專利名稱：：表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于材料合成、應用領域，涉及一種用于生物樣品中分離核酸的材料，具體涉及一種表面修飾二乙胺基乙基(DEAE)的磁性二氧化硅微球及其制備方法和用途。
背景技術：
：生物磁分離技術是在傳統(tǒng)磁分離技術的基礎上發(fā)展起來，以細胞、細菌、核酸和蛋白質等生物體為應用對象的高效分離技術。它利用磁性或磁性標記生物體在外磁場作用下做定向運動這一特性，對目標生物體進行提取、富集、分離和純化。早期的工作主要集中于發(fā)展磁性標記物的制備技術上，包括通過在磁流體中浸漬將磁性納米粒子吸附到瓊脂糖、聚丙烯酰胺、聚戊二醛和聚乙烯醛等聚合物微球中。這種微球以顆粒大小分布均勻和磁性粒子含量均勻為特征，保證了不同生物分離過程的可重現(xiàn)性和可控性。生物磁分離技術與標準分離步驟相比有一定優(yōu)勢。首先磁分離過程通常非常簡單，只涉及幾個處理步驟，所有的純化步驟都可在單個試管或者容器中發(fā)生，不需要昂貴的液相色譜系統(tǒng)、離心機、過濾器或者其它設備。分離過程可以在含有懸浮固體物質的粗制樣品上直接進行。在某些情況下，例如細胞內蛋白質的提取，甚至可以整合裂解和分離步驟，從而縮短整個分離時間。磁分離技術對細胞、蛋白質和核酸等生物體通常是非常溫和的。與高速離心和親和色譜相比，磁分離技術具有較低的剪切力，能較好地保持被分離細胞的活力和生物分子的生物活性。目前，生物磁分離技術正在成為生命科學研究的一個重要手段。在分子生物學領域中，核酸是現(xiàn)代生物學、醫(yī)學研究中的重要課題。作為遺傳信息的攜帶者，DNA是基因表達的物質基礎，除在生物體正常生長、發(fā)育和繁殖等生命活動中的作用外，它與生命異常如腫瘤的發(fā)生、遺傳疾病等也密切相關。因此，對核酸分離純化是許多研究領域的重要前提和保障。目前常見的核酸分離方法有酚提取/沉淀法、層析法、密度梯度離心法等。這些傳統(tǒng)方法往往比較費時，步驟繁瑣，需使用有機試劑，有損操作者健康。所以有必要研究一種新的快速、方便的提取基因組DNA的方法。Levison應用一種以磁性瓊脂糖微球作為基質，表面修飾二乙胺基乙基(DEAE)的磁性微球用于核酸提取。但其與核酸結合能力不高，每毫克磁粒僅能結合約3.5嗎核酸。孫敏莉通過磁性納米粒子與葡聚糖-DEAE包裹的方法合成一種磁性葡聚糖-DEAE微球，并應用于大場桿菌中提取質粒，但未用于全血中核酸的提取。上述兩種表面修飾DEAE的磁性微球，由于DEAE直接修飾在基質的碳羥基上，功能基團DEAE與基質距離較近，核酸與DEAE結合過程中受空間位阻的影響較大，所以該磁球結合核酸能力不高。
發(fā)明內容為了解決
背景技術：
中存在的上述技術問題，本發(fā)明提供了一種表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制備方法及其用途，該方法設計合理、工藝可行，依該方法制備出的微球提取核酸量大，該微球可應用于生物樣品中分離核酸。本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球，其化學式為Fc為/SiQrGPTMS纖DEAE上述表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制備方法，包括以下步驟(1)制備磁性二氧化硅微球；(2)磁性二氧化硅微球的環(huán)氧基化；(3)二乙胺基乙基表面修飾(3.1)將步驟(2)制得的表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球與稀鹽酸混合，邊攪拌邊加熱反應；(3.2)反應完畢后，磁性分離，得到沉淀物，將沉淀物用二次水洗滌；(3.3)將二乙胺基乙基與NaOH水溶液混合溶解，加入步驟(3.2)洗滌后的沉淀物，攪拌均勻，通過調節(jié)二乙胺基乙基和NaOH水溶液的相對量使該混合溶液pH值至89，加熱反應；(3.4)反應完畢后，磁性分離，得到沉淀物，將沉淀物用二次水洗滌，再用STET溶液洗滌后，放入STET溶液中，制備成表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球。上述步驟(3.1)稀鹽酸的濃度為0.01~0.05mol/L，表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球與稀鹽酸的質量比為1:100500，攪拌速度為600800轉/分鐘，加熱至8010(TC，反應時間為24小時；步驟(3.3)NaOH水溶液的體積濃度為4060g/L，二乙胺基乙基與NaOH水溶液的質量比為1:0.53，攪拌速度為600800轉/分鐘，加熱至557(TC，反應時間為46小時；步驟(3.4)STET溶液的成分是:O.OlMTris，O.lMNaCl，O扁MEDTA和質量濃度為1%的TritonX-IOO。上述步驟(2)磁性二氧化硅微球的環(huán)氧基化的方法是(2.1)取步驟(1)制得的磁性二氧化硅微球與甲苯按質量比為1:10001100配成混合溶液，以5070Hz的頻率超聲處理10~30分鐘；(2.2)在氣體流速為23mL/min氮氣保護下，加入3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅垸，邊滴加邊以600800轉/分鐘攪拌，再以90110°C回流1224小時，得到沉淀物，所述3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷與步驟(2.1)的混合溶液的質量比為l:22~26;(2.3)用外部磁鐵將步驟(2.2)得到的沉淀物分離出來，將該沉淀物依次用二甲基甲酰胺、丙酮、無水乙醇、水交替洗滌后，放入真空干燥箱內，507(TC干燥1224小時，制備成表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球。