專利名稱：一種具有免疫隔離性能的微膠囊的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微膠囊的制備，具體地說是一種具有免疫隔離性能的微膠囊的制備方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞移植是治療某些臟器功能完全喪失的疾病的唯一有效措施。但是供體來源 嚴(yán)重缺失和免疫排斥反應(yīng)，限制了細(xì)胞移植技術(shù)的發(fā)展。解決免疫排斥難題的有效途徑之 一，是以微膠囊作為免疫隔離裝置，采用微囊化技術(shù)對異體活性組織或細(xì)胞進(jìn)行包封，將移 植物與宿主隔離。微膠囊的免疫隔離性能是微膠囊應(yīng)用于細(xì)胞移植的必要條件。理想的用 于細(xì)胞移植的微膠囊必須允許囊外小分子量物質(zhì)(細(xì)胞生存所需營養(yǎng)物如血清白蛋白、生 長因子、葡萄糖和氧氣等)和囊內(nèi)小分子產(chǎn)物(如細(xì)胞分泌物胰島素、代謝產(chǎn)物和二氧化 碳等)自由進(jìn)出微膠囊，而將大分子免疫物質(zhì)(如免疫球蛋白、補(bǔ)體等)或免疫細(xì)胞(淋 巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)阻隔在微膠囊外，從而避免了囊內(nèi)細(xì)胞或組織被機(jī)體免疫系統(tǒng)攻擊 并殺死。因?yàn)槊庖咔虻鞍妆让庖呒?xì)胞小，而IgG又是免疫球蛋白中最小的分子，故研究者 [Anal. Biochem. 1996,242 :104_111， Adv. Drug. Deliv. Rev. 2000,42 29-64, Biotechnol. Prog. 2002，18 401-403]認(rèn)為，對IgG的隔離性能是檢測微膠囊是否具有免疫隔離性能的 最可靠而直接的指標(biāo)，理想的用于細(xì)胞移植的微膠囊應(yīng)能夠阻止微囊外分子量大于等于 IgG分子進(jìn)入微膠囊內(nèi)，同時(shí)，允許細(xì)胞生存必需的營養(yǎng)物質(zhì)自由通過微膠囊，常用的代表 營養(yǎng)物質(zhì)的模型蛋白是分子量在66kDa的牛血清白蛋白(BSA)。由天然多糖海藻酸鈉(簡寫為NaAlg或Alg，由a-L-甘露糖醛酸與0-D-古羅糖 醛酸依靠1，4-糖苷鍵連接而成)、殼聚糖[化學(xué)名為聚(1，4) -2-氨基-2-脫氧-0 -D-葡 聚糖]經(jīng)復(fù)凝聚反應(yīng)而制成的具有核殼結(jié)構(gòu)的海藻酸鈉-殼聚糖-海藻酸鈉微膠囊(以 下簡稱ACA微膠囊)，具有無毒、免疫原性低及制備條件溫和等優(yōu)點(diǎn)[化學(xué)進(jìn)展，2008， 20(1) :126-139]，是比較理想的組織細(xì)胞移植用微膠囊。但根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，由海藻酸 鈉、殼聚糖僅通過復(fù)凝聚反應(yīng)而制成的ACA微膠囊均不能隔離IgG，即不具有免疫隔離性能 [Biomaterials. 1999,20(8) :773_83]。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述問題，提出在復(fù)凝聚法制備的海藻酸鈣_殼聚糖微膠囊的基礎(chǔ) 上，分別與海藻酸鈉溶液及殼聚糖溶液進(jìn)行層層交替自組裝，通過精確控制微囊膜的孔徑， 使其可以通過牛血清白蛋白(BSA)，但不能通過免疫球蛋白IgG，從而制備出具有免疫隔離 性能的海藻酸鈉_殼聚糖微膠囊。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是參考文獻(xiàn)[中華器官移植雜志，2003，24 (2) :86_88]的方法，制備出包埋有動物細(xì) 胞的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊，在此基礎(chǔ)上，分別與海藻酸鈉溶液及殼聚糖溶液進(jìn)行層層 交替自組裝，通過精確控制微囊膜的孔徑，使其可以通過牛血清白蛋白(BSA)，允許分子量小于BSA的營養(yǎng)物質(zhì)通透，保證細(xì)胞生長代謝需求，但不能通過免疫球蛋白IgG，從而制備 出具有免疫隔離性能的海藻酸鈉_殼聚糖微膠囊。參與層層交替自組裝的海藻酸鈉溶液的配制方法是海藻酸鈉溶于0. 3-0. 9 % 妝(1[通?？蔀?.4-0.85% (w/v)]溶液中，海藻酸鈉濃度為0.05-0. 