專利名稱：半枝蓮中黃酮類抗腫瘤活性成分的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物有效成分的提取和分離技術(shù)領(lǐng)域，具體說是運(yùn)用大孔吸附樹脂方法提取 半枝蓮中所含木樨草素和芹菜素的方法。
背景技術(shù)：
半枝蓮(Scutellaria barbata D. Don)為唇形科黃芩屬植物，別名狹葉韓信草、并頭草、 牙刷草等，以干燥全草入藥。其名最早見于《外科正宗》，味辛、苦，性寒，歸肺、肝、腎 經(jīng)，具有清熱解毒、散瘀止血、利尿消腫的功效，用于疔瘡腫毒、咽喉腫痛、毒蛇咬傷、跌 撲腫痛及水腫、黃疸等。日本學(xué)者在通過體外實(shí)驗(yàn)對800種中藥作抗腫瘤活性篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)有 88種中藥對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率在90%以上，其中半枝蓮對JTc-26腫瘤細(xì)胞體外抑制率 達(dá)100%，其對正常細(xì)胞的抑制率則僅為50%。半枝蓮的主要生理活性物質(zhì)為黃酮類化合物， 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，半枝蓮黃酮類化合物對A549、 HL-60、 H0NE1、 KB、 HT29、 U937型腫瘤 細(xì)胞有明顯的抑制作用。
半枝蓮全草含多種黃酮，文獻(xiàn)報(bào)道其黃酮的主要包括野黃苳苷、野黃芩素、木犀草素和 芹菜素等，其中以木犀草素和芹菜素抗腫瘤活性最為明顯，有廣泛的應(yīng)用前景，而其他的黃 酮類物質(zhì)的抗腫瘤作用未見報(bào)道。木犀草素和芹菜素的結(jié)構(gòu)式如下
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木犀草素
木犀草素是抗腫瘤的啟動(dòng)因子。研究證實(shí)其對多種實(shí)體瘤、腹水癌和白血病細(xì)胞有顯著 抑制作用。木犀草素還能增敏多種致凋亡因子，具有多靶點(diǎn)抗腫瘤的潛力(張芳芳，沈漢明， 朱心強(qiáng)，木犀草素抗腫瘤作用的研究進(jìn)展，浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2006, 35(5) :573-578)。 芹菜素的抗腫瘤作用主要表現(xiàn)在抗腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和 轉(zhuǎn)移、干擾腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)途徑、抗氧化等方面(苑林宏，芹菜素抗腫瘤作用的研究進(jìn)展， 中國公共衛(wèi)生，2004， 20(2): 241-242)。 二者均是非常有前途的潛在抗腫瘤藥物。
目前，半枝蓮黃酮的提取主要集中在總黃酮的提取為主，常見的提取方法有溶劑提取法 和微波提取法([l]邸多隆，劉麗春，劉曄瑋等，半枝蓮提取工藝的研究，中成藥，2003， 25(7〉 530-532; [2]薛梅，王自軍，周靜，半枝蓮中總黃酮和多糖的微波提取與含量測定， 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2005， 16(10): 965-966)，這兩種提取方法只能得到粗提物。涂其順等應(yīng)用吸附樹脂法精制半枝蓮總黃酮，得到了純度較高的提取物(涂其順，蔡光明，黃媛等，大孔 樹脂分離純化半枝蓮總黃酮的研究，中南藥學(xué)，2008, 6(2): 171-174)。在前述大孔樹脂法 提取總黃酮的報(bào)道中使用的樹脂為全苯乙烯結(jié)構(gòu)或含少量極性基團(tuán)的吸附樹脂，疏水作用很 強(qiáng)，而黃酮類物質(zhì)具有大部分相同的疏水性結(jié)構(gòu)，因此這些樹脂對黃酮具有相同的吸附能力， 無法將木犀草素和芹菜素從半枝蓮總黃酮中提取出來。為此，我們合成了一種大孔吸附樹脂
MDG，從半枝蓮全草中提取得到高純度的木犀草素和^菜素，工藝簡單，易于實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)