上述步驟(1)磁性二氧化硅微球的制備方法是(1.1)將十六烷基三甲基溴化銨與甲苯按質量比為1:1220混合，以8001000轉/分鐘將該混合物攪拌均勻；(1.2)將FeClf4H20與FeCly6H20按質量比為1:3溶解于二次水中，配制成濃度為130150g/L的水溶液；(1.3)在氣體流速為23mL/min氮氣保護下以45mL/h的速度將步驟(1.2)的水溶液滴加到步驟(1.1)的混合物中，邊滴加邊以600800轉/分鐘持續(xù)攪拌46小時；(1.4)加入質量濃度為25%的氨水，以600800轉/分鐘持續(xù)攪拌2~4小時，有四氧化三鐵納米顆粒形成，所述氨水與十六烷基三甲基溴化銨的質量9比為0.10.2:1;(1.5)再以23mL/h的速度滴加正硅酸乙酯，邊滴加邊以600~800轉/分鐘攪拌反應，調節(jié)pH值至89，滴加完畢12小時后，停止通氮氣，常溫常壓下以600800轉/分鐘攪拌45天，得到產物，所述正硅酸乙酯與十六垸基三甲基溴化銨的質量比為11.5:1;(1.6)在產物中加入乙醇，以1500-2000轉/分鐘離心3050分鐘，得到上層液和沉淀物，所述乙醇與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為22.5:1;(1.7)棄上層液，將沉淀物在乙醇中以7080。C回流1224小時，得到上層亮黃色溶液和黑色沉淀物，所述乙醇與十六垸基三甲基溴化銨的質量比為2025:1;(1.8)棄上層亮黃色溶液，將黑色沉淀物用乙醇，水，丙酮交替洗滌后，放入真空干燥箱內，507(TC干燥1224小時，制備成磁性二氧化硅微球。上述步驟(1.1)十六烷基三甲基溴化銨與甲苯的質量比為1:1218;步驟(1.2)配制成的水溶液濃度為140150g/L;步驟(1.4)氨水與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為0.150.2:1;步驟(1.5)正硅酸乙酯與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為L21.5:1;步驟(1.6)乙醇與十六垸基三甲基溴化銨的質量比為2.12.4:1;步驟(1.7)乙醇與十六垸基三甲基溴化銨的質量比為2024:1;上述步驟(2.1)磁性二氧化硅微球與甲苯的質量比為1:10201080;上述步驟(3.1)表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球與稀鹽酸的質量比為1:100300;步驟(3.3)二乙胺基乙基與NaOH水溶液的質量比為l:11.2，制備出的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球用于生物樣品中分離基因組DNA效果較佳。上述步驟(1.1)中十六垸基三甲基溴化銨與甲苯質量比為1:15;步驟(1.2)配制成的水溶液濃度為140g/L;步驟(1.4)氨水與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為0.17:1;步驟(1.5)正硅酸乙酯與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為1.25:1;步驟(L6)乙醇與十六垸基三甲基溴化銨的質量比為2.25:1;步驟(1.7)乙醇與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為22.5:1;所述步驟(2.1)磁性二氧化硅微球與甲苯的質量比為1:1050;步驟(2.2)3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅垸與步驟(2.1)的混合溶液的質量比為1:25;所述步驟(3.1)表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球與稀鹽酸的質量比為1:150，該稀鹽酸的濃度為0.01mol/L;步驟(3.3)NaOH水溶液的體積濃度為40g/L，二乙胺基乙基與NaOH水溶液的質量比為1:1.2，制備出的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球用于生物樣品中分離基因組DNA效果最佳。如上述方法制備出的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球應用于生物樣品中分離基因組DNA。上述生物樣品可以是全血、細菌、動物組織、真菌或植物。上述生物樣品是全血，將表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球應用于全血中分離基因組DNA的方法，包括以下步驟(1)紅細胞的裂解(1.1)取凍存血，加入預冷紅細胞裂解液，顛倒混勻，在冰浴中孵育10~20分鐘，于4。C，10001500g離心10~20min，棄上清；(1.2)加入200~30(Hil預冷紅細胞裂解液，700800pl滅菌水，渦旋1~5分鐘，于4。