5% (w/v)，反應(yīng)溫度 在10-40°C，通常為室溫，反應(yīng)時(shí)間在1-20分鐘。采用低濃度的海藻酸鈉溶液，是由于自 組裝反應(yīng)的反應(yīng)速度隨溶液濃度增高而加快，而海藻酸鈉又是一種高分子材料(分子量在 40-2000kDa)，因此，高濃度溶液會導(dǎo)致大量海藻酸鈉分子在瞬間完成自組裝反應(yīng)，但海藻 酸鈉分子上殘留很多未參與自組裝反應(yīng)的片段堆積在膜表面，從而影響微膠囊膜表面的光 滑度。因此，本專利提出采用低濃度的海藻酸鈉溶液能夠大大降低自組裝的反應(yīng)速度，使得 參與反應(yīng)的海藻酸鈉分子有足夠時(shí)間使分子上各單體均參與自組裝反應(yīng)，減少在膜表面的 堆積，并通過控制反應(yīng)時(shí)間來調(diào)整參與自組裝反應(yīng)的反應(yīng)量，一方面通過控制反應(yīng)量來調(diào) 整膜孔徑，另一方面可以提高微膠囊表面的光滑度。參與層層交替自組裝的殼聚糖溶液的配制方法是殼聚糖溶于pH為5. 5-7. 0的醋 酸-醋酸鈉緩沖液，殼聚糖濃度為0.01-0. 5% [通?？蔀?.05-0. 5% (w/v)]，反應(yīng)溫度在 10-40°C，通常為室溫，反應(yīng)時(shí)間在1-20分鐘。采用低濃度的殼聚糖溶液的理由與采用低濃 度海藻酸鈉的理由一樣，通過降低自組裝的反應(yīng)速度，使得參與反應(yīng)的殼聚糖分子有足夠 時(shí)間使分子上各單體均參與自組裝反應(yīng)，減少在膜表面的堆積，并通過控制反應(yīng)時(shí)間來調(diào) 整參與自組裝反應(yīng)的反應(yīng)量，一方面通過控制反應(yīng)量來調(diào)整膜孔徑，另一方面可以提高微 膠囊表面的光滑度。同時(shí)，由于殼聚糖材料成本高于海藻酸鈉，尤其用于細(xì)胞移植用的殼聚 糖材料都需要經(jīng)過純化、改性等預(yù)處理過程，導(dǎo)致殼聚糖材料價(jià)格較高。而在本專利應(yīng)用過 程中，由于濃度大大降低，導(dǎo)致投料量明顯減少，大大降低了工藝成本。參與層層交替自組裝的殼聚糖材料的脫乙酰度90-98%，分子量為1-12萬。要求 上述殼聚糖材料是因?yàn)楦呙撘阴６鹊臍ぞ厶侨芤耗芴峁└嗟淖越M裝反應(yīng)位點(diǎn)，提高反應(yīng) 效率，節(jié)省材料用量，降低成本。另外，由于高分子量的殼聚糖分子在自組裝反應(yīng)過程中，僅 部分片段參與反應(yīng)，大部分沒參與反應(yīng)的片段堆積在膜表面，影響膜的光滑度，且會導(dǎo)致自 組裝的殼聚糖整層剝脫。因此，本專利選用低分子量區(qū)間的殼聚糖分能充分參與自組裝反 應(yīng)，提高膜的光滑度和完整性，同時(shí)，通過控制分子量及其分布，可以有效控制膜孔徑，實(shí)現(xiàn) 微膠囊膜阻隔IgG的同時(shí)，允許BSA通透。層層交替自組裝最后反應(yīng)的溶液必須是海藻酸鈉溶液。層層交替自組裝過程中， 各層之間需要生理鹽水洗滌。本發(fā)明的有益效果是1、本發(fā)明所用的海藻酸鈣凝膠微球與殼聚糖溶液及海藻酸鈉溶液層層交替自組 裝的方法反應(yīng)條件溫和，有利于移植物的活性保存。2、本發(fā)明利用層層交替自組裝技術(shù)制備的ACA微膠囊可將分子量大于IgG的大分 子免疫物質(zhì)隔離在微膠囊外，使ACA微膠囊用于細(xì)胞移植時(shí)使囊內(nèi)細(xì)胞或組織免受機(jī)體免 疫系統(tǒng)攻擊并殺死。同時(shí)，允許分子量小于BSA的營養(yǎng)物質(zhì)通透，保證細(xì)胞生長代謝需求。


圖1為實(shí)施例1中通過層層交替自組裝技術(shù)制備的具有免疫隔離性能的ACA微膠囊的顯微鏡照片。圖2為實(shí)施例1中通過層層交替自組裝技術(shù)制備的具有免疫隔離性能的ACA微膠 囊浸于FITC-IgG溶液中6小時(shí)后得激光共聚焦照片。圖3為實(shí)施例1中通過層層交替自組裝技術(shù)制備的具有免疫隔離性能的ACA微膠 囊浸于FITC-IgG溶液后囊內(nèi)的FITC-IgG熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線。囊內(nèi)熒光強(qiáng)度為零， 且隨時(shí)間無變化。圖4為實(shí)施例1中FITC-BSA由囊外向囊內(nèi)的擴(kuò)散曲線。圖5為比較例1中經(jīng)復(fù)凝聚反應(yīng)制成的ACA微膠囊浸于FITC-IgG溶液中6小時(shí) 后得激光共聚焦照片。圖6為比較例1中復(fù)凝聚反應(yīng)制成的ACA微膠囊浸于FITC-IgG溶液后囊內(nèi)的 FITC-IgG熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線。囊內(nèi)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間逐漸增大。
