有1磷酸化位點(diǎn)； 序號8的[M+H獷為1832.83，其所對應(yīng)的肽段上帶有1磷酸化位點(diǎn); 序號9的[M+H廣為1847.69，其所對應(yīng)的肽段上帶有1磷酸化位點(diǎn)；序號10的[]^+司+為1927.69，其所對應(yīng)的肽段上帶有2酸化位點(diǎn)； 序號11的[M+Hf為1944，其所對應(yīng)的肽段上帶有2個(gè)磷酸化位點(diǎn)； 序號12的[]\4+司+為1951.95，其所對應(yīng)的肽段上帶有1磷酸化位點(diǎn); 序號13的[]\4+司+為2079.04，其所對應(yīng)的肽段上帶有1磷酸化位點(diǎn); 序號14的[M+Hf為2619.04，其所對應(yīng)的肽段上帶有4磷酸化位點(diǎn); 序號15的[14+司+為2720.91，其所對應(yīng)的肽段上帶有5磷酸化位點(diǎn); 序號16的[M+H]+為3008.01，其所對應(yīng)的肽段上帶有4磷酸化位點(diǎn)； 序號17的[M+Hf為3087.99，其所對應(yīng)的肽段上帶有5磷酸化位點(diǎn)； 很明顯用該整體柱處理后磷酸化肽獲得很好的富集。 本發(fā)明制備的材料主要用于高特異性的富集磷酸肽，由于磷酸酯鋯與 磷酸基團(tuán)有強(qiáng)相互作用，其也可以用于富集其它含磷酸基團(tuán)的化合物；如 圖2所示，其給出了利用本吸附材料富集和檢測磷酸肽的過程。從單個(gè)蛋 白質(zhì)的酶解液中純化出來的磷酸肽可以直接使用MALDI質(zhì)譜儀來分析，而 對于復(fù)雜樣品如蛋白質(zhì)組樣品中提純出來的磷酸化肽需要利用液質(zhì)聯(lián)用和 數(shù)據(jù)庫檢索來鑒定其中的磷酸化肽。
實(shí)施例2 聚合物顆粒的制備
絕大多數(shù)液相色譜柱、固相萃取柱都使用顆粒狀填料如瓊脂糖顆粒、 有機(jī)聚合物顆粒、無機(jī)物顆粒作為固定相，本實(shí)施例制備了帶磷酸基團(tuán)的 聚合物顆粒并將其用于磷酸肽的富集。
1)聚合物顆粒的制備 把聚合反應(yīng)液(配比同實(shí)施例1)裝于離心管中，封口并浸于60°C水 浴中反應(yīng)8-24h。反應(yīng)完成后，研磨成顆粒用甲醇浸泡除去致孔劑、殘留反 應(yīng)試劑以及反應(yīng)產(chǎn)生的一些低聚合度物質(zhì)。
2) 鋯離子的固載
制備的顆粒浸泡在20mM二氯氧鋯溶液，振蕩15分鐘，離心，收集沉 積物，得到磷酸酯鋯聚合物顆粒
3) 磷酸化肽段的富集
取2 pmol -酪蛋白酶解液放入含有0.4 mg顆粒的100mM氯化鈉，50 X乙腈pH2的甲酸溶液中，振蕩，離心后，棄去上清液，用200mM氯化 鈉pH 2的甲酸溶液洗滌沉積物，離心后，棄去上清液，用pH2的甲酸溶 液洗滌沉積物，離心后，棄去上清液，最后用pH 10的氨水溶液處理沉積 物，離心后收集上清液，冷凍干燥后，用MALDI分析，譜圖見附圖5。 使用相同的方法用于-酪蛋白酶解液中磷酸化肽段的富集，所獲得的 MALDI譜圖見附圖6。從譜圖上看，顯著的峰都是磷酸肽的峰，說明 磷酸肽在聚合物顆粒上有高特異性的富集。
權(quán)利要求
1. 一種用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制備方法，其特征在于采用帶有烯鍵和磷酸基團(tuán)的化合物單體，進(jìn)行聚合反應(yīng)，形成磷酸基團(tuán)聚合物，該材料經(jīng)與鋯離子作用后生成磷酸酯鋯基團(tuán)，可用于富集磷酸化肽段等帶有磷酸基團(tuán)的化合物。
2. 按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述帶有烯鍵和 磷酸基團(tuán)的化合物具有如式(I)結(jié)構(gòu)，<formula>formula see original document page 2</formula>(i)R為CH2、 CH2CH2、 CH2CH2CH2之一，磷酸基團(tuán)以磷酸酯鍵存在 于單體中，為磷酸一酯。
3. 按照權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于 具體過程為，1) 以采用帶有烯鍵和磷酸基團(tuán)的化合物為功能單體、亞甲基雙丙烯酰 胺作為交聯(lián)劑，加入有機(jī)致孔劑，形成反應(yīng)物料，進(jìn)行熱引發(fā)聚合反應(yīng)， 形成磷酸基團(tuán)聚合物；功能單體與交聯(lián)劑的質(zhì)量比為75-85: 55-65，致孔劑的加入量為反應(yīng) 物料體積的75~85%;反應(yīng)溫度為50 8(TC;2) 將磷酸基團(tuán)聚合物與10-lOOmM鋯離子溶液接觸，生成磷酸酯鋯基 團(tuán)，其可用于富集磷酸化肽段或帶有磷酸基團(tuán)的化合物。
4. 按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述致孔劑為十二 醇，二甲基亞砜和N,N-二甲基甲酰胺，十二醇、二甲基亞砜和N,N-二甲基 甲酰胺的體積比為18-22: 25 -30: 3-7。
5. 按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于引發(fā)劑為偶氮二異 丁腈、正丁基鋰或硫酸銨或硫代硫酸鈉，引發(fā)劑的加入量為功能單體與交 聯(lián)劑總重量的0.1~5%。
全文摘要
本發(fā)明涉及磷酸化肽的高選擇性富集，具體的說是一種用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制備方法。本方法采用帶有磷酸基團(tuán)的單體進(jìn)行聚合反應(yīng)直接形成帶有磷酸基團(tuán)的聚合物材料。該材料用含鋯離子的溶液作用后生成磷酸酯鋯基團(tuán)，使其可以從復(fù)雜的蛋白酶解液中特異地富集和純化磷酸肽。本發(fā)明采用聚合的方法直接合成出含功能基團(tuán)的聚合物材料，無需額外化學(xué)改性，具有簡單方便的特點(diǎn)。
文檔編號B01J20/281GK101412778SQ20071015752
公開日2009年4月22日 申請日期2007年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月17日
發(fā)明者葉明亮, 周厚江, 靖 董, 鄒漢法 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所