C，1000~1500g離心15min，棄上清；(2)白細胞的裂解向步驟(1.2)得到的產物中加入100~20(^1白細胞裂解液，渦旋3060秒，加入2.55nl20mg/ml蛋白酶K，混勻，于5060。C裂解2560min;(3)核酸的結合向步驟(2)得到的產物中加入0.81.6ml滅菌水和lmg儲存于STET溶液的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球，吹吸混勻，孵育35分鐘；(4)清洗向步驟(3)得到的產物中加入0.40.8ml清洗液，搖勻，靜置13分鐘，磁性分離，棄上清；(5)洗脫向步驟(4)得到的產物中加入100200nl洗脫液，吹吸均勻，50~65°C孵育510分鐘，磁性分離，收集上清；(6)除鹽(6.1)在步驟(5)收集的上清中加入200600pl無水乙醇，混勻，靜置1020min，于4。C，10000~15000g離心20~30min，棄上清；(6.2)加入70%乙醇50100jiL，混勻，于4。C，1000015000g離心5~10min，棄上清；(6.3)室溫風干1(K15分鐘，加入100200)iLTE溶液溶解，即得到基因組DNA。上述方法中步驟(1.1)凍存血的用量為200pL，預冷紅細胞裂解液的用量為200pL，預冷紅細胞裂解液的成分為O.OlMTris-HCl、0.32M蔗糖、0.005MMgCl2和質量濃度為1%的TritonX-100,該預冷紅細胞裂解液的pH值為7.5;步驟(2)白細胞裂解液的成分是0.03MTris-HCl、0.8M鹽酸胍、0.03MEDTA和質量濃度為0.5%的TritonX-IOO，該白細胞裂解液的pH值為8.0;步驟(3)STET溶液的成分是O.OlMTris-HCl、O.lMNaCl、0.001MEDTA和質量濃度為1%的TritonX-100;步驟(4)清洗液的成分是0.01MTris-HCl、0.4MNaCl禾BlmMEDTA、該清洗液的pH值為8.0;步驟(5)洗脫液的成分是0.05MArg和l.OMNaCl;步驟(6.3)TE溶液的成分為0.01MTris和0.001MEDTA，該溶液的pH為8.0。本發(fā)明的優(yōu)點是1、采用該方法制備的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球提取核酸量大。2、該方法設計合理、工藝可行性好，操作簡單。3、采用該方法制備的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球可用于生物樣品中分離核酸。圖1是實施例1磁性二氧化硅微球表面修飾DEAE前后的VSM磁滯回線。其中圖a是修飾DEAE前的VSM磁滯回線；圖b是修飾DEAE后的VSM磁滯回線。圖2-a是實施例1制備的磁性二氧化硅微球的掃描電子顯微鏡照片。圖2-b是實施例1制備的磁性二氧化硅微球的透射電子顯微鏡照片。圖2-c是實施例1制備的表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球的掃描電子顯微鏡照片。圖3是實施例1制備的表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球XPS光電子能譜圖。圖4是實施例1制備的表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球XPS光電子能譜N元素的化學位移譜圖。圖5是實施例1制備的表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球的全自動X一射線衍射圖譜。圖6是以實例1制備的表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球純化核酸的電泳照片。圖7是用不同量DEAE修飾磁性二氧化硅微球純化核酸的電泳照片。圖8是二氧化硅微球經環(huán)氧化修飾后與DEAE反應的磁性微球和不經環(huán)氧化修飾直接與DEAE反應的磁性二氧化硅微球純化核酸的電泳照片。具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。本發(fā)明采用了溶膠凝膠法制備了以四氧化三鐵納米顆粒為核，以正硅酸乙酯作硅源為殼的磁性二氧化硅微球，以此微球作模版以環(huán)氧垸偶聯(lián)劑3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)作為活化劑，二乙胺基乙基鹽酸鹽作為功能基團，制備成表面修飾二乙胺基乙基(DEAE)的磁性二氧化硅微球，該微球的化學式為該表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制備方法的具體實施例如下l.制備磁性二氧化硅微球取7.2892g十六烷基三甲基溴化銨與109.3g甲苯加入到四口燒瓶內，用攪拌機以1000轉/分鐘攪拌均勻，將0.329gFeCl2'4H20與0.987gFeCl3'6H20溶解于9.4397g二次水中配制成濃度為140g/L的水溶液，在23mL/min氮氣保護下以45mL/h滴加到上述混合物中，800轉/分鐘持續(xù)攪拌46小時，再加入質量濃度為25。/。