專利名稱：常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)及其在葛根素糖基化衍生物分離制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種層析柱系統(tǒng)，具體是常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)及其在葛根素糖基化衍生 物分離制備中的應(yīng)用。
技術(shù)背景葛根素(puerarin) ， 4'，7-二羥基-8-"-D-葡萄糖基異黃酮(8-C-y9-Z)-Glucopyranosyl-7 ，4'-hydroxy-Isoflavone)(結(jié)構(gòu)如式A),臨床上被廣泛應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)疾病(如心絞痛、 心肌梗死、心律失常、冠心病、心力衰竭、椎-基底動(dòng)脈供血不足、高黏血癥、高血壓、腦血 栓、腦水腫等)、糖尿病、眼底疾病(如視網(wǎng)膜動(dòng)脈栓塞、單純性青光眼)、突發(fā)性耳聾、急性 酒精中毒、擬菊酯類農(nóng)藥中毒及腫瘤的治療。但存在如下缺點(diǎn)1)體內(nèi)消除速率快，臨床使 用劑量較大，口服生物利用度低；2)水溶解度低，注射制劑大多含有助溶劑以增加制劑的穩(wěn) 定性，但助溶劑的使用易產(chǎn)生一定的毒副作用，致使用藥安全性降低。為了改善葛根素的水 溶性，進(jìn)而改善其藥理活性、提高其生物利用度，我們利用氧化微桿菌(M/cro6a"en'wm ox;^ww) CGMCC 1788所含糖基化酶對(duì)葛根素進(jìn)行糖基化修飾，獲得了葛根素-7-0-葡萄糖 苷(結(jié)構(gòu)如式B)。葛根素-7-O-葡萄糖苷水溶性明顯提高，在體內(nèi)存留時(shí)間延長(zhǎng)，血管舒張活性有所改善， 有望開(kāi)發(fā)成為新的葛根素藥物。但葛根素經(jīng)氧化微桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化后得到的轉(zhuǎn)化液成分復(fù) 雜，其中含有糖基化葛根素，葛根素，磷酸鹽，蔗糖，菌體代謝產(chǎn)物等。特別是葛根素與糖 基化葛根素結(jié)構(gòu)相似，分離比較困難。采用現(xiàn)有的葛根素純化常用的大孔吸附樹(shù)脂普通層析 柱層析法并不能有效地將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與葛根素相分離。 發(fā)明內(nèi)容為了有效提高層析柱的分離因素和塔板數(shù)，本發(fā)明提供了一種常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系
統(tǒng)，以有效增加層析柱的理論塔板數(shù)，結(jié)果顯示大大提高了層析的分離效率，從而達(dá)到了從 葛根素轉(zhuǎn)化液中分離制備糖基化葛根素的目的。本發(fā)明所述的常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)，其特征在于，在普通層析柱的后面，有一個(gè)可 拆卸的外接加長(zhǎng)層析柱，所說(shuō)的外接加長(zhǎng)層析柱，由柔性管材制成。在使用時(shí)，采用普通濕 法裝柱法向普通層析柱和外接加長(zhǎng)層析柱中分別裝填預(yù)處理好的樹(shù)脂。填充外接加長(zhǎng)層析柱 時(shí)，先將該柱從高處垂下使該柱伸展，分批裝填樹(shù)脂直到填滿自然沉降壓實(shí)，然后將外接加 長(zhǎng)層析柱盤(pán)旋起來(lái)備用。層析時(shí)，用平衡溶液將層析柱系統(tǒng)充分平衡后，將外接加長(zhǎng)層析柱 與普通層析柱分離，將含待分離物質(zhì)的混合物溶液先流過(guò)普通層析柱進(jìn)行吸附，然后用平衡 溶液洗滌普通層析柱去除未吸附物質(zhì)，將外接加長(zhǎng)層析柱接到普通層析柱出口處，用洗脫液 開(kāi)始洗脫，分部收集洗脫液并檢測(cè)，將相同洗脫峰的收集液合并。利用該法采用大孔吸附樹(shù) 脂分離葛根素糖基化衍生物混合液，用低濃度的乙醇梯度洗脫，可有效地將葛根素與糖基葛 根素相互分離，分離產(chǎn)物純度達(dá)到90%以上，產(chǎn)品回收率達(dá)到80%以上。