專利名稱：：用于親合分析的結(jié)合性表面的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有不飽和的或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的支持物，包括具有用于親合分析的包含配體的結(jié)合性表面的支持物。本發(fā)明的方面尤其涉及包含生物素、或生物素以及生物素特異性的配體結(jié)合劑比如鏈霉抗生物素蛋白(SA)的結(jié)合性表面。提供了用于免疫測定的結(jié)合性表面，包括包含抗原或抗體或它們的片段的結(jié)合性表面。本發(fā)明進(jìn)一步的實施方式涉及封閉的固體支持物表面和分散的微粒。提供了用于制備并使用這些支持物的方法。
背景技術(shù)：
：結(jié)合性表面在多種應(yīng)用，例如，親合分析中被廣泛使用。典型地，通過最大化每單位固相支持物表面的表面面積上的配體結(jié)合劑量而制備出普通的結(jié)合性表面。盡管常規(guī)方法可以得到具有高密度配體結(jié)合劑的支持物表面，但簡單地最大化支持物表面上的配體結(jié)合劑的數(shù)量不會一成不變地提高結(jié)合性表面的性能。一些在親合分析中使用的普通結(jié)合性表面可以通過將配體結(jié)合劑直接涂敷到固相上、并且用牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白封閉固相而最大化結(jié)合力，該配體結(jié)合劑比如是抗體，或者是生物素特異性的配體結(jié)合劑比如SA。盡管這最大化結(jié)合性表面的抗原或生物素結(jié)合力，但各個抗體或生物素特異性的配體結(jié)合劑在結(jié)合性表面上很擁擠，沒有特定的定向。并且傳統(tǒng)的封閉策略不能必要地抑制或者減輕抗體或者生物素特異性的配體結(jié)合劑從結(jié)合性表面上脫落。另外，脫落能夠引起很弱的分析靈敏度(最佳以下的信噪比)、準(zhǔn)確度、精確性、穩(wěn)定性、或可制造性、或其組合。由于空間位阻，結(jié)合性表面的擁擠和隨機定向能夠降低結(jié)合性表面的結(jié)合效率或能力。因此，需要有改進(jìn)的結(jié)合性表面和組成、以及用于不依靠簡單地最大化結(jié)合性表面上的配體結(jié)合劑的密度而制備改進(jìn)的結(jié)合性表面的方法
發(fā)明內(nèi)容飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面；提供了用于制備不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法；并且提供了用于制備不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的成分的方法。本發(fā)明還提供了用于親合分析比如，例如，免疫測定的不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法和組成。在一個方面，本發(fā)明提供了用于制備用于免疫測定的不飽和的、或者不飽和的并且被定向的捕獲部分的方法和組合物，其中，由于結(jié)合至不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面，該捕獲部分是不飽和的、或者不飽和的并且被定向的。在一個特定的實施方式中，捕獲部分包含免疫球蛋白或其片段，其中，捕獲部分通過與固定在支持物連接物(coupler)上的配體結(jié)合而被固定在不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面上，其中，支持物連接物被固定在固相支持物上。在一個特定的實施方式中，免疫球蛋白或其片段被生物素化，生物素化的免疫球蛋白或其片段與生物素特異性的配體結(jié)合劑(生物素結(jié)合性部分)相連接，并且生物素特異性的配體結(jié)合劑與直接地或者通過支持物連接物而附接于支持物的生物素相連接。在一個特定的實施方式中，支持物連接物包含蛋白質(zhì)，并且固相支持物包含微粒。在另一個方面，本發(fā)明提供一種用于通過使用具有不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的支持物進(jìn)行免疫測定的方法，其中，該方法包括使用免疫球蛋白或其片段來捕獲分析物，其中免疫球蛋白或其片段是不飽和的、或者不飽和的并且被定向在結(jié)合性表面上。在各種實施方式中，免疫球蛋白或其片段的不飽和的、或者不飽和的并且被定向的性質(zhì)由結(jié)合性表面的不飽和的、或者不飽和的并且被定向的性質(zhì)所確定，因為免疫球蛋白或其片段被結(jié)合于該結(jié)合性表面。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種具有不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的支持物，其包含直接地或通過偶聯(lián)于支持物連接物間接地與支持物偶聯(lián)的配體，其中所述支持物連接物被偶聯(lián)于支持物。其中，配體的密度是約1.0X10's至約5.0X10—1微摩爾配體/每平方米支持物；或者約0.5X10'2至約2.0x10—1微摩爾配體/每平方米支持物；或約1.0乂10'2至約1.6xl0"微摩爾配體/每平方米支持物；或約1.0Xl(^至約2.0x10—1微摩爾配體海平方米支持物。作為另一種選擇，配體的密度是約0.5X10—4至約10X10"4微摩爾配體/每毫克(mg)微粒；或約1.0X1(T"至約5.5Xl(^微摩爾配體/每mg微粒。在各種實施方式中，支持物連接物以約1.2X10—z微摩爾/每平方米分析物支持物至約7.5X10—2微摩爾/每平方米分析物支持物的密度存在于分析物支持物上。在各種實施方式中，配體與配體結(jié)合劑相連接，其中，配體結(jié)合劑的密度是小于約0.4X10'z至小于約8xl(^微摩爾配體結(jié)合劑/每平方米支持物、或者其密度是約1.0乂10'2至約5.()乂10'2微摩爾/每平方米分析物支持物。本發(fā)明實施方式的目的在于使捕獲部分以約1.0X1(^微摩爾/每平方米分析物支持物至約2.0Xl()J微摩爾/每平方米分析物支持物的密度存在于分析物支持物上。在各種實施方式中，結(jié)合性表面還包括捕獲部分，其中，捕獲部分的密度是小于約2X10—3至小于約4X10—"微摩爾捕獲部分/每平方米支持物。在一個特定的實施方式中，配體(例如，生物素)的密度是約1.9乂10—2至約1.6X10"微摩爾配體/每平方米支持物，配體結(jié)合劑(例如，生物素結(jié)合性部分比如SA)的密度是約l.OX10—2至約5.0X10—2微摩爾/每平方米分析物支持物、或者約1.2乂10—2至小于約4.6乂10—2微摩爾配體結(jié)合劑/每平方米支持物，并且捕獲部分(例如，生物素化捕獲部分比如生物素化對分析物特異的抗體)的密度是約2.5X10-3至約1.4X10々微摩爾捕獲部分/每平方米支持物。在本發(fā)明的至少一種實施方式中，支持物連接物是任選的。在這樣的一個實施方式中，配體可以是生物素或其衍生物。在一個特定的實施方式中，配體包含生物素或其衍生物。在另一個特定的實施方式中，配體結(jié)合劑包含生物素結(jié)合性部分或其片段比如，例如抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin(卵白素)、SA的片段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin的片段、或者其混合物。在各種實施方式中，捕獲部分每含抗體、抗體的結(jié)合性片段、受體、受體配體、激素、激素受體、酶、酶的底物、單鏈的低聚核苷酸、單鏈的多聚核苷酸、雙鏈的低聚核苷酸、雙鏈的多聚核苷酸、抗原、肽或蛋白質(zhì)中的一種或多種。在各種實施方式中，配體通過支持物連接物與支持物偶聯(lián)，并且支持物連接物依次與支持物偶聯(lián)。在一個特定的實施方式中，支持物連接物包含蛋白質(zhì)。在一個特定的實施方式中，該蛋白質(zhì)是BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。在一個特定的實施方式中，支持物是微粒。在一個特定的實施方式中，結(jié)合性表面具有約1X10—z至約5Xl(T'微摩爾配體/每平方米支持物；或者作為另一種選擇，結(jié)合性表面具有約2X1(^至約2X10"微摩爾配體/每平方米支持物。在另一個特定的實施方式中，結(jié)合性表面具有約1.9X10—2至約1.6X10"微摩爾配體/每平方米支持物。在另一個特定的實施方式中，結(jié)合性表面具有約1.6X10'2至約6.6X10'2微摩爾配體/每平方米支持物。在另一個特定的實施方式中，結(jié)合性表面具有約1.6Xl(^至約3.2X10—2微摩爾配體/每平方米支持物。在另一個特定的實施方式中，結(jié)合性表面具有約1.6X10'2至約2.0X10"微摩爾配體/每平方米支持物。在各種實施方式中，結(jié)合性表面包含附接于配體的配體結(jié)合劑和附接于配體結(jié)合劑的捕獲部分，其中，捕獲部分以一定密度存在。在各種實施方式中，捕獲部分的密度為配體密度的約75%、配體密度的約50%、以及配體密度的約25%。在一個特定的實施方式中，配體包含生物素。該生物素通過支持物連接物蛋白質(zhì)而與支持物偶聯(lián)，所述蛋白質(zhì)選自于下組BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。該生物素被附接于配體結(jié)合劑，所述配體結(jié)合劑包含選自下組的生物素結(jié)合性部分:抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin的片段、或其混合物。并且生物素結(jié)合性部分被附接于生物素化的捕獲部分，其中，該捕獲部分選自下組中的一種或多種抗體、抗體的結(jié)合性片段、受體、受體配體、激素、激素受體、酶、酶的底物、單鏈的低聚核苷酸、雙鏈的低聚核苷酸、單鏈的多聚核苷酸、雙鏈的多聚核苷酸、抗原、肽或蛋白質(zhì)。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種具有不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的支持物，其包含設(shè)置在支持物上的多個支持物連接物；以及與支持物連接物偶聯(lián)的配體；其中，配體是不飽和的，并且以提供空間上可接近的配體的方式被定向在表面上。在一個特定的實施方式中，配體與二價的或多價的能夠特異性地與配體相連接的配體結(jié)合劑相連接，并且結(jié)合性表面基本上不含未結(jié)合的、游離的配體。在各種實施方式中，支持物連接物偶聯(lián)有約1.9X10^至約1.6X10"微摩爾配體/每平方米支持物。支持物連接物能夠被通過共價的或非共價的連接關(guān)系而與支持物相偶聯(lián)。在各種實施方式中，支持物連接物與支持物共價偶聯(lián)。在其中支持物連接物與支持物共價偶聯(lián)的實施方式中，本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的任何合適的結(jié)合性化學(xué)技術(shù)能夠被用于將支持物連接物附接于支持物上。合適的結(jié)合性化學(xué)技術(shù)包括，但不限于，通過一種以上選自下組的官能團(tuán)進(jìn)行附著羧基、羥基、甲苯磺酰基、環(huán)氧基、醛、胺、酰胺、酰肼、異硫氰酸酯、順丁烯二酰亞胺、以及巰基。在一個特定的實施方式中，通過使用用于進(jìn)行附著的甲苯磺酰基化學(xué)技術(shù)而將支持物連接物與支持物共價偶聯(lián)。支持物連接物能夠包含任何合適的能夠與支持物偶聯(lián)并且還能夠與配體偶聯(lián)的物質(zhì)。與支持物的偶聯(lián)、以及與配體的偶聯(lián)可以是共價的。合適的支持物連接物包括，但不限于，大分子比如，例如蛋白質(zhì)或其他的聚合物。在各種實施方式中，支持物連接物包含蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)可以是，例如單體、二聚體、多聚體、或融合蛋白。在特定的實施方式中，該蛋白質(zhì)包含至少一種白蛋白，例如BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。在各種實施方式中，配體包含生物素。用于將生物素附接至支持物表面或支持物連接物的合適的生物素試劑包括胺反應(yīng)性的生物素標(biāo)簽試劑比如，例如硫代-NHS-生物素、硫代-NHS-LC-生物素、硫代-NHS-IX-LC-生物素、硫代-NHS-SS-生物素、NHS陽PE04-生物素、NHS-生物素、NHS-LC-生物素、NHS-LC-LC-生物素、PFP-生物素、TFP-PEQ-生物素、或NHS-亞氨基生物素三氟乙酰胺；巰基反應(yīng)性的生物素標(biāo)簽試劑比如，例如馬來酰亞胺-PE02-生物素、生物素-BMCC、PEO-碘代乙酰基生物素、碘代乙?；?LC-生物素、或生物素-HPDP;羧基反應(yīng)性的生物素標(biāo)簽試劑比如，例如生物素PEO-胺、或生物素PEO-LC-胺；碳水化合物反應(yīng)性的生物素標(biāo)簽試劑比如，例如生物胞素酰肼、生物素酰肼、或生物素-LC-酰肼；或者光反應(yīng)性的生物素標(biāo)簽試劑比如，例如補骨脂素-PEO-生物素。在一個特定的實施方式中，配體包含生物素，并且通過使用胺反應(yīng)性的生物素標(biāo)簽試劑硫代-NHS-LC-生物素而被附接于支持物或支持物連接物。在其中配體包含生物素的實施方式中，支持物上的結(jié)合性表面能夠進(jìn)一步包含與生物素相連接的配體結(jié)合劑。在特定的實施方式中，配體結(jié)合劑包含生物素結(jié)合性部分。在各種實施方式中，生物素結(jié)合性部分包含蛋白質(zhì)，例如，至少一種的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)比如抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin的片段、或者其混合物。該生物素結(jié)合性部分還可以包含融合蛋白比如，例如融合于不同的結(jié)合性蛋白的抗生物素蛋白。在各種實施方式中，支持物連接物包含蛋白質(zhì)，并且配體包含生物素，并且蛋白質(zhì)以低的生物素投入比率而被生物素化，從而使得支持物連接物具有小于或等于5摩爾生物素/每摩爾支持物連接物的摻入比率。在一個特定的實施方式中，該蛋白質(zhì)是BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。在各種實施方式中，其中支持物上的結(jié)合性表面包含生物素結(jié)合性部分，支持物上的結(jié)合性表面還包括與生物素結(jié)合性部分相連接的生物素化的捕獲部分。該生物素化的捕獲部分可以包含間隔物，例如，其中，間隔物是在生物素部分和捕獲部分之間。該生物素化的捕獲部分能夠根據(jù)待捕獲的物質(zhì)而包含任何合適的捕獲部分。合適的捕獲部分包括抗體、抗體的結(jié)合性片段、受體、受體配體、激素、激素受體、酶、酶的底物、單鏈低聚核苷酸、雙鏈低聚核苷酸、單鏈多聚核苷酸、雙鏈多聚核苷酸、抗原、肽或蛋白質(zhì)中的至少一種。在各種實施方式中，支持物上的結(jié)合性表面還包括嵌段共聚物。所述嵌段共聚物包含疏水性的頭部基團(tuán)，該疏水性的頭部基團(tuán)的側(cè)翼為至少兩個親水性的尾部，其中，疏水性的頭部基團(tuán)接觸支持物。親水性尾部的長度能夠各自獨立地是頭部基團(tuán)長度的約2至約2.5倍。該嵌段共聚物能夠包含下述通式I的結(jié)構(gòu)，其具有聚氧化丙烯區(qū)段和聚氧化乙烯區(qū)段HO(C2H40)x(C3H60)y(C2H40)zH(I)，其中，x和y被選擇從而使聚氧化丙烯區(qū)段與支持物相連接。在一個特定的實施方式中，x是約100至約135，y是約40至約75，并且z是約100至約135。在其他的實施方式中，x是約110至約125，y是約60至約70，并且z是約110至約125。在各種實施方式中，嵌段共聚物的平均分子量為約12，700道爾頓(Da)-17,400Da;或者平均分子量是約9,000至約18,000Da。在特定的實施方式中，嵌段共聚物的平均分子量是約9,840Da至約14,600Da。在一個特定的實施方式中，嵌段共聚物的平均分子量是約14,600Da。在另一個特定的實施方式中，嵌段共聚物的平均分子量是約12,600Da。在各種實施方式中，支持物包含有機聚合物或共聚物。在各種實施方式中，有機聚合物或共聚物是疏水性的。合適的聚合物包括，但不限于聚苯乙烯、聚(二乙烯基苯)、苯乙烯-?；簿畚?、苯乙烯一丁二烯共聚物、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚(苯乙烯-環(huán)氧乙烷)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚戊二醛、聚乙烯亞胺、聚乙烯吡咯烷酮、N，N'-亞甲基二丙烯酰胺、聚烯烴、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、聚砜、聚醚砜、吡咯化的(pyrolized)材料、嵌段共聚物、以及前述化合物的共聚物、硅酮、或二氧化硅。在一個特定的實施方式中，支持物包含苯乙烯和二乙烯基苯，并且涂敷有聚氨酯層。在各種實施方式中，使用疏水性的聚合物或共聚物將導(dǎo)致支持物具有超過約60度的水接觸角(watercontactangle)。在各種實施方式中，使用疏水性的聚合物或共聚物將導(dǎo)致支持物具有超過約70度的水接觸角。在各種實施方式中，支持物包含微粒。在一個特定的實施方式中，微粒包含順磁性材料或超順磁性材料比如，例如，強磁性氧化鐵Fe304或Fe203。術(shù)語"順磁性"和"超順磁性"，指的是在磁場梯度中經(jīng)受力、但是不會變得永久磁化的材料。在一個特定的實施方式中，支持物包含呈磁赤鐵礦、或Fe203形式的鐵。在各種實施方式中，微粒的平均直徑在100nm至22,900nm的范圍內(nèi)。在一個特定的實施方式中，微粒的平均直徑在約750nm至約3,000nm的范圍內(nèi)。在另一個特定的實施方式中，微粒的平均直徑在約950nm至約1,150nm的范圍內(nèi)。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于親合分析的改性支持物，其包含包含一種以上選自下組材料的支持物聚苯乙烯、聚(二乙烯基苯)、苯乙烯-酰化共聚物、苯乙烯一丁二烯共聚物、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、聚(苯乙烯-環(huán)氧乙烷)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氨酯、聚戊二醛、聚乙烯亞胺、聚乙烯吡咯烷酮、N.N'-亞甲基二丙烯酰胺、聚烯烴、聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚丙烯腈、聚砜、聚醚砜、吡咯化材料、嵌段共聚物、以及前述化合物的共聚物、硅酮、或二氧化硅；共價附接于支持物的蛋白質(zhì)，其中蛋白質(zhì)包含生物素，其中，有小于5摩爾的偶聯(lián)的生物素/每摩爾蛋白質(zhì)；與生物素相連接的生物素結(jié)合性部分，其中，生物素結(jié)合性部分是至少二價的；與生物素結(jié)合性部分相連接的生物素化的捕獲部分，其中生物素化的捕獲部分是選自下組中的至少一種抗體、抗體的結(jié)合性片段、受體、受體配體、激素、激素受體、酶、酶的底物、單鏈低聚核苷酸、雙鏈低聚核苷酸、單鏈多聚核苷酸、雙鏈多聚核苷酸、抗原、肽、或蛋白質(zhì)；接觸支持物的嵌段共聚物，其中，嵌段共聚物包含聚氧化丙烯頭部基團(tuán)，聚氧化丙烯頭部基團(tuán)的側(cè)翼為聚氧化乙烯尾部，其中聚氧化丙烯頭部基團(tuán)接觸支持物，并且其中聚氧化乙烯尾部的長度獨立地是聚氧化丙烯頭部基團(tuán)長度的約2至約2.5倍，并且其中嵌段共聚物的平均分子量是約9，84QDa至約17,400Da。該改性支持物可以包含微粒。在一個特定的實施方式中，微粒包含順磁性材料或超順磁性材料比如Fe203，并且微粒的平均直徑在950nm至1,150nm的范圍內(nèi)。在一個特定的實施方式中，生物素化的捕獲部分包含免疫球蛋白或其片段。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于涂敷支持物的方法，其包括以配體對被選擇的支持物連接物的投入比率來結(jié)合配體和支持物連接物，從而得到配體::支持物連接物復(fù)合物的混合物，其中，配體::支持物連接物復(fù)合物至少基本上不含游離的配體；以及將配體::支持物連接物復(fù)合物共價附接于支持物。在一個特定的實施方式中，配體對支持物連接物的投入比率是小于或等于8摩爾配體1摩爾支持物連接物。作為另一種選擇，配體對支持物連接物的投入比率是小于或等于4摩爾配體1摩爾支持物連接物。在一個特定的實施方式中，該方法中的配體包含生物素，其中，配體包含胺反應(yīng)性的生物素標(biāo)簽試劑比如硫代-NHS-LC-生物素。在各種實施方式中，支持物連接物包含蛋白質(zhì)，并且配體包含生物素，并且蛋白質(zhì)以低的生物素投入比率而被生物素化，從而使得支持物連接物具有小于或等于5摩爾生物素/每摩爾支持物連接物的摻入比率。在一個特定的實施方式中，該蛋白質(zhì)是BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于涂敷微粒的方法，其包括將微粒暴露于分散劑從而形成分散相，其中，微粒包含含有配體和支持物連接物的結(jié)合性表面，所述配體和支持物連接物被偶聯(lián)以產(chǎn)生配體::支持物連接物復(fù)合物，并且分散劑包含嵌段共聚物，該嵌段共聚物具有疏水性的頭部基團(tuán)，該疏水性的頭部基團(tuán)的側(cè)翼為親水性尾部基團(tuán)；以及將分散相暴露于與配體::支持物連接物復(fù)合物的配體相連接的配體結(jié)合劑。在該用于涂敷的方法的一個特定實施方式中，配體包含生物素，并且用胺反應(yīng)性的生物素標(biāo)簽試劑比如硫代-NHS-LC-生物素與支持物或支持物連接物相偶聯(lián)。在各種實施方式中，支持物連接物包含蛋白質(zhì)，如上所述，支持物具有不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面。在一個特定的實施方式中，該蛋白質(zhì)包含BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。在該用于涂敷的方法的各種實施方式中，配體結(jié)合劑包含生物素結(jié)合性部分。在一個特定的實施方式中，生物素結(jié)合性部分是至少二價的，并且包含抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin的片段、或者其混合物中的至少一種。在各種實施方式中，該用于涂敷的方法還包括將生物素化的捕獲部分與生物素結(jié)合性部分相連接。在該用于涂敷的方法的一個特定實施方式中，生物素化的捕獲部分包含抗體、抗體的結(jié)合性片段、受體、受體配體、激素、激素受體、酶、酶的底物、單鏈低聚核苷酸、雙鏈低聚核苷酸、單鏈多聚核苷酸、雙鏈多聚核苷酸、抗原、肽或蛋白質(zhì)中的至少一種。在一個特定的實施方式中，生物素化的捕獲部分包含間隔物。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于在支持物上制造不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法，其包括制備分析物連接性部分與空間填充部分的混合物，從而形成稀釋的混合物；以及在足以使分析物連接性部分和空間填充部分與支持物相偶聯(lián)、并且形成不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的條件下，將混合物暴露于分析物支持物，所述結(jié)合性表面相對于與支持物表面偶聯(lián)的分析物連接性部分的數(shù)量是不飽和的。這里使用的分析物連接性部分可以是任何分子，比如蛋白質(zhì)、抗體、或核酸，當(dāng)該分子與支持物表面結(jié)合時，其將直接地或通過連接性分子間接地與所研究的分析物相連接；即，其將形成結(jié)合性表面的一部分。這里使用的空間填充部分可以是任何分子，比如蛋白質(zhì)、抗體、或核酸，其將與支持物表面相偶聯(lián)，但是將不會直接地或通過連接性分子間接地與所研究的分析物相連接。該空間填充部分不會形成結(jié)合性表面的一部分，但是將具有占據(jù)支持物表面上空間、并且抑制過量分析物連接性部分的結(jié)合性的功能。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于在支持物上制造不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法，其包括稀釋配體::支持物連接物復(fù)合物與缺乏配體的支持物連接物的混合物，從而形成稀釋的混合物；以及在足以使配體::支持物連接物復(fù)合物與支持物相偶聯(lián)、并且形成不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的條件下，將稀釋的混合物暴露于支持物。在該用于在支持物上制造不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法的各種實施方式中，其中，支持物包括微粒，不飽和的結(jié)合性表面具有約0.5Xl()4至約10X10^微摩爾配體/每毫克(mg)微粒、約1.0X10"至約5.5X10^微摩爾配體/每mg微粒、或約2Xl(^至約4Xl(^微摩爾配體海mg微粒。在該用于在支持物上制造不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法的特定實施方式中，其中，支持物包括微粒，不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面具有約1.0Xl()4至約5.5X10—4微摩爾配體/每mg微粒、、或約1.6X10^至約4.9Xl()4微摩爾配體/每mg微粒。在該用于在支持物上制造不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法的特定實施方式中，支持物是粗糙的，并且不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面具有約1.0X10々至約2.0X10"微摩爾配體/每平方米。作為另一種選擇，結(jié)合性表面具有約1.9X1(^至約6.6X1()J微摩爾配體海平方米。在該用于在支持物上制造不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法的其他特定實施方式中，支持物是光滑的，并且不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面具有約3.3X1(^至約1.6X10—1微摩爾配體/每平方米。在該用于在支持物上制造不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法的其他特定實施方式中，粗糙的不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面具有約1.9乂10—2至約6.6乂10'2微摩爾支持物連接物/每平方米；并且光滑的不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面具有約2.7X1(^至約7.1乂10—2微摩爾支持物連接物/每平方米。