氨水2mL，800轉/分鐘持續(xù)攪拌2小時，在混合物中，有四氧化三鐵納米顆粒形成，緩慢加入正硅酸乙酯9.79mL，800轉/分鐘攪拌反應，調節(jié)pH至8，以23mL/h滴加正硅酸乙酯完畢后1小時，停止氮氣保護，800轉/分鐘攪拌，常溫常壓下老化5天，在產物中加入乙醇16.4g，以2000轉/分鐘離心40分鐘，去掉上層液，沉淀物8(TC用乙醇164g回流12小時，去掉上層亮黃色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗滌，放入真空干燥箱內6(TC干燥1224小時，制備成磁性二氧化硅微球。2.磁性二氧化硅微球的環(huán)氧基化取磁性二氧化硅微球0.1g，甲苯105g加入三口燒瓶，用超聲清洗機頻率為60Hz的超聲處理10分鐘，在23mL/minN2氣保護下，再加入3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅垸4.2g，800轉/分鐘攪拌，11(TC回流12小時，用外部磁鐵將沉淀物分離，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、無水乙醇、水交替洗滌3次后，放入真空干燥箱內6(TC干燥1224小時，制備成表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球。3.二乙胺基乙基表面修飾將表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球0.3g與濃度為0.01mol/L稀鹽酸75mL加入兩口燒瓶內，800轉/分鐘攪拌，并加熱至IO(TC反應3小時，反應完畢，用外部磁鐵將沉淀分離，用二次水洗滌610次，再將5gDEAE與12g體積濃度為40g/L的NaOH水溶液混合溶解加入兩口燒瓶內，用攪拌器以800轉/分鐘攪拌均勻，通過調節(jié)兩者的相對量使溶液pH至9，加熱至65i:反應5小時。反應完畢，用外部磁鐵將沉淀分離，用二次水洗滌沉淀8次，再用STET溶液(O.OlMTris-HCl、O.lMNaCl、0.001MEDTA和質量濃度為1%的TritonX-IOOO，pH=8.0)洗滌沉淀3次，并放入STET溶液中備用。制備成表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球。實施例2l.制備磁性二氧化硅微球取7.2892g十六烷基三甲基溴化銨與87.47g甲苯加入到四口燒瓶內，用攪拌機以1000轉/分鐘攪拌均勻，將0.305gFeCl24H2O與0.916gFeCl3'6H20溶解于9.4397g二次水中配制成濃度為130g/L的水溶液，在23mL/min氮氣保護下以45mL/h滴加到上述混合物中，800轉/分鐘持續(xù)攪拌46小時，再加入質量濃度為25%的氨水1.15mL，800轉/分鐘持續(xù)攪拌2小時，在混合物中，有四氧化三鐵納米顆粒形成，緩慢加入正硅酸乙酯6.78mL，800轉/分鐘攪拌反應，調節(jié)pH至8，以23mL/h滴加正硅酸乙酯完畢后1小時，停止氮氣保護，800轉/分鐘攪拌，常溫常壓下老化5天，在產物中加入乙醇14.58g，以2000轉/分鐘離心40分鐘，得到上層液和沉淀物，去掉上層液，沉淀物8CTC用乙醇145.8g回流12小時，去掉上層亮黃色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗滌后，放入真空干燥箱內6(TC干燥1224小時，制備成磁性二氧化硅微球。2.磁性二氧化硅微球的環(huán)氧基化取磁性二氧化硅微球0.1g，甲苯100g加入三口燒瓶，用超聲清洗機頻率為60Hz的超聲處理10分鐘，在23mL/minN2氣保護下，再加入3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷4.0g，800轉/分鐘攪拌，11(TC回流12小時，用外部磁鐵將沉淀物分離，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、無水乙醇、水交替洗滌3次后，放入真空干燥箱內6(TC干燥1224小時，制備成表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球。3.二乙胺基乙基表面修飾將表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球0.48g與濃度為0.01mol/L稀鹽酸120mL加入兩口燒瓶內，800轉/分鐘攪拌，并加熱至IO(TC反應3小時，反應完畢，用外部磁鐵將沉淀分離，用二次水洗滌610次，再將10gDEAE與12g體積濃度為40g/L的NaOH水溶液混合溶解加入兩口燒瓶內，用攪拌器以800轉/分鐘攪拌均勻，通過調節(jié)兩者的相對量使溶液pH至9，加熱至65。C反應5小時。反應完畢，用外部磁鐵將沉淀分離，用二次水洗滌沉淀8次，再用STET(0.01MTris-HCl、0.1MNaCl、0.001MEDTA和質量濃度為1°/。的TritonX-IOOO，pH=8.0)溶液洗滌沉淀3次，并放入STET溶液中備用。制備成表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球。實施例3l.