具體實(shí)施例方式將海藻酸鈣凝膠微球轉(zhuǎn)入殼聚糖溶液進(jìn)行殼聚糖在海藻酸鈣凝膠微球內(nèi)的自組 裝成膜，生理鹽水洗滌之后轉(zhuǎn)入海藻酸鈉溶液進(jìn)行海藻酸鈉的自組裝成膜，生理鹽水洗滌 后再次進(jìn)行殼聚糖、海藻酸鈉的自組裝，生理鹽水洗滌后即生成具有免疫隔離性能的ACA 微膠囊。實(shí)施例11、參考文獻(xiàn)[中華器官移植雜志，2003，24 (2) :86_88]的方法，制備出包埋有胰 島細(xì)胞的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊，將微膠囊浸入濃度0. 05% (w/v)的海藻酸鈉溶液中，反 應(yīng)20分鐘。2、用生理鹽水洗滌后將步驟1中的微膠囊浸入濃度為0.05% (w/v)、分子量10 萬、脫乙酰度95%、pH6. 0的殼聚糖溶液中，反應(yīng)20分鐘。3、生理鹽水洗滌后，再浸入濃度0. 05% (w/v)的海藻酸鈉溶液中，反應(yīng)20分鐘。4、生理鹽水洗滌并保存于生理鹽水中(圖1)。5、取約300-500個(gè)微膠囊于載玻片上，吸干表面水分，滴加0. 5mL濃度為 Z.OmgmL—1的FITC熒光標(biāo)記蛋白溶液(微囊與蛋白溶液的體積比約為1 50)。避光條件 下用激光共聚焦掃描顯微鏡對微膠囊和蛋白溶液進(jìn)行每隔lOmin間隔的連續(xù)掃描(圖2)， 可得微膠囊內(nèi)的固定區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度的時(shí)間變化曲線。制備的微膠囊可隔離IgG(圖 3)，并允許BSA擴(kuò)散入微膠囊(圖4)。實(shí)施例21、參考文獻(xiàn)[中華器官移植雜志，2003，24 (2) :86_88]的方法，制備出包埋有肝 細(xì)胞HepG2的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊，將微膠囊浸入濃度0. (w/v)的海藻酸鈉溶液 中，反應(yīng)10分鐘。2、用生理鹽水洗滌后將步驟1中的微膠囊浸入濃度為0. 2% (w/v)、分子量6萬、 脫乙酰度95%、pH6. 5的殼聚糖溶液中，反應(yīng)10分鐘。3、生理鹽水洗滌后，再浸入濃度0. 1% (w/v)的海藻酸鈉溶液中，反應(yīng)10分鐘。4、生理鹽水洗滌并保存于生理鹽水中。5、按照實(shí)例1步驟5操作，考察微膠囊的免疫隔離性能，結(jié)果表明，F(xiàn)ITC-IgG在囊內(nèi)熒光強(qiáng)度為零，且隨時(shí)間無變化，說明該條件制備的微膠囊具有免疫隔離性能，且允許 FITC-BSA擴(kuò)散入微膠囊。實(shí)施例31、參考文獻(xiàn)[中華器官移植雜志，2003，24 (2) :86_88]的方法，制備出包埋有胚 胎干細(xì)胞的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊，將微膠囊浸入濃度0.1% (w/v)的海藻酸鈉溶液中， 反應(yīng)10分鐘。2、用生理鹽水洗滌后將步驟1中的微膠囊浸入濃度為0. 2% (w/v)、分子量2萬、 脫乙酰度98%、pH6. 8的殼聚糖溶液中，反應(yīng)5分鐘。3、生理鹽水洗滌后，再浸入濃度0. 1% (w/v)的海藻酸鈉溶液中，反應(yīng)10分鐘。4、生理鹽水洗滌后重復(fù)步驟2。5、生理鹽水洗滌后重復(fù)步驟3。6、生理鹽水洗滌并保存于生理鹽水中。7、按照實(shí)例1步驟5操作，考察微膠囊的免疫隔離性能，結(jié)果表明，F(xiàn)ITC-IgG在 囊內(nèi)熒光強(qiáng)度為零，且隨時(shí)間無變化，說明該條件制備的微膠囊具有免疫隔離性能，且允許 FITC-BSA擴(kuò)散入微膠囊。比較例1 經(jīng)復(fù)凝聚反應(yīng)制備的ACA微膠囊1、參考文獻(xiàn)[中華器官移植雜志，2003，24 (2) :86_88]的方法，將包埋有肝細(xì)胞 HepG2的海藻酸鈣凝膠微球與殼聚糖溶液復(fù)凝聚反應(yīng)，制備成海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊。2、按照實(shí)例1步驟5操作，考察微膠囊的免疫隔離性能，結(jié)果可得微膠囊在 FITC-IgG溶液中6小時(shí)，囊內(nèi)呈現(xiàn)明顯的熒光(圖5)，囊內(nèi)的固定區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度的 隨時(shí)間增大(圖6)。說明制備的ACA微膠囊不能隔離IgG。比較例2 1、參考文獻(xiàn)[中華器官移植雜志，2003，24 (2) :86_88]的方法，制備出包埋有肝 細(xì)胞HepG2的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊，將微膠囊浸入濃度0. (w/v)的海藻酸鈉溶液 中，反應(yīng)10分鐘。2、用生理鹽水洗滌后將步驟1中的微膠囊浸入濃度為0. 2% (w/v)、分子量20萬、 脫乙酰度95%、pH6. 5的殼聚糖溶液中，反應(yīng)10分鐘。3、生理鹽水洗滌后，再浸入濃度0. 1% (w/v)的海藻酸鈉溶液中，反應(yīng)10分鐘。4、生理鹽水洗滌并保存于生理鹽水中。5、按照實(shí)例1步驟5操作，考察微膠囊的免疫隔離性能，結(jié)果表明，F(xiàn)ITC-IgG在囊 內(nèi)熒光強(qiáng)度隨時(shí)間不斷增大，說明該條件制備的微膠囊不能隔離IgG。
權(quán)利要求
一種具有免疫隔離性能的微膠囊的制備方法，其特征在于在復(fù)凝聚法制備的包埋有細(xì)胞的海藻酸鈣-殼聚糖微膠囊的基礎(chǔ)上，分別與海藻酸鈉溶液及殼聚糖溶液通過層層交替自組裝的方法，精確控制微囊膜的孔徑，使其可以通過牛血清白蛋白BSA，但不能通過免疫球蛋白IgG，從而制備出具有免疫隔離性能的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于具體操作過程為，1)將包埋有動物細(xì)胞的海藻酸鈉_殼聚糖微膠囊浸入海藻酸鈉溶液中，反應(yīng)1-20分 鐘，反應(yīng)溫度在10-40°C，取出，用生理鹽水洗滌；海藻酸鈉溶液的配制方法是海藻酸鈉溶于0. 3-0.9% (w/v)NaCl溶液中，海藻酸鈉濃 度為 0. 05-0. 5% (w/v)；2)將步驟1)中的微膠囊浸入殼聚糖溶液中，反應(yīng)1-20分鐘，反應(yīng)溫度在10-40°C，取 出，用生理鹽水洗滌；殼聚糖溶液的配制方法是殼聚糖溶于PH為5. 5-7. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，殼聚糖 濃度為 0. 01-0. 5% ；3)交替重復(fù)步驟1)和步驟2)的過程0-5次；4)層層交替自組裝最后反應(yīng)的溶液必須是海藻酸鈉溶液，即層層交替自組裝的最外層 為海藻酸鈉層；因此再重復(fù)步驟1)的過程，得成品，生理鹽水洗滌并保存于生理鹽水中。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于參與層層交替自組裝的海藻 酸鈉溶液的配制方法是海藻酸鈉溶于0.4-0. 85% (w/v)NaCl溶液中，海藻酸鈉濃度為 0. 05-0. 5% (w/v)。
4.按照權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于參與層層交替自組裝的殼聚 糖溶液的配制方法是殼聚糖溶于PH為5. 5-7. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，殼聚糖濃度為 0. 05-0. 5% (w/v)，殼聚糖材料的脫乙酰度90-98%，分子量為1-12萬。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有免疫隔離性能的微膠囊的制備方法，在復(fù)凝聚法制備的海藻酸鈣-殼聚糖微膠囊的基礎(chǔ)上，分別與海藻酸鈉溶液及殼聚糖溶液通過層層交替自組裝的方法，精確控制微囊膜的孔徑，使其可以通過牛血清白蛋白(BSA)，但不能通過免疫球蛋白IgG，從而制備出具有免疫隔離性能的海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊。
文檔編號B01J13/02GK101850228SQ200910010978
公開日2010年10月6日 申請日期2009年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月1日
發(fā)明者于煒婷, 謝紅國, 馬小軍 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所