術(shù)語"粗糙的"形態(tài)學(xué)上包括花椰菜狀、或多孔狀。術(shù)語"光滑的"指的是形態(tài)學(xué)上基本光滑，并且基本上呈球形。對于具有相同直徑的微粒，由于粗糙的支持物表面上的凹槽、凹點、或孔提供了增加的支持物表面積，故"粗糙的"支持物表面將比"光滑的"支持物表面具有更大的支持物表面面積。支持物連接物、配體、配體結(jié)合劑、捕獲部分等的實際微摩爾數(shù)，將落在計算的粗糙的支持物表面積和光滑的支持物表面積之間某處，因為對于配體、或支持物連接物、附著物而言，不是所有粗糙的支持物表面積在空間上均是可利用的。在該用于在支持物上制造不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法的各種實施方式中，支持物連接物包括蛋白質(zhì)，如上所述，支持物具有不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面。在一個特定的實施方式中，該蛋白質(zhì)包含BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于在支持物上制造不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法，其包括以配體對支持物連接物的任何投入比率制備配體::支持物連接物復(fù)合物的混合物；用未與配體復(fù)合的支持物連接物稀釋配體::支持物連接物復(fù)合物的混合物，從而形成稀釋的混合物；以及在足以使配體::支持物連接物復(fù)合物和支持物連接物與支持物相偶聯(lián)、并且形成不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的條件下，將稀釋的混合物暴露于支持物。然后可以根據(jù)在此描述的任何合適的方法處理包含配體的支持物。支持物連接物能夠包含一種或多種蛋白質(zhì)或者非蛋白質(zhì)聚合物。在各種實施方式中，配體通過在支持物連接物上的官能團(tuán)被復(fù)合至支持物連接物。在將支持物連接物暴露于配體之前，在一種以上支持物連接物上的官能團(tuán)數(shù)量的一部分可以被省去或者中和，用這樣的方式降低能夠與支持物連接物復(fù)合的配體的數(shù)量。在制備配體::支持物連接物復(fù)合物的混合物中，全部或者僅一些被暴露于配體的支持物連接物可以具有一種以上被中和的官能團(tuán)。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于免疫測定的結(jié)合性表面，其中，結(jié)合性表面包含多個能夠結(jié)合配體結(jié)合劑的配體，所述配體結(jié)合劑可以結(jié)合所研究的捕獲部分。結(jié)合性表面上的配體是不飽和的、或者不飽和的并且被定向在支持物上，并且配體或者(a)被直接地附接于支持物、或者(b)通過支持物連接物被附接，并且支持物連接物被附接于支持物。在各種實施方式中，結(jié)合性表面基本上不含游離的(即，未結(jié)合的)配體。在一個特定的實施方式中，支持物包含直徑數(shù)量級為大約1微米至大約5微米的微粒，配體包含生物素，并且生物素被復(fù)合至包含蛋白質(zhì)的支持物連接物。在特定的實施方式中，配體包含生物素；配體結(jié)合劑包含生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)；支持物連接物包含BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物；并且BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物通過低投入比率的生物素而被生物素化。在一個特定的實施方式中，生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)是SA，并且生物素化抗體存在于涂敷了SA的結(jié)合性表面上，其中，生物素化抗體被挑選從而在免疫測定，例如競爭性免疫測定或夾心(sandwich)免疫測定中捕獲所研究的分析物?？梢酝ㄟ^使用在此描述的任何合適的方法來制造免疫測定中支持物上的結(jié)合性表面。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種具有不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的支持物，其包含多個設(shè)置在支持物上的支持物連接物；以及與支持物連接物偶聯(lián)的配體；其中，支持物連接物以約1.6乂10—2至約7.1Xl(^微摩爾海平方米支持物的密度存在于支持物上。在各種實施方式中，支持物連接物包含蛋白質(zhì)。在一個特定的實施方式中，該蛋白質(zhì)是BSA、卵清蛋白、BSA的片段、卵清蛋白的片段、或其混合物。在各種實施方式中，配體包含生物素。在一個特定的實施方式中，生物素的密度是約1.9X10'2至約1.6X10"微摩爾生物素/每平方米支持物。在各種實施方式中，結(jié)合性表面包含能夠特異性地與配體相連接的配體結(jié)合劑。在各種實施方式中，配體結(jié)合劑的密度是約1.2X10'2至約4.6乂10-2微摩爾配體結(jié)合劑/每平方米支持物。在各種實施方式中，配體結(jié)合劑是抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin的片段、或者其混合物。在各種實施方式中，結(jié)合性表面還包括能夠特異性地與配體結(jié)合劑相連接的捕獲部分。在各種實施方式中，捕獲部分的密度是約2.5X10—s至約1.4X10—2微摩爾捕獲部分/每平方米支持物。在一個特定的實施方式中，捕獲部分包含免疫球蛋白或其片段。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種具有不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的支持物，其包含多個設(shè)置在支持物上的支持物連接物；以及與支持物連接物偶聯(lián)的配體；其中，支持物連接物以約1.3X10'4至約2.1X10'4微摩爾支持物連接物/每mg支持物的密度存在于支持物上。在各種實施方式中，配體包含生物素。在一個特定的實施方式中，生物素的密度是約1.6X1(T"至約4.9X10^微摩爾生物素/每mg支持物。在各種實施方式中，結(jié)合性表面包含能夠特異性地與配體相連接的配體結(jié)合劑。在各種實施方式中，配體結(jié)合劑的密度是約l.OX10—4至約1.4X10'4微摩爾配體結(jié)合劑/每mg支持物。在各種實施方式中，配體結(jié)合劑是抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白的片段、NeutrAvidin的片段、或者其混合物。在各種實施方式中，結(jié)合性表面還包括能夠特異性地與配體結(jié)合劑相連接的捕獲部分。在各種實施方式中，捕獲部分的密度是約2.1X10—s至約4.1X10's微摩爾捕獲部分/每mg支持物。在一個特定的實施方式中，捕獲部分包含生物素化免疫球蛋白或其片段。在另一個方面中，本發(fā)明提供了一種支持物上的結(jié)合性表面，其中，結(jié)合性表面特異性地結(jié)合至多約為4.0X10^微摩爾生物素/每mg支持物。在一個特定的實施方式中，支持物包含微粒，并且特異性地結(jié)合約2.5X10'5至不超過約4.0X1(^微摩爾生物素/每mg微粒。在一個特定的實施方式中，支持物包含微粒，并且特異性地結(jié)合約7.5X10—5至約3.5X1(^微摩爾生物素/每mg微粒。在另一個特定的實施方式中，支持物包含微粒，并且特異性地結(jié)合約l.OX1(^至約3.0x1(^微摩爾生物素/每mg微粒。在各種實施方式中，支持物包含附接于(直接地或者通過支持物連接物)與生物素結(jié)合性部分比如、例如SA相連接的支持物上的生物素，并且前述生物素結(jié)合能力指的是生物素結(jié)合性部分(例如SA)結(jié)合游離生物素的能力。在另一個方面，提供了支持物上的結(jié)合性表面，其中，結(jié)合性表面特異性地結(jié)合不超過約1.3X10—1微摩爾生物素/每平方米支持物。在一個特定的實施方式中，支持物特異性地結(jié)合約3.0X10—s至不超過約1.3x10"微摩爾生物素/每平方米支持物。在一個特定的實施方式中，支持物特異性地結(jié)合約8.9X10'3至約1.2X10"微摩爾生物素/每平方米支持物。在一個特定的實施方式中，支持物特異性地結(jié)合約1.2乂10'2至約9.9X10—2微摩爾生物素/每平方米支持物。在各種實施方式中，支持物包含附接于(直接地或者通過支持物連接物)與生物素結(jié)合性部分比如、例如SA相連接的支持物上的生物素，并且前述生物素結(jié)合能力指的是生物素結(jié)合性部分(例如SA)結(jié)合游離生物素的能力。除非另有說明，或者由本公開暗示，與在此描述的任何特定方法或組成有關(guān)的任何實施方式可以被用于與在此描述的任何其他實施方式相結(jié)合。圖1A圖示了在順磁性微粒(PMP)結(jié)合性表面上制備不飽和的并且被定向的SA的工序。圖1B是圖1A的工序示意圖的續(xù)頁。圖2圖示了本發(fā)明的一種具體實施方式，其包含固體支持物表面；共價附接于支持物表面的BSA或卵清蛋白；共價附接于BSA或卵清蛋白的生物素；與生物素相連接的鏈霉抗生物素蛋白、NeutrAvidin或抗生物素蛋白；以及與鏈霉抗生物素蛋白、NeutrAvidin、或抗生物素蛋白相連接的生物素化抗體。圖3圖示了在低投入比率的生物素化方法中在BSA分子上一些可能的生物素分子取向。圖4圖示了用低投入比率的生物素化BSA涂敷固相來制備不飽和的結(jié)合性表面。圖5圖示了使用嵌段共聚物作為封閉劑用于固相支持物表面。圖6圖示了使用嵌段共聚物作為分散劑用于包含生物素的結(jié)合性表面。圖7圖示了用SA涂敷被嵌段共聚物封閉的生物素化結(jié)合性表面。圖8圖示了將各種生物素化捕獲部分施加至根據(jù)本發(fā)明制備的固相支持物表面上的涂敷了SA的結(jié)合性表面。圖9A圖示了用生物素化抗體或Fab片段涂敷的普通的或者標(biāo)準(zhǔn)的涂敷了SA的微粒結(jié)合性表面。圖9B圖示了用生物素化抗體或Fab片段涂敷的不飽和的并且被定向的涂敷了SA的微粒。圖10，在A欄和B欄中，圖示了與使用本發(fā)明的分散步驟相關(guān)的增加的可結(jié)合的表面面積。圖11圖示了在4。C下或37。C下用SA涂敷3天后生物素從生物素-BSA固體支持物上脫落的分析。圖12顯示了實施例6的工序再現(xiàn)性(可制造性)研究的表格中的數(shù)據(jù)。圖13顯示了實施例6的進(jìn)一步工序再現(xiàn)性(可制造性)研究的表格中的數(shù)據(jù)。圖14A顯示實施例7的增強的穩(wěn)定性研究的表格中的數(shù)據(jù)。圖14B是圖14A的續(xù)表，顯示了實施例7的增強穩(wěn)定性研究的數(shù)據(jù)。圖15A顯示了脫落分析的結(jié)果。圖15B是脫落分析結(jié)果的進(jìn)一步的示意圖。圖16A顯示了對于根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式制備的實施例11的各種大量的微粒，進(jìn)行實際的結(jié)合性表面的密度計算獲得的表格中的數(shù)據(jù)。圖16B顯示了對于根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式制備的微粒，進(jìn)行實際的結(jié)合性表面的密度計算獲得的表格中的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)通過采用粗糙度假定而由微粒數(shù)據(jù)衍生得來。圖16C顯示了對于根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式制備的各種大量的微粒，假定支持物表面光滑情況下進(jìn)行結(jié)合性表面的面積計算獲得的表格中的數(shù)據(jù)。圖16D顯示了在假定根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式制備的支持物表面光滑的前提下，進(jìn)行結(jié)合性表面的密度計算獲得的表格中的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)由微粒數(shù)據(jù)衍生得來。圖17是示意圖，顯示了在本發(fā)明的不飽和的結(jié)合性表面和本發(fā)明的不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面之間的差異。具體實施例方式本發(fā)明至少部分地基于通過如下步驟而實現(xiàn)的結(jié)合性表面的設(shè)計(a)通過連接少于飽和量的配體，產(chǎn)生沿著可接近的空間取向被稀疏地分散穿過支持物的結(jié)合性表面的含有捕獲部分的復(fù)合物；以及任選地，(b)通過銜接著地定位配體，并且沿著線性或近似線性的結(jié)構(gòu)(物理)取向依次定位含有捕獲部分的復(fù)合物的其他組成部分，與通過簡單地通過增加配體密度的擠滿支持物表面來設(shè)計結(jié)合性表面相比，可以得到具有更期望的質(zhì)量的結(jié)合性表面以用于進(jìn)行分析、比如親合分析(例如，免疫測定或核酸測定)。用于制備結(jié)合性表面的常規(guī)方法典型地致力于最大化單位面積支持物上的配體含量，而不考慮配體的可接近性和/或取向，從而經(jīng)常導(dǎo)致在支持物上擠滿配體。最大化單位面積結(jié)合性表面上的配體可能會導(dǎo)致結(jié)合性表面性能的下降，這至少部分地歸因于位阻效應(yīng)。性能下降還可能因過量的配體從結(jié)合性表面脫落而引起。在此使用的術(shù)語"與......偶聯(lián)"或其語法上的等價用語，是指在兩個部分之間共價的或非共價的結(jié)合或相互作用。術(shù)語"與......偶聯(lián)"不是用于暗示偶聯(lián)的取向或方向。在此使用的術(shù)語"融合蛋白"包括重組體蛋白(比如嵌合蛋白)、雜化蛋白、以及合成衍生的蛋白。其用途為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。根據(jù)本發(fā)明的不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面包括通過在支持物上偶聯(lián)少于飽和量的配體(例如，通過直接地附接于支持物，或者通過附接于被附接到支持物上的支持物連接物)而構(gòu)建的結(jié)合性表面。相對于配體"不飽和的"結(jié)合性表面是這樣的結(jié)合性表面其具有次最大密度的配體/每單位支持物表面面積、或者具有次最大密度的配體/每單位重量支持物。在本發(fā)明的一個特定實施方式中，不飽和的結(jié)合性表面上的配體被相間隔地定向。這里使用的術(shù)語"相間隔地定向"或其語法上的等價用語，指的是被分散開一定距離或面積的部分。換句話說，這些部分在支持物表面上被定向或者相間隔，以使得它們基本上不接觸最接近的鄰位。"次最大"密度的配體/每單位支持物表面面積，指的是相對于可以存在于支持物表面上的配體數(shù)量而言是不飽和的結(jié)合性表面。例如，其上配體飽和的支持物表面具有最大百分比的在給定條件下可以設(shè)置于支持物表面上的配體，最大百分比由100%表示(例如，給定配體::支持物連接物復(fù)合物，其中支持物連接物上配體是飽和的，并且在可以促進(jìn)配體::支持物連接物復(fù)合物最大附著于支持物的條件下，復(fù)合物以其最大可能的密度被設(shè)置在支持物上)。對于在免疫測定中使用的結(jié)合性表面，不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面可以是特別期望的。大部分免疫測定使用支持物上的結(jié)合性表面。在許多這些應(yīng)用中，支持物是微粒或微孔板，其中用于捕獲分析物例如抗原的部分被構(gòu)造在其他分子上，從而形成可結(jié)合分析物的含有捕獲部分的復(fù)合物。其一個非限制性的實施例是具有固定在微粒上的免疫球蛋白的免疫測定。該免疫球蛋白可以被直接地固定在支持物上，或者該免疫球蛋白可以被偶聯(lián)(例如，共價偶聯(lián))于依次被固定在支持物上的其他分子上。在此描述在上述兩種狀態(tài)下制備不飽和的結(jié)合性表面。提供如下情形的詳細(xì)實施例，其中免疫球蛋白或其片段不是被直接附著于支持物，而是代之以與被附接于支持物的其他部分相連接。術(shù)語"偶聯(lián)"包括(a)共價結(jié)合(例如，直接地或通過一個以上碳-碳鍵、碳-氮鍵、碳-氧鍵等間接地)；以及(b)非共價結(jié)合(間接地或者直接地)。已知可特異性地彼此相互作用的實體可以被共價偶聯(lián)。己知可特異性地相互作用、并且可以被共價偶聯(lián)的實體的一個非限制性實施例是抗原及其特異抗體，其可以通過例如偶聯(lián)化學(xué)技術(shù)而被共價附接。不能特異性地彼此相互作用的實體可以被共價偶聯(lián)。已知不能特異性地彼此相互作用、但可以被共價偶聯(lián)的實體的一個非限制性實施例是SA和BSA，其可以通過例如偶聯(lián)化學(xué)技術(shù)而被共價附接。非共價結(jié)合的例子包括親合力、離子結(jié)合、范德華力(例如，偶極/偶極或者倫敦力)、氫鍵結(jié)合(例如，在多聚核苷酸雙鏈之間)、以及疏水作用。其中連接關(guān)系是非共價的，在實體之間的連接關(guān)系優(yōu)選是特異性的。特異性的非共價連接關(guān)系的非限定性的例子包括在生物素與生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)比如抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白片段、NeutrAvidin片段、或其混合物之間的相互結(jié)合作用；生物素化Fab、生物素化免疫球蛋白或其片段、生物素化小分子(比如，例如激素或受體配體)、生物素化多聚核苷酸、生物素化大分子(例如，蛋白質(zhì)或者天然或合成的聚合物)與生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)比如抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白片段、NeutrAvidin的片段、或其混合物的結(jié)合；底物與其酶的結(jié)合；糖蛋白與對糖蛋白特異的凝集素的結(jié)合；配體與對配體特異的受體的結(jié)合；抗體與該抗體對其抗性升高的抗原的結(jié)合;以及在多聚核苷酸與互補的或者基本上互補的多聚核苷酸之間形成雙鏈；等等。對于具有附接于微粒的生物素化蛋白質(zhì)(配體::支持物連接物復(fù)合物)的微粒，提供了特定的例子。其中，生物素化蛋白質(zhì)被SA(生物素結(jié)合性部分)涂敷，并且涂敷了SA-生物素化蛋白質(zhì)的微粒然后用在測定中用于捕獲分析物的生物素化免疫球蛋白或其生物素化片段(生物素化的捕獲部分)涂敷；或者結(jié)合另一種在測定中用于捕獲分析物的免疫球蛋白或其片段(例如，生物素化山羊x小鼠IgG被用于捕獲小鼠IgGx抗原l，后者是用于捕獲抗原1)。在支持物表面上的生物素化蛋白質(zhì)的不飽和本性被反映在SA涂層中，由于與其連接的生物素的不飽和性質(zhì)，該SA涂層也是不飽和的，這導(dǎo)致用于捕獲分析物的生物素化免疫球蛋白(或者生物素化免疫球蛋白片段)的不飽和性、或者用于捕獲可捕獲分析物的額外的免疫球蛋白或片段的生物素化免疫球蛋白(或者生物素化免疫球蛋白片段)的不飽和性。在本發(fā)明的各種實施方式中，配體可以被共價結(jié)合于支持物連接物、或者非共價結(jié)合于支持物連接物。在一個特定的實施方式中，配體被共價結(jié)合于支持物連接物，并且配體結(jié)合劑是至少二價的。在另一種特定的實施方式中，配體是生物素并且被共價結(jié)合于支持物連接物，而配體結(jié)合劑是至少二價的部分比如鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、或NeutrAvidin、鏈霉抗生物素蛋白片段、抗生物素蛋白片段、NeutrAvidin的片段、或其混合物。在其中配體結(jié)合劑是至少二價的實施方式中，配體共價偶聯(lián)于支持物連接物可以得到更穩(wěn)定的結(jié)合性表面，因為過量配體的脫落被降低或消除。在其他的實施方式中，配體共價偶聯(lián)于支持物連接物是任選的。例如，其中配體是具有單一結(jié)合位點的抗體片段，配體可以非共價地與支持物連接物偶聯(lián)。因此，本發(fā)明包含了用于提供用于免疫測定的不飽和量的捕獲部分的方法和組合物，其中，由于結(jié)合至不飽和的支持物表面，該捕獲部分是不飽和的。在各種實施方式中，捕獲部分可以被用于進(jìn)一步捕獲捕獲性部分。例如，用生物素-BSA(配體::支持物連接物復(fù)合物)涂敷的支持物再用SA(配體結(jié)合劑)涂敷，用生物素化山羊x小鼠IgG涂敷的支持物可以進(jìn)一步用例如小鼠IgGxTSH涂敷，然后其可以用于捕獲TSH分析物。在支持物表面上的組分的密度可以用多種方式表示。對于微粒支持物比如，例如，微粒，其適宜于用單位重量微粒來論述結(jié)合性表面上的組分密度，例如，微摩爾組分(例如配體，比如生物素；配體結(jié)合劑，比如SA;捕獲部分，比如對分析物特異的生物素化IgG;等等)海mg微粒。對于非微粒支持物比如，例如，微孔板、其適宜于用支持物的表面面積來論述組分密度，比如，例如，微摩爾配體結(jié)合劑/每平方米。對于下述物質(zhì)，可以用支持物表面上的組分密度表示配體(例如，實施例中的生物素-BSA微粒上的生物素，用生物素結(jié)合性來表示)或者構(gòu)造在支持物表面上的任何其他組分(例如，在生物素-BSA微粒的例子中，用與微粒結(jié)合的SA、或者與SA結(jié)合的對分析物特異的生物素化免疫球蛋白來表示)。由于小于地飽和量的配體與支持物偶聯(lián)(直接或通過例如蛋白質(zhì)間接地)，逐層的配體結(jié)合劑將是不飽和的，并且在附接于支持物的配體層上的配體結(jié)合劑的密度將包含連續(xù)地變小的密度(例如，連續(xù)地變小的微摩爾/每mg微粒、或微摩爾/每平方米)。因此，對于根據(jù)本發(fā)明的生物素化微粒的實施例，在支持物表面上的SA密度將低于BSA支持物連接物的密度，后者將低于支持物表面上的生物素配體的密度(在加入SA以前的估算值)。因此、在微粒支持物比如約l.O微米直徑的微粒、或非微粒的支持物(例如，微孔板)的各種實施方式中，其中支持物連接物明顯大于配體(例如，白蛋白支持物連接物的分子量為約66,000Da，而生物素配體的分子量為約244Da)，配體結(jié)合劑(例如，SA)的密度要小于配體::支持物連接物復(fù)合物(例如，生物素-BSA)的密度約10%至約90%，在多種實施方式中，其密度小于配體::支持物連接物復(fù)合物的密度約30%至約70%，并且在多種實施方式中，其密度小于配體::支持物連接物復(fù)合物密度約40%至約60%。在一個特定的實施方式中，配體結(jié)合劑包含生物素結(jié)合性部分比如，例如SA;并且配體包含與支持物連接物比如，例如，BSA或卵清蛋白或其混合物、或者BSA或卵清蛋白或其混合物的片段偶聯(lián)的生物素。在多種實施方式中，附接于配體結(jié)合劑(其中配體結(jié)合劑依次與配體相連接)的捕獲部分也是不飽和的。在多種實施方式中，在微?；蚍穷w粒支持物上的捕獲部分的密度要小于配體結(jié)合劑的密度約10%至約卯％，在多種實施方式中，其密度小于配體結(jié)合劑的密度約30%至約70%，并且在多種實施方式中，其密度小于配體結(jié)合劑的密度約40%至約60%。另一種飽和水平的表示方式，是與可與支持物偶聯(lián)的配體的最大含量相比較。在各種實施方式中，相對于配體不飽和的支持物表面將具有少于100%的偶聯(lián)配體。例如，在支持物表面上的配體的百分比可能是可以設(shè)置于支持物表面的配體最大含量的約10%至約90%。或者在支持物表面上的配體的百分比可能是可以設(shè)置于支持物表面的配體最大含量的約20%至約80%?；蛘咴谥С治锉砻嫔系呐潴w的百分比可能是可以設(shè)置于支持物表面的配體最大含量的約30%至約70%。在支持物表面上的配體的最佳百分比(以100%為配體的最大數(shù)值)是提供下述條件的配體百分比(或百分比范圍)最優(yōu)信噪比、配體從結(jié)合性表面上的最低解離、最大穩(wěn)定性(在與應(yīng)用有關(guān)的溫度處)，以及與普通的結(jié)合性表面相比在確認(rèn)研究中相對低的變化(例如，小于10%、更優(yōu)選5%以下)。如同在本申請中在別處的解釋，支持物連接物是任選的。例如，配體可以是與固相支持物表面偶聯(lián)的生物素或其衍生物。由于小于飽和量的配體與支持物偶聯(lián)(直接地或通過例如蛋白質(zhì)間接地)，逐層的配體結(jié)合劑和捕獲部分將是不飽和的，并且在與支持物偶聯(lián)的配體層上的逐層配體結(jié)合劑和捕獲部分的密度將包含連續(xù)地變小的密度(例如，連續(xù)地變小的微摩爾/每mg微粒、或微摩爾/每平方米)。因此，對于根據(jù)本發(fā)明的生物素化微粒的實施例，支持物表面上的生物素化IgG(生物素化的捕獲部分)的密度將低于SA(生物素結(jié)合性部分)的密度，支持物表面上的SA密度將低于BSA支持物連接物(生物素-BSA)的密度，后者將低于支持物表面上的生物素密度(生物素-BSA;在加入SA之前的生物素密度估算值)。在一個特定的實施方式中，表面包含的生物素(生物素-BSA)密度為約1X10—5至約5X1(^微摩爾生物素/每mg微粒，或者作為另一種選擇該密度為約1.6Xl(^至約4.9Xl(^微摩爾生物素/每mg微粒。在其他實施方式中，表面包含的BSA(生物素-BSA)密度為約1.6Xl(T4至約4.9X10'4微摩爾BSA/每mg微粒，包含的SA密度為約l.OX10^至約1.4X10^微摩爾SA/每mg微粒，或者包含的生物素化IgG的密度為約2.1XIO'5至約4.1X10—s微摩爾生物素化IgG/每mg微粒。在一個特定的實施方式中，粗糙的支持物表面包含的生物素(生物素-BSA)密度為約1.9X10—2至約6.6X10—2微摩爾生物素/每平方米，包含的BSA(生物素-BSA)密度為約1.6X10'2至約2.9X10—2微摩爾BSA/每平方米，包含的SA密度為約1.2Xl(^至約1.9X1()J微摩爾SA/每平方米，并且包含的生物素化IgG密度為約2.5X10—3至約5.5X10's微摩爾生物素化IgG/每平方米。通過使用在此描述的用于基于生物素應(yīng)用的方法的同類方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以確定給定應(yīng)用中結(jié)合性表面上配體的最佳百分比。例如，如果低聚核苷酸或多聚核苷酸被用作配體以代替生物素，那么可將低聚核苷酸或多聚核苷酸與支持物連接物(例如，蛋白質(zhì)或核蛋白)偶聯(lián)，并且合適的固相可以用低聚核苷酸或多聚核苷酸及其支持物連接物涂敷。類似于在此描述的方法，可以進(jìn)行穩(wěn)定性、脫落或解離、信噪比、以及確認(rèn)研究，以得到最佳的每單位面積結(jié)合性表面的配體含量(例如，最大值的10%至90%、20%至80%、30%至70%等)。一個便利的方法是首先最大化每單位表面面積的低聚核苷酸或多聚核苷酸含量；然后使用在此描述的方法(例如，在制備配體::支持物連接物復(fù)合物中，以低聚核苷酸或多聚核苷酸對支持物連接物的數(shù)種較低的摩爾投入比率)制備不飽和的并且被定向的表面；并且比較由各種制品得到的穩(wěn)定性、解離、信噪比、以及驗證。