制備磁性二氧化硅微球取7.2892g十六垸基三甲基溴化銨與145.784g甲苯加入到四口燒瓶內，用攪拌機以1000轉/分鐘攪拌均勻，將0.354gFeCl2'4H2O與1.060gFeCl3'6H20溶解于9.4397g二次水中配制成濃度為150g/L的水溶液，在23mL/min氮氣保護下以45mL/h滴加到上述混合物中，800轉/分鐘持續(xù)攪拌46小時，再加入質量濃度為25%的氨水2.28mL，800轉/分鐘持續(xù)攪拌2小時，在混合物中，有四氧化三鐵納米顆粒形成，緩慢加入正硅酸乙酯U.76mL，800轉/分鐘攪拌反應，調節(jié)pH至8，以23mL/h滴加正硅酸乙酯完畢后1小時，停止氮氣保護，800轉/分鐘攪拌，常溫常壓下老化5天，在產物中加入乙醇18.223，以2000轉/分鐘離心40分鐘，得到上層液和沉淀物，去掉上層液，沉淀物8(TC用乙醇182.23g回流12小時，得到上層亮黃色溶液和黑色沉淀物，去掉上層亮黃色溶液，黑色沉淀用乙醇、水、丙酮交替洗滌，放入真空干燥箱內60。C干燥1224小時，制備成磁性二氧化硅微球。2.磁性二氧化硅微球的環(huán)氧基化取磁性二氧化硅微球O.lg，甲苯110g加入三口燒瓶，用超聲清洗機頻率為60Hz的超聲處理10分鐘，在23mL/minN2氣保護下，再加入3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷4.4g，800轉/分鐘攪拌，11(TC回流12小時，用外部磁鐵將沉淀物分離，依次用二甲基甲酰胺、丙酮、無水乙醇、水交替洗滌3次后，放入真空干燥箱內6(TC干燥1224小時，制備成表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球。3.二乙胺基乙基表面修飾將表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球0.5g與濃度為0.01mol/L稀鹽酸125mL加入兩口燒瓶內，800轉/分鐘攪拌，并加熱至IO(TC反應3小時，反應完畢，用外部磁鐵將沉淀分離，用二次水洗滌610次，再將15gDEAE與12g體積濃度為40g/L的NaOH水溶液混合溶解加入兩口燒瓶內，用攪拌器以800轉/分鐘攪拌均勻，通過調節(jié)兩者的相對量使溶液pH至9，加熱至65"C反應5小時。反應完畢，用外部磁鐵將沉淀分離，用二次水洗滌沉淀8次，再用STET(0.01MTris-HCl、0.1MNaCl、0.001MEDTA和質量濃度為1%的TritonX-IOOO，pH=8.0)溶液洗滌沉淀3次，并放入STET溶液中備用。制備成表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球。為了確定最佳的工藝步驟，進行了大量的實驗室研究試驗，各種試驗情況如下161、DEAE用量對表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球從人外周血提取基因組DNA的影響。在本發(fā)明實施例1的DEAE表面修飾工藝步驟3中，分別將5g、10g和15g的DEAE與等量的NaOH水溶液分別加入等量的表面鍵合環(huán)氧基的磁性微球，后續(xù)工藝步驟與實例1完全相同，得到三種表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球。所得到三種表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球純化全血gDNA的結果見圖7，該圖中泳道1為核酸Maker;泳道2、3和4分別為加入5g、10g和15gDEAE修飾的二氧化硅微球在200nL人全血中提取的基因組核酸，結果表明DEAE用量為lOg為最佳用量。2、GPTMS對表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球純化全血中基因組DNA的影響。在本發(fā)明實施例1的表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球工藝步驟2中，磁性二氧化硅微球不經GPTMS修飾成表面鍵合環(huán)氧基的磁性微球，而是將磁性二氧化硅微球上直接與DEAE結合，后續(xù)其它工藝步驟與實例1完全相同，制備成直接由磁性二氧化硅微球與DEAE結合的磁性微球。所制備的直接由磁性二氧化硅微球與表面修飾DEAE的磁性微球純化分析DNA的電泳照片見圖8，該圖中泳道1為DNAmarker、泳道2為經GPTMS修飾成表面鍵合環(huán)氧基后再結合DEAE的磁性微球純化的核酸、泳道3為不經GPTMS修飾成表面鍵合環(huán)氧基的磁性微球直接和DEAE反應的磁性微球純化的核酸。結果表明不經GPTMS修飾成表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球不能與DEAE結合，沒有純化全血中gDNA的能力。為了驗證本發(fā)明的有益效果，將實施例1制備的表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球用VSM磁滯回線儀、XPS光電子能譜儀、全自動X—射線衍射儀、掃描電子顯微鏡、透射電鏡、元素分析儀、原子吸收光譜儀對其進行了表征；利用瓊脂糖凝膠電泳測試了表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球純化基因組DNA的性能，各種試驗情況如下觀察物品表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球實驗儀器振動樣品磁強計型號為vsm-9500;高分辨透射電子顯微鏡型號為JEM-3010;XPS光電子能譜儀型號為KRATOSAXISULTRA;全自動X一射線衍射儀型號為D/Max-3c;環(huán)境掃描電子顯微鏡型號為Quanta200;元17素分析儀；原子吸收分光度計型號為TAS986(G)。