上述常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)中，所說(shuō)的外接加長(zhǎng)層析柱是由一根柔性管材制成，其材 質(zhì)可以是聚乙烯，聚氯乙烯，聚丙烯等各種塑料管，也可以是乳膠管，硅膠管，橡膠管等， 但必須要有足夠的柔軟性，能夠隨意盤(pán)繞巻曲；其長(zhǎng)度至少要達(dá)到與外接加長(zhǎng)柱相連的普通 層析柱的2倍以上，實(shí)際長(zhǎng)度依據(jù)分離物質(zhì)需要確定；其直徑可與相連的普通層析柱相同， 也可比相連的普通層析柱略粗或略細(xì)。上述的常壓加長(zhǎng)兩段柱層析系統(tǒng)在裝填樹(shù)脂時(shí)，需要將普通層析柱和外接加長(zhǎng)層析柱分 開(kāi)，采用普通濕法裝柱法分別向普通層析柱和外接加長(zhǎng)層析柱填入預(yù)處理好的樹(shù)脂；填充外 接加長(zhǎng)層析柱時(shí)，先將該柱從高處垂下使柱充分伸展，分批裝填樹(shù)脂直到填滿自然沉降壓實(shí)， 然后將外接加長(zhǎng)層析柱盤(pán)旋起來(lái)備用。上述的常壓加長(zhǎng)兩段柱層析系統(tǒng)所裝填的樹(shù)脂可以是極性或非極性吸附劑，如硅膠，氧化鋁，大孔樹(shù)脂，活性炭，硅藻土；可以是疏水性吸附劑，如Phenyl-Sepharose;可以是離子 交換樹(shù)脂，如amberlite系列離子交換樹(shù)脂、dowex系列離子交換樹(shù)脂、duolite系列離子交換 樹(shù)脂，asmit系列離子交換樹(shù)脂、diaion系列離子交換樹(shù)脂、ionac系列離子交換樹(shù)脂、allassion 系列離子交換樹(shù)脂。上述的常壓加長(zhǎng)兩段柱層析系統(tǒng)在層析時(shí)，需要將外接加長(zhǎng)層析柱與普通層析柱分離， 將含待分離物質(zhì)的混合物溶液先流過(guò)普通層析柱進(jìn)行吸附，接著用平衡溶液洗滌普通層析柱 去除未吸附物質(zhì)后，再將外接加長(zhǎng)層析柱接到普通層析柱出口處，進(jìn)行洗脫分部收集。上述的常壓加長(zhǎng)兩段柱層析系統(tǒng)用于分離葛根素糖基化衍生物混合液時(shí)，向普通層析柱
和外接加長(zhǎng)層析柱內(nèi)所裝填的樹(shù)脂是大孔樹(shù)脂，平衡溶液是雙蒸水，洗脫溶液是5 — 30%的 乙醇溶液，或由0 — 15%乙醇與20—35%乙醇組成的乙醇梯度濃度溶液。本發(fā)明提供的常壓加長(zhǎng)兩段柱層析系統(tǒng)極大地增加了柱層析理論塔板數(shù)和分離效率，有 效地解決了糖基化葛根素與葛根素的分離工藝，并且具有制作簡(jiǎn)單、成本低廉、實(shí)用性強(qiáng)的 優(yōu)點(diǎn)。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。圖l.常壓加長(zhǎng)兩段柱層析系統(tǒng)示意圖。其中1、普通層析柱；2、外接加長(zhǎng)層析柱。 圖2葛根素糖基化衍生物層析圖譜(A)普通層析柱，(B)常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)圖3. HPLC分析圖譜，(A)葛根素轉(zhuǎn)化液，稀釋20倍。(B)峰I層析收集液。(C)峰II層析收集液。
具體實(shí)施方式
在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)，除非有另外說(shuō)明， 一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的 含義。下面結(jié)合具體的實(shí)施例，并參照數(shù)據(jù)進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說(shuō)明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。在以下的實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過(guò)程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法。