在結(jié)合性表面上定向配體包括物理地定向配體，S卩，調(diào)節(jié)配體相對于其圍繞物的布局。含有最大含量的配體/支持物連接物結(jié)合性表面通常會導(dǎo)致許多配體是空間上不可接近的，并且在間距小的相鄰的配體間會競爭進(jìn)入的所研究的用于結(jié)合復(fù)合物中配體的分子。這里使用的術(shù)語"物理(結(jié)構(gòu)性)定向"、或其語法上的等價用語，意思指以如下方式被操控的部分大多數(shù)部分被定向至朝向特定的方向。在本發(fā)明的一個實施方式中，這些部分被這樣定向識別部位或結(jié)合位點基本上被定向成離開支持物表面。在本發(fā)明的另一個實施方式中，物理地定向的部分被銜接著地連接。通過在此用于任何配體::支持物連接物配對的方法，可以實現(xiàn)定向。一個在結(jié)合性表面上定向配體的方法是以低的配體對支持物連接物的摩爾投入比率來制備配體::支持物連接物復(fù)合物(在此提供生物素-BSA復(fù)合物的實施例)。如同在別處描述的那樣，使用低的配體對支持物連接物的摩爾投入比率的目的是，制備具有控制量的偶聯(lián)配體/支持物連接物的復(fù)合物。通過提供基本上不含游離配體的表面(例如，抑制或者減輕配體脫落)來取得控制量(即，次最大值)的配體/支持物連接物，可能會導(dǎo)致在表面上的配體的較好的空間可接近性、相鄰配體之間較少的相互作用、結(jié)合性表面上的配體之間更均一的的距離(平均)、以及提高的穩(wěn)定性。本發(fā)明的組合物和方法包括對測定性能參數(shù)包括靈敏度(信噪比)、準(zhǔn)確度、測定精確性(定量測定)、測定再現(xiàn)性(定性分析)、以及穩(wěn)定性的改進(jìn)、以及對測定生產(chǎn)參數(shù)比如順磁性微粒(PMP)生產(chǎn)工藝再現(xiàn)性(PMP可制造性)的改進(jìn)，或?qū)ι鲜鰠?shù)的組合的改進(jìn)。在本發(fā)明中包括的組合物和方法用于用于親合分析的不飽和的、或者不飽和的并且被定向的生物素結(jié)合分子(例如，不飽和的、或者不飽和的并且被定向的生物素化抗體被用作在夾心和競爭性測定中的固相捕獲抗體)；減小測定中的與非特異性結(jié)合或者異嗜性干擾相關(guān)的噪音、或背景；由于增強微粒分散(增加有效表面面積和碰撞率；降低測定擴(kuò)散距離)而提高測定信號；由于SA不飽和、或者不飽和和定向(空間自由度用以結(jié)合較大的和較小的結(jié)合生物素的分子，提高結(jié)合效率)而提高測定信號；由于結(jié)合生物素的分子的不飽和、或者不飽和并且定向(空間自由度用以捕獲或結(jié)合較大的或較小的分析物結(jié)合劑(生物素化的捕獲部分)和/或分析物，改進(jìn)分析物結(jié)合劑(生物素化的捕獲部分)和/或分析物識別性以及分析物結(jié)合劑(生物素化的捕獲部分)比活力)而提高測定信號；增強產(chǎn)品穩(wěn)定性(改進(jìn)封閉效率并且減少SA從表面上脫落)；以及/或者由于用于在微粒表面上制備不飽和的、或者不飽和的并且被定向的SA的工藝優(yōu)化而提高免疫測定實用性和工序再現(xiàn)性。在各種實施方式中，通過將不同水平的配體結(jié)合劑(例如，SA)滴至配體(例如，生物素)，并且/或者將不同水平的捕獲部分(例如，生物素化抗體)滴至配體結(jié)合劑(例如，SA)，可以增強在不飽和的、或者不飽和的并且被定向的支持物表面上的信噪比，以便取得最佳的信噪比。在如下一種實施方式中，通過使用3~6微克生物素化IgG/每mg微粒的生物素化抗體投入量，得到了免疫測定中的最優(yōu)信噪比和IgG結(jié)合力該實施方式基于涂敷有低投入比率的生物素化BSA的微粒、用嵌段共聚物Pluronic⑧F108(購自BASF公司)封閉、用Pluronic⑧F108分散、并且用SA涂敷。當(dāng)IgG投入量大于10微克生物素化IgG/每mg微粒時，在IgG結(jié)合力的信噪比方面沒有顯著的變化。IgG投入量小于3微克生物素化IgG/每mg微粒會導(dǎo)致信噪比和IgG結(jié)合力的顯著降低，并且當(dāng)抗體投入量接近零時，信噪比和IgG結(jié)合力接近于零。雖然在此進(jìn)行了討論，并且例舉了實施例、和相關(guān)的附圖、使用生物素作為配體的本發(fā)明實施方式，但是，本發(fā)明不局限于具有生物素的結(jié)合性表面。即，在此的描述可以被概括為使用所述方法和組合物的其配體可以是不飽和的、或者不飽和的并且被定向的任何結(jié)合性表面。下述具有生物素作為配體的結(jié)合性表面的描述被用于說明用于制備不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的組合物和制造方法。此外，如同在該說明書的其它部分的解釋，支持物連接物是任選的。因此，支持物連接物只是本發(fā)明的一個具體實施方式，并且對支持物連接物的描述并非是對本發(fā)明的限制。提供了包含不飽和的并且被定向的配體的結(jié)合性表面。該結(jié)合性表面可以被用于構(gòu)造適合于捕獲任何所研究分子的捕獲部分的表面。在表面上的配體的不飽和的本性和定向允許更多組分比如捕獲部分的設(shè)置，所述更多組分在結(jié)合性表面上的布置反映了襯底配體的不飽和的本性和定向。提供了多種實施方式的配體::支持物連接物復(fù)合物，根據(jù)在此描述的方法，使用低的配體對支持物連接物的摩爾投入比率而制備所述復(fù)合物，以使得在支持物連接物上設(shè)置次最大量的配體，并且因此使得脫落被降低。這些復(fù)合物可以被用于產(chǎn)生本發(fā)明的不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面。在制備配體::支持物連接物復(fù)合物中使用低的配體對支持物連接物的投入比率的實施方式可能對如下情況特別有用其中二價或多價的配體結(jié)合劑被使用(比如，例如，其中生物素是配體，而二價或多價的生物素結(jié)合性蛋白質(zhì)比如SA是配體結(jié)合劑)。提供了分散劑和制造包含結(jié)合性表面的微粒的方法、以及制造具有結(jié)合性表面的微粒的方法，例如，在加入生物素結(jié)合性部分比如SA(配體結(jié)合劑)之前，在分散涂敷有生物素(配體)的微粒中使用嵌段共聚物比如Pluronic⑧嵌段共聚物。這里可以使用的具體Pluronic⑧嵌段共聚物、以及它們的數(shù)均分子量，包括F108(約12,700-17,400Da，平均值為約14,600Da)和F127(約9,840-14,600Da，平均值為約12,600Da)。根據(jù)廠商，在此描述的各個Pluronic⑧的嵌段長度為近似值，因為精確的嵌段長度將隨批次而變。除非另有說明、或者由上下文顯而易見，嵌段共聚物的分子量被表示為數(shù)均分子量。本發(fā)明提供的方法用于制備在涂敷表面中使用的穩(wěn)定的生物素化分子(例如，生物素-BSA和生物素-卵清蛋白)用于捕獲具有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的分子(例如，抗生物素蛋白、SA、以及NeutrAvidin)。這些物質(zhì)被依次用于結(jié)合在結(jié)合性測定中可以捕獲所研究的其他分子的生物素化捕獲部分(例如，對于生物素化抗體，所研究的分子是抗原；對于生物素化小分子，所研究的分子可以是酶、抗體、或者可結(jié)合小分子的結(jié)合性蛋白；等等)。提供了特定的實施例，當(dāng)生物素化BSA時，使用通過以低摩爾的生物素投入比率而制備的低投入比率的生物素化BSA，用于涂敷支持物來捕獲SA。然后可以將該SA復(fù)合至合適的生物素化的捕獲部分。本發(fā)明提供的方法用于將生物素化分子涂敷到支持物上來捕獲、定向、以及連接少于飽和量的分子，所述分子具有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域(例如抗生物素蛋白、SA、或者NeutrAvidin)。提供的特定實施例顯示了在PMP表面上涂敷低摩爾投入比率的生物素-BSA用于捕獲、定向、以及連接少于飽和量的SA。本發(fā)明提供的方法使用嵌段共聚物作為用于涂敷有生物素化和/或未生物素化的分子的支持物的封閉劑。提供的特定實施例顯示了使用三區(qū)段共聚物Pluronic⑧F108作為用于涂敷有低投入比率的生物素-BSA的PMP的封閉劑。本發(fā)明提供的方法用于通過使用嵌段共聚物作為用于涂敷有生物素化和/或未生物素化的分子的微粒的分散劑。提供的特定實施例顯示了使用Pluronic③F108作為用于涂敷有低投入比率的生物素-BSA的PMP的分散劑。本發(fā)明提供的方法用于在涂敷含有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的分子(例如，抗生物素蛋白、SA、以及NeutrAvidin)期間，使用嵌段共聚物作為用于涂敷有生物素化分子的微粒的分散劑。提供的特定實施例顯示了在涂敷有低投入比率生物素-BSA的PMP表面上涂敷SA期間使用Pluronic⑧F108作為分散劑(例如，在加入SA之前，先加入Pluronic⑧F108來制備低投入比率生物素-BSA微粒的單分散體)。本發(fā)明提供的方法用于將少于飽和量的包含兩個以上生物素結(jié)合性位點的分子(例如，抗生物素蛋白、SA、或者NeutrAvidin)涂敷、定向、以及連接到生物素化表面。提供的特定實施例顯示了在涂敷有低投入比率生物素-BSA的PMP表面上涂敷、定向、以及連接少于飽和量的SA。本發(fā)明提供的方法用于將少于飽和量的生物素結(jié)合分子連接、并且任選地定向到表面上。提供的特定實施例顯示了在特別地涂敷有SA(即，不飽和的并且被定向的)的PMP表面上涂敷、定向、并且連接少于飽和量的含生物素的結(jié)合物(例如，生物素化抗體、Fab片段、小分子、大分子、載體分子等)，用于親合分析比如，例如，免疫測定。親合分析包括，可以確定樣品中存在或不含分析物、和/或定量樣品中的分析物含量的測定，該測定直接或間接地基于在分析物和可優(yōu)選地結(jié)合分析物的分子之間的特異性的或者相對特異性的相互作用。親和分析包括，在至少一些方面依賴于一種實體對另一種實體的特異性或者相對特異性結(jié)合親合力的分析。親和分析包括，但不限于，依賴下述結(jié)合性相互作用的測定在受體和配體之間、酶與其底物之間、多聚核苷酸與其補體或者基本上的補體之間、小分子與可特異性結(jié)合小分子的結(jié)合性蛋白之間等。免疫測定包括依賴于在例如抗原與可識別抗原的抗體之間相互作用的測定。免疫測定還包括，例如，利用抗體或其片段來結(jié)合樣品中所研究抗原的測定。親和分析還包括，例如，競爭性測試和夾心法測試。這些測定包括依賴于表面被結(jié)合的抗原的相互作用的測定，用來檢測樣品中所研究的抗體；以及依賴于表面被結(jié)合的抗體或其片段的相互作用的測定，用來檢測樣品中所研究的抗原。這里使用的術(shù)語"抗原"不局限于多肽或者蛋白質(zhì)，而是還可以包括小分子(比如，例如，半抗原)和抗體(例如，抗體可以被用作抗原來產(chǎn)生可識別它們的其他抗體)。一般來講，在此使用的抗原包括樣品中通過使用本發(fā)明的組合物或方法用抗體或其片段進(jìn)行免疫測定的任何所研究的分析物。在此描述的組合物和方法的特定實施方式的應(yīng)用顯示在圖1A和1B中，顯示了在PMP表面上定向并連接少于飽和量的SA的特別情形。將在別處提供在該工序中的不同步驟的更祥細(xì)說明。對于表面包含生物素化BSA、能夠結(jié)合SA、依次能夠結(jié)合生物素化的捕獲部分比如例如免疫球蛋白或其片段的情況，提供了制備不飽和的并且被定向的表面的工序的一般說明。提供的這些論述和實施例描述了生物素/SA體系，雖然本發(fā)明不局限于生物素化的表面。應(yīng)當(dāng)注意的是，因為論述和實施例使用了生物素，并且典型地利用生物素來結(jié)合二價或多價的生物素結(jié)合性部分(比如，例如，SA)，所以使用多價生物素結(jié)合性部分的事實存在這樣的特殊的問題可能不會與未使用多價配體結(jié)合劑的許多結(jié)合性表面相接觸。這些問題之一是，當(dāng)使用涂敷有SA的生物素化微粒時，非共價結(jié)合的生物素的脫落可能會妨礙結(jié)合性表面的性能(例如，游離的生物素可以與SA分離和復(fù)合)。在這種情況下，該現(xiàn)象可以通過導(dǎo)入低投入比率的生物素化的BSA、而不是導(dǎo)入任意大大過量的生物素化BSA而被減少，因為低投入比率的生物素可以降低與BSA相連接的非共價結(jié)合的生物素的含量。而且，當(dāng)在微粒上用多價的部分比如SA涂敷支持物時，在涂敷SA期間可能會出現(xiàn)聚集現(xiàn)象。這是因為各個SA分子結(jié)合了一個以上生物素分子。SA是四聚體蛋白質(zhì)，分子量約為56,000Da,并且生物分子的具體例子是其具有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域。抗生物素蛋白-生物素相互作用是已知的在蛋白質(zhì)和配體之間最強烈的非共價相互作用，并且SA四個亞基中的每一個都可以結(jié)合生物素，結(jié)合常數(shù)為Ka-lO"M—1。SA的三級結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其四個生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域位于分子的相對側(cè)。如果SA生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域之一結(jié)合于生物素化表面，三個未被占據(jù)的生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域中的至少兩個將仍然是空間上可用于結(jié)合生物素化捕獲部分的?？股锼氐鞍缀蚇eutrAvidin是具有四個生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的四聚體蛋白質(zhì)的其他實施例；它們不同于SA之處在于它們的pI、溶解性、以及非特異性的結(jié)合特性。當(dāng)生物素化表面暴露于SA時，游離的SA將與表面上的生物素結(jié)合，但是與表面結(jié)合的SA然后可以結(jié)合己與另一種微粒結(jié)合的生物素。按這種方法，可以形成大的微粒聚集體。這可以通過在SA加入步驟產(chǎn)生單分散的微粒而被闡明。簡言之，用于在微粒上制備生物素-BSA表面的工序應(yīng)從低投入比率的生物素化的BSA開始。然后通過生物素-BSA中BSA中的伯胺對PMP的表面官能團(tuán)的共價連接，將低投入比率的生物素化BSA與PMP偶聯(lián)。得到的生物素化PMP被懸浮于合適的Pluronic⑧中一段時間(封閉步驟)，清洗，然后分離。接著，生物素化的PMP被懸浮于合適的Pluronic^中(增強分散的步驟)，并且加入SA。微粒在室溫下保溫一段時間，清洗，然后分離。一旦分離出來，可以加入合適的生物素化分子(比如生物素化捕獲部分)，用于任何特定的測定應(yīng)用。上述使用合適的Pluronic⑧的封閉步驟使非特異性、人為的結(jié)合現(xiàn)象最小化，同時允許所要求的特異性連接產(chǎn)生本發(fā)明的基于配體的復(fù)合物，該非特異性的、人為的結(jié)合現(xiàn)象涉及到本發(fā)明的不飽和的結(jié)合性表面上別的未被占據(jù)的結(jié)合位點(圖5和圖7)。這樣的封閉促進(jìn)了作為它們的連接部分的本發(fā)明的基于配體的復(fù)合物的空間(立體的)可接近性，并且便于本發(fā)明的各個基于配體的復(fù)合物按照形成目的的線性結(jié)構(gòu)定向，借此提高本發(fā)明的各個獲得的含有捕獲部分的復(fù)合物的優(yōu)化測定性能參數(shù)作用的可能性，所述參數(shù)包括作為實施例而非限定性的信噪比。另外，由于對免疫測定通常來說是正確的，封閉步驟也使非特異性結(jié)合最小化，該非特異性結(jié)合可以被描述為在免疫測定中的人為結(jié)合現(xiàn)象，該現(xiàn)象涉及其產(chǎn)生不期望有的副產(chǎn)品的組分和/或支持物表面，該副產(chǎn)品可能會對測定性能參數(shù)包括作為非限制性的實施例的信噪比產(chǎn)生不利影響。這種人為的結(jié)合現(xiàn)象對信噪比的不利影響可能采用如下形式降低信號、提高噪音、或者同時采用上述兩者。最終，因為與支持物表面和結(jié)合性表面的特異性結(jié)合同時被優(yōu)化、而與這些表面的非特異性結(jié)合被最小化，所以本發(fā)明的基于配體的組分從支持物和微?；蛭⒖装宓慕Y(jié)合性表面上的脫落附隨地被最小化。因為這些原因，用合適的Pluronic⑧封閉的步驟導(dǎo)致性能和制造性的改進(jìn)，其對下述性能產(chǎn)生有益的影響測定靈敏度(信噪比)、測定準(zhǔn)確度、測定精確性(定量測定)、測定再現(xiàn)性(定性分析)、測定穩(wěn)定性、或者PMP生產(chǎn)工藝再現(xiàn)性(PMP可制造性)、或它們的組合。上述在微粒上制備生物素-BSA表面的工序期間通過在添加SA之前使用合適的Pluronic⑧的增強分散步驟，，可以減輕微粒聚集，并且附隨地提高暴露在微粒上的表面面積(圖6和10)，借此賦予微粒表面上最小數(shù)量的不能用于結(jié)合的基于配體的復(fù)合物。這樣的Pluronic⑧介導(dǎo)的抑制聚集性可用于包括、但不限于如下應(yīng)用增強PMP可制造性(PMP工序再現(xiàn)性)，并且改進(jìn)測定性能和其中使用這種PMP的試劑盒。當(dāng)來自不同批次PMP的微粒聚集水平在PMP生產(chǎn)工藝之前、期間、和之后是可控制時，增強了PMP可制造性。在PMP生產(chǎn)工藝后，使用這種PMP進(jìn)行測定的性能可以通過包括、但不限于下述的手段被優(yōu)化:在免疫測定期間在添加樣本以前將微粒暴露于含有Phironic③的溶液和/或在免疫測定期間在添加底物之前將微粒暴露于含有Pluronic⑧的溶液。因為這些原因，用合適的Pluronic⑧增強分散的步驟導(dǎo)致性能和制造性的改進(jìn)，其對下述性能產(chǎn)生有益的影響測定靈敏度(信噪比)、測定準(zhǔn)確度、測定精確性(定量測定)、測定再現(xiàn)性(定性分析)、測定穩(wěn)定性、或者PMP生產(chǎn)工藝再現(xiàn)性(PMP可制造性)、或它們的組合。圖1A和1B所示的工藝是這樣的特定實施方式其使用均一尺寸(<5%CV)1.0pm的MyOne甲苯磺酰基活化的(沒有要求進(jìn)一步的表面激活)Dynal⑧PMP(Invi加gen公司)、低投入比率(4分子生物素試劑1分子BSA)的生物素化BSA、Pluronic⑧F108三區(qū)段共聚物(合成的、非生物學(xué)的；BASF公司)、SA21SA-PLUS(冷凍，從不凍干；ProZyme⑧)、磁石，來分離并洗滌微粒(緩沖液交換)。微粒處理涉及利用25mgPMP/mL的濃度、在高處的混合和超聲處理，從而再懸浮并分散微粒用于重懸浮工序，利用在高處混合進(jìn)行保溫工序、升溫(38-42°C)保溫和室溫保溫，利用甲苯磺?；瘜W(xué)技術(shù)將生物素化BSA經(jīng)由BSA伯氨基團(tuán)而共價偶聯(lián)于微粒表面甲苯磺?；鶊F(tuán)。利用Pluronic③F108三區(qū)段共聚物用于微粒表面封閉(除去被動吸附的蛋白質(zhì)、最小化蛋白質(zhì)對微粒表面的非特異性結(jié)合)，利用PluroriiCF108三區(qū)段共聚物用于PMP的單分散，并且當(dāng)存在PluronicF108三區(qū)段共聚物時將SA二級偶聯(lián)(親合)至生物素-BSAPMP中間體上(在SA偶聯(lián)工藝期間減輕微粒聚集)。—種用于顯示在制備不飽和的、或者不飽和的并且被定向的表面中以低投入比率的生物素化后原理的便利途徑是，通過泊松分布的透鏡(thelensofaPoissondistribution)來顯示生物素化工藝。隨后的示意圖所示原理適用于所有的配體和支持物連接物配對(并不僅僅是生物素和BSA)。當(dāng)配體支持物連接物被涂敷在支持物上時，通過使用低的配體對支持物連接物的投入比率制備的配體::支持物連接物復(fù)合物被認(rèn)為可以得到更優(yōu)選的配體分子定向。該更優(yōu)選的配體分子的定向有助于支持物上涂層的空間可接近性。為了示意僅用于但并非限于任何特定的支持物連接物或配體的原理，在此使用生物素化的BSA說明該現(xiàn)象。下述示意圖適用于任何配體和支持物連接物，其中支持物連接物能夠與一個以上配體相連接。對于除生物素和BSA之外的配體和支持物連接物，如同在實施例1中的BSA通過選擇可提供期望穩(wěn)定性的投入比率、確定平均取代a)、并且圖示在合適的分布例如泊松分布中的定向效應(yīng)，可以確定配體對支持物連接物的投入比率。就生物素化的BSA而言，在BSA的氨基酸序列中有大量能夠通過使用伯胺反應(yīng)性的生物素化試劑硫代-NHS-LC-生物素而被生物素化的可能位點。賴氨酸--一種含有游離伯胺的氨基酸，在BSA的氨基酸序列中出現(xiàn)59次。然而，在BSA中僅約30至35個賴氨酸伯胺可以用來與胺反應(yīng)性的生物素化試劑起反應(yīng)。例如，N-末端胺類可以被掩埋、或封閉在BSA的三級結(jié)構(gòu)內(nèi)部。僅位于分子表面(例如，頂部、底部、側(cè)面、溝部、凹處等)的伯胺可用于生物素化。已經(jīng)憑經(jīng)驗確定(參見實施例l)，以4摩爾硫代-NHS-LC-生物素/每摩爾BSA的摩爾投入比率來生物素化BSA可以得到平均約1.63生物素分子/每BSA分子(參見表1)。對于BSA生物素化，假定硫代-NHS-LC-生物素與BSA分子(4摩爾硫代-NHS-LC-生物素對1摩爾BSA)進(jìn)行任意反應(yīng)、并且平均取代值a)為1.63分子生物素/每BSA分子，那么生物素化BSA分子的分布可以近似地使用泊松分布(參見圖3:20%的BSA具有0個生物素；32%的BSA具有1個生物素；26%的BSA具有2個生物素；14%的BSA具有3個生物素；6n/。的BSA具有4個生物素；2。/。的BSA具有5個生物素；并且〈1。/。的BSA具有6個生物素)。如圖3所示，泊松分布顯示，在選擇的摩爾投入比率的生物素:BSA下，至少50%的生物素-BSA復(fù)合物具有少于或等于3個生物素/每個支持物連接物(即，BSA)。該分布也顯示，在選擇的摩爾投入比率下，每個BSA分子結(jié)合有0至6個生物素。低投入比率的生物素化BSA可以被與支持物共價偶聯(lián)，因為BSA具有約30至35個伯胺可用于伯胺化學(xué)技術(shù)，并且泊松分布預(yù)計，在低投入比率的生物素化后，BSA的0-6個伯胺被結(jié)合于生物素。因此，約24至35個伯胺仍然可以用來將各個BSA分子經(jīng)由伯胺化學(xué)技術(shù)(例如，甲苯磺酰基、環(huán)氧基、碳二亞胺等)共價偶聯(lián)于支持物。多個可利用的伯胺可以提高BSA偶聯(lián)至支持物官能團(tuán)的效率，并且可以經(jīng)由多個連接點(即，一個以上支持物對BSA共價鍵/每BSA分子)提高穩(wěn)定性。根據(jù)生物素化試劑廠商說明書(Pierce化合物公司.抗生物素蛋白-生物素化學(xué)技術(shù)手冊A。M.Savage等，第二版，1992.第34頁)，用2.5摩爾生物素/每摩爾蛋白質(zhì)生物素化的蛋白質(zhì)還可以得到蛋白質(zhì)庫中的高斯(鐘形)分布。雖然在該庫中的一些蛋白質(zhì)可以不具有被結(jié)合的生物素，但大多數(shù)具有2-3摩爾被結(jié)合的生物素，并且?guī)熘蟹浅Ｐ〉牟糠挚梢跃哂?摩爾被結(jié)合的生物素。因為生物素可能與任何可利用的伯胺結(jié)合，因此非常有可能產(chǎn)生不同的具有生物素的生物素-BSA結(jié)合物，該生物素被結(jié)合于各個BSA分子上不同的可利用的胺。顯示如何使用低投入比率的生物素化BSA的示意圖如圖4所示，其顯示了低投入比率的生物素-BSA偶聯(lián)于1.0微米甲苯磺?；罨奈⒘９滔?，該固相的表面官能團(tuán)(即，羧酸、甲苯磺?；罨鶊F(tuán)、環(huán)氧基等)被用于共價結(jié)合生物素-BSA原始的氨基或巰基官能團(tuán)。相對于其表面上的生物素，得到的支持物是不飽和的并且被定向的。因為生物素-BSA結(jié)合物(配體::支持物連接物復(fù)合物)可以具有不同數(shù)量的生物素/每BSA分子，并且BSA分子的定向和表面生物素的位置是任意的，因此生物素-BSA結(jié)合物將與支持物表面相偶聯(lián)，從而使得那些延伸進(jìn)入溶液的生物素作為結(jié)合性表面是空間上可利用的，并且面向支持物表面的那些生物素作為結(jié)合性表面是空間上不能利用的。主要市售微粒是基于聚苯乙烯的微粒，并且蛋白質(zhì)對微粒表面的吸附被動地發(fā)生(例如，通過疏水性相互作用和/或離子相互作用)，并且是非特異性的。盡管顯示了甲苯磺酰基活化的微粒，但支持物可以用任何合適的可以共價結(jié)合生物素-BSA官能團(tuán)(例如，BSA的原始氨基或硫氫基)的官能團(tuán)(例如，羧酸、環(huán)氧基等)活化。如果BSA分子的表面上的各個￡胺具有相同的峰值，那么生物素在BSA表面上的分布將是高斯型曲線(Pierce化合物公司.抗生物素蛋白-生物素化學(xué)技術(shù)手冊A.M.Savage等，第二版，1992。第34頁)。圖4顯示了通過將平均取代值a)為1.63個生物素/每BSA分子的生物素-BSA共價連接至1.0微米支持物而制備的不飽和表面。由示意圖可以看出，在此至少部分地通過用低投入比率的生物素化BSA涂敷支持物而取得了不飽和性。另一種在支持物上取得不飽和的結(jié)合性表面的方法包括以選擇的配體對支持物連接物的摩爾投入比率制備配體::支持物連接物復(fù)合物；制備得到的配體::支持物連接物復(fù)合物的稀釋制品；以及在將配體::支持物連接物復(fù)合物與支持物連接的過程中，使用配體::支持物連接物復(fù)合物的稀釋制品來涂敷支持物。對于結(jié)合了至少二價生物素結(jié)合性部分的生物素化表面，所選擇的摩爾投入比率優(yōu)選是低的生物素對支持物連接物的摩爾投入比率，從而減少由于脫落境成的性能降低。在該方法中，低的投入比率并不決定得到的支持物的不飽和特性，因為與支持物偶聯(lián)的配體的不飽和本質(zhì)是通過限制在支持物上每單位面積的配體::支持物連接物復(fù)合物的濃度而取得的，而不是通過限制每個支持物連接物上的配體含量取得。因此，例如，通過使用該方法，BSA可以以超過4摩爾生物素/每摩爾BSA的摩爾投入比率與生物素結(jié)合，雖然生物素化優(yōu)選是以低的生物素投入比率進(jìn)行，以便降低在結(jié)合性表面上非共價結(jié)合的生物素含量。雖然在許多情形中，在較高的配體對支持物連接物的摩爾投入比率下(例如，以約20以上摩爾生物素化試劑/每摩爾BSA的摩爾投入比率)會有不期望的和/或浪費的生物素化BSA(或者偶聯(lián)任何配體與任何支持物連接物)，但采用該方法，以這樣的高投入比率制備的配體::支持物連接物復(fù)合物(例如，生物素-BSA)也可以被用于制造不飽和的結(jié)合性表面。因此，與限制配體/每支持物連接物的平均取代值a)(例如，生物素/每BSA)無關(guān)，通過在將配體::支持物連接物復(fù)合物偶聯(lián)至支持物的反應(yīng)中限制配體::支持物連接物復(fù)合物的濃度，可以實現(xiàn)對支持物上的配體飽和性的限制。