1、觀察按透射電鏡、掃描電子顯微鏡使用方法對磁性二氧化硅微球修飾前后進行觀察，觀測結果見圖2-a、圖2-b和圖2-c。由圖2-a、圖2-b可見，透射電鏡觀察和掃描電子顯微鏡觀察磁性二氧化硅微球呈類球形，結構完整；由圖2-c可見，掃描電子顯微鏡觀察磁性二氧化硅微球修飾后仍呈類球形，結構完整。按VSM磁滯回線儀、XPS光電子能譜儀、全自動X—射線衍射儀、元素分析儀、原子吸收光譜儀，電泳分析的測試方法對表面鰲合金屬離子的磁性二氧化硅微球進行測試。3、觀測結果用VSM磁滯回線儀測試表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球結果見圖1。由圖1可見，表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球順磁性好，無矯頑力，飽和磁化強度為30.081emu/g。用XPS光電子能譜儀測試的光電子能譜圖見圖3，由圖3可見，DEAE成功的結合在磁性二氧化硅微球上，各元素的含量見表l。表1表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球XPS光電子能譜元素含量<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>由表1可見，所得微球含有Si、C、O、N等元素，表明表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球含有制備該微球相應成分。表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球XPS光電子能譜N元素的化學位移譜圖見圖4。由圖4可見，N元素峰在399.4ev，說明N元素以叔胺形式存在。用全自動X—射線衍射儀測定表面修飾DEAE的磁性二氧化硅納米微球的X—射線衍射圖譜示于圖5。由圖5可見，X—射線衍射圖譜20在18.2°、30.613°、35.6卯。、43.420°、53.949。和57.214。等處出現(xiàn)了Fe304的特征強衍射峰，在22.700。等處出現(xiàn)了Si02的特征強衍射峰，這些衍射信號與立方晶系Fe304的(111)、(220)、(311)、(400)、(422)、(511)等點陣面的衍射峰[JCPDS，65-3107]相一致，在22.700。附近出現(xiàn)了Si02無定型的特征衍射峰。用元素分析儀進行測試，得到的磁性二氧化硅微球和表面修飾DEAE的磁性二氧化硅納米微球的元素含量。測試結果見表2。表2磁性二氧化硅微球和表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球的元素含量名稱<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>1.7507由表2可見，表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球與磁性二氧化硅微球相比，C、H、N的含量顯著升高，說明磁性二氧化硅微球已被相應的有機成分所修飾。圖6是以實例1制備的表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球測得的電泳照片。泳道1為DNAmarker;泳道2至6為平行樣，為表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球所純化得到的gDNA。由圖6可見，表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球可以有效的提取純化得到純的且完整性好的gDNA。4、用表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球與核酸結合用Tris-HCl緩沖液(10mMTris，lmMEDTA,pH7.5)將鮭魚精DNA配置成10pg/20(^L的溶液。取2mL離心管兩個標記為1號、2號，分別加入200)iL上述DNA溶液和lmg磁性微球，吹吸混勻，孵育2分鐘。磁性分離，取上清液測紫外，計算磁性微球結合DNA的量。核酸定量方法用安捷倫8453型紫外可見分光光度劑測定DNA溶液在260nm的紫外吸光值，比色皿光程為0.2厘米，然后根據公式260nm紫外吸光值X0.25X體積，計算DNA溶液中DNA的質量。結果見表3<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>用上述方法制備出的表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球用于從生物樣品中分離基因組DNA。該生物樣品可以是全血、細菌、動物組織、真菌、植物。以表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球用于從全血中分離基因組DNA為例，該方法具體實施例如下取2mL離心管，分別加入200jiL凍存血、200jiL預冷紅細胞裂解液(0.01MTris畫HCl、0.32M蔗糖、0.005MMgCl2、1%(w/v)TritonX-100、pH7.5)顛倒混勻于冰浴中孵育10分鐘。于4"、1300g離心15min，去上清。加入250^1預冷紅細胞裂解液、750jil滅菌水，渦旋1分鐘。于4匸、1300g離心15min，去上清。加入100^1白細胞裂解液(0.03MTris-HCl、0.8M鹽酸胍、0.03MEDTA、0.5%(w/v)TritonX-100、pH8.0),渦旋30秒，加入20mg/ml蛋白酶K，混勻，于5(TC裂解25min。