所用試劑的來(lái)源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例1:如圖l，采用一根玻璃層析柱(50cmX2.5cml.D)作為普通層析柱l，外接加長(zhǎng)層析柱2由一根長(zhǎng)8米直徑1.5厘米的聚氯乙烯塑料軟管制成。將先后用lmol的鹽酸、lmol的氫氧化鈉、50%的乙醇、95。/。的乙醇處理過(guò)的AB-8型大孔樹(shù)脂浸泡在水中，進(jìn)行裝柱。將普通層析柱與外接加長(zhǎng)層析柱分別裝柱。普通層析柱的填充采用常規(guī)濕法裝柱法即可。外接加長(zhǎng)層析柱填裝時(shí)，先將外接加長(zhǎng)層析柱從高處垂下來(lái)，使外接加長(zhǎng)層析柱伸展，裝滿與普通層析柱相同的AB-8型大孔樹(shù)脂。然后使該柱繼續(xù)懸掛3小時(shí)，并使水不停地流過(guò)該柱，使樹(shù)脂壓實(shí)后，再次補(bǔ)滿樹(shù)脂。然后將外接加長(zhǎng)層析柱取下盤(pán)旋起來(lái)放到合適的地方。依次用細(xì)管將以下裝置連接梯度混合儀，蠕動(dòng)泵，普通層析柱，外接加長(zhǎng)層析柱，紫外檢測(cè)器，自動(dòng)部分收集器。用2000mL水流過(guò)該裝置，然后將普通層析柱與外接加長(zhǎng)層析柱分開(kāi)，將200ml葛根 素轉(zhuǎn)化液(其葛根異黃酮總濃度約為5mg/ml )經(jīng)過(guò)濾紙過(guò)濾后，流過(guò)普通層析柱，流速1.5mlmin"。然后用2000mL水流過(guò)普通層析柱，流速1.5 ml min—1，此時(shí)將普通層析柱與外接加長(zhǎng) 層析柱相連。用10%_25%乙醇線型梯度洗脫，75小時(shí)后換成30%乙醇繼續(xù)洗脫直到110小 時(shí)，1.5mlmin"流速。流出液用紫外檢測(cè)儀254nm波長(zhǎng)下檢測(cè)并記錄(圖2B.)。流出液用 自動(dòng)部分收集器收集。洗脫完成后合并相同分離峰組分。其中峰I收集了 1215ml，峰II收 集了 1575ml。用HPLC檢測(cè)每個(gè)收集峰和初始混合液，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)得到如下結(jié)果其 中峰I為糖基化葛根素，其純度97.9%濃度為373pg m1—1，回收率88.1%。峰II為葛根素， 其純度為98.7%，濃度為246昭mr1，回收率為87.0%，(圖3)。同時(shí)我們也用普通層析柱做 了對(duì)照實(shí)驗(yàn)，其分離情況見(jiàn)圖2A。實(shí)施例2.加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)連接及裝柱方法同實(shí)施例1。用2000ml水流過(guò)該裝置， 然后將普通層析柱與外接加長(zhǎng)層析柱分開(kāi)，將200ml葛根素轉(zhuǎn)化液(其葛根異黃酮總濃度約 為5mg/ml )經(jīng)過(guò)濾紙過(guò)濾后，流過(guò)普通層析柱，流速2mlmin—1。然后用2000mL水流過(guò)普 通層析柱，流速2mlmirT1，此時(shí)將普通層析柱與外接加長(zhǎng)層析柱相連。用20%乙醇洗脫，2ml min—'流速。流出液用紫外檢測(cè)儀254nm波長(zhǎng)下檢測(cè)并記錄。流出液用自動(dòng)部分收集器收集。 洗脫完成后合并相同分離峰組分。用HPLC檢測(cè)每個(gè)收集峰和初始混合液，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線比 對(duì)得到如下結(jié)果糖基化葛根素，其純度96.6%，回收率86%。葛根素，其純度為99.1%， 回收率為92%。實(shí)施例3.采用一根玻璃層析柱(75cmX3.5cml.D)作為普通層析柱，外接加長(zhǎng)層析柱 由一根長(zhǎng)10米，直徑2.4厘米的塑料軟管制成。層析柱的填充及層析柱系統(tǒng)的連接方法同實(shí) 施例l。用5升左右水流過(guò)該裝置，然后將普通層析柱與外接加長(zhǎng)層析柱分開(kāi)，將600ml葛 根素轉(zhuǎn)化液(其葛根異黃酮總濃度約為5mg/ml )經(jīng)過(guò)濾紙過(guò)濾后，流過(guò)普通層析柱，流速 約5mlmin—1。