例如，通過控制反應(yīng)速度，例如，控制反應(yīng)溫度(例如，對于吸熱的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行冷卻，或者對于放熱的偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行加熱)、選擇較慢的或較少的反應(yīng)性偶聯(lián)化學(xué)技術(shù)、限制反應(yīng)時間等，可以進(jìn)一步控制飽和程度。如上所述，主要市售微粒是基于聚苯乙烯的微粒。己知通過例如疏水性作用和/或離子相互作用，蛋白質(zhì)可被動吸附至這些表面。在此論述了通過使用封閉劑比如，例如，至少一種Pluronic③來改良非特異性結(jié)合。如同在別處詳細(xì)地公開的那樣，這些試劑也可用于產(chǎn)生包含結(jié)合性表面的單分散或者基本上單分散的微粒制品。嵌段共聚物作為封閉劑用于固相的應(yīng)用、以及對于使用Pluronic⑧嵌段共聚物作為封閉劑用于涂敷有低投入比率的生物素化BSA的微粒的特定情況，如圖5所示。圖中，Pluronic⑧F108(分子量=13,518Da;親水親油平衡值(HLB)=27)，封閉了固相的暴露的疏水性聚合物表面，并且在沒有除去共價附接的蛋白質(zhì)的情況下替換、除去、或者剝離被動吸附的蛋白質(zhì)。由于在Pluronic⑧的尾部存在表面羥基，故該表面仍然保持親水性?？梢允褂萌魏魏线m的有能力與支持物表面相連接、并且也延伸出相對親水性的尾部進(jìn)入周圍介質(zhì)的嵌段共聚物。三區(qū)段共聚物(比如，例如，購自BASF公司的PluronicF108)具有約17至約69個單體單元長度的單一疏水性的聚丙烯(PPO)頭部基團(tuán)、以及兩個有1至約129個單體單元長度的親水性聚乙烯(PEO)尾部。三區(qū)段共聚物的親水親油平衡值(HLB)直接地與PPO頭部基團(tuán)和PEO尾部的長度或大小相關(guān)，并且HLB值可以是1(在水中不溶解)至29(可高度溶于水)。如果PPO頭部基團(tuán)是至少56個單體單元長度，那么三區(qū)段共聚物的頭部基團(tuán)不僅用作疏水性的探針并強烈地結(jié)合到疏水表面上，而且其能與來自相同疏水表面的另一種分子相競爭并且替換。如果兩個PEO尾部都是至少105個單體單元長度，那么它們將離開固相表面而延伸進(jìn)入溶液。在各個PEO尾部末端的羥基提供了親水性的小環(huán)境，因為該尾部足夠長并且在溶液中自由地從一側(cè)移動至另一側(cè)，并且該羥基尾部用作空間屏障以抑制蛋白質(zhì)的被動吸附或者再吸附至固相支持物表面?；诩俣?.82至1.03微米的球形微粒的光滑表面具有1.5g/cm3的密度的理論有效表面面積(38.83至48.77cm〃每mg微粒)、、以及PluronicF127分子的理論上的界面表面積(15.1至20.0nm2)，微粒表面上的理論上單層的PluronicF127被計算出為約4.05Xl()4至約5.43XIO"4nmol的Pluronic⑧F127/每mg微粒。用5-(4,6-二氯三嗪基)氨基熒光素(5-DTAF)標(biāo)記的Pluronic⑧F127的熒光分析表明，約3.68X10—4至約8.37X10—4nmol的Pluronic⑧F127可結(jié)合每微克的0.82至1.03微米的球形微粒。血球計數(shù)分析被用于確定要求完全破裂所有基于聚苯乙烯的PMP聚集體、并且導(dǎo)致微粒單分散的PluronicF108、PluronicF127、以及Tetronic⑧908的最小濃度。濃度優(yōu)化研究表明，Pluronic③F108產(chǎn)生了濃度為約5mM(0.007%w/v)至約500mM(0.67%w/v)的僅為單體和二聚體的微粒單分散。用Pluronic⑧F127得到了濃度為約6.67mM(0.009%w/v)至約33.33mM(0.043%w/v)的微粒單體、二聚體和三聚體，以及濃度為約50mM(0.064%w/v)至約667mM(0.850%w/v)的單體、二聚體和較大的聚集體。然而，Tetronic⑧908產(chǎn)生了最大測試濃度的聚集體。濃度為約0.4%w/v至約0.6%w/v的Pluronic⑧F108可用作生物素-BSAPMP封閉劑。在本發(fā)明的其他實施方式中，Pluronic⑧F108以約0.1%w/v至約1.0%w/v、或約0.5%w/v至約0.75%w/v的濃度被加入。在加入具有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的生物素結(jié)合性分子之前將嵌段共聚物作為用于涂敷有生物素化分子的微粒的分散劑的應(yīng)用如圖6所示，圖中所示為在將SA加至涂敷生物素的微粒之前使用Pluronic⑧F108作為分散劑的特定實施方式。圖中顯示，Pluronic⑧F108被用于促進(jìn)單分散并阻斷對表面的非特異性結(jié)合。圖中顯示了存在或不存在Pluronic⑧F108時添加至少二價的生物素結(jié)合性分子的情況。當(dāng)不存在PluronicF108時，在加入生物素結(jié)合性分子期間微?？赡軙奂．?dāng)存在PluronicF108時，在加入生物素結(jié)合性分子期間和之后，微粒是單分散的。分散步驟優(yōu)選是在用于最優(yōu)結(jié)果的特定情況下進(jìn)行的，因為，例如，顯示為可與具有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的生物素結(jié)合性部分(例如，抗生物素蛋白、SA、或NeutrAvidin)結(jié)合的生物素-BSA的生物素化微粒顯示出如下傾向由于生物素化微粒經(jīng)由各個生物素結(jié)合性部分的兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的交聯(lián)而聚集或者凝塊。例如，涂敷有合成的或生物學(xué)的包含兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域/每個生物素結(jié)合性部分的配體結(jié)合劑(生物素結(jié)合性部分)的生物素化微粒具有如下傾向由于在一種生物素化的微粒上生物素結(jié)合性部分的未被占據(jù)的、可以接近的結(jié)合性結(jié)構(gòu)域與在另一種生物素化微粒上的未結(jié)合的、可以接近的生物素(配體)相結(jié)合而聚集或者凝塊。通過將生物素化微粒慢慢地滴入(g卩，逐滴加入)含有非常高濃度或摩爾過量的生物素結(jié)合性部分(例如，抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白片段或NeutrAvidin的片段)的連續(xù)地混合的溶液中，可以減輕微粒聚集。該方法可以通過在交聯(lián)可能發(fā)生之前用生物素結(jié)合性分子來飽和微粒表面生物素而減輕微粒聚集。然而，滴定方法并不是非常成本有效的或?qū)嵱玫?，因為有多個參數(shù)需要控制，并且其由于特定的生物素結(jié)合性部分的成本而可能是相當(dāng)昂貴的。但是其在用挑選的生物素結(jié)合性部分涂敷后可以取得微粒單分散。對于上述緩慢滴定方法，使用嵌段共聚物比如Pluronic⑧可能是較好的可選方法。Pluronic⑧F108(購自BASF公司的三區(qū)段共聚物)具有約56個單體單元長度的單一疏水性的聚丙烯(PPO)頭部基團(tuán)、以及兩個有約129個單體單元長度的親水性聚乙烯(PEO)尾部。Pluronic⑧F108的PPO頭部基團(tuán)用作疏水性的探針并且較強地結(jié)合于在蛋白質(zhì)或固相支持物表面比如微粒支持物表面上的疏水性斑點(patch)或位點。其結(jié)果是，由于表面蛋白質(zhì)相互作用(即疏水性的或離子性的蛋白質(zhì)相互作用)，Pluronic⑧F108可以被用于破壞微粒聚集。由于疏水性相互作用或離子性相互作用，該PEO尾部提供了親水性的小環(huán)境并且可以用作空間屏障以抑制蛋白質(zhì)再連接。其結(jié)果是，一旦微粒用Pluronic⑧F108處理，它們是非常親水性的并且被單分散在溶液中。本發(fā)明的一個實施方式提供了與微粒有關(guān)的改進(jìn)的親合分析。本實施方式中，通過使用嵌段共聚物比如Pluronic⑧F108或F127，制備出分散的微粒的群體、比如微粒的單分散群體。分散的微粒然后被并入普通的親合分析。因為微粒被分散，親合分析將具有提高的靈敏度(信噪比)、提高的測定準(zhǔn)確度、提高的測定精確性(定量測定)、以及提高的測定再現(xiàn)性(定性分析)。圖6和圖7示意了對于Pluronic⑧F108和涂敷了SA的微粒的特定情形，在分散步驟中使用嵌段共聚物。圖7顯示，用低投入比率的生物素化BSA涂敷、并且用PluronicF108封閉的微粒被分散或者再懸浮于0.4%至0.6%(w/v%)PluronicF108中。一旦生物素化微粒被單分散，就加入SA來涂敷生物素化微粒。因為SA(分子量約56kDa)稍小于BSA(分子量約66kDa)，很可能僅一個SA分子空間上可以與一個生物素-BSA分子結(jié)合(即使BSA具有多個可以接近的生物素)。另外，并非每個BSA分子都具有可利用的生物素(參見上述泊松分布的論述)。因此，在結(jié)合性表面上捕獲的SA分子總數(shù)將小于與支持物表面偶聯(lián)的BSA分子的總數(shù)，并且SA在結(jié)合性表面上將是不飽和的(將有少于最大含量的SA分子/每單位表面面積)(參見實施例ll)。在用生物素化的合成分子或生物分子(配體::支持物連接物復(fù)合物)涂敷支持物表面之后，其可以被用于捕獲、或者捕獲并定向小于飽和量的含有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的合成或生物學(xué)配體結(jié)合劑(生物素結(jié)合性部分)。假定生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域位于各個生物素結(jié)合性部分相反的或近似相反的末端或側(cè)面，則其生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域中的至少一個將與固相生物素結(jié)合，反之，其剩余的相反的或近似相反的生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域?qū)⒖梢杂脕砼c生物素化的捕獲部分(例如，生物素化抗體或抗原)結(jié)合。正如以上的討論，通過在加入生物素結(jié)合性部分之前將生物素化微粒分散在約0.4%至約0.6°/。的Pluronic⑧F108(三區(qū)段共聚物)中，或者通過將生物素化微粒慢慢地滴入(例如，逐滴)含有非常高濃度或摩爾過量的生物素結(jié)合性部分的連續(xù)地混合的溶液中，生物素化微粒可以用含有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的合成的或生物學(xué)的配體結(jié)合劑(生物素結(jié)合性部分)涂敷，而沒有微粒聚集的情況。實際上，Pluronic⑧F108以約0.1%至約1.0%(w/v%)、或者作為另一種選擇為約0.4%至約0.6%(w/v%)的濃度分散涂敷有低投入比率的生物素化BSA的微粒。一旦生物素化、微粒被處理并且被分散在約0.4%至約0.6%(w/v%)Pluronic⑧F108溶液中，就可以將低水平或含量的SA加至生物素化微粒，而不形成微粒聚集體或凝塊。該工藝導(dǎo)致在涂敷特異性的生物素結(jié)合性部分(例如SA)后微粒單分散。與如上所述微粒滴定法相比較，該工藝成本有效得多，并且是非常實用的和可再現(xiàn)的方法，可用于用含有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的合成的或生物學(xué)的配體結(jié)合劑(生物素結(jié)合性部分)涂敷生物素化微粒。產(chǎn)生不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的一個目標(biāo)在于，提供一種基礎(chǔ)，用于為親合分析構(gòu)建組分。因為根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的襯底的配體::支持物連接物復(fù)合物是不飽和的并且被定向的，在該配體::支持物連接物復(fù)合物上構(gòu)造的任何組分將反映出其不飽和的本質(zhì)和定向性。這樣一種結(jié)構(gòu)的實施例如8圖所示。圖8顯示了將生物素化捕獲部分涂敷到通過下述步驟制備出的生物素特異性的微粒結(jié)合性表面上(1)用低投入比率的生物素化BSA涂敷表面；(2)用三區(qū)段共聚物Pluronic⑧F108封閉表面；(3)在加入含有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的合成的或生物學(xué)的生物素結(jié)合性部分(例如，SA)之前在Pluronic⑧F108中分散微粒；以及(4)將SA加至表面。得到的涂敷了SA的微粒可以被用于定向并且捕獲不飽和量的所研究的任何生物素化的捕獲部分。圖8顯示了如何將涂敷了SA的微粒用于定向并捕獲不飽和量的所研究的特定的生物素化捕獲部分，所述捕獲部分包括(a)抗體的Fab片段(不含IgFc區(qū)域可以降低或減輕非特異性的結(jié)合現(xiàn)象)；(B)免疫球蛋白(多克隆抗體和/或單克隆抗體)；以及(C、D和E)分別為小的、中等的、和/或大的分子，無論它們是合成的還是生物學(xué)的分子。任何所研究的生物素化捕獲部分可以包含，例如，在分子和生物素部分之間的間隔物。間隔物可以對相對小的生物素化分子特別有用。因為SA分子中的生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域被掩埋在表面下9埃處，由于空間位阻，生物素化小分子(例如，分子量小于約l，OOODa的小分子)可能不會被較大的免疫測定示蹤(可檢測的結(jié)合劑)檢測到。通過使用具有附接于它們的間隔物臂的生物素衍生物、或者通過將小分子結(jié)合于較大的生物素化分子(即，載體分子)，可以獲得更大的結(jié)合力和更高的檢測靈敏度。為了達(dá)到它們可用的程度，用于辨別小分子與中等分子或大分子的方針可以按下述方法表示小分子通常被認(rèn)為分子量小于約5,000Da;中等分子通常被認(rèn)為分子量為約5,000以上至約150,000Da;大分子通常被認(rèn)為分子量為大于約150,000Da。在根據(jù)本發(fā)明制備具有結(jié)合性表面的微粒中的本發(fā)明的某些方面如圖9A和9B所示。圖9A和9B顯示了將小于飽和量的生物素化抗體、或生物素化Fab片段定向并涂敷到根據(jù)本發(fā)明制備的生物素結(jié)合性微粒(例如，涂敷了SA的微粒)上。根據(jù)本發(fā)明制備的涂敷了SA的PMP可以提高免疫測定靈敏度(提高信噪比)，因為生物素結(jié)合性固相可以被用于定向并捕獲少于飽和量的生物素化捕獲部分比如對分析物特異的生物素化抗體或Fab片段。因為各個涂敷了SA的微粒的SA分子總數(shù)/每支持物表面積的降低導(dǎo)致生物素化捕獲抗體結(jié)合力降低、但是由于空間自由度的提高而引起生物素化捕獲抗體結(jié)合性能的提高，故測定靈敏度得到改善。目卩，在表面上提供低于最大含量的SA分子的目的在于提高各個SA分子結(jié)合較大的生物素化捕獲部分(例如，生物素化抗體)的空間自由度，并且提高各個SA分子的結(jié)合效率。圖9A顯示了普通的或標(biāo)準(zhǔn)的涂敷了SA的微粒表面，其中通過伯胺或其他偶聯(lián)化學(xué)技術(shù)，SA被直接涂敷到微粒表面上，并且使用BSA封閉表面。在這樣一種普通的或標(biāo)準(zhǔn)的表面上，SA分子在表面上未被特定地不飽和化或定向；也就是說，其附著是任意的。加入生物素化抗體或Fab片段會得到如下結(jié)合性表面未被顯著地不飽和化或定向，因為表面上的SA被隨機定向。抗體或Fab擁擠可能會產(chǎn)生空間障礙(可接近性低)并且降低抗原捕獲效率，尤其當(dāng)抗原是大分子時。圖9B顯示了根據(jù)本發(fā)明制備的涂敷了SA的微粒結(jié)合性表面。在該結(jié)合性表面上，SA分子是不飽和的(總的SA分子/每單位微粒結(jié)合性表面下降)并且在表面上被定向。該微粒支持物表面被低投入比率的生物素化BSA共價涂敷，并且用Pluronic⑧F108封閉。然后在SA加入之前，將生物素化微粒分散在Pluronic③F108中。SA附著是特異性的并且是非隨機的。附著于根據(jù)本發(fā)明制備的SA微粒結(jié)合性表面的生物素化抗體或者生物素化Fab片段是不飽和的并且被定向的，因為在結(jié)合性表面上SA分子也是不飽和的并且被定向的。生物素化抗體或者生物素化Fab片段的這種定向并且不飽和的性質(zhì)會促進(jìn)抗原(分析物)捕獲效率(信號被提高)，尤其是當(dāng)抗原是大分子時。另外，歸因于Pluronic⑧F108封閉劑，微粒的表面是親水性的，并且對表面的非特異性結(jié)合被最小化或消除(噪音被降低)。本發(fā)明的另一個特征如圖10所示，其顯示了增加的與微粒單分散有關(guān)的可利用的表面面積。圖10中，A欄顯示了由于微粒-微粒表面間相互作用而產(chǎn)生的微粒聚集體或凝集物。該聚集現(xiàn)象將同時降低(1)總的可利用的微粒表面面積，因為聚集體內(nèi)側(cè)任何面積都不是空間上可利用的(可以接近的)；以及(2)結(jié)合性表面上生物素結(jié)合性部分(例如，SA)的結(jié)合力和效率，導(dǎo)致測定信號降低。圖10中，B欄顯示了根據(jù)本發(fā)明的微粒增加了結(jié)合性表面面積，從而得到結(jié)合性表面上生物素結(jié)合性部分(例如，SA)的提高的結(jié)合力和提高的結(jié)合效率，導(dǎo)致測定信號增強。與聚集體微?；蛭⒘Ｄ龎K相比，單分散的微粒具有更多的總的可利用的表面面積，并且由于提高的碰撞率和降低的測定擴(kuò)散距離，而將提供改進(jìn)的測定動力學(xué)。根據(jù)本發(fā)明的微粒設(shè)計如下用嵌段共聚物比如三區(qū)段共聚物Pluronic⑧F108封閉低投入比率的生物素化BSA結(jié)合性表面，并且正如以上的討論，在加入SA分子之前將中。當(dāng)然，Pluronic⑧F108僅是本實施方式的示例。應(yīng)理解，本發(fā)明的任何嵌段共聚物可以以這種方式使用。通過使用生物素作為配體、并且使用BSA或卵清蛋白作為支持物連接物，來制備根據(jù)本發(fā)明的微粒。也制備涂敷了SA的微粒，以及具有特異性的捕獲部分的微粒。在下文和在實施例中論述這些研究的結(jié)果。研究了生物素化反應(yīng)中改變生物素摩爾投入比率的影響，并且結(jié)果顯示在實施例1中。BSA以不同的生物素對BSA的摩爾投入比率3.4:1至30:1進(jìn)行生物素化，確定生物素化的程度，并且確定在4。C下和37。C下3天的穩(wěn)定性(參見表l)。穩(wěn)定性降低至少部分地反映生物素或生物素試劑從生物素-BSA結(jié)合物上的脫落或者解離(參見圖11)。結(jié)果表明，以較高的生物素摩爾投入比率(例如，8:1、15:1、以及30:1)制備的生物素-BSA顯示出微弱的穩(wěn)定性，但是隨著生物素試劑對BSA的摩爾投入比率從30:1降低至4:1，穩(wěn)定性從4%提高到100%。因此，選擇相對低的配體對支持物連接物的投入比率，并且將配體::支持物連接物復(fù)合物連接至固相，可以得到比通常制備的具有生物素作為配體的結(jié)合性表面更穩(wěn)定的結(jié)合性表面?？梢酝ㄟ^在配體::支持物連接物復(fù)合物制備之后、但在其被涂敷到支持物表面之上之前向其加入合適的分散劑來促進(jìn)通過用以任何投入比率而制備的配體::支持物連接物復(fù)合物(尤其是用以較高配體對支持物連接物的投入比率而制備的配體::支持物連接物復(fù)合物)涂敷支持物表面來制備不飽和的結(jié)合性表面。在此論述用于該方法的合適分散劑。在此提供一個示意圖，用于解釋使用合適的分散劑與以低的生物素對BSA的投入比率而制備的生物素-BSA—起來制備不飽和的表面，雖然該使用分散劑的方法不局限于生物素化涂層。提供一種制造不飽和的結(jié)合性表面方法，其通過使用合適的分散劑來抑制固相支持物比如，例如，微粒的聚集。該方法是至少部分地基于下述現(xiàn)象相對分散(例如，近似單分散)的微粒制品是所期望的。當(dāng)微?？赡馨l(fā)生聚集時，例如，其中配體是生物素并且生物素用SA涂敷，可以使用該方法。當(dāng)配體結(jié)合劑是至少二價時，也就是說，當(dāng)單一的、至少二價的生物素結(jié)合性部分比如SA可將一個微粒上的生物素-BSA分子中的生物素與另一個微粒上的生物素-BSA分子中的生物素交聯(lián)時，該分散方法特別有用。對于在下文和實施例2中的實施方式其中配體::支持物連接物復(fù)合物是生物素-BSA，并且配體結(jié)合劑(生物素結(jié)合性部分)是SA，在此提供一種該分散方法的示意圖。如同此前的解釋，該方法不局限于生物素/SA結(jié)合性表面。分散劑比如嵌段共聚物可以用于制備不飽和的結(jié)合性表面的方法。在此提供一個示意圖，在加入包含兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的合成的或生物學(xué)的生物素結(jié)合性部分(配體結(jié)合劑)之前，嵌段共聚物被用作分散劑而用于涂敷有合成的或者生物學(xué)的配體::支持物連接物復(fù)合物的微粒。在此提供一個示意圖，使用嵌段共聚物Pluranic⑧F108;然而，該方法不局限于示意圖中特定的嵌段共聚物?！愕兀瑘D7顯示了用含有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的合成的或生物學(xué)的生物素結(jié)合性部分(配體結(jié)合劑)來涂敷合成的或生物學(xué)的生物素化表面。更具體地講，圖7顯示，將SA涂敷到用Pluronic⑧F108封閉并且在SA加入之前分散在Pluronic⑧F108中的低投入比率的生物素化BSA微粒結(jié)合性表面。在此提供的方法和組合物可以用于制備用于固相支持物表面的不飽和涂層，其中，涂層包含與支持物表面偶聯(lián)的配體::支持物連接物復(fù)合物、與配體::支持物連接物復(fù)合物中的配體相連接的配體結(jié)合劑(生物素結(jié)合性部分)、以及與配體結(jié)合劑相連接的捕獲部分(例如，生物素化的捕獲部分)?？梢赃x擇捕獲部分，從而便于捕獲所研究的任何分子比如分析物。對于生物素/SA體系，在下文和圖8中提供了說明，但是本發(fā)明不局限于生物素/SA體系。通過在支持物表面上定向并連接少于飽和量的含有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的合成的或生物學(xué)的配體結(jié)合劑(生物素結(jié)合性部分)，可以設(shè)計不飽和的結(jié)合性表面。該表面可以通過一個實施例顯示，其中在微粒例如PMP的表面上定向并提供了小于飽和量的SA。圖8顯示了通過將生物素化捕獲部分涂敷到生物素結(jié)合性微粒結(jié)合性表面上而制備不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面，其中所述生物素結(jié)合性微粒結(jié)合性表面通過下述步驟制備(1)用低投入比率的生物素化BSA涂敷表面；(2)用三區(qū)段共聚物Pluronic⑧F108封閉表面；(3)(在加入含有兩個以上生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域的合成的或生物學(xué)的生物素結(jié)合性部分之前)將微粒分散在Pluronic⑧F108中；以及(4)加入SA作為生物素結(jié)合性部分。如圖8所示，涂敷了SA的微?？梢员挥糜诙ㄏ蚝?或捕獲小于飽和量的生物素化捕獲部分例如(A)抗體的Fab片段(不含IgFc區(qū)域可以降低或減輕非特異性的結(jié)合現(xiàn)象)；(B)免疫球蛋白(多克隆抗體和/或單克隆抗體)；以及(C、D和E)分別為小的、中等的、和/或大的分子，無論它們是合成的還是生物學(xué)的分子。圖8顯示了在采用生物素/SA體系的不飽和的結(jié)合性表面上的生物素化捕獲部分。共價附接于微粒表面的低投入比率的生物素化BSA用三區(qū)段共聚物Pluronic⑧F108封閉，在加入SA之前，微粒被分散在Pluronic⑧F108中，接著加入SA，并且然后期望的生物素化的捕獲部分被暴露于不飽和的涂敷了SA的表面。顯示的生物素化捕獲部分實施例包括(圖8中從左至右生物素化Fab片段(分子量為約30,000Da)、生物素化抗體(IgG、分子量為約150,000Da);生物素化小分子、或具有間隔臂的生物素化小分子(例如，分子量小于約5,000Da);生物素化中等分子、或作為小分子載體的生物素化中等分子(例如，分子量約5,000Da至約150,000Da);以及生物素化大分子(例如，分子量大于約150,000Da)。如圖8所示，在固相支持物的表面，生物素-BSA的定向和不飽和的性質(zhì)被反映在不飽和的涂敷了SA的表面，并且同樣反映在不飽和的捕獲部分涂層。Pluronic⑧F108的疏水性頭部基團(tuán)被顯示出與支持物表面相連接，并且Pluronic⑧F108的親水性尾部基團(tuán)被顯示出延伸離開支持物表面。根據(jù)本發(fā)明的不飽和的結(jié)合性表面典型地具有與市售結(jié)合性表面相比較低的結(jié)合力。提供了一個使用生物素/SA體系的實施例(參見表2、實施例2)。用每單位表面面積較少的SA分子涂敷的支持物將固有地具有降低的結(jié)合生物素的能力，因為該表面將具有較少的生物素結(jié)合性位點。該在表面上提供低于最大含量的SA分子的目的在于提高各個SA分子結(jié)合較大的生物素化捕獲部分(例如，生物素化抗體)的空間自由度，并且提高各個SA分子的結(jié)合效率。實施例2顯示，在結(jié)合性表面上具有被定向并且小于飽和量的分子降低了結(jié)合力，但是提高了測定信號，導(dǎo)致較好和更有效的用于親合分析的結(jié)合性表面。根據(jù)本發(fā)明的微粒顯示出與類似的、市售、普通的或者標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)品(參見，例如，表2)相比降低的結(jié)合力，但是顯示出增強的測定性能(參見，例如，表3和表4)。由于較低的背景而提高的信噪比和提高的信號反應(yīng)反映了增強的測定性能。總體上，本發(fā)明得到的支持物允許用于生產(chǎn)涂敷了SA的微粒，該微粒具有與市售涂敷有SA的微粒相比更低的結(jié)合力、但是由于微粒表面上的鏈霉抗生物素蛋白定向和空間可接近性而具有增強的測定性能，并且具有新穎的結(jié)合性表面封閉性。實施例3顯示，根據(jù)本發(fā)明的分散步驟制備的微粒得到了基本上不含聚集體或凝塊的微粒單分散群體。實施例4顯示，在一個涂敷了SA的微粒的特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的微粒與普通或標(biāo)準(zhǔn)的微粒相比，顯示出由于SA的不飽和和定向的性質(zhì)而更優(yōu)選的信噪比特性、增強的表面封閉性、以及提高的結(jié)合效率。實施例5顯示，使用根據(jù)本發(fā)明的微粒非特異性的結(jié)合減小。甚至在其中分析物傾向與固相上的涂層相連接、例如甲狀腺激素比如T3(三碘甲腺原氨酸)和T4(甲狀腺素)對于BSA的傾向的測定中，在根據(jù)本發(fā)明的微粒中非特異性的結(jié)合也被減少。實施例6通過驗證研究表明，本發(fā)明用于涂敷支持物的工藝是可再現(xiàn)的并且是可靠的，對于診斷性親合分析具有期望的特征。實施例7顯示，對于涂敷了SA的微粒的特定實施方式，根據(jù)本發(fā)明的微粒在多組驗證中顯示出增強的穩(wěn)定性。