裂解后分別加入0.8ml滅菌水和約lmg表面修飾DEAE的磁性二氧化硅微球(儲存于0.01MTris陽HCl、0.1MNaCl、0.001MEDTA、1%(w/v)TritonX-100的溶液中)。吹吸混勻，孵育5分鐘，加入0.4ml清洗液(0.01MTris-HCl、0.4MNaCl、lmMEDTA、pH8.0)，搖勻靜置1分鐘。磁性分離去上清。加入100iul洗脫液(0.05MArg、l.OMNaCl)，吹吸均勻，65""C孵育5分鐘，磁性分離收集上清。加入2.5體積無水乙醇，混勻靜止15分鐘。4°C、15000g離心30分鐘，棄上清，加入70%乙醇50pL，混勻4t:、15000g離心10分鐘，棄上清。室溫風干10分鐘，加入10(^LTE溶解。進行瓊脂糖電泳。用紫外分光光度計進行核酸定量分析。用該方法做5組平行樣。實驗結果見表4表4樣品260nm吸光值280nm吸光值260nm吸光值280nm吸光值提取核酸的量"g10.2550.1471.736.37520.2360.1431.655.930.2470.1381.796.17540.2610.151.746.52550.2580.1541.686.45平均---------6.285可見該磁性微球可以從200pL全血中純化約5-6pg基因組核酸。電泳見圖6。權利要求1、表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球，其化學式為Fe3O4/SiO2-GPTMS-DEAE2、如權利要求1所述的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制備方法，包括以下步驟(1)制備磁性二氧化硅微球；(2)磁性二氧化硅微球的環(huán)氧基化；(3)二乙胺基乙基表面修飾(3.1)將步驟(2)制得的表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球與稀鹽酸混合，邊攪拌邊加熱；(3.2)反應完畢后，磁性分離，得到沉淀物，將沉淀物用二次水洗滌；(3.3)將二乙胺基乙基與NaOH水溶液混合溶解，加入步驟(3.2)洗滌后的沉淀物，攪拌均勻，通過調節(jié)二乙胺基乙基和NaOH水溶液的相對量使該混合溶液pH值至8~9，加熱反應；(3.4)反應完畢后，磁性分離，得到沉淀物，將沉淀物用二次水洗漆，再用STET溶液洗滌后，放入STET溶液中，制備成表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球。3、根據權利要求2所述的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制備方法，其特征在于步驟(3.1)中所述稀鹽酸的濃度為0.01~0.05mol/L，表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球與稀鹽酸的質量比為1:100500，攪拌速度為600800轉/分鐘，加熱至8010(TC，反應時間為2~4小時；步驟(3.3)NaOH水溶液的體積濃度為4060g/L，二乙胺基乙基與NaOH水溶液的質量比為1:0.53，攪拌速度為600800轉/分鐘，加熱至5570°C，反應時間為4~6小時；步驟(3.4)STET溶液的成分是0.01MTris，0.1MNaCl，0.001MEDTA和質量濃度為1%的TritonX-l000。4、根據權利要求2或3所述的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制備方法，其特征在于步驟(2)磁性二氧化硅微球的環(huán)氧基化的方法是(2.1)取步驟(1)制得的磁性二氧化硅微球與甲苯按質量比為1:10001100配成混合溶液，以50~70Hz的頻率超聲處理1030分鐘；(2.2)在氣體流速為23mL/min的氮氣保護下，加入3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷，邊滴加邊以600-800轉/分鐘攪拌，再以9011(TC回流1224小時，得到沉淀物，所述3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅垸與步驟(2.1)的混合溶液的質量比為l:2226;(2.3)用外部磁鐵將步驟(2.2)得到的沉淀物分離出來，將該沉淀物依次用二甲基甲酰胺、丙酮、無水乙醇、水洗滌后，放入真空干燥箱內，507(TC干燥1224小時，制備成表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球。