然后用約5升水流過(guò)普通層析柱，流速約5mlrain—1，此時(shí)將普通層析柱與外 接加長(zhǎng)層析柱相連。用20%乙醇洗脫，5 ml min"流速。流出液用紫外檢測(cè)儀254nm波長(zhǎng)下 檢測(cè)并記錄。流出液用自動(dòng)部分收集器收集。洗脫完成后合并相同分離峰組分，可達(dá)到以下 分離結(jié)果糖基化葛根素，其純度可達(dá)90.2%，回收率約為85%。葛根素，其純度可達(dá)90.6%， 回收率約為86%。本發(fā)明不限于這些公開(kāi)的實(shí)施方案，本發(fā)明將覆蓋在專利書(shū)中所描述的范圍，以及權(quán)利 要求范圍的各種變型和等效變化。
權(quán)利要求
1、一種常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)，其特征在于，在一根普通層析柱的后面，有一個(gè)可拆卸的外接加長(zhǎng)層析柱，所說(shuō)的外接加長(zhǎng)層析柱，由柔性管材制成。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)，其特征在于，所說(shuō)的柔性管材是塑 料管、乳膠管、硅膠管或橡膠管。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所說(shuō)的常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)，其特征在于，所說(shuō)的外接加長(zhǎng)層析 柱的長(zhǎng)度是普通層析柱的2倍以上。
4、 權(quán)利要求1所說(shuō)的常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)在葛根素糖基化衍生物分離制備中的應(yīng)用。
5、 權(quán)利要求4所說(shuō)的應(yīng)用，具體是在普通層析柱和外接加長(zhǎng)層析柱內(nèi)裝填大孔樹(shù)脂， 用適量水平衡常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)，然后將普通層析柱與外接加長(zhǎng)層析柱分開(kāi)；將過(guò)濾 后的葛根素轉(zhuǎn)化液流過(guò)普通層析柱使所含葛根素及其糖基化衍生物吸附到樹(shù)脂柱上；用適量 水流過(guò)普通層析柱洗去未吸附的雜質(zhì)；然后將普通層析柱與外接加長(zhǎng)層析柱相連，用5 — 30 %的乙醇溶液或由1一15%乙醇與20 — 35%乙醇組成的乙醇梯度濃度溶液洗脫；流出液分部 收集檢測(cè)，合并相同洗脫峰組分。分離產(chǎn)物糖基葛根素純度達(dá)到90%以上，產(chǎn)品回收率達(dá)到 80%以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)及其在葛根素糖基化衍生物分離制備中的應(yīng)用。所說(shuō)的常壓加長(zhǎng)兩段層析柱系統(tǒng)，是在一根普通層析柱后面，有一個(gè)可拆卸的外接加長(zhǎng)層析柱，所說(shuō)的外接加長(zhǎng)層析柱，由柔性管材制成。利用該系統(tǒng)分離葛根素糖基化衍生物混合液，可有效地將葛根素與糖基葛根素相互分離，分離產(chǎn)物純度達(dá)到90％以上，產(chǎn)品回收率達(dá)到80％以上。本發(fā)明提供的常壓加長(zhǎng)兩段柱層析系統(tǒng)極大地增加了柱層析理論塔板數(shù)和分離效率，有效地解決了糖基化葛根素與葛根素的分離工藝，并且具有制作簡(jiǎn)單、成本低廉、實(shí)用性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)B01D15/34GK101161325SQ20071019088
公開(kāi)日2008年4月16日 申請(qǐng)日期2007年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日
發(fā)明者丁娟芳, 叢曉東, 戴亦軍, 朱守創(chuàng), 生 袁 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)