實施例8表明，在本發(fā)明的微粒中配體脫落不成問題；并且實施例9顯示了用卵清蛋白代替BSA根據(jù)本發(fā)明制備的結(jié)合性表面。雖然大量論述和許多實施例描述了通過用具有復(fù)合其上的配體的支持物連接物涂敷支持物表面而制備不飽和的表面，其中支持物連接物包含蛋白質(zhì)，但可以通過以多種方式使用本發(fā)明來得到不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面。例如，支持物連接物可以是非蛋白質(zhì)比如，例如，聚合物。在特定設(shè)定的條件下，該聚合物可以被賦予與配體反應(yīng)并復(fù)合的功能，或者可以挑選聚合物/配體配對以使得自然地存在于聚合物上的官能團(tuán)將與配體的官能團(tuán)結(jié)合。通過鈍化一些反應(yīng)基團(tuán)，可以控制在聚合物上的反應(yīng)性的、或功能性的基團(tuán)數(shù)量，借此允許較少配體被附接于每個聚合物分子上。還可以用缺乏配體的聚合物來稀釋聚合物/配體復(fù)合物，并且稀釋的混合物可以被用于涂敷支持物表面從而制備不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面?？梢允褂靡粋€種類的聚合物、或者聚合物的混合物。因此，在多種實施方式中，本發(fā)明包含這樣的支持物其包含用于親合分析的結(jié)合性表面、包含有附接于聚合物的配體，其中，配體在表面上是不飽和的、或者不飽和的并且被定向的。然后可以根據(jù)在此描述的任何合適的方法處理包含配體的支持物。在各種實施方式中，表面可以包含沒有附接任何配體的聚合物混合物、以及附接有配體的聚合物。在各種實施方式中，支持物是微粒，結(jié)合性表面用嵌段共聚物封閉，測定是免疫測定法，并且配體結(jié)合至少二價的配體結(jié)合劑，所述配體結(jié)合劑本身可以與捕獲部分比如修飾或未修飾的免疫球蛋白或其片段結(jié)合。在特定的實施方式中，配體可以被直接地偶聯(lián)在支持物表面上，而無需使用支持物連接物。在這些實施方式中，在足以使配體附接于支持物的條件下，將具有能夠與配體反應(yīng)的官能團(tuán)的支持物表面暴露于配體。在各種實施方式中，附接是在活化的配體和支持物表面之間的共價鍵，其也可以被活化。可以通過控制附接于支持物表面的配體數(shù)量來實現(xiàn)配體的不飽和性。在各種實施方式中，支持物表面包含多個能夠在給定條件下與配體反應(yīng)的官能團(tuán)。通過操控反應(yīng)條件、或者加入降低支持物表面上的官能團(tuán)數(shù)量的試劑，可以以一種降低能夠與配體反應(yīng)的官能團(tuán)數(shù)量的方式來處理支持物表面。然后可以根據(jù)在此描述的任何合適的方法處理包含配體的支持物表面。因此、本發(fā)明還提供了一種用配體涂敷的支持物表面，其中，在支持物表面的表面上配體是不飽和的。在各種實施方式中，結(jié)合性表面用嵌段共聚物封閉，測定是免疫測定法，并且配體結(jié)合至少二價的配體結(jié)合劑，所述配體結(jié)合劑本身可以與捕獲部分比如修飾或未修飾的免疫球蛋白或其片段結(jié)合。在各種實施方式中，在支持物表面上的配體密度是在此處描述的范圍內(nèi)，所述范圍是用于描述附接于支持物連接物上的配體的實施方式。任何合適的配體比如，例如，免疫球蛋白或其片段、低聚核苷酸、以及凝集素可以被用于直接地附接于支持物表面。如同在其他實施方式中那樣，配體可以包含連接物，并且連接物可以被附接于支持物表面。本發(fā)明提供了用于在微粒(例如，PMP)表面上定向并連接小于飽和量的配體比如SA的方法?？缮虡I(yè)購買的生物素結(jié)合性表面(例如，DynalDYNABEADSTMMyOne鏈霉抗生物素蛋白Tl、以及DYNABEADSM-280鏈霉抗生物素蛋白)被設(shè)計成具有最大的生物素結(jié)合力?？缮虡I(yè)購買的生物素結(jié)合性表面典型地通過在微粒表面上直接涂敷SA或其他生物素結(jié)合性分子而生產(chǎn)。相反，本發(fā)明提供的方法是用低投入比率的生物素化BSA涂敷微粒，用PluronicF108封閉生物素-BSA微粒，在Pluronic⑧F108中分散被封閉的生物素-BSA微粒，并且最后用SA涂敷生物素-BSA微粒。由于不飽和并定向，根據(jù)本發(fā)明的微粒顯示出更優(yōu)良的信噪比特性、增強的表面封閉性、以及提高的結(jié)合效率。如實施例所示，這一狀況被涂敷有SA的低投入比率的生物素化BSA微粒所顯示。本發(fā)明的方法和組合物可以與本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的任何合適的測定法相結(jié)合使用，所述測定法例如是本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的任何合適的親合分析或免疫測定，其中可以優(yōu)選使用不飽和的、或者不飽和的并且被定向的表面，包括但不限于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)親合分析、蛋白質(zhì)-配體親合分析、核酸親合分析、間接熒光抗體測定(IFAs)、酶聯(lián)免疫吸附測定(EUSA)、放射免疫測定(RIAs)、以及酶免疫測定(EIAs)、直接或間接的測定、競爭性測試、夾心法測試等。合適的測定形式包括但不限于，在實施例中使用的測定和形式。本發(fā)明的方法和組合物可以與本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的任何支持物例如合適的固體支持物組合使用。這樣的固相支持物的例子被論述，但是本發(fā)明不局限于明確地論述的支持物。例如，固相支持物不局限于微粒支持物、微粒、聚苯乙烯微粒、微孔板、涂敷試管等。其它固相支持物也可以被用于本發(fā)明，包括但不限于本
技術(shù)領(lǐng)域：
已知的被用于與親合分析相關(guān)聯(lián)的任何支持物。例如，可以使用包含以Mylar做后襯的硝化纖維素(mylar-backednitrocellulose)的固相支持物、和/或尼龍。例如，可以使用包含濾膜或薄膜的固相支持物。例如，可以使用包含微小管、納米顆粒、或納米管例如碳納米管的固相支持物。固相支持物可以包含任何大小的微粒，并且可以使用具有大的平整表面區(qū)域的固相支持物。本發(fā)明的方法和組合物可以被用于與任何其中期望提高信噪比的測定相結(jié)合。例如，可以在平整的或基本上平整的固相支持物上制備根據(jù)本發(fā)明的不飽和的、并且用合適的嵌段共聚物比如，例如，Pluronic⑧處理過的結(jié)合性表面，用于橫向流動測定(lateralflowassay)和/或擴(kuò)散測定(diffusionassay)。橫向流動測定的一個實施例是其中樣本被設(shè)置于結(jié)合性表面(固定化或未固定化)上，并且液相中的一種以上分析試劑經(jīng)過樣本上方(在擴(kuò)散測定中，通過在表面上方擴(kuò)散)，并且當(dāng)與液相中的試劑接觸時，通過合適的信號而檢測和/或定量分析物。橫向流動測定的另一個實施例是其中一種以上分析試劑被設(shè)置于結(jié)合性表面(固定化或未固定化)上，并且液相中的樣本經(jīng)過一種以上分析試劑上方(在擴(kuò)散測定中，通過在表面上方擴(kuò)散)，并且當(dāng)在結(jié)合性表面上與一種以上分析試劑接觸時，通過合適的信號而檢測和/或定量樣品中的分析物。橫向流動測定的另一個實施例是包含根據(jù)本發(fā)明的不飽和的結(jié)合性表面的測深標(biāo)尺(dipstick)。橫向流動測定和/或擴(kuò)散測定不局限于移動穿過平整支持物的一個結(jié)合性表面的液體；這些測定包括穿過薄膜或濾膜的液體，其中薄膜或者濾膜包含不飽和的結(jié)合性表面。因此，在各種實施方式中，根據(jù)在此描述的任何實施方式，提供了用于橫向流動測定和/或用于擴(kuò)散測定的結(jié)合性表面、以及制備用于橫向流動測定和/或擴(kuò)散測定的結(jié)合性表面的方法和組合物。在另一個方面，在此提供了在免疫測定中任何方法和組合物的應(yīng)用。在各種實施方式中，在免疫測定中提供了一種具有不飽和的結(jié)合性表面的支持物的應(yīng)用，該不飽和的結(jié)合性表面包含設(shè)置在支持物上的多個支持物連接物、以及與支持物連接物偶聯(lián)的配體，其中，配體是不飽和的并且以提供空間上可接近的配體的方式被定向在表面上。在一個特定的實施方式中，具有結(jié)合性表面的微粒被用于樣品中所研究的分析物例如抗原的免疫測定，該結(jié)合性表面包含生物素化蛋白質(zhì)(配體::支持物連接物復(fù)合物)；與生物素化蛋白質(zhì)中的生物素部分相連接的至少二價的生物素結(jié)合性部分，該生物素結(jié)合性部分選自于抗生物素蛋白、SA、NeutrAvidin、SA的片段、抗生物素蛋白片段、NeutrAvidin的片段、或其混合物；以及與至少二價的生物素結(jié)合性部分(配體結(jié)合劑)相連接的生物素化免疫球蛋白或其片段(生物素化的捕獲部分)。在另一個實施方式中，與生物素化蛋白質(zhì)中的生物素部分相連接的至少二價的生物素結(jié)合性部分與生物素化抗原或其片段(生物素化的捕獲部分)相連接，并且微粒被用于樣品中所研究的分析物例如抗體的免疫測定。在免疫測定中使用的組合物的特性、以及組合物的制造方法包括在此描述的任何特性(包括，例如，敘述表面組分密度的特定實施方式)。本發(fā)明的方法、組合物、以及試劑盒可以與任何合適的免疫測定體系一起使用。合適的免疫測定體系的例子包括，但不限于，Access⑧免疫測定體系、Access⑧2免疫測定體系、SynchronLXi725臨床體系、UniCel⑧DxI800Access免疫測定體系、IMMAGE免疫化學(xué)體系(全部購自貝克曼考爾特公司)、以及Triage⑧體系(Biosite公司)。一個合適的免疫測定基陣系統(tǒng)是AZ⑧Microassay體系(貝克曼考爾特公司)。在下文詳細(xì)列舉出非限制性的物質(zhì)表，取決于待設(shè)計的親合分析的應(yīng)用，這些物質(zhì)可以作為包含分析物結(jié)合劑(捕獲部分)和分析物的結(jié)合性配對中的一個、或可選地作為其他成員。這些物質(zhì)可以被用作，例如，捕獲部分(分析物結(jié)合劑)，或者可以被用于產(chǎn)生可以用于本發(fā)明的捕獲部分(例如，通過使用它們作為半抗原/抗原來產(chǎn)生特異性的抗體)。包括免疫測定在內(nèi)的親和分析，可以根據(jù)本發(fā)明被設(shè)計用于檢測這些物質(zhì)的存在和/或水平，其中這些物質(zhì)是樣品中的分析物。在一個特定的實施方式中，本發(fā)明的分析物結(jié)合性捕獲部分可以被用于按下述方法檢測作為樣品中的分析物的這些物質(zhì)捕獲部分可以被生物素化并且與根據(jù)本發(fā)明的涂敷了SA的固相支持物表面(例如具有其上涂覆了SA的低投入比率的生物素化BSA涂層)相連接，并且被用于捕獲這些物質(zhì)。作為另一種選擇，列于下表的物質(zhì)可以被生物素化并且與根據(jù)本發(fā)明的涂敷了SA的固相支持物表面相連接，并且被用來捕獲與它們互相作用的分子(比如，例如，對所列物質(zhì)特異的抗體或其片段、結(jié)合性蛋白、或酶)?？梢宰鳛榘治鑫锝Y(jié)合劑(捕獲部分)和分析物的結(jié)合性配對中的一個成員、或者可選地作為其他成員的非限制性的物質(zhì)列表包括可誘導(dǎo)的氧化氮合酶(iNOS)、CA19-9、IL-la、IL-1卩、IL-2、IL-3、IL-4、IL-t、IL-5、IL隱7、IL-IO、IL-12、IL-13、sIL-2R、sIL-4R、sIL-6R、SIV核心抗原、IL-1RA、TNF-a、IFN-y、GM-CSF;PSA(前列腺-特異性的抗原)同種型比如PSA、pPSA、BPSA、inPSA、非al-抗凝乳蛋白酶-復(fù)合物PSA、al-抗凝乳蛋白酶-復(fù)合物PSA;前列腺激肽釋放酶比如hK2、hK4、以及hK15、ek-rhK2、Ala-rhK2、TWT-rhK2、Xa-rhK2、HWT-rhK2、以及其他的激肽釋放酶；HIV-1p24;鐵蛋白、L鐵蛋白、肌鈣蛋白I、BNP、瘦素(leptin)、地高辛、肌紅蛋白、B型促尿鈉排泄肽或腦促尿鈉排泄肽(BNP)、前房的促尿鈉排泄肽(ANP);人生長激素、骨堿性磷酸酶、人類促卵泡激素、人促黃體生成激素(leutinizinghormone)、催乳激素；人絨毛膜促性腺激素(例如，CGcc、CG(3);甲狀腺球蛋白；抗甲狀腺球蛋白；IgE、IgG、IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、及aW/zmc^保護(hù)性抗原、炭疽桿菌(及^"^mc/W致死因子、及fl"Arack孢子抗原、土拉熱弗朗西絲菌(F.似/amw&LPS)、S.flwe氾腸毒素B、Kp^to莢膜Fl抗原、胰島素、a甲胎蛋白(例如，AFP300)、癌胚抗原(CEA)、CA15.3抗原、CA19.9抗原、CA125抗原、HAVAb、HAVIgm、HBcAb、HBcIgm、HIV1/2、HBsAg、HBsAb、HCVAb、抗p53、組胺；新蝶呤；s-VCAM-l、血清素、sFas、sFas配體、sGM-CSFR、slCAM-l、胸苷激酶、IgE、EPO、內(nèi)因子Ab、結(jié)合珠蛋白、抗心磷脂、抗dsDNA、抗Ro、Ro、抗La、抗SM、SM、抗nRNP、抗組蛋白、抗Scl-70、Scl-70、抗核抗體、抗著絲?？贵w、SS-A、SS-B、Sm、U1-RNP、Jo-l、CK、CK-MB、CRP、局部缺血修飾白蛋白、HDL、LDL、oxLDL、VLDL、肌鈣蛋白T、肌鈣蛋白I、微小白蛋白、淀粉酶、ALP、ALT、AST、GGT、IgA、IgQ、前清蛋白、抗鏈球菌溶血素、衣原體、CMVIgG、毒IgG、毒IgM、脫脂蛋白A、脫脂蛋白B、C3、C4、備解素因子B、白蛋白、ar酸性糖蛋白、cn-抗胰蛋白酶、a,-小球蛋白、(X2-巨球蛋白、抗鏈球菌溶血素O、抗凝血酶-m、脫脂蛋白A1、脫脂蛋白B、(32-小球蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、補體C3、補體C4、C-反應(yīng)蛋白、DNaseB、鐵蛋白、游離k輕鏈、游離X輕鏈、結(jié)合珠蛋白、免疫球蛋白A、免疫球蛋白A(腦脊髓液)、免疫球蛋白E、免疫球蛋白G、免疫球蛋白G(腦脊髓液)、免疫球蛋白G(尿液)、免疫球蛋白G亞類、免疫球蛋白M、免疫球蛋白M(腦脊髓液)、k輕鏈、X輕鏈、脂蛋白(a)、微小白蛋白、前清蛋白、備解素因子B、類風(fēng)濕因子、鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白(尿液)、風(fēng)疹I(lǐng)gG、甲狀腺球蛋白抗體、弓型屬IgM、弓型屬IgG、IGF-I、IGF結(jié)合性蛋白質(zhì)(IGFBP)-3、七菌素、phn-l激酶、E-鈣黏著蛋白、EZH2、以及a-甲基乙?；?輔酶A消旋酶、TGF-p、IL6SR、GAD、IA-2、CD-64、嗜中性CD-64、CD-20、CD-33、CD-52、細(xì)胞色素P450同種型、s-VCAM-l、sFas、sICAM、乙型肝炎表面抗原、促凝血酶原激酶、HIVp24、HlVgp41/120、HCVC22、HCVC33、血紅蛋白Alc、以及GAD65、IA2。取決于待設(shè)計的親合分析的應(yīng)用，可以作為包含分析物結(jié)合劑(捕獲部分)和分析物的結(jié)合性配對中一個成員、或者可選地作為其他成員、并且可以被用于本發(fā)明的合適物質(zhì)還包括對世界衛(wèi)生組織國際生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)制品(WHOInternationalBiologicalReferencePreparations)持有的并且被世界衛(wèi)生組織國際生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)實驗室(WHOInternationalLaboratoriesforBiologicalStandards)表征、和/或經(jīng)銷的任何產(chǎn)品(可禾U用http:〃www.who.int/bloodproducts/re_materials，2005年6月30日起更新，其列出了為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的物質(zhì)；在此將該列表引入本文以供參考)具有特異性的部分，比如，例如，抗體或其片段。這些合適的由緊隨物質(zhì)名稱后的括號中的WHO代碼注明的國際參考標(biāo)準(zhǔn)的部分列表包括人重組促凝血酶原激酶(rTF/95)、兔促凝血酶原激酶(RBT/90)、甲狀腺刺激抗體(90/672)、重組人組織纖溶酶原激活物(98/714)、高分子量尿激酶(87/594)、前列腺特異性的抗原(96/668)、前列腺特異性的抗原90:10(96/700);人血漿蛋白質(zhì)C(86/622)、人血漿蛋白質(zhì)S(93/590)、變形性關(guān)節(jié)炎血清(W1066)、血清淀粉狀A(yù)蛋白質(zhì)(92/680)、鏈激酶(00/464)、人凝血酶(01/580)、牛結(jié)合促凝血酶原激酶(OBT/79)、抗D陽性對照靜脈注射免疫球蛋白(02/228)、小島細(xì)胞抗體(97/550)、脂蛋白a(IFCCSRM2B)、人細(xì)小病毒B19DNA(99/800)、人胞漿素(97/536)、人血纖維蛋白溶酶原激活劑抑制劑1(92/654)、血小板因子4(83/505)、前激肽釋放酶活化劑(82/530)、人腦CJD對照物和人腦散發(fā)性CJD制品1以及人腦散發(fā)性CJD制品2和人腦變異CJD(無；WHOTRSECBSReportNo.926，第53個報告，腦組織均漿引用的每一個)、人血清補體組分Clq、C4、C5、因子B、以及所有的功能性補體CH50(W1032)、人血清免疫球蛋白E(75/502)、人血清免疫球蛋白G、A、以及M(67/86)、人血清蛋白白蛋白、a-l-抗胰蛋白酶、a-2-巨球蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、補體C3、轉(zhuǎn)鐵蛋白(W1031)、抗D陰性對照靜脈注射免疫球蛋白(02/226)、甲型肝炎RNA(00/560)、乙型肝炎表面抗原亞型adw2基因型A(03/262和00/588)、乙型肝炎病毒DNA(97/746)、丙型肝炎病毒RNA(96/798)、HIV-1p24抗原(90/636)、HIV-1RNA(97/656)、HIV-1RNA基因型(10101/466組)、人纖維蛋白酶原濃縮物(98/614)、人血漿纖維蛋白原(98/612)、升高A2血紅蛋白(89/666)、升高F血紅蛋白(85/616)、血紅蛋白氰化物(98/708)、低分子量肝素(85/600和卯/686)、未分段的肝素(97/578)、凝血因子VIII和vonWillebrand因子(02/150)、人凝血因子VIII濃縮物(99/678)、人凝血因子XIII血漿(02/206)、人凝血因子II、VII、IX、X(99/826)、人凝血因子II和X濃縮物(98/590)、人癌胚抗原(73/601)、人C-反應(yīng)蛋白(85/506)、重組人鐵蛋白(94/572)、脫脂蛋白B(SP3-07)、P-2-小球蛋白(B2M)、人P-血小板球蛋白(83/501)、人凝血因子IX濃縮物(96/854)、人凝血因子IXa濃縮物(97/562)、人凝血因子VLeiden、人gDNA樣本Fv野生型、FVL同合子、FVL雜合子(03/254、03/260、03/248)、人凝血因子VII濃縮物(97/592)、人凝血因子Vlla濃縮物(89/688)、人治梅毒血清(HS)、人抗破傷風(fēng)免疫球蛋白(TE-3)、人抗凝血酶濃縮物(96/520)、人血漿抗凝血酶(93/768)、人抗甲狀腺球蛋白血清(65/93)、抗弓型屬血清(TOXM)、人抗弓型屬血清(IgG)(01/600)、人抗水痘帶狀皰疹免疫球蛋白(W1044)、脫脂蛋白A-l(SP1-01)、人抗干擾素(3血清(G038-501-572)、人抗囊蟲血清(66/202)、抗核的核糖核酸蛋白質(zhì)血清(W1063)、抗核因子(同源)血清(66/233)、抗細(xì)小病毒B19(IgG)血清(91/602)、抗脊髓灰質(zhì)炎病毒血清類型1，2，3(66/202)、人抗狂犬病免疫球蛋白(RAI)、人抗風(fēng)疹免疫球蛋白(RUBl-卜94)、抗平滑肌血清(W1062)、人抗雙鏈DNA血清(Wo/80)、人抗E完全血液型血清(W1005)、人抗棘球?qū)傺?ECHS)、人抗甲型肝炎免疫球蛋白(97/646)、人抗乙型肝炎免疫球蛋白(W1042)、人抗戊型肝炎血清(95/584)、抗人血小板抗原-la(93/710)、抗人血小板抗原-5b(99/666)、人抗干擾素a血清(B037-501-572)、人甲胎蛋白(AFP)、安克洛酶(74/581)、人抗A血型血清(W1001)、人抗B血型血清(W1002)、人抗C完全血型血清(W1004)、抗D(抗p)完全血型試劑(99/836)、人抗D(抗p)不完全血型血清(W1006)、以及人抗D免疫球蛋白(01/572)。取決于待設(shè)計的親合分析的應(yīng)用，可以作為包含分析物結(jié)合劑(捕獲部分)和分析物的結(jié)合性配對中的一個成員、或者可選地作為其他成員的合適物質(zhì)的其他例子包括這樣的化合物其可以用作半抗原而產(chǎn)生能夠識別該化合物的抗體，并且包括但不局限于下述物質(zhì)的任何鹽、酯、或醚激素，其包括但不限于黃體酮、雌激素、以及睪丸激素、孕酮、皮質(zhì)甾類、以及脫氫表雄甾酮；以及可以列舉的被WHO作為國際參考標(biāo)準(zhǔn)的任何非蛋白質(zhì)/非多肽抗原。由緊隨物質(zhì)名稱的括號中的WHO代碼注明的這些合適的國際參考標(biāo)準(zhǔn)的部分列表包括維生素B12(WHO81.563)、葉酸(WHO95/528)、同型半胱氨酸、運鈷胺素蛋白、T4/T3、以及在WHO的國際生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)制品目錄中公開的其他物質(zhì)(可利用世界衛(wèi)生組織網(wǎng)址，例如http:〃www.who.int/bloodproducts/ref—materials/,2005年3月30日更新)，將其引入本發(fā)明作為參考。在此描述的方法和組合物可以包含一種或多種上述的世界衛(wèi)生組織參考標(biāo)準(zhǔn)或含有參考標(biāo)準(zhǔn)的混合物。在至少一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種具有兩個以上不同捕獲部分的結(jié)合性表面。取決于待設(shè)計的親合分析的應(yīng)用，可以作為包含分析物結(jié)合劑(捕獲部分)和分析物的結(jié)合性配對中的一個成員、或者可選地作為其他成員的物質(zhì)的其他例子包括禁用藥物。禁用藥物包括，例如，下面的藥物列表和它們的代謝產(chǎn)物(例如，存在于血液、尿液中的代謝產(chǎn)物以及其他生物材料)、以及其任何鹽、酯、或醚海洛因、嗎啡、氫嗎啡酮、可待因、14-羥基二氫可待因酮、氫可酮、芬太尼、地美羅、美沙酮、達(dá)而豐、斯達(dá)多(stadol)、鎮(zhèn)痛新、止痛劑、丁丙奈斯(buprenex);興奮劑比如安非他明、脫氧麻黃堿；甲基苯丙胺、乙基苯內(nèi)胺、甲基菲內(nèi)特(methyiphenidate)、麻黃素、假麻黃堿、麻黃、麻黃、亞甲基二氧安非他明(methylenedioxyamphetamine，MDS)、苯丁胺、苯丙醇胺；阿米苯唑、波米利德(bemigride)、甲基苯異丙基芐胺、波羅馬坦(bromatan)、對氯苯丁胺、克羅丙胺、克羅乙胺、二乙胺苯丙酮、二甲基苯丙胺、嗎乙苯吡酮、乙迷奮、芬坎法明、氯酯醒、哌甲酯、尼可剎米、佩默林、噴達(dá)唑(pentetrazol)、苯基雙五甲烯四氮嗪、苯甲嗎啉、苯丁胺、苯丙醇胺、匹羅托欣(picrotoxine)、匹拉多(pipradol)、丙林坦(prolintane)、士的寧、對羥福林、苯西克定和類似物比如安琪得特(angeldust)、PCP、開他敏；鎮(zhèn)靜劑，比如巴比妥酸鹽、谷希米得(gluthethimide)、安眠酮、以及安寧、美索比妥、希米爾(thiamyl)、戊硫代巴比妥、異戊巴比妥、戊巴比妥、司可巴比妥、布他比妥、布塔巴比妥、他布酮、以及阿普比妥、苯巴比妥、甲苯巴比妥；苯二氮平類比如艾司唑侖、氟胺安定、羥基安定、三唑苯二氮、咪達(dá)唑侖、阿普唑侖、利眠寧、氯拉齊佩(clorazepate)、安定、哈拉西泮、氯羥安定、去甲羥基安定、環(huán)丙二氮卓、夸西泮、氯硝西泮、氟硝西泮；重傷(GBH)藥物比如Y羥基丁酸和Y丁內(nèi)酯；導(dǎo)眠能、安眠酮、安寧、肌安寧、唑吡坦、扎來普??；大麻醇類藥物比如四氫大麻醇和類似物；古柯堿、3-4-亞甲基二氧甲基苯丙胺(MDMA);迷幻劑比如墨斯卡靈和LSD。取決于待設(shè)計的親合分析的應(yīng)用，可以作為包含分析物結(jié)合劑(捕獲部分)和分析物的結(jié)合性配對中的一個成員、或者可選地作為其他成員的物質(zhì)的其他例子包括甾族化合物及其它與性能增強相關(guān)的藥物，包括通常在黑市上遇到、或者用作強力助劑(ergogenicaid)的那些藥物，比如下面的化合物和其任何鹽、酉旨、或醚睪丸激素(包括其具有比如庚酸酯、環(huán)戊丙酸酯(cypionate)、以及丙酸酯部分的酯)、二氫睪酮(DHT)、四氫孕三烯酮、諾龍、諾睪酮、甲基雄烯醇酮、康力龍、羥甲雄二烯酮、去氫甲睪酮、雄烯二酮(例如，5a-雄-3,17-二酮)、雄烯二醇比如1-雄烯二醇(3^17^二羥-5a-雄-l-烯；)、4-雄烯二醇(3b,17b-二羥-雄-4-烯)、5-雄烯二醇(3b,17b-二羥-雄-5-烯)、雄烯二酮，比如1-雄烯二酮([5a]-雄-l-烯-3,17-二酮)、4-雄烯二酮(雄-4-烯-3,17-二酮)、5-雄烯二酮(雄-5-烯-3,17-二酮)、諾龍雄烯二酮、19-諾龍雄烯二醇、19-諾龍雄烯二酮、諾龍雄烯二醇、脫氫表雄甾酮(DHEA)、勃地酮、氟烴甲基睪丸素、甲基雄烯二醇、甲基睪甾酮、氧甲氫龍、康復(fù)龍、去甲雄三烯醇酮、氯睪酮、脫氫氯甲睪甾酮、屈他雄酮、17a-乙炔基雄二醇、孕三烯酮、甲二氫睪酮、去氫甲睪酮、甲基雄烯醇酮、諾生卓隆、氧甲氫龍、康復(fù)龍、四氫孕三烯酮(THG)、去甲雄三烯醇酮、克林勃醇(clenbutorol)、以及包括在2004年促蛋白合成甾類控制行動中的甾族化合物(將其引入本發(fā)明作為參考)，包括3b,17b-二羥-5a-雄甾烷；3a,17b-二羥-5a-雄甾烷;雄烷二酮、17-二甲睪酮(7a,17a-二甲基-17b-羥基雄-4-烯-3-酮)、勃地酮(17&-羥基雄-1,4,-二烯-3-酮)、二甲睪酮(7b，17a-二甲基-1715-羥基雄-4-烯-3-酮)、氯睪酮(4-氯-171)-羥基雄-4-烯-3-酮)、脫氫氯甲睪酮(4-氯-171)-羥基-17&-甲基-雄-1，4-二烯-3-酮)、4-二氫睪酮(171>-羥基-雄-3-酮)、屈他雄酮(17b-羥基-2a-甲基-5a-雄-3-酮)、乙基雌烯醇(17&-乙基-1713-羥基雌-4-烯)、氟烴甲基睪丸素(9-氟代-17a-甲基-llb,17b-二羥雄-4-烯-3-酮)、甲酰勃龍(2-甲酰-17&-甲基-11&，171>二羥雄-1,4-二烯-3-酮)、呋拉扎勃(17a-甲基-17b-羥基雄甾酮[2,3-c]—呋咱)、18a-同型(homo)-17b-羥基雌-4-烯-3-酮(18-甲基炔諾酮)、4-羥睪甾酮"，17b-二羥-雄-4-烯-3-酮)、4-羥基-19-去甲睪酮(4,17b-二羥-雌-4-烯-3-酮)、二氫睪酮U7a-甲基-17b-羥基-5a-雄甾-3-酮)、甲二氫睪酮(la-甲基-17b-羥基-[5a]-雄-3-酮)、去氫甲睪酮U7a-甲基-17b-羥基雄-l,4-二烯-3-酮)、甲基雄烯二醇(17a-甲基-3b，17b-二羥雄-5-烯)、甲基雄烯醇酮(1陽甲基-171>-羥基-5&-雄-1-烯-3-酮)、乙睪酮U7a-甲基-17b-羥基雄-4-烯-3-酮)、米勃龍(7a,17a-二甲基-17b-羥基雌_4-烯-3-酮)、諾龍(17b-羥基雌-4-烯-3-酮)、諾龍雄烯二醇、19-諾龍-4-雄烯二醇Gb，nb-二羥基雌甾-4-烯)、19-諾龍-4-雄烯二醇(3a，17b-二羥基雌甾-4-烯)、19-諾龍-5-雄烯二醇(3b,17b-二羥基雌甾-5-烯)、19-諾龍-5-雄烯二醇(3a，17b-二羥基雌甾-5烯)、諾龍雄烯二酮、19-諾龍-4-雄烯二酮(雌-4-烯-3，17-二酮)、19-諾龍5-雄烯二酮(雌-5畫烯-3,17畫二酮)、諾勃龍(18a-同型-17b-羥基孕-4陽烯陽3-酮)、諾司替勃"隱氯-17b-羥基雌-4-烯-3-酮)、諾生卓隆(17a-乙基-17b-羥基雌-4-烯-3-酮)、氧甲氫龍(17a-甲基-17b-羥基-2-氧雜[5a]-雄-3-酮)、羥甲睪酮(17a-甲基-4，17b-二羥雌-4-烯-3-酮)、康復(fù)龍(17a-甲基-2-羥基亞甲基-17b-羥基-[5a]-雄-3-酮)、康力龍(17a-甲基-17b-羥基-[5&]-雄-2-烯[3，2-c]-吡唑)、司騰勃龍U7b-羥基-2-甲基-[5a]-雄-l-烯-3-酮)、睪內(nèi)酯(13-羥基-3-氧代-13，17-司考雄-1，4-二烯-17-酮酸內(nèi)酯)、1-睪甾酮(17b-羥基-5a-雄-l-烯-3-酮)、睪甾酮(17b-羥基雄-4-烯-3-酮)、四氫孕三烯酮(13b，17a-二乙基-17b-羥基性(hydroxygon)-4,9,11-三烯-3-酮)、去甲雄三烯醇酮(17b-羥基雌-4,9,U-三烯-3-酮)。