5、根據權利要求4所述的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制備方法，其特征在于步驟(1)磁性二氧化硅微球的制備方法是(1.1)將十六垸基三甲基溴化銨與甲苯按質量比為1:1220混合，以8001000轉/分鐘將該混合物攪拌均勻；(1.2)將FeCl2'4H20與FeCly6H20按質量比為1:3溶解于二次水中，配制成濃度為130150g/L的水溶液；(1.3)在氣體流速為23mL/min氮氣保護下以45mL/h的速度將步驟(1.2)的水溶液滴加到步驟(1.1)的混合物中，邊滴加邊以600~800轉/分鐘持續(xù)攪拌46小時；(1.4)加入質量濃度為25%的氨水，以600~800轉/分鐘持續(xù)攪拌2~4小時，有四氧化三鐵納米顆粒形成，所述氨水與十六垸基三甲基溴化銨的質量比為0.10.2:1;(1.5)再以23mL/h的速度滴加正硅酸乙酯，邊滴加邊以600~800轉/分鐘攪拌反應，調節(jié)pH值至89，滴加完畢12小時后，停止通氮氣，常溫常壓下以600800轉/分鐘攪拌45天，得到產物，所述正硅酸乙酯與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為11.5:1;(1.6)在產物中加入乙醇，以1500-2000轉/分鐘離心3050分鐘，得到上層液和沉淀物，所述乙醇與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為22.5:1;(1.7)棄上層液，將沉淀物在乙醇中以708(TC回流12~24小時，得到上層亮黃色溶液和黑色沉淀物，所述乙醇與十六垸基三甲基溴化銨的質量比為2025:1;(1.8)棄上層亮黃色溶液，將黑色沉淀物用乙醇，水，丙酮交替洗滌后，放入真空干燥箱內，507(TC干燥1224小時，制備成磁性二氧化硅微球。6、根據權利要求5所述的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制備方法，其特征在于所述步驟(1.1)十六烷基三甲基溴化銨與甲苯的質量比為l:1218;步驟(1.2)配制成的水溶液濃度為140150g/L;步驟(1.4)氨水與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為0.150.2:1;步驟(1.5)正硅酸乙酯與十六垸基三甲基溴化銨的質量比為1.21.5:1;步驟(1.6)乙醇與十六垸基三甲基溴化銨的質量比為2.12.4:1;步驟(1.7)乙醇與十六垸基三甲基溴化銨的質量比為2024:1;所述步驟(2.1)磁性二氧化硅微球與甲苯的質量比為1:10201080;所述步驟(3.1)表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球與稀鹽酸的質量比為1:100300;步驟(3.3)二乙胺基乙基與NaOH水溶液的質量比為1:11.2。7、根據權利要求6所述的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球的制備方法，其特征在于所述步驟(1.1)中十六烷基三甲基溴化銨與甲苯質量比為1:15;步驟(1.2)配制成的水溶液濃度為140g/L;步驟(1.4)氨水與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為0.17:1;步驟(1.5)正硅酸乙酯與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為1.25:1;步驟(1.6)乙醇與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為2.25:1;步驟(1.7)乙醇與十六烷基三甲基溴化銨的質量比為22.5:1;所述步驟(2.1)磁性二氧化硅微球與甲苯的質量比為h1050;步驟(2.2)3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅垸與步驟(2.1)的混合溶液的質量比為l:25;所述步驟(3.1)表面鍵合環(huán)氧基的磁性二氧化硅微球與稀鹽酸的質量比為1:150，該稀鹽酸的濃度為0.01mol/L;步驟(3.3)NaOH水溶液的體積濃度為40g/L，二乙胺基乙基與NaOH水溶液的質量比為1:1.2。8、一種如權利要求1所述的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球應用于生物樣品中分離基因組DNA。9、根據權利要求8所述的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球應用于生物樣品中分離基因組DNA，其特征在于該生物樣品是全血，將表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球應用于全血中分離基因組DNA的方法，包括以下步驟(1)紅細胞的裂解(1.1)取凍存血，加入預冷紅細胞裂解液，顛倒混勻，在冰浴中孵育1020分鐘，于4。C，10001500g離心1020min，棄上清；(1.2)加入20030(Hil預冷紅細胞裂解液，700800pl滅菌水，渦旋15分鐘，于4。C，10001500g離心15min，棄上清；(2)白細胞的裂解向步驟(1.2)得到的產物中加入100200pl白細胞裂解液，渦旋30-60秒，加入2.5~5|al20mg/ml蛋白酶K，混勻，于506(TC裂解2560min;(3)核酸的結合向步驟(2)得到的產物中加入0.81.6ml滅菌水和lmg儲存于STET溶液的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球，吹吸混勻，孵育35分鐘；(4)清洗向步驟(3)得到的產物中加入0.4~0.8ml清洗液，搖勻，靜置1~3分鐘，磁性分離，棄上清；(5)洗脫向步驟(4)得到的產物中加入100~200jil洗脫液，吹吸均勻，50~65°(:孵育5~10分鐘，磁性分離，收集上清；(6)除鹽(6.1)在步驟(5)收集的上清中加入200600jil無水乙醇，混勻，靜置1020min，于4°C，1000015000g離心20~30min，棄上清；(6.2)加入70。/。乙醇50100iiL，混勻，于4。C，腦