化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以高選擇性大孔吸附樹脂作為主要提取介質(zhì)的半枝蓮黃酮類抗 腫瘤成分的樹脂法提取方法。
本發(fā)明所用的高選擇性大孔吸附樹脂的制備方法，包括下列步驟
在常溫下，將聚乙烯醇溶解于水中，配成廣5%的水溶液，加熱至3(TC;將丙烯酸甲酯、 甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯、二乙烯苯、長鏈烷烴、偶氮二異丁氰混合成油相，各物質(zhì)在油相 中的質(zhì)量百分含量為20 30%、 5 15%、 5%、 10%、 50%、 1 2%，水相和油相質(zhì)量比為3: 1，按 照常規(guī)懸浮聚合的方法，先緩慢升溫至6(T70'C反應(yīng)4小時(shí)，然后繼續(xù)升溫至90'C反應(yīng)6小 時(shí)；最后經(jīng)過濾、洗滌處理后得到吸附樹脂，編號為MDG。
MDG樹脂為白色、球形，粒徑為0. 3 1. Omm，比表面積為12(T600m2/g的干樹脂，含水率 為50~70%，平均孔徑為2(T50nm,孔隙率為5(T70%。
本發(fā)明的半枝蓮中黃酮類抗腫瘤活性成分的提取方法，包括下列步驟
a) 半枝蓮全草干燥、粉碎，在6(T75。C時(shí)用體積百分?jǐn)?shù)為70 90%的乙醇水溶液提取2小 時(shí)，重復(fù)提取2、次，合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，加水稀釋，溶液體積與原料 半枝蓮質(zhì)量比為5/1~10/1，溶液體積以毫升計(jì)、原料半枝蓮質(zhì)量以克計(jì)；過濾得澄 清水溶液，為吸附上柱液；
b) 將大孔吸附樹脂裝入吸附柱中，吸附柱的徑長比為1/5~1/20:
c) 室溫下，將上柱液以1.(T2.0BV/小時(shí)的流速通過MDG樹脂柱吸附，其中木犀草素和 芹菜素被吸附在MDG樹脂柱上，每次上柱吸附時(shí)，樹脂的處理量為0. 3 0. 8g半枝蓮 /ml濕樹脂
d) 吸附完成后，用水將樹脂清洗干凈，然后以體積百分?jǐn)?shù)為50~70%的乙醇水溶液解吸， 解吸速度為0. 5iBV/小時(shí)，收集解吸液；
e) 將上述解吸液減壓蒸餾回收乙醇、濃縮、真空干燥，得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成 分的提取物；經(jīng)高效液相色譜檢測，其中木犀草素質(zhì)量百分含量為30~35%，斧菜素 含量為6(T65%。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明根據(jù)半枝蓮中木犀草素和^菜素的結(jié)構(gòu)特征，合成了 一種高選擇性的大孔吸附樹脂MDG，僅通過"吸附-解吸" 一步簡單工藝，即可得到高純度的
4木犀草素和"菜素提取物，工藝簡單，環(huán)境友好、不使用有毒溶劑、生產(chǎn)成本低廉、樹脂可
重復(fù)使用，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。制得的木犀草素和芹菜素質(zhì)量穩(wěn)定，其中木犀草素的質(zhì)
量百分含量約為30~35%，芹菜素的質(zhì)量百分含量約為60 65%，。本發(fā)明的工業(yè)化應(yīng)用可為半
枝蓮的抗腫瘤活性研究以及藥物開發(fā)提供大量高純度的試驗(yàn)樣品。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1-
通過以下步驟制備高選擇性大孔吸附樹脂MDG:
在常溫下，將聚乙烯醇溶解于水中，配成質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為1%的水溶液450g，于1000ml三 口瓶中水浴加熱至3(TC;以45g丙烯酸甲酯、7. 5g甲基丙烯酸甲酯、7. 5g苯乙烯和15g 二 乙烯苯的混合物為總反應(yīng)單體、以50g甲苯和25g液蠟混合做為致孔劑、以3g偶氮二異丁腈 為引發(fā)劑，混合均勻后加入三口瓶中，開動(dòng)攪拌，調(diào)節(jié)油珠尺寸在0.3-l.Omm之間，經(jīng)懸浮聚 合，以rC/min的升溫速度緩慢升溫至7(TC反應(yīng)4小時(shí)，再繼續(xù)升溫至90'C反應(yīng)6小時(shí)，停 止反應(yīng)，經(jīng)過濾、洗滌處理后，得到MDG樹脂。 實(shí)施例2:
在常溫下，將聚乙烯醇溶解于水中，配成質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為3%的水溶液450g，于1000ml三 口瓶中水浴加熱至30。C;以30g丙烯酸甲酯、10g甲基丙烯酸甲酯、10g苯乙烯和10g二乙 烯苯的混合物為總反應(yīng)單體、以60g甲苯和30g液蠟混合做為致孔劑、以1.5g偶氮二異丁腈 為引發(fā)劑,混合均勻后加入三口瓶中，開動(dòng)攪拌，調(diào)節(jié)油珠尺寸在0. 3-1. Oram之間，經(jīng)懸浮聚 合，以rC/min的升溫速度緩慢升溫至70。C反應(yīng)4小時(shí)，，再繼續(xù)升溫至90T反應(yīng)6小時(shí)， 停止反應(yīng)，經(jīng)過濾、洗滌處理后，得到MDG樹脂。 實(shí)施例3:
通過MDG樹脂從半枝蓮全草中制備高純度黃酮類抗腫瘤成分的提取工藝 將10g半枝蓮干燥全草粉碎，70ml7(^的乙醇水溶液6(TC加熱回流提取2小時(shí)，共2次， 過濾后合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，加水稀釋至50ml，過濾得澄清溶液，將其通入MDG 樹脂柱(柱內(nèi)徑15鵬，柱長250mm，裝有30ml濕樹脂)，吸附速度為1. 0BV/h，吸附完成后， 用去離子水清洗樹脂柱，用50%乙醇水溶液解吸，解吸速度為0. 5BV/h，將解吸液經(jīng)減壓蒸餾、 真空干燥得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成分的提取物。經(jīng)高效液相色譜檢測，其中木犀草素 的質(zhì)量百分含量為31. 1%，芹菜素的總含量為質(zhì)量百分含量為61. 8%。 實(shí)施例4:
將10g半枝蓮干燥全草粉碎，100ml 90%的乙醇水溶液75。C加熱回流提取2小時(shí)，共3 次，過濾后合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，加水稀釋至100ml，過濾得澄清溶液，將其通 入MDG樹脂柱(柱內(nèi)徑15mm，柱長250mm，裝有30ml濕樹脂)，吸附速度為2. 0BV/h，吸附 完成后，用去離子水清洗樹脂柱，用70%乙醇水溶液解吸，解吸速度為1. 0BV/h，將解吸液經(jīng)減壓蒸餾、真空干燥得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成分的提取物。經(jīng)高效液相色譜檢測，其 中木犀草素的質(zhì)量百分含量為32. 4%，芹菜素的總含量為質(zhì)量百分含量為63. 8%。 實(shí)施例5:
將20g半枝蓮干燥全草粉碎，150ml 70%的乙醇水溶液60。C加熱回流提取2小時(shí)，共2 次，過濾后合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，加水稀釋至100ml，過濾得澄清溶液，將其通 入MDG樹脂柱(柱內(nèi)徑15mni，柱長250mm，裝有30ml濕樹脂)，吸附速度為0. 5BV/h，吸附 完成后，用去離子水清洗樹脂柱，用50%乙醇水溶液解吸，解吸速度為0.5BV/h，將解吸液經(jīng) 減壓蒸餾、真空干燥得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成分的提取物。經(jīng)高效液相色譜檢測，其 中木犀草素的質(zhì)量百分含量為30. 9%，芹菜素的總含量為質(zhì)量百分含量為62. 7%。 實(shí)施例6:
將20g半枝蓮干燥全草粉碎，200ml 70%的乙醇水溶液60'C加熱回流提取2小時(shí)，共3 次，過濾后合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，加水稀釋至100ml，過濾得澄清溶液，將其通 入MDG樹脂柱(柱內(nèi)徑15mm，柱長250隨，裝有30ml濕樹脂)，吸附速度為2. OBV/h，吸附 完成后，用去離子水清洗樹脂柱，用60%乙醇水溶液解吸，解吸速度為1. OBV/h，將解吸液經(jīng) 減壓蒸餾、真空干燥得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成分的提取物。經(jīng)高效液相色譜檢測，其 中木犀草素的質(zhì)量百分含量為30. 7%,芹菜素的總含量為質(zhì)量百分含量為64. 1%。 實(shí)施例7:
將20g半枝蓮全草粉碎，200ml 909&的乙醇水溶液75'C加熱回流提取2小時(shí)，共3次， 過濾后合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，加水稀釋至200ml，過濾得澄清溶液，將其通入MDG 樹脂柱(柱內(nèi)徑15咖，柱長250咖，裝有30ml濕樹脂)，吸附速度為2. OBV/h,吸附完成后， 用去離子水清洗樹脂柱，用70%乙醇水溶液解吸，解吸速度為lBV/h，將解吸液經(jīng)減壓蒸餾、 真空干燥得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成分的提取物。經(jīng)高效液相色譜檢測，其中木犀草素 的質(zhì)量百分含量為32. 4%，芹菜素質(zhì)量百分含量為64. 8%。 實(shí)施例8:
將200g半枝蓮干燥全草粉碎，1500ml7(W的乙醇水溶液6(rC加熱回流提取2小時(shí)，共2 次，過濾后合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，加水稀釋至1000ml，過濾得澄清溶液，將其通 入MDG樹脂柱(柱內(nèi)徑5cm，柱長60cm，裝有500ml濕樹脂)，吸附速度為0. 5BV/h,吸附完 成后，用去離子水清洗樹脂柱，用60%乙醇水溶液解吸，解吸速度為0. 5BV/h,將解吸液經(jīng)減 壓蒸餾、真空干燥得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成分的提取物。經(jīng)高效液相色譜檢測，其中 木犀草素的質(zhì)量百分含量為33. 1%，芹菜素的總含量為質(zhì)量百分含量為63. 2%。 實(shí)施例9:
將400g半枝蓮干燥全草粉碎，700ml 90%的乙醇水溶液6(TC加熱回流提取2小時(shí)，共3 次，過濾后合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，加水稀釋至2000ml，過濾得澄清溶液，將其通 入MDG樹脂柱(柱內(nèi)徑5cm，柱長60cm，裝有500ml濕樹脂)，吸附速度為0. 5BV/h，吸附完成后，用去離子水清洗樹脂柱，用70%乙醇水溶液解吸，解吸速度為1. 0BV/h,將解吸液經(jīng)減 壓蒸餾、真空千燥得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成分的提取物。經(jīng)高效液相色譜檢測，其中 木犀草素和芹菜素的含量為94. 7% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，木犀草素31.鄉(xiāng)，芹菜素63.3%)。 實(shí)施例10:
將20g半枝蓮全草粉碎，200ml 9096的乙醇水溶液7(TC加熱回流提取2小時(shí)，共2次， 過濾后合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，加水稀釋至200ml,過濾得澄清溶液，將其通入MDG 樹脂柱(柱內(nèi)徑15mm，柱長250mm，裝有30ml濕樹脂)，吸附速度為1.0BV/h，吸附完成后， 用去離子水清洗樹脂柱，用70%乙醇水溶液解吸，解吸速度為lBV/h，將解吸液經(jīng)減壓蒸餾、 真空干燥得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成分的提取物。經(jīng)高效液相色譜檢測，其中木犀草素 的質(zhì)量百分含量為32. 3%，芹菜素的總含量為質(zhì)量百分含量為63. 2%。 實(shí)施例ll:
將400g半枝蓮干燥全草粉碎，700ml 90%的乙醇水溶液601:加熱回流提取2小時(shí)，共3 次，過濾后合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，加水稀釋至2000tnl，過濾得澄清溶液，將其通 入MDG樹脂柱(柱內(nèi)徑5cm，柱長60cm,裝有500ml濕樹脂)，吸附速度為1. 5BV/h，吸附完 成后，用去離子水清洗樹脂柱，用70%乙醇水溶液解吸，解吸速度為1. OBV/h，將解吸液經(jīng)減 壓蒸餾、真空干燥得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成分的提取物。經(jīng)高效液相色譜檢測，其中 木犀草素的質(zhì)量百分含量為30. 8%，芹菜素的總含量為質(zhì)量百分含量為64. 1%。
權(quán)利要求
1. 一種高選擇性大孔吸附樹脂的制備方法，包括下列步驟在常溫下，將聚乙烯醇溶解于水中，配成質(zhì)量百分含量為1~5％的水溶液，加熱至30℃；將丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯、二乙烯苯、長鏈烷烴、偶氮二異丁氰混合成油相，各物質(zhì)在油相中的質(zhì)量百分含量為20~30％、5~15％、5~10％、5~20％、50~60％、1~2％，水相和油相質(zhì)量比為3∶1，按照常規(guī)懸浮聚合的方法，先緩慢升溫至60~70℃反應(yīng)4小時(shí)，然后繼續(xù)升溫至90℃反應(yīng)6小時(shí)；最后經(jīng)過濾、洗滌處理后得到高選擇性大孔吸附樹脂，編號為MDG。
2. 按照權(quán)利要求1所述的高選擇性大孔吸附樹脂MDG，其特征在于，該樹脂為白色、球形， 粒徑為0.3、.0mm，比表面積為12(T600ni7g的干樹脂，含水率為50 70%，平均孔徑為 2(T50nm，孔隙率為50~70%。
3. —種半枝蓮中黃酮類抗腫瘤活性成分的提取方法，包括下列步驟a) 半枝蓮全草干燥、粉碎，在6(T75'C時(shí)用體積百分?jǐn)?shù)為70、0%的乙醇水溶液提取2小 時(shí)，重復(fù)提取2~3次，合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，加水稀釋至溶液與原料半枝 蓮體積質(zhì)量比ml/g為5/;TlO/l，；過濾得澄清水溶液，為吸附上柱液；b) 將權(quán)利要求1所述方法制備的高選擇性大孔吸附樹脂MDG裝入吸附柱中，吸附柱的徑 長比為1/5~1/20;c) 室溫下，將上柱液以1.0 2.0BV/小時(shí)的流速通過b)所述樹脂柱吸附，其中木犀草素 和芹菜素被吸附在樹脂柱上，每次上柱吸附時(shí)，樹脂的處理量為0. 3~0. 8g半枝蓮/ml 濕樹脂；d) 吸附完成后，用水將樹脂清洗干凈，然后以體積百分?jǐn)?shù)為50~70%的乙醇水溶液解吸， 解吸速度為0. 5、BV/小時(shí)，收集解吸液；e) 將上述解吸液減壓蒸鎦回收乙醇、濃縮、真空干燥，得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成 分的提取物；經(jīng)高效液相色譜檢測，其中木犀草素質(zhì)量百分含量為3(T35%,芹菜素 含量為6(T65%。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物有效成分的提取和分離技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是運(yùn)用大孔吸附樹脂方法提取半枝蓮中所含木樨草素和芹菜素的方法。本發(fā)明將半枝蓮干燥、粉碎，用乙醇水溶液提取回收乙醇，稀釋過濾得澄清水溶液，為吸附上柱液；將自行合成的吸附樹脂MDG裝入吸附柱中，將上柱液通過樹脂柱吸附，然后以乙醇水溶液解吸，將解吸液減壓蒸餾回收乙醇、濃縮、真空干燥，得到半枝蓮黃酮類抗腫瘤活性成分的提取物。本發(fā)明通過“吸附-解吸”一步工藝，得到高純度的木犀草素和芹菜素提取物，工藝簡單，環(huán)境友好、不使用有毒溶劑、生產(chǎn)成本低廉、樹脂可重復(fù)使用，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號B01J20/22GK101422723SQ20081015309
公開日2009年5月6日 申請日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者施榮富, 王春紅, 耿嘯天 申請人:南開大學(xué)