取決于待設(shè)計的親合分析的應(yīng)用，可以作為包含分析物結(jié)合劑(捕獲部分)和分析物的結(jié)合性配對中的一個成員、或者可選地作為其他成員的物質(zhì)的其他例子，包括給藥于動物(包括人類)、并且對其的檢測在臨床實踐中是有用的、以及通過使用例如免疫測定可在生物制品中實現(xiàn)對其的檢測的抗生素及其他藥物。這些藥物的例子包括抗生素比如，列在WHO國際生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)制品上的抗生素(可利用因特網(wǎng)http:〃www.who.int/bloodproducts/ref—materials/Ant-Sept05.pdf，2005年9月21日更新，將其引入本發(fā)明作為參考)。這些例子包括慶大霉素(92/670)、鏈霉素(76/539)、托普霉素(82/510)、以及萬古霉素(50/020)。在至少一種實施方式中，本發(fā)明提供了一種具有兩個以上不同捕獲部分的結(jié)合性表面。在此描述的各種實施方式中的任何特征可以被用來與公開的任何其他實施方式的有關(guān)特征相結(jié)合。例如，與本發(fā)明的組合物有關(guān)的公開的特征可以被用于在此描述的任何方法等。不應(yīng)把與各種或特定的實施方式有關(guān)的所描述的特征理解為與在此公開的其他實施方式不相關(guān)，除非這樣的排他性被明確地陳述或者在上下文中被暗示。本發(fā)明的特定實施方式被顯示在附圖和實施例中，提供這些附圖和實施例是為了顯示本發(fā)明的特定實施方式，并非用以限制本發(fā)明。實施例實施例l牛血清白蛋白的低投入比率生物素化BSA用硫代-NHS-LC-生物素(硫代琥珀酰亞胺-6-[生物素酰氨基]己酸；Pierce生物技術(shù)公司/ThermoScientific公司)以生物素對BSA的不同摩爾投入比率進(jìn)行生物素化(參見表1)。簡言之，硫代-NHS-LC-生物素(556.59g/mol)以30毫克/每毫升(mg/mL)的濃度溶于DMF(二甲基甲酰胺)，并且凍干的BSA(牛血清白蛋白，游離的蛋白酶；Celliance公司—一家血清公司；66,000g/mol)以15~20mg/mL的濃度溶于pH8.2的0.05M硼酸鹽緩沖液。將該硫代-NHS-LC-生物素溶液加至BSA溶液，以使得硫代-NHS-LC-生物素對BSA的最終摩爾投入比率是3.4至30(硫代-NHS-LC-生物素的摩爾數(shù)BSA的摩爾數(shù))。將反應(yīng)物在4。C下保溫2小時，然后立即用pH8.2的0.05M硼酸鹽緩沖液透析(即，滲濾或透滲析)以除去過量的硫代-NHS-LC-生物素(即，生物素試劑、以及水解的生物素試劑、游離的生物素)。在整個制備低投入比率的生物素化BSA中使用這種一般程序。通過使用本
技術(shù)領(lǐng)域：
任何已知的用于定量生物素的方法可以估算生物素化程度。一個合適的方法是HABA比色測定，其使用對于生物素具有選擇性的4'-羥基偶氮苯-2-羧酸(HABA)。通過HABA分析估算每摩爾BSA結(jié)合的生物素的摩爾數(shù)。結(jié)果如表1所示。通過下述步驟完成17組單獨生物素化的生物素化BSA的穩(wěn)定性分析在37~42。C下，在pH9.0-9.5的0.1M硼酸鹽緩沖液中用生物素-BSA涂敷25mg/mL甲苯磺酰基活化的PMP(Dynal⑧DYNABEADSMyOne甲苯磺?；罨?，l.O微米直徑，Invitrogen公司)(0.030-0.050毫克生物素-BSA/每mgPMP)18~24小時；用pH7.4的TBS(0.02MTris、0.15M氯化鈉)洗滌微粒三次；在3742。C下，用含在TBSpH7.4中的0.4%~0.6%(w/v)的三區(qū)段共聚物Pluronic⑧F108(PluronicF-108NF金屬顆粒；BASF公司)封閉涂敷了生物素-BSA的微粒表面4-4.5小時；用TBSpH7.4洗滌微粒三次；將生物素-BSA微粒分散在含有0.4%~0.6%(w/v)PluronicF108的TBSpH7.4中；在室溫下，用在TBSpH7.4中的SA(冷凍，未曾凍千，加SA21SA，Prozyme公司)涂敷生物素-BSA微粒(0.025-0.050毫克SA/每mg生物素-BSAPMP)30-50分鐘；用含有疊氮化鈉(0.1%w/v)的TBSpH7.4洗滌微粒三次；用對Access⑧FreeT4測定特異的微粒緩沖液洗滌微粒三次；用對Access⑧FreeT4測定特異的微粒緩沖液將微粒從25mg/mL稀釋到0.35mg/mL;在4°C下或37°C下保溫涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒3天；以及在Access⑧FreeT4測定(貝克曼考爾特公司)中，測試涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒結(jié)合對生物素化FreeT4特異的抗體的能力。通過計算單個FreeT4標(biāo)準(zhǔn)RLU(相對光單元、信號、或應(yīng)答)回收率的平均值來確定穩(wěn)定性。該Access⑧FreeT4測定使用了具有0ng/ml至6ng/ml的抗原水平的6個不同的標(biāo)準(zhǔn)(S0、Sl、S2、S3、S4、以及S5)(參見表4)。通過用4°C標(biāo)準(zhǔn)RLU應(yīng)答除以37。C下標(biāo)準(zhǔn)RLU應(yīng)答、并且乘以100%，計算出回收率。通過平均全部6個標(biāo)準(zhǔn)的回收率，計算出穩(wěn)定性。結(jié)果如表l所示。穩(wěn)定性是在4°C或37°C下保溫固相3天之后SA結(jié)合力變化的指示。穩(wěn)定性降低起因于被動地結(jié)合的生物素或生物素試劑從生物素-BSA結(jié)合物上脫落或解離(參見圖11;虛線37。C下；實線4°C下)、以及隨后的游離生物素或生物素試劑隨時間被SA捕獲。結(jié)果表明，以較高的摩爾投入比率(B卩，8:1、15:1、30:1)制備的生物素-BSA顯示試劑對BSA的摩爾投入比率從30:1降低至4:1時，穩(wěn)定性由4%提高到100%。BSA以30摩爾硫代-NHS-LC-生物素/每molBSA的摩爾投入比率進(jìn)行生物素化。通過下述步驟，將該按30:1生物素化的BSA附接于Dynal⑧MyOne甲苯磺酰基活化的PMP:在37~42。C下，在pH9.0-9.5的0.1M硼酸鹽緩沖液中用生物素-BSA涂敷25mg/mL甲苯磺?；罨腜MP(0.030-0.050毫克生物素-BSA/每mgPMP)18~24小時；用pH7.4的TBS洗漆微粒三次；在37~42。C下，用含在TBSpH7.4中的0.4%~0.6%(w/v)的三區(qū)段共聚物PluronicF108封閉涂敷了生物素-BSA的微粒表面4-4.5小時；用TBSpH7.4洗滌微粒三次；將生物素-BSA微粒分散在含有0.4%~0.6%(w/v)PluronicF108的TBSpH7.4中；在室溫下，用在TBSpH7.4中的SA涂敷生物素-BSA微粒(0.025-0.050毫克SA/每mgPMP)30~50分鐘；以及用TBSpH7.4洗滌微粒三次。在4°C或37°C下，將25mg/mL涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的PMP放置3天；并且放置于磁石上10分鐘以分離PMP(從4°C或37°C下的緩沖液中除去微粒)。通過使用篩析(size-exclusion)高效液相色譜(SEC-HPLC;貝克曼考爾特系統(tǒng)黃金HPLC系統(tǒng)，32KARATTM5.0軟件，Phenomenex300x7.80mMBioSep-SEC-S3000柱，PBSpH7.2流動相，1.0ml/min流速，0.050mL樣本體積，17分鐘運行時間，200至400nm光電二極管陣列檢測)，收集4°C和37°C無微粒的上清液，并且分析上清液。與4°C上清液相比，在37°C的上清液中210nm處的SEC-HPLC分析顯示出在10.8分鐘保持時間(RT)處和12.4分鐘RT處明顯較高水平的低分子量分析物。這些峰值被認(rèn)為是在以30:1(生物素試劑BSA)投入比率的生物素化工序期間被動地吸附至BSA分子上、并且未通過透滲析或脫鹽而除去的生物素和/或生物素試劑的峰值。該結(jié)果也表明，在液體上清液中沒有檢測到BSA或SA(RT為7.8至8.2min)(低于該方法的檢測極限)。并且生物素-BSA結(jié)合物和/或SA未從固相上脫落。SEC-HPLC的結(jié)果支持了穩(wěn)定性結(jié)果(參見表l)，在該結(jié)果中，與4。C下的穩(wěn)定性相比，30分子生物素試劑1分子BSA的樣本在37°C下的穩(wěn)定性有最顯著的降低(穩(wěn)定性降低95.9%，或穩(wěn)定性為4.1%);并且與4。C的上清液相比，在37。C的上清液中還顯示出顯著含量的低分子量分析物的存在。穩(wěn)定性降低起因于被動地結(jié)合的生物素或生物素試劑從生物素-BSA結(jié)合物上脫落或解離、以及隨后的游離生物素或生物素試劑隨時間被SA捕獲。通過下述步驟優(yōu)化生物素-BSA涂覆工藝使用4摩爾硫代-NHS-LC-生物素/每molBSA來生物素化BSA;提供30、40、50、或60微克生物素-BSA/每mg微粒(Dynal⑧DYNABEADSMyOne甲苯磺?；罨?，l.O微米直徑，Invitrogen公司)；在37°C或40°C下將生物素-BSA與微粒一起在0.1M硼酸鹽pH9.5中保溫2、4、或18小時；用TBSpH7.4洗滌微粒三次；在37°C下用含有0.4%(w/v)PluronicF108的TBSpH7.4封閉微粒4小時；用TBSpH7.4洗滌微粒三次；在含有0.4%(w/v)PluronicF108的TBS中分散生物素-BSA微粒；通過加入35微克SA/每mg微粒并在室溫下保溫30分鐘來偶聯(lián)SA;以及用TBSpH7.4洗滌涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒三次。測定性能試驗(Access⑧FreeT4和AccessAccuTnl測定；貝克曼考爾特公司)、以及生物素化IgG結(jié)合力測試的結(jié)果表明，當(dāng)以25mg/mL的微粒濃度將30至50嗎生物素-BSA/每mg微粒加入pH9.5的0.1M硼酸鹽緩沖液中、并且在37°C至42°C下孵育18至24小時時，生物素-BSA涂覆工藝是實用的。簡言之，將^I-標(biāo)記的生物素化IgG方法用于評價結(jié)合力，該方法通過使用標(biāo)準(zhǔn)碘化作用程序(抗體和生物素化抗體在室溫下各自與Na1251和氯胺T三水合物一起孵育，各個反應(yīng)用偏亞硫酸氫鈉終止，并且被1251標(biāo)記的未生物素化的抗體和被1251標(biāo)記的生物素化抗體各自通過使用經(jīng)0.5%BSA/PBS/0.1。/。疊氮化鈉預(yù)處理的SEPHADEXG-50進(jìn)行純化)，用^I標(biāo)記生物素化IgG和未生物素化的IgG;通過使用Y粒子計數(shù)管計算出總的CPM(每分鐘計數(shù))/mg生物素化的125I-IgG和未生物素化的125I-IgG;對涂敷了SA的微粒提供摩爾過量的1251-生物素-&0(經(jīng)由生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域主動吸收)或^I-IgG(被動吸收或非特異性結(jié)合)；用洗滌緩沖液洗滌微粒5次；洗滌后的微粒被置于Y粒子計數(shù)管中以確定總CPM;并且通過用^I-生物素-IgGSA微粒的CPM減去涂敷了125I-IgG的SA微粒(非特異性結(jié)合對照物)的CPM來確定特異性地捕獲的生物素-IgG的量。實施例2不飽和性降低了結(jié)合力但是增強了測定信號通過使用PMP、以低的生物素對BSA的摩爾投入比率(4:1)制備的生物素-BSA來制備采用生物素/SA體系的不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面。簡言之，通過下述步驟制備出一組具有不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的微粒用低投入比率的生物素化BSA涂敷DynalAKT-100甲苯磺?；罨腜MP;用Pluronic⑧F108封閉生物素-BSA微粒；在Pluronic⑧F108中分散被封閉的生物素-BSA微粒；以及最后用SA涂敷生物素-BSA微粒。參見表2，"BCI樣本"。為進(jìn)行比較，測試了市售生物素結(jié)合性微粒(Dynal⑧DYNABEADSMyOne鏈霉抗生物素蛋白Tl，Invitrogen公司)。參見表2，"Dynal⑧對照物"。通過使用相同的未加工的微粒(Dynal⑧MyOne甲苯磺?；罨?.0微米PMP，購自Invitrogen公司)，各自制備不飽和的表面和市售生物素結(jié)合性表面。通過使用"C-生物素結(jié)合力測試方法(Invitrogen公司)，對不飽和的生物素結(jié)合性表面和市售生物素結(jié)合性(即，涂敷了SA)表面進(jìn)行生物素結(jié)合力測試。結(jié)果如表2所示。標(biāo)準(zhǔn)水平表示為納克/每mL。市售微粒的生物素結(jié)合力是1,400pmol生物素/mg，然而根據(jù)本發(fā)明制備的具有不飽和的結(jié)合性表面的微粒的生物素結(jié)合力僅為214pmol生物素/mg。因此，與根據(jù)本發(fā)明制備的相同直徑微粒相比，市售生物素結(jié)合性微粒顯示出高出6倍的對于生物素的結(jié)合力。還測試了微粒結(jié)合生物素化IgG的能力。市售微粒顯示出的生物素化IgG結(jié)合力為20.0微克生物素化IgG/每mg微粒，然而根據(jù)本發(fā)明的微粒顯示出的結(jié)合力為6.7微克生物素化IgG/每mg微粒。因此，與根據(jù)本發(fā)明的微粒相比，市售生物素結(jié)合性微粒顯示出高3倍的生物素化IgG結(jié)合力。然而，與根據(jù)本發(fā)明的微粒相比，市售微粒的生物素結(jié)合力要高出6倍。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>在對于蛋白質(zhì)、肌鈣蛋白I的測定中將市售生物素結(jié)合性微粒的功能特性與根據(jù)本發(fā)明制備的不飽和的微粒的性能相比較。簡言之，市售一微米直徑的用重組體SA涂敷的生物素結(jié)合性微粒(DynalDYNABEADSMyOne鏈霉抗生物素蛋白Tl，Invitrogen公司)、以及根據(jù)本發(fā)明的不飽和的一微米直徑的用SA涂敷的微粒被用于對于肌鈣蛋白I的測定，該測定使用Access③AccuTnl測定即夾心法測定(貝克曼考爾特公司)，其用生物素化的抗肌鈣蛋白I處理涂敷了SA的微粒并且測量對肌鈣蛋白I標(biāo)準(zhǔn)(貝克曼考爾特公司)的分析應(yīng)答。結(jié)果如表3所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>表3顯示，在整個標(biāo)準(zhǔn)水平(S1至S5)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的不飽和的微粒顯示出比市售微粒更高的RLU讀數(shù)、以及比市售微粒更低的背景RLU讀數(shù)(S0)。這一結(jié)果令人驚奇并且預(yù)料不到，因為根據(jù)本發(fā)明的不飽和的微粒顯示出比市售生物素結(jié)合性微粒更低的生物素結(jié)合力(參見表2)。在幾乎全部范圍內(nèi)不飽和的微粒的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)答都較高。對不飽和的微粒來說，S0的a/。CV標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)答(CV-變化系數(shù))的測定精確性要高出兩倍。然而，與市售微粒相比，不飽和的微粒具有明顯地較低的S0RLU應(yīng)答(8,116對13,023)，并且隨著RLU信號下降，在重復(fù)性之間RLUs的較小差異可以導(dǎo)致更大的。/。CV。平均起來，不飽和的微粒的表示為％CV標(biāo)準(zhǔn)劑量的測定不精確性明顯地較低。至于動態(tài)范圍，不飽和的微粒的比率S1/S0和S5/S0高約兩倍。因此，與市售微粒相比，雖然根據(jù)本發(fā)明的微粒結(jié)合較少的生物素(并且因此，結(jié)合較少的生物素化IgG)，但它們在功能性親合分析中表現(xiàn)得出乎意料的好，并且具有降低的噪音或非特異性結(jié)合。在Access⑧FreeT4測定(貝克曼考爾特公司)中，將市售2.8微米直徑的涂敷了SA的微粒(Dynal⑧DYNABEADSM-280鏈霉抗生物素蛋白，生物素結(jié)合性能力為650至卯0皮可摩爾生物素/每mg，Invi加gen公司)的性能與根據(jù)本發(fā)明制備的1.0微米涂敷了SA的微粒的性能相比較(生物素結(jié)合力為約214皮可摩爾生物素/每mg;參見表2)。通過使用Access⑧FreeT4測定法—一種競爭性測試來測定FreeT4，步驟包括用根據(jù)本發(fā)明的生物素化的抗T4處理涂敷了SA的微粒(市售涂敷了SA的2.8微米直徑PMP用"Dynal方法"；根據(jù)本發(fā)明制備的l.O微米直徑涂敷了SA的PMP用"BCI方法")；并且測量對T4標(biāo)準(zhǔn)(貝克曼考爾特公司)的分析應(yīng)答。測定在Access⑧2免疫測定體系(貝克曼考爾特公司)上進(jìn)行，并且在該系統(tǒng)上得到的RLUs結(jié)果如表4所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>如表4所示，根據(jù)本發(fā)明制備的1.0微米涂敷了SA的微粒對于分析物(FreeT4)發(fā)出與市售2.8微米直徑涂敷了SA的微粒大致一樣的信號。這一結(jié)果令人驚奇并且預(yù)料不到，因為與市售抗生物素微粒(Dynal⑧DYNABEADSM-280鏈霉抗生物素蛋白，生物素結(jié)合力為650至900皮可摩爾生物素/每mg，Invitrogen公司)相比，根據(jù)本發(fā)明的不飽和的微粒顯示出更低的生物素結(jié)合力。如上述表格(參見表2、3和4)所示，根據(jù)本發(fā)明制備微?？梢缘玫浇Y(jié)合性表面的不飽和性，從而使得配體(生物素)的數(shù)量被降低。根據(jù)本發(fā)明的微粒結(jié)合更少的生物素(與市售DYNABEADSM-280微粒的650至900皮可摩爾/每mg、以及DYNABEADSMyOneSATl微粒的大于1,000皮可摩爾/每mg相比，根據(jù)本發(fā)明的微粒為214皮可摩爾/每mg)，但是它們具有更好的功能(參見表3和表4)。根據(jù)本發(fā)明的1.0微米微粒的結(jié)合性稍小于2.8微米微粒，但是本發(fā)明的微粒產(chǎn)生更多的信號?？傊Y(jié)果表明，與市售微粒相比，雖然根據(jù)本發(fā)明的不飽和的微粒具有更低的結(jié)合力，但它們產(chǎn)生的分析信號和市售微粒一樣好，或者比市售微粒更好。盡管存在本發(fā)明的結(jié)合性表面具有與市售微粒相比明顯更低的結(jié)合力這一事實。實施例3使用分散步驟制備不飽和的表面通過使用低的生物素化試劑對BSA的摩爾投入比率(4:1)制備的生物素-BSA在用于制造不飽和結(jié)合性表面的的分散方法中被使用。簡言之，將(如上所述制備的)生物素-BSA共價附接于如上所述Dynal⑧微粒，從而產(chǎn)生相對于每單位支持物表面積生物素數(shù)量不飽和的表面。在加入SA之前，然后在分散步驟中使用該涂敷的微粒。最初的研究使用血球計數(shù)器(顯微鏡分析)在如下階段評價如上所述制備的涂敷了生物素-BSA的微粒的聚集狀況(1)在加入SA之前；(2)在將10mg/mL涂敷了生物素-BSA的微粒的溶液逐滴加至連續(xù)地混合的SA溶液(0、125、250、375、500、750、或1000微克SA/每mL)后；以及(3)在將不同含量的18mg/mL的SA溶液(25、50、75、100、150或200微克SA/每mg微粒)加至連續(xù)地混合的10mg/mL生物素-BSA涂敷微粒的溶液后進(jìn)行。報道了包括單體(單一微粒)、二聚體(兩個微粒的聚集體)、三聚體(三個微粒的聚集體)、小聚集體(4至10個微粒的聚集體)、以及大聚集體(大于10個微粒的聚集體)的血球計數(shù)結(jié)果。聚集體定義為兩個以上生物素-BSA微粒經(jīng)由SA交聯(lián)的連接體(即，SA是多價的，具有四個亞基，并且各個亞基具有一個生物素結(jié)合性結(jié)構(gòu)域)。血球計數(shù)結(jié)果表明，在加入SA之前生物素-BSA微粒是單分散(僅為單體和二聚體)的，當(dāng)將生物素-BSA微粒(逐滴)滴入SA溶液直到750微克SA/每毫升時，大部分生物素-BSA微粒發(fā)生聚集(大聚集體)；當(dāng)將生物素-BSA微粒(逐滴)滴入1000微克SA/每毫升的SA溶液時，生物素-BSA微粒發(fā)生單分散(三聚體、二聚體、以及單體)；并且當(dāng)將SA以全部測試濃度加入至生物素-BSA微粒時，生物素-BSA微粒發(fā)生高度聚集(大聚集體)。這里使用的術(shù)語"基本上單分散"，意思是指微粒群體基本上僅以單體和二聚體形態(tài)存在。通過將涂敷了生物素-BSA的微粒逐滴加入至SA的混合溶液、或者通過將SA溶液加入至生物素-BSA微粒的混合溶液制備出的涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒，可以通過使涂敷了SA的微粒與混合物一起經(jīng)受超聲能量處理(2X300瓦特，60秒)而被驅(qū)逐成臨時的單分散狀態(tài)(大部分為三聚體，具有二聚體和單體)，但是微粒不會隨時間保持單分散，并且會再次變得高度聚集。超聲能量不會得到永久性地單分散的涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒，并且不能減輕生物素-BSA微粒由于SA交聯(lián)而聚集的傾向。完成血球計數(shù)研究來確定疏水性的微粒單分散(1.03微米聚苯乙烯PMP，目錄編號Ml-070/40、EMD生物科學(xué)公司)所要求的Pluronic⑧F108的含量(在水中從0到1000nMPluronicF108的17個稀釋水平)。這些研究結(jié)果表明，在PluronicF108濃度為27.04嗎PluronicF108/mg微粒(稀釋度水平6)到2027.7嗎PluronicF108/mg微粒(稀釋度水平15)處，M1-070/40微粒是基本上單分散的(即，僅有單體和二聚體)。當(dāng)PluronicF108濃度小于27.04嗎PluronicF108/mg微粒時、以及當(dāng)濃度大于2027.7ngPluronic⑧F108/mg微粒時，微粒發(fā)生聚集(很可能由于三區(qū)段共聚物的多層堆積)。假定界面表面積為20腦2/每Pluronic⑧F108分子、并且微粒表面面積為38.38cm々mg(基于1.03pm、光滑表面、完美的圓球形)，表面面積計算預(yù)計單層的Pluronic⑧F108理論上將需要至少4.1嗎Pluronic⑧FI08/mg微粒。應(yīng)該注意，M1-070/40微粒的尺寸或光滑表面是不均一的(粒徑分布不均勻)，并且含有大量直徑小于1.03微米的細(xì)微粒(基于通過使用貝克曼考爾特公司LS13320激光衍射顆粒分級機的微粒粒度分析)。細(xì)微粒和粗糙的微粒表面都表明，M1-070/40微粒具有比上述計算值更大的表面面積/每mg。該血球計數(shù)結(jié)果支持這一假設(shè)，因為微粒單分散需要大于27嗎Pluronic⑧F108/mg微粒。該研究結(jié)果表明，在濃度為27.04至2027.7嗎PluronicF108/mg微粒(稀釋度水平6至lj15)處，Pluronic⑧F108可以導(dǎo)致微粒單分散。用生物素-BSA涂敷的特定組的微粒(Dynal⑧DYNABEADSMyOne甲苯磺?；罨琹.O微米直徑，Invitrogen公司)具有從74至84cm2/mg的表面面積(分析證明上提供的數(shù)據(jù)；Irwitrogen公司)。基于這些數(shù)值、以及上述的Pluronic⑧F108血球計數(shù)研究，計算出含有25mg生物素-BSA微粒/每mL的0.4%(w/v)的Pluronic⑧F108溶液(或4mg/mL)將提供大約160嗎PluronicF108/mg微粒。因為在Pluronic⑧F108血球計數(shù)研究中使用的1.03微米M1-070/40微粒(EMD生物科學(xué)公司)具有大于38.38cm2/mg的表面面積，并且在27.04至2027.7jigPluronicF108/mg微粒的濃度處是單分散地，故0.4%(w/v)PluronicF108、或者160嗎PluronicF108/mg微粒的溶液被用于最初的分散研究，以確保存在足夠量的Pluronic⑧F108來促進(jìn)生物素-BSA微粒單分散。通過將SA(25至50嗎SA/mg微粒)加入至25mg/mL生物素-BSA微粒制備出的涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒在加入SA后是單分散的，該生物素-BSA微粒分散在含有0.4%(w/v)PluronicF108(PluronicF-108NF金屬顆粒，BASF公司)的PBS(20mM磷酸鈉，150mM氯化鈉，pH7.2)緩沖液、或者含有0.4%(w/v)PluronicF108的TBS(20mMTris、150mM氯化鈉、pH7.2)緩沖液中。微粒保持單分散，與SA的加入順序無關(guān)(g卩，將生物素-BSA微粒逐滴加入至SA、或者將SA加入至生物素-BSA微粒)，只要在與SA結(jié)合之前將生物素-BSA微粒分散在含有0.4%(w/v)Pluronic⑧F108的溶液中。不同于如上所述超聲處理的應(yīng)用，如果在與SA結(jié)合之前，將生物素-BSA微粒分散在含有Pluronic⑧F108的緩沖液中，那么涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的微粒就會保持單分散。因此，在生物素-BSA微粒與SA結(jié)合之前和之后，通過提高微粒膠體穩(wěn)定性(由于Pluronic③F108懸掛的羥基而降低微粒支持物表面疏水性、提高微粒支持物表面負(fù)電荷，并且由于表面對表面的負(fù)電荷排斥性而提高微粒排斥力)，并且在微粒交聯(lián)可能發(fā)生之前通過允許SA分子與全部可利用的(未結(jié)合的和可以接近的)微粒表面生物素結(jié)合，0.4M(w/v)Pluronic⑧F108成功地用作分散劑來促進(jìn)生物素-BSA微粒單分散。只有當(dāng)微粒生物素可被利用時，并且當(dāng)四個SA結(jié)合性結(jié)構(gòu)域中的至少兩個可以與在兩個不同的微粒上的未結(jié)合的和可以接近的生物素結(jié)合時，交聯(lián)才可能發(fā)生。憑經(jīng)驗確定，Pluronic⑧F108可以0.4。/。至0.6。/。(w/v)的濃度用作用低投入比率的生物素化BSA涂敷的微粒的分散劑。簡言之，組合評估SA的投入比率(10、15、25和35jigSA/mg生物素-BSA微粒)、保溫時間(30和60分鐘)、以及PIuronicF108百分比(0.4至0.6%w/v)，來優(yōu)化分散步驟。測定性能試驗(AccessFreeT4和AccessAccuTnl測定；貝克曼考爾特公司)、以及生物素化IgG結(jié)合力測試的結(jié)果表明，當(dāng)符合如下條件時，分散過程是實用的以在含有0.4%至0.6%(w/v)Pluronic⑧F108的TBS緩沖液(20mMTris，150mM氯化鈉，pH7.2)中25mg生物素-BSA微粒/mL的微粒濃度加入25至35[xgSA/每mg生物素-BSA微粒，并且孵育30至60分鐘?！┥锼鼗⒘１惶幚聿⑶冶环稚⒃?.4%至0.6%(w/v%)Pluronic⑧F108溶液中，就可以將低水平或含量的SA加至生物素化微粒，而不形成微粒聚集體或凝塊。該工藝導(dǎo)致在用SA涂敷微粒后，微粒單分散。在圖6所示的工藝示意圖中，其顯示了在沒有PluronicF108時涂敷的微粒用SA處理的情況，并且顯示了由Pluronic⑧F108處理導(dǎo)致的單分散。實施例4由于SA不飽和性和定向性而提髙的信噪比、增強的表面封閉性、以及提高的結(jié)合效率在普通微粒的信噪比與本發(fā)明的的不飽和微粒的信噪比之間的兩個測定平臺上進(jìn)行比較，本發(fā)明微粒的特征為SA不飽和性和定向性、增強的表面封閉性、以及提高的結(jié)合效率。通過使用涂敷至微粒表面上的GxBiotin(山羊抗生物素)抗體一次涂層、接著使用指示BNP的生物素化OMNKXONAL(Biosite公司)Fab片段的二次涂層，將指示B型促尿鈉排泄肽或腦促尿鈉排泄肽(BNP)的結(jié)合性表面構(gòu)造在普通的微粒(M1-070/40微粒，EMD生物科學(xué)公司)上。簡言之，通過下述步驟，使用碳二亞胺化學(xué)技術(shù)將GxBiotinIgG—次涂層涂敷于10mg/mL微粒在MESpH5.5中，用大約6至10摩爾EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽；Pierce生物技術(shù)公司/ThermoScientific公司)、和6至10摩爾硫代-NHS(n-羥基硫代琥珀酰亞胺；Pierce生物技術(shù)公司/ThermoScientific公司)/每mol表面羧基來活化微粒表面羧基(70至100pmolsCOOH/g);將微粒與活化試劑一起保溫30至35分鐘；通過用MESpH5.5洗滌微粒三次，除去過量的活化劑；加入40微克的GxBiotinIgG/每mg活化微粒；將活化的微粒與GxBiotinIgG—起保溫120至135分鐘；用基于甘氨酸的緩沖液除去過量的GxBiotinIgG，并淬火殘余的活化羧基；使用低pH(pH2.5)和高pH(pH8.0)含有表面活性劑TRITON⑧X-100(聚乙二醇對(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚)的緩沖液剝離被動地吸附的GxBiotinIgG;以及用BSA封閉微粒表面。通過下述步驟涂敷二次涂層將GxBiotinIgG初次涂敷的微粒洗滌入對BNP測定特異的稀釋劑；加入10微克的生物素化BNPFab/每mg的GxBiotin微粒；在室溫下將生物素化BNPFab與微粒一起保溫90至135分鐘;洗滌微粒，以除去過量的生物素化BNPFab;以及用對BNP測定特異的稀釋劑將涂敷BNP的微粒稀釋至1.0mg/mL。通過下述步驟制備出根據(jù)本發(fā)明的不飽和的微粒將低投入比率的生物素化BSA共價連接于DynalAKT-100甲苯磺?；罨腜MP，其中BSA以4摩爾生物素對1摩爾BSA的摩爾投入比率被生物素化；接著用PluronicF108封閉生物素-BSA微粒；在PlurOnicF108中分散被封閉的生物素-BSA微粒；以及最后用SA涂敷生物素-BSA微粒。生物素化單克隆抗體的投入比率對于普通涂敷的微粒和不飽和的微粒是一樣的。該生物素化OMINCLONALFab可指示BNP。以相同的微粒濃度(1.0mg/mL)評估普通涂敷的微粒和不飽和的微粒，并且對它們用相同的試劑、對照樣品、以及病人樣本按相同的Access測定形式(貝克曼考爾特公司)進(jìn)行測試。結(jié)果如表5所示。對于普通的微粒和不飽和的微粒，在下述兩個測定平臺(貝克曼考爾特公司)中的每一個上測量信噪比UniCelDxI800Access⑧免疫測定體系(相對高通量的系統(tǒng))和Access⑧2免疫測定體系(相對較低通量的系統(tǒng))。對于13個分離的病人樣本，在整個標(biāo)準(zhǔn)水平范圍內(nèi)測量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)答。以RLUs顯示對于普通的微粒的結(jié)果(表5中"對照物")和對于不飽和微粒的結(jié)果(表5中"Dev3")。對于對照物和不飽和的微粒，以同樣方式確定表示為"％偏差"的測定平臺偏差。術(shù)語"偏差"指的是可能發(fā)生在任何測定系統(tǒng)之間的測定劑量差異，所述系統(tǒng)包括Access2免疫測定體系和UniCel⑧DxI800Access⑧免疫測定體系，該差異是由于硬件、設(shè)計、以及通量差異(即，Access③2免疫測定體系可以完成100個測試/每小時，而UniCelDxl800⑧免疫測定體系可以完成400個測試/每小時)而造成的，即使兩種平臺使用相同的試劑和供給物。任何偏差可以被歸因于在各個平臺超聲處理、混合、洗滌、以及保溫微粒試劑的方式中的差異。對于普通微粒和不飽和的微粒，計算出平均劑量。如表5顯示，對于根據(jù)本發(fā)明的微粒的偏差測量總體上比對于普通微粒的偏差測量更好。表5還顯示，對于不飽和的微粒(1)背景更低(將S0與S1-S5相比較)；(2)在全部標(biāo)準(zhǔn)水平和全部病人樣本范圍內(nèi)，背景信號更優(yōu)良；并且(3)對于全部標(biāo)準(zhǔn)水平和全部病人樣本，靈敏度更高。因此，不飽和的微粒使得測定信號增大(例如，使用Dxl平臺，對于普通的微粒在S5處為13X106RLUs，而對于本發(fā)明的不飽和微粒在S5處為23X106RLUs)，并且使得測定噪音或者背景顯著降低(例如，通過使用DxI平臺，對于普通的微粒在SO處為10X103RLUs，而對于本發(fā)明的不飽和微粒在SO處為7X103RLUs)。表51由于在微接結(jié)合性表面上不飽和的生物素化技體和定向兩導(dǎo)致増大的信號翔定<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>根據(jù)本發(fā)明的微粒與市售結(jié)合性微粒進(jìn)行另一個比較(參見表2對于微粒的描述)。在該比較中，得到了通過用重組體SA初次涂敷Pyna隨AKT-100甲苯磺酰基活化的PMP而制備的市售Dynal③微粒(Invitrogen公司)。將市售涂敷了SA的微粒的性能與通過下述步驟制備的根據(jù)本發(fā)明的微粒的性能相比較用低投入比率的生物素化BSA涂敷DynalAKT-100甲苯磺酰基活化的PMP;用Pluronic⑧F108封閉生物素-BSA微粒；在PluronicF108中分散被封閉的生物素-BSA微粒；以及最后用SA涂敷生物素-BSA微粒。市售微粒和不飽和的微粒都被用于肌鈣蛋白I測定(Access③AccuTnl測定；貝克曼考爾特公司)，該測定使用抗作為捕獲部分的Tnl的生物素化抗體。市售微粒和本發(fā)明的不飽和的微粒都以相同的微粒濃度進(jìn)行評估，并且用相同的試劑、對照樣品、以及病人樣本按相同的測定形式進(jìn)行測試。結(jié)果如表6所示。表6由于在微粒表面上的SA不飽和性和定S性、H及瞎后的生物素化抗體不炮和性和定S性而帝來的提高的》|定信噪比參數(shù)Dynal方法BCI方法標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)答(皮克/mL)so='013,0238,116S1a2949,03054鄰6s2=113149,472194,922S3=525587,250779,833S4=24652,870,7403,829,280S5-48419,611,63512,422,050y,cv標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)答S0=0，.9%CV標(biāo)準(zhǔn)劑雖'''■■—…"|f':'......i—.......'〗S1=291.01.8S2M131.80.7S3-5253.60.4S4-24653.21.0S5-48414.61.7比率S1/S03,86.8SS/S07381531本發(fā)明的不飽和的微粒導(dǎo)致測定信號與市售微粒的測定信號相比顯著增大(例如，對于S5，從9.6X106RUJs增大至12.4X106RLUs)、以及測定噪音或背景的顯著降低(例如，對于S0，由13X1()3rLUs降低至8X103RLUs)。因此，由于SA在微粒結(jié)合性表面上的不飽和性和定向性、以及其累積的對隨后加入的生物素化抗體的不飽和性和定向性影響，本發(fā)明的不飽和的微粒顯示出增大的測定信噪比。應(yīng)注意，上述Dyna1⑧方法和BCI方法的比較使用了優(yōu)化的(商品化產(chǎn)品，Dynal⑧DYNABEADSMyOne鏈霉抗生物素蛋白T1;Invitrogen公司)Dynal⑧方法，但沒有使用優(yōu)化的BCI方法。隨后的使用優(yōu)化的BCI方法進(jìn)行的不飽和微粒的Tnl測試(AccessAccuTnl測定)導(dǎo)致了測定信號更顯著的增大(B卩，Sl=80,000RLUs、S5=18,300，000RLUs)、類似的測定噪音或背景(即，S0=8,500RLUs)、以及增大的曲率(即，Sl/S0-9.4、S5/S0=2,130)。實施例5非特異結(jié)合性下降通過使用根據(jù)本發(fā)明制備的微粒進(jìn)行的研究顯示了非特異的結(jié)合性下降，因為在許多測定形式中非特異的結(jié)合性是不期望有的現(xiàn)象。非特異的結(jié)合性描述了在免疫測定中涉及其組分和/或支持物表面的人為的結(jié)合現(xiàn)象，該人為的結(jié)合現(xiàn)象產(chǎn)生不期望有的副產(chǎn)品，所述副產(chǎn)品可以不利地影響測定性能參數(shù)，包括作為非限制性的例子的信噪比。非特異的結(jié)合性可以涉及對于固相支持物表面本身、和/或?qū)τ谕糠笤谥С治锉砻嫔系呐潴w::支持物連接物復(fù)合物的結(jié)合。檢驗了使用BSA作為支持物連接物的微粒的特定實施方式。BSA是白蛋白(牛血清白蛋白)，并且白蛋白可以結(jié)合甲狀腺激素。已經(jīng)識別出BSA作為對于甲狀腺激素T3和T4的結(jié)合性蛋白。如果固相支持物表面用BSA涂敷，那么結(jié)合性表面將會捕獲或者結(jié)合這樣的甲狀腺激素，除非其被成功地封閉。因為通過下述步驟制造出不飽和的SA微粒用生物素化BSA涂敷微粒、用Pluronic⑧F108封閉表面、以及用SA涂敷生物素-BSA表面，所以不飽和的SA微粒有潛力去結(jié)合甲狀腺激素比如T3和T4，除非它們的表面被足夠地封閉。特別地，如果將不飽和的SA微粒與T3堿性磷酸酶結(jié)合物一起保溫，那么該微?？梢越Y(jié)合T3結(jié)合物，并且在測定中產(chǎn)生非特異結(jié)合性(NSB)信號，除非表面被封閉并且非特異的結(jié)合性被減輕或者消除。除了增大的背景之外，提高的標(biāo)準(zhǔn)信號可能由T3結(jié)合物的非特異的結(jié)合性引起。憑經(jīng)驗確定，PluronicF108可以0.4%至0.6%(w/v)的濃度封閉用低投入比率的生物素化BSA涂敷的微粒。最初的封閉研究評估了作為封閉劑用于用生物素化BSA涂敷的甲苯磺?；罨槾判晕⒘５?.1MTrispH8.0中的0.1%(w/v)BSA、以及0.1MTrispH8.0中的0.4%(w/v)Pluronic③F108。在37°C下將生物素-BSA微粒與0.1%(w/v)BSA或0.4%(w/v)PluronicF108封閉緩沖液一起保溫18小時，并且通過慢慢地將生物素-BSA微粒滴入摩爾過量的SA而用SA涂敷。在封閉之前、并且也在封閉以后，使用下述緩沖液之一來洗滌該生物素-BSA微粒三次PBS，pH7.4;含有0.1%(w/v)TRITONX-100的PBS，pH7.4;含有0.4%(w/v)Pluronic⑧F108的PBS，pH7.4;TBS，pH7.4;含有0.1%(w/v)TRITONX-100的TBS，pH7.4;或者含有0.4%(w/v)Pluronic⑧F108的TBS。測定性能試驗(AccessAccuTnl測定；貝克曼考爾特公司)的結(jié)果表明，使用0.4%(w/v)Pluronic⑧F108封閉緩沖液、以及用TBSpH7.4洗漆會得到最最低的背景信號(最低的S0RLUs)、最高的標(biāo)準(zhǔn)信號(最高的Sl和S5RLUs)、最大的測定動態(tài)范圍、以及最高的信噪比。隨后的封閉優(yōu)化研究評估了通過下述方法制備的生物素-BSA微粒的性能用硫代-NHS-LC-生物素、硫代HHS-LC-LC-生物素、或PFP生物素生物素化BSA;用TBSpH7.4洗滌三次；用0.1%(w/v)BSA封閉緩沖液或用0.4%(w/v)Pluronic⑧F108封閉緩沖液在37。C下封閉4小時，或者在37。C下封閉18小時；用TBSpH7.4洗滌三次；并且通過慢慢地將生物素-BSA微粒滴入摩爾過量的SA或NeutrAvidin而用SA或NeutrAvidin涂敷。測定性能試驗(Access⑧AccuTnl測定；貝克曼考爾特公司)的結(jié)果表明，用下述方法得到的硫代-NHS-LC-生物素BSA微粒、以及PFP-生物素BSA微粒得到了最低的背景信號(SO)、最高的標(biāo)準(zhǔn)信號(Sl和S5)、最大的測定動態(tài)范圍、以及最高的信噪比用0.4%(w/v)Pluronic⑧F108在37。C下封閉4小時，并且用SA或NeutrAvidin涂敷。使用通過下述步驟制備的生物素-BSA微粒進(jìn)行最后的Pluronic⑧F108封閉優(yōu)化研究在0.1M硼酸鹽pH9.5中，在40。C下將低投入比率的硫代-NHS-LC-生物素結(jié)合的BSA(40微克生物素-BSA/每mg微粒)涂敷到Dynal⑧MyOne甲苯磺酰基活化的微粒(Dynal⑧DYNABEADSMyOne甲苯磺?；罨?.0微米直徑，Invitrogen公司)上18小時；用TBSpH7.4洗滌該生物素-BSA微粒三次；在40。C下，用TBSpH7.4中的0.2%、0.4%、0.6%、或0.8。/o(w/v)Pluronic⑧F108封閉2、4、或24小時；用TBSpH7.4洗滌三次；并且通過在含有0.4%(w/v)Pluronic⑧F108pH7.4的TBS中分散生物素-BSA微粒、然后加入35微克SA/每mg微粒而用SA涂敷。測定性能試驗(Access⑧FreeT4和Access⑧AccuTnl測定；貝克曼考爾特公司)、以及生物素化IgG結(jié)合力測試的結(jié)果表明，用0.4%至0.6%(w/v)Pluronic⑧F108封閉4小時的微粒得到了最低的背景信號、最高的標(biāo)準(zhǔn)信號、最大的測定動態(tài)范圍、最高的信噪比、以及可再現(xiàn)的生物素化IgG結(jié)合力。為了評價不飽和的涂敷了SA的微粒的非特異的結(jié)合性，在4°C或37°C下將許多不飽和的涂敷了SA的微粒保溫3天，并且通過使用Access⑧FreeT4標(biāo)準(zhǔn)和Access⑧FreeT4試劑包(貝克曼考爾特公司)在FreeT4免疫測定中進(jìn)行測試。在沒有對生物素化FreeT4特異的抗體("無AB")的情況下的測試樣本將評價T3結(jié)合物對于微粒表面的的非特異結(jié)合性。表7顯示了本發(fā)明的具有用SA涂敷的生物素化BSA的微粒與市售微粒測定(Access⑧FreeT4)中產(chǎn)生的信號相比較的結(jié)果，該測定使用卵清蛋白和生物素化抗體以及購自Invitrogen公司的DynalDYNABEADSM-280鏈霉抗生物素蛋白微粒(2.8微米微粒)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>平均X差異有Ab為105.9X:沒有Ab為107.65SAccess儀器sAccessFreeT4試劑包結(jié)果表明，結(jié)合物的非特異結(jié)合不會發(fā)生，因為當(dāng)從試劑包(無Ab)中除去對生物素化FreeT4特異的抗體時，在4。C和37。C下不飽和的樣本中的SO測定信號皆是<8,500RLUs。僅當(dāng)非特異的結(jié)合發(fā)生時、或者當(dāng)對生物素化FreeT4特異的抗體存在于測定中時，才產(chǎn)生測定信號，因為SA表面將捕獲對生物素化FreeT4特異的抗體，并且被捕獲的對FrceT4特異的抗體確實結(jié)合了T3結(jié)合物(S卩，S0〉1.5x106RLUs)。市售微粒使用具有卵清蛋白(無BSA)的SA微粒，以便降低非特異的結(jié)合性。盡管不飽和的微粒使用低投入比率的生物素化BSA，但它們表現(xiàn)得更好?？傊Y(jié)果表明，即使在升溫下延長期限(37。C下3天)，也未觀察到非特異的結(jié)合性，該結(jié)果建議，在這些條件下Pluronic⑧F108未從不飽和的微粒中被取代。因此，甚至在升高的溫度下隨時間延長，用PluronicF108封閉的涂敷了生物素-BSA、涂敷了SA的結(jié)合性表面也得到了降低的或最小化的T3堿性磷酸酯結(jié)合物的非特異結(jié)合性。實施例6涂覆工藝再現(xiàn)性對于根據(jù)本發(fā)明的不飽和的并且被定向的微粒，對SA涂敷工藝進(jìn)行驗證。結(jié)果如表8和圖12及圖13所示。進(jìn)行工藝驗證的微粒是根據(jù)本發(fā)明制備的微粒。簡言之，用低投入比率的生物素化BSA涂敷DynalAKT-100甲苯磺?；罨腜MP(Invitrogen公司)；用Pluronic⑧F108封閉生物素-BSA微粒；將被封閉的生物素-BSA微粒分散在Pluronic⑧F108中；并且用SA涂敷生物素-BSA微粒。用獨立地制備的下述物質(zhì)不同的組合物進(jìn)行測定SA涂敷("工藝")、微粒組("甲苯磺酰基活化的PMP組")、低投入比率的生物素化BSA組("低投入比率的生物素化BSA組")、PluronicF108組("嵌段共聚物PluronicF108組")、以及SA組("SA組")。在表8中，術(shù)語"工藝"指的是用低投入比率的生物素化BSA涂敷微粒、用Pluronic⑧F108封閉微粒、在PluronicF108中分散微粒、以及將SA涂敷在生物素-BSA微粒上；"操作者"是指，SA涂敷或稱"工藝"由四個不同的操作員中的一個進(jìn)行。<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table>使用五種單獨的市售對照物("Bio-Rad液體l"、"Bio-Rad液體2"、"Bio-Rad1"、"Bio-Rad2"、以及"Bio-Rad3";Bio-Rad實驗室公司)和兩個庫存的病人血清樣本("病人庫1"和"病人庫2")以及三個個體樣本("試樣1"、"樣本2"、和"樣本3")，采用FreeT4測定(參見圖12)進(jìn)行11組驗證，該進(jìn)一步驗證研究的結(jié)果顯示出較好的一致性，CV小于或等于約5。/。。相反，傳統(tǒng)制備的微粒(例如，DYNABEADSM-280SA微粒)的CV至少為約10%。使用三組其中抗原被摻入血清的對照物(對照物A、B、以及C)和三個病人血清對照物(QC病人1、2、3)，采用BPH-A標(biāo)記進(jìn)行IO組驗證，該進(jìn)一步的驗證研究(參見圖13)得到類似的發(fā)現(xiàn)結(jié)果。SA涂覆工藝驗證的結(jié)果顯示，全部驗證說明符合全部驗證組。另外，結(jié)果表明，根據(jù)本發(fā)明制備微粒的工藝與低程度的差異有關(guān)，是可再現(xiàn)的，并且是可靠的。實施例7不飽和的微粒增強的穩(wěn)定性通過T4在標(biāo)準(zhǔn)或樣本中的回收率進(jìn)行測量的加快的穩(wěn)定性試驗，在多組連接有生物素化抗T4抗體的不飽和的涂敷了SA的微粒的驗證中進(jìn)行，測試條件為在Access⑧FreeT4測定(貝克曼考爾特公司)中使用Access⑧FreeT4標(biāo)準(zhǔn)，在4。C下和在37。C下為期4天、以及在4。C下和在37。C下為期127天。結(jié)果如表9和圖14A及圖14B所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>*工藝指的是人工制備微粒，或者通過三種半自動的工藝制備微粒.無論是人工還是半自動合成根據(jù)圖1A和1B的歩頃制備微粒表9顯示了不飽和的涂敷了SA的微粒在37。C下保溫4天與在4。C下保溫4天相比較的驗證組中的平均標(biāo)準(zhǔn)、對照物劑量、以及病人劑量回收率。由表9可見，所有組中的平均回收率是或約為100%。在圖14A和I4B中，回收率被表示為通過在37。C下127天后測定FT4而測量的RLUs與通過在4。C下127天后測定FT4而測量的RLUs相比的百分?jǐn)?shù)。標(biāo)準(zhǔn)水平是SO=0.0ng/mL、SI=0.54ng/mL、S2=1.01ng/mL、S3=1.98ng/mL、S4=3.00ng/mL、以及S5=6.11ng/mL。除標(biāo)準(zhǔn)外，測定的其他樣本包括Bio-Rad對照物1=0.64ng/mL、Bio-Rad對照物2=2.18ng/mL、以及Bio-Rad對照物3=4.19ng/mL("Bio-Radlypho");五個單獨的病人樣本("病人#")，劑量分別為病人1=1.02ng/mL、病人2=1.12ng/mL、病人3-1.83ng/mL、病人4=2.74ng/mL、以及病人5=3.80ng/m乙?？傮w上，回收率是或約為100%，這表明，在升高的溫度下延長時間期限的處理不會不利地影響不飽和微粒的性能。為比較目的，對于使用市售涂敷了SA的微粒的FreeT4測定(Access⑧FreeT4測定；貝克曼考爾特公司)的說明被包含于圖14A和14B中("當(dāng)前的FT4測定說明書")。該不飽和的微粒落入了市售FreeT4測定說明書的范圍內(nèi)?？傮w上，加快的穩(wěn)定性測試確認(rèn)，獨立地生產(chǎn)的涂敷了SA的微粒批次是很穩(wěn)定的。研究沒有發(fā)現(xiàn)在4。C下保溫3天或在37。C下保溫3天的驗證組之間有顯著的差異。標(biāo)準(zhǔn)信號非常類似(標(biāo)準(zhǔn)回收率為99.1%至113.5%)，并且平均對照物和病人劑量回收率全部為97.2%至102.9%。當(dāng)單一組在4。C或37。C下保溫127天時，沒有發(fā)現(xiàn)顯著的性能差異。標(biāo)準(zhǔn)信號非常類似(標(biāo)準(zhǔn)回收率為95.1%至109.6%)、曲率非常類似(％回收率為91.3%至105.1%),并且平均對照物和病人劑量回收率全部為93.7%至107.6%。實施例8不飽和的微粒的脫落分析對根據(jù)本發(fā)明制備的不飽和的微粒進(jìn)行脫落研究。在根據(jù)本發(fā)明制備的使用生物素-BSA并且涂敷有SA的微粒(參見實施例11)中有大約8.7-14.0嗎生物素-BSA/mgPMP、以及5.6-7.8ngSA/mgPMP。如果1%的蛋白質(zhì)從10mg總的PMP中脫落，在溶液中將有大約0.7-1.0嗎的蛋白質(zhì)。對于這樣的涂敷了SA的微粒進(jìn)行脫落分析。在HPLC(SEC-HPLC)上的篩析色譜法結(jié)果顯示，在210nm處未檢測到SA或BSA、或者脫落小于1%。如果SA和/或生物素-BSA在溶液中是游離的，那么它們低于SEC-HPLC方法的檢測極限(參見圖15a和15b)。在圖15b中，y球蛋白和卵清蛋白sec標(biāo)準(zhǔn)峰值(峰高1,400mAU)代表在210nm處的83.5嗎總蛋白。5mAU的峰高(毫吸收單位)將代表0.3fig的蛋白質(zhì)。在210nm處的篩析HPLC分析表明，微粒在37。C下加壓3天后，在溶液中沒有可檢測到的生物素-BSA或SA分子(例如，沒有蛋白質(zhì)從微粒表面上脫落)。因此，對于根據(jù)本發(fā)明制備的微粒，不存在脫落的問題。上述的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)支持SEC-HPLCSA脫落分析的結(jié)果，因為測定信號、以及假定的生物素化的IgG結(jié)合性不受微粒在37。C下加壓127天的影響(圖14A-B)。實施例9卵清蛋白的低投入比率的生物素化用與生物素偶聯(lián)的卵清蛋白代替與生物素偶聯(lián)的BSA來制備根據(jù)本發(fā)明的微粒。如同實施例1中對于BSA的描述，卵清蛋白被以不同的生物素對卵清蛋白的摩爾投入比率(參見表10)用硫代-NHS-LC-生物素(硫代琥珀酰亞胺-6-[生物素酰氨基]己酸，Pierce生物技術(shù)公司/ThermoScientific公司)生物素化。簡言之，如表10所示，通過如下步驟制備四個單獨的生物素化組以不同的投入比率用硫代-NHS-LC-生物素對在硼酸鹽緩沖液、pH8.2和DMF中的卵清蛋白(在1.253mL中20mg)進(jìn)行生物素化。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>產(chǎn)生的生物素化百分?jǐn)?shù)是對于投入比率2為75.6%;對于投入比率4為83.3%;對于投入比率6為85.1%;以及對于投入比率8為79.1%。對各個投入比率進(jìn)行HABA(4'-羥基偶氮苯-2-羧酸)分析。結(jié)果如表ll所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>通過下述步驟完成4個單獨的生物素化卵清蛋白的生物素化組的穩(wěn)定性分析在37。C下，在pH9.5的0.1M硼酸鹽緩沖液中用卵清蛋白-生物素涂敷25mg/mL甲苯磺?；罨腜MP(Dynal⑧DYNABEADSMyOne甲苯磺酰基活化，l.O微米直徑，Invi加gen公司)(0.050毫克卵清蛋白-生物素/每mgPMP)18~24小時；用pH7.4的TBS洗滌微粒三次；在37。C下，在TBSpH7.4中，用0.4%(w/v)的PluronicF108封閉涂敷了卵清蛋白-生物素的微粒表面4小時；用TBSpH7.4洗滌微粒三次；將卵清蛋白-生物素微粒分散在含有0.4%(w/v)PluronicF108的TBSpH7.4中；在室溫下，用在TBSpH7.4中的SA涂敷卵清蛋白-生物素微粒30分鐘(0.035mgSA/每mg卵清蛋白-生物素PMP);用含有疊氮化鈉(0.1%w/v)的TBSpH7.4洗滌微粒三次；用對AccessFreeT4測定特異的微粒緩沖液洗滌微粒三次；用對Access⑧FreeT4測定特異的微粒緩沖液將微粒從25mg/mL稀釋至0.35mg/mL;在4。C或37。C下將涂敷了卵清蛋白-生物素-SA的微粒保溫3天；以及在Access⑧FreeT4測定(貝克曼考爾特公司)中測試卵清蛋白-生物素-SA微粒結(jié)合生物素化抗FreeT4抗體的能力。通過計算單個的FreeT4標(biāo)準(zhǔn)RLU回收率的平均值來確定穩(wěn)定性。該Access⑧FreeT4測定使用了具有0ng/ml至6ng/ml的抗原水平的6個不同的標(biāo)準(zhǔn)(SO、Sl、S2、S3、S4、以及S5)(參見表4)。通過用4。C下的標(biāo)準(zhǔn)RLU應(yīng)答除以37。C下標(biāo)準(zhǔn)RLU應(yīng)答、并且乘以100%，計算出回收率。通過平均全部6個標(biāo)準(zhǔn)的回收率，計算出穩(wěn)定性。結(jié)果如表ll所示。穩(wěn)定性是在4°C或37°C下保溫固相3天之后SA結(jié)合力變化的指示。穩(wěn)定性降低起因于被動地結(jié)合的卵清蛋白或卵清蛋白試劑從卵清蛋白-BSA結(jié)合物上脫落或解離、以及隨后的游離生物素或生物素試劑隨時間被SA捕獲。表11表明，通過使用在此描述的低投入比率的生物素化，可以有效地制備除BSA之外的蛋白質(zhì)比如卵清蛋白。卵清蛋白-生物素穩(wěn)定性測試的結(jié)果非常類似于較早描述的生物素-BSA穩(wěn)定性結(jié)果(參見表1)。結(jié)果表明，以較高的摩爾投入比率(即，8:1)制備的卵清蛋白-生物素顯示出降低的穩(wěn)定性。隨著生物素試劑對卵清蛋白的摩爾投入比率從8:1降低至2:1，穩(wěn)定性從82%提高到97°/。(參見表ll)。實施例10在用于親合分析的微粒表面上的生物素、SA、以及免疫球蛋白的密度通過使用生物素作為配體、并且使用BSA作為支持物連接物，來制備根據(jù)本發(fā)明的PMP。SA被用于結(jié)合作為捕獲部分的生物素化IgG。簡言之，根據(jù)實施例1所述的程序(即，用根據(jù)實施例1的方案制備的低投入比率的生物素-BSA涂敷PMP)，制備Dyna隨PMP(Invi加gen公司)。微粒根據(jù)本發(fā)明制備并且根據(jù)本發(fā)明用低投入比率的生物素-BSA涂敷，然后用SA涂敷。此后，用生物素化IgG處理涂敷了SA的PMP。使用了下述IgG:生物素化M06IgG,其為McxAccessAccuTnl單克隆抗體，在Access⑧AccuTnl測定(貝克曼考爾特公司)中用作檢測抗體(S卩，其被結(jié)合于堿性磷酸酶)；以及生物素化399.4IgG,其為McxFPSA單克隆抗體，在Access⑧FreePSA測定(貝克曼考爾特公司)中用作捕獲抗體(即，其被涂敷到山羊抗生物素PMP上)。用M06IgG或399.4IgG涂敷根據(jù)本發(fā)明制備的各組SAPMP，如同較早描述的那樣，通過使用1251-標(biāo)記的生物素化IgG方法來評價各SAPMP組的生物素化IgG結(jié)合力。微粒的描述和表面上組分的表面密度的結(jié)果列于表12中。表<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>§PMP直徑是估算值PMP群體就直徑而言在某程度上是多分散的Vd=未確定表12中的數(shù)據(jù)可以被轉(zhuǎn)化為摩爾數(shù)值，轉(zhuǎn)換結(jié)果顯示，在所示的實施例中約有2.46Xl(T40imol生物素)/(mgPMP)(參見A)。對于直徑約為l微米、表面面積為7.7X10'3m2/(mg的PMP)的微粒，約有3.19Xl(T2Oimol生物素)/(m2PMP)。除如上所述各組之外，根據(jù)本發(fā)明制備生物素化PMP，并且發(fā)現(xiàn)對于表面面積為7.7m2/g的1.10微米PMP，其密度為15.1(嗎生物素-BSA)/(mgPMP)。除如上所述各組之外，以同樣方式制備三個進(jìn)一步驗證的組。這些進(jìn)一步的組如表13所述。<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>§PMP直徑是估算值；PMP群體就直徑而言在某程度上是多分散的從表13中的以摩爾計的數(shù)據(jù)看，假定有約6.1OigSA)/(mgPMP)，并且使用的SA分子量為56kDa，則約有1.41Xl(T2OimolSA)/(m2PMP)。因此，與表12中數(shù)據(jù)相比，在微粒上SA的量似乎約為生物素量的一半。實施例11對于在如上所述實施例中制備的各組，計算BSA、生物素、SA、以及IgG的表面密度。顯示較好穩(wěn)定性(13組)的表1中所示低投入的生物素化組被用于產(chǎn)生微粒的表面密度。對于微粒、以及對于非微粒支持物(基于微粒數(shù)據(jù))的實際表面密度計算值如圖16A和16B以及下表14所示。假定表面光滑，則對于微粒、以及對于非微粒支持物(基于"光滑的"微粒的數(shù)據(jù))的表面密度計算值如圖16A、16C、16D以及下表15所示。表面密度計算是以物理試驗參數(shù)為基礎(chǔ)的。簡言之，在涂敷步驟后，通過上清液分析，使用蛋白質(zhì)濃度測定的BCA方法(BCA蛋白質(zhì)測定[二辛可寧酸];Pierce生物技術(shù)公司/ThermoScientific公司)和/或在280nm處的吸光度(對于BSA和SA)，測量在涂敷步驟期間涂敷在表面上的BSA和SA的量。HABA分析被用于定量BSA上生物素的含量。^I結(jié)合性被用于評價生物素-IgG的結(jié)合力。簡言之，向TBS中的微粒提供已知量的BSA，保溫，并且將微粒從上清液中分離出來。測量上清液中殘留的蛋白質(zhì)，并且減去加入的蛋白質(zhì)量。洗滌微粒，并且分析洗液中的蛋白質(zhì)含量。Tris-緩沖鹽水pH7.4被用于偶聯(lián)以及用于將抗體結(jié)合至微粒?；谙率鲞M(jìn)行計算(a)微粒廠商提供的實際測量的表面面積，和(b)基于微粒直徑和光滑假設(shè)而計算的表面面積。對于表14中所示的表面密度測量值，微粒表面面積(基于使用干固體重量的計算)的范圍為最小7.4m2/g至最大8.4m2/g，中值7.7m"g。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>從基于市售微粒(Dynal⑧DYNABEADSMyOne甲苯磺酰基活化，l.O微米直徑；Irwitrogen公司)測量值的表14中可以看出，一旦配體(例如，生物素)是不飽和的，則結(jié)合性表面上隨后的層也將是不飽和的。在一個特定的實施方式中，1微米微粒表面面積為約0.0077m2/mg，并且涂敷有顯示的量的生物素化BSA、和結(jié)合有2.1X1(rSpmol生物素-IgG/每mgPMP的SA。對于表15中顯示的表面密度測量值，微粒表面面積(基于光滑性假設(shè)，微粒直徑為0.90至1.10拜，并且微粒密度為1.4至1.8g/cm3)的范圍為最小0.0030m2/mg至最大0.0048m2/mg。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>分子雖生物素244Da:BSA:66,000Da;SA:56,000Da:IgG:150,000Da表15假定表面光滑。從表15中可以再一次看出，一旦配體(例如，生物素)是不飽和的，則結(jié)合性表面中隨后的層也將是不飽和的。然而，與在沒有光滑性假設(shè)的情況下的表面密度計算值相比，由于光滑性假設(shè)，表面密度計算得到更大的pmol配體(生物素)/每平方米、更大的pmol支持物連接物(BSA)/每平方米、更大的pmol配體結(jié)合劑(SA)/每平方米、以及更大的nmol捕獲部分(生物素-IgG)/每平方米(參見表14)。表面密度的增大起因于如下事實生物素、BSA、SA、或生物素-IgG的pmol/mg是恒定的，但是具有光滑性假設(shè)的微粒表面的總表面積小于在沒有光滑性矯正的情況下的微?？偙砻娣e。例如，如果兩個微粒具有相同的直徑和形狀，但是一個微粒是多孔的，而另一個為完美地光滑的微粒，則多孔的微粒與光滑微粒相比就具有更大的可利用的表面面積/每單位質(zhì)量(m2/mg)。如果這兩種微粒都可以結(jié)合配體，并且它們兩個都被提供相同含量的配體，則多孔的微粒與光滑的微粒相比將會結(jié)合較少的配體/每平方米。權(quán)利要求1.一種用于親合分析的不飽和的結(jié)合性表面，其包含a)分析物支持物；以及b)至少一種支持物連接物，其中，少于飽和量的支持物連接物與所述分析物支持物偶聯(lián)。2.如權(quán)利要求1所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，還包括至少一種與所述支持物連接物偶聯(lián)的配體。3.如權(quán)利要求2所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述不飽和的結(jié)合性表面具有約0.5X1(^至約10Xl(^微摩爾配體/毫克所述分析物支持物、或者約0.5Xl(T2至約2.0X10'1微摩爾配體/平方米所述分析物支持物。4.如權(quán)利要求l所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述不飽和的結(jié)合性表面具有約1.0Xl(^至約5.5X10^微摩爾配體/毫克所述分析物支持物、或者約1.0X1(T2至約2.0X1(T1微摩爾配體/平方米所述分析物支持物。5.如權(quán)利要求2所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，還包括至少一種與所述配體相連接的配體結(jié)合劑。6.如權(quán)利要求5所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述配體結(jié)合劑是至少二價的，所述二價的配體結(jié)合劑包括鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、卵白素、鏈霉抗生物素蛋白片段、抗生物素蛋白片段、卵白素的片段、或上述的組合。7.如權(quán)利要求5所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，還包括與所述配體結(jié)合劑相連接的捕獲部分。8.如權(quán)利要求7所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述捕獲部分以約l.OX10—4微摩爾/平方米至約2.0X10'2微摩爾/平方米分析物支持物的密度存在于所述分析物支持物上。9.如權(quán)利要求7所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述捕獲部分相對于所述分析物支持物被空間地定向。10.如權(quán)利要求7所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述捕獲部分相對于所述分析物支持物被空間地定向和被物理學(xué)地定向。11.如權(quán)利要求1所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，還包括嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物包含疏水性的頭部基團(tuán)，所述疏水性的頭部基團(tuán)的側(cè)翼為至少兩個親水性的尾部基團(tuán)，并且其中所述疏水性的頭部基團(tuán)接觸所述分析物支持物。12.如權(quán)利要求1所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述支持物連接物包括蛋白質(zhì)或融合蛋白。13.如權(quán)利要求1所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述支持物連接物與所述分析物支持物共價偶聯(lián)。14.如權(quán)利要求2所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述配體與所述支持物連接物共價偶聯(lián)。15.如權(quán)利要求1所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述支持物連接物是牛血清白蛋白、牛血清白蛋白的片段、卵清蛋白、卵清蛋白的片段、或上述的混合物。16.如權(quán)利要求2所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述配體包括生物素。17.如權(quán)利要求16所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述支持物連接物被生物素化從而使得生物素對支持物連接物的摩爾摻入比率小于或等于5:1。18.如權(quán)利要求17所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述支持物連接物被生物素化從而使得生物素對支持物連接物的摩爾摻入比率小于或等于3:1。19.如權(quán)利要求16所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，還包括與所述生物素相連接的配體結(jié)合劑。20.如權(quán)利要求19所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述配體結(jié)合劑是至少二價的，所述至少二價的配體結(jié)合劑包括鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、卵白素、鏈霉抗生物素蛋白片段、抗生物素蛋白片段、卵白素的片段、或上述的組合。21.如權(quán)利要求19所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，還包括與所述配體結(jié)合劑相連接的捕獲部分。22.如權(quán)利要求21所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述捕獲部分被生物素化。23.如權(quán)利要求22所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述被生物素化的捕獲部分選自于由如下至少一種物質(zhì)構(gòu)成的組中抗體、抗體的結(jié)合性片段、受體、受體配體、激素、激素受體、酶、酶的底物、單鏈低聚核苷酸、雙鏈低聚核苷酸、單鏈多聚核苷酸、雙鏈多聚核苷酸、抗原、肽、以及蛋白質(zhì)。24.如權(quán)利要求22所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述生物素化的捕獲部分包含間隔物。25.如權(quán)利要求1所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述分析物支持物包含微粒、微珠、微孔板、涂敷試管、以Mylar做后襯的硝化纖維支持物、尼龍支持物、微小管、納米顆粒、納米管、或者順磁性材料或超順磁性材料。26.如權(quán)利要求7所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，還包括至少一種與所述配體結(jié)合劑相連接的第二捕獲部分。27.如權(quán)利要求5所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述配體結(jié)合劑以約1.0Xl(^至約5.0乂10—2微摩爾/平方米所述分析物支持物的密度存在于所述分析物支持物上。28.如權(quán)利要求27所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述配體結(jié)合劑是鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、卵白素、鏈霉抗生物素蛋白片段、抗生物素蛋白片段、卵白素的片段、或上述的組合。29.如權(quán)利要求1所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述至少一種支持物連接物以約1.2Xl(^至約7.5乂10—2微摩爾/平方米所述分析物支持物的密度存在于所述分析物支持物上。30.如權(quán)利要求1所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，還包括與所述支持物連接物偶聯(lián)的配體，其中所述配體是生物素或其衍生物，并且其中所述生物素或其衍生物以約1.6乂10—2至約2.0X10—'微摩爾/平方米所述分析支持物的密度存在。31.如權(quán)利要求1所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述用于分析的結(jié)合性表面包含多個微粒，其中所述多個微粒具有至少約25皮可摩爾生物素或其衍生物/毫克微粒、但至多約425皮可摩爾生物素或其衍生物/毫克微粒的容量。32.—種用于親合分析的不飽和的并被定向的結(jié)合性表面，其包含a)支持物；b)與所述支持物共價偶聯(lián)的蛋白質(zhì)或融合蛋白，其中所述蛋白質(zhì)或融合蛋白被生物素化，其中有小于5摩爾的偶聯(lián)的生物素/摩爾蛋白質(zhì)或融合蛋白；C)與所述生物素相連接的生物素結(jié)合性部分，其中所述生物素結(jié)合性部分是至少二價的；d)與所述生物素結(jié)合性部分相連接的生物素化的捕獲部分；以及e)接觸所述支持物的嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物包含聚氧化丙烯頭部基團(tuán)，所述聚氧化丙烯頭部基團(tuán)的側(cè)翼為至少兩個聚氧化乙烯尾部基團(tuán)，其中所述聚氧化丙烯頭部基團(tuán)接觸所述支持物。33.—種制備用于分析的不飽和的結(jié)合性表面的方法，所述方法包括-a)以選擇的配體對支持物連接物的比率來結(jié)合支持物連接物和配體，從而得到配體::支持物連接物復(fù)合物的混合物；以及b)將所述配體::支持物連接物復(fù)合物共價連接于分析物支持物，從而產(chǎn)生不飽和密度的配體::支持物連接物復(fù)合物。34.如權(quán)利要求33所述的制備用于分析的不飽和的結(jié)合性表面的方法，其特征在于，在將所述配體::支持物連接物復(fù)合物與所述分析物支持物共價連接后，所述分析物支持物包含約l.OXl(^微摩爾配體/平方米分析物支持物至約2.0X10"微摩爾配體/平方米分析物支持物。35.如權(quán)利要求33所述的制備用于分析的不飽和的結(jié)合性表面的方法，其特征在于，所述配體與所述支持物連接物共價偶聯(lián)。36.如權(quán)利要求33所述的制備用于分析的不飽和的結(jié)合性表面的方法，其特征在于，所述支持物連接物是牛血清白蛋白、牛血清白蛋白的片段、卵清蛋白、卵清蛋白的片段、或上述的混合物，其中所述配體是生物素，并且其中所述牛血清白蛋白、牛血清白蛋白的片段、卵清蛋白、卵清蛋白的片段、或其混合物被生物素化，從而使得生物素:支持物連接物的摩爾摻入比率小于或等于5:1。37.如權(quán)利要求33所述的制備用于分析的不飽和的結(jié)合性表面的方法，其特征在于，還包括制備不飽和的且被定向的用于分析的結(jié)合性表面，包括使所述用于分析的結(jié)合性表面與多個嵌段共聚物分子接觸，其中所述嵌段共聚物分子包含疏水性的頭部基團(tuán)，所述疏水性的頭部基團(tuán)的側(cè)翼為至少兩個親水性尾部基團(tuán)。38.如權(quán)利要求34所述的制備不飽和的且被定向的用于分析的結(jié)合性表面的方法，其特征在于，所述配體結(jié)合劑相對于所述配體::支持物連接物復(fù)合物被物理學(xué)地定向。39.—種被封閉的用于分析的結(jié)合性表面，其包含a)分析物支持物，b)至少一種支持物連接物；以及c)接觸所述分析物支持物的多個嵌段共聚物分子，其中所述嵌段共聚物分子包含疏水性的頭部基團(tuán)，所述疏水性的頭部基團(tuán)的側(cè)翼為至少兩個親水性尾部基團(tuán)。40.如權(quán)利要求39所述的被封閉的用于分析的結(jié)合性表面，其特征在于，所述兩個以上親水性尾部基團(tuán)的長度可以各自獨立地是所述疏水性頭部基團(tuán)長度的約2至約2.5倍。41.如權(quán)利要求39所述的被封閉的用于分析的結(jié)合性表面，其特征在于，所述嵌段共聚物包含化學(xué)式I所示的結(jié)構(gòu)HO(C2H40)x(C3H60)y(C2H40)zH(1)，其中，x是約100至約135;y是約40至約75;并且z是約100至約135。42.如權(quán)利要求39所述的被封閉的用于分析的結(jié)合性表面，其特征在于，所述嵌段共聚物的平均分子量是約9,000道爾頓至約18,000道爾頓。43.—種分散的微粒群體，其中所述微粒被暴露于分散劑，所述分散劑包含具有疏水性頭部基團(tuán)的嵌段共聚物，所述疏水性頭部基團(tuán)的側(cè)翼為至少兩個親水性尾部基團(tuán)。44.如權(quán)利要求43所述的分散的微粒群體，其特征在于，所述微粒包含a)至少一種支持物連接物；以及b)接觸所述微粒的多個嵌段共聚物分子，其中所述嵌段共聚物分子包含疏水性的頭部基團(tuán)，所述疏水性的頭部基團(tuán)的側(cè)翼為至少兩個親水性尾部基團(tuán)。45.如權(quán)利要求44所述的分散的微粒群體，其特征在于，還包括與所述支持物連接物偶聯(lián)的配體。46.如權(quán)利要求44所述的分散的微粒群體，其特征在于，所述群體基本上是單分散的。47.—種制備被涂敷和分散的微粒群體的方法，其包括a)將微粒暴露于分散劑從而形成分散的微粒群體，其中i)所述微粒包含支持物連接物和配體，所述支持物連接物和配體被偶聯(lián)從而產(chǎn)生配體::支持物連接物復(fù)合物；ii)所述分散劑包含具有疏水性的頭部基團(tuán)的嵌段共聚物，所述疏水性的頭部基團(tuán)的側(cè)翼為至少兩個親水性尾部基團(tuán)；以及b)通過將所述分散的微粒群體暴露于與所述配體::支持物連接物復(fù)合物的所述配體相連接的配體結(jié)合劑，用配體結(jié)合劑涂敷所述分散的微粒。48.—種制備用于分析的不飽和的結(jié)合性表面的方法，其包括a)制備分析物聯(lián)接部分與間隔填充部分的混合物，其中所述分析物聯(lián)接部分直接或間接地與所研究的分析物相連接，并且所述間隔填充部分未直接或間接地與所研究的分析物相連接；以及b)將所述混合物暴露于分析物支持物，從而使得所述分析物聯(lián)接部分和所述間隔填充部分與所述分析物支持物相偶聯(lián)，并且形成用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，所述結(jié)合性表面相對于與所述分析物支持物偶聯(lián)的所述分析物聯(lián)接部分的含量而言是不飽和的。49.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述分析物聯(lián)接部分包含配體::支持物連接物復(fù)合物，并且所述間隔填充部分包含缺乏配體的支持物連接物。50.如權(quán)利要求48所述的方法，其特征在于，所述用于分析的不飽和的結(jié)合性表面還包含嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物包含疏水性的頭部基團(tuán)，所述疏水性的頭部基團(tuán)的側(cè)翼為至少兩個親水性尾部基團(tuán)。51.—種制備被封閉的用于分析的結(jié)合性表面的方法，其包括將分析物支持物與支持物連接物相偶聯(lián)從而產(chǎn)生結(jié)合性表面，使所述結(jié)合性表面接觸嵌段共聚物，其中所述嵌段共聚物包含疏水性的頭部基團(tuán)，所述疏水性的頭部基團(tuán)的側(cè)翼為至少兩個親水性尾部基團(tuán)。52.—種親合分析，其使用用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，所述親合分析包括使用于分析的不飽和的結(jié)合性表面接觸分析物，其中所述用于分析的不飽和的結(jié)合性表面包含支持物連接物、配體、配體結(jié)合劑、以及對分析物特異的捕獲部分，并且檢測所述分析物與所述用于分析的不飽和的結(jié)合性表面的結(jié)合。53.如權(quán)利要求52所述的親合分析，其特征在于，所述對分析物特異的捕獲部分被生物素化。54.如權(quán)利要求52所述的親合分析，其特征在于，所述親合分析是免疫測定。55.—種用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其包含a)分析物支持物；以及b)至少一種配體，其中，少于飽和量的配體與所述分析物支持物偶聯(lián)。56.如權(quán)利要求55所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，還包括至少一種與所述配體相連接的配體結(jié)合劑，其中所述配體結(jié)合劑是至少二價的。57.如權(quán)利要求56所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述配體結(jié)合劑是鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、卵白素、鏈霉抗生物素蛋白片段、抗生物素蛋白片段、卵白素的片段、或上述的組合。58.如權(quán)利要求57所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，還包括與所述配體結(jié)合劑相連接的捕獲部分。59.如權(quán)利要求55所述的用于分析的不飽和的結(jié)合性表面，其特征在于，所述配體是生物素或其衍生物。全文摘要本發(fā)明提供了不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面，并且提供了用于制備不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面的方法和組合物。提供了制備結(jié)合性表面的方法以用于制備親合分析用支持物表面，該方法包括使用順磁性微粒上不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面。該方法包括制造基于配體支持物連接物的復(fù)合物的方法，包括下述工藝任選地使用低的配體對支持物連接物的投入比率，稀釋，使用嵌段共聚物進(jìn)行分散和/或涂敷。提供了使用生物素-BSA和生物素-卵清蛋白結(jié)合性表面、以及涂敷鏈霉抗生物素蛋白的微粒、和涂敷有捕獲部分比如生物素化免疫球蛋白或其片段的微粒的具體實施例。提供了將配體偶聯(lián)于固體表面的其他實施例。提供了這些方法和與多種分析物和捕獲部分相連的組合物的應(yīng)用。提供了用于免疫測定的不飽和的、或者不飽和的并且被定向的結(jié)合性表面。另外，提供了分散的微粒和它們的制造方法。文檔編號B01L99/00GK101529251SQ200780040215公開日2009年9月9日申請日期2007年11月1日優(yōu)先權(quán)日2006年11月1日發(fā)明者喬舒亞·C·索爾多,詹姆斯·L·薩克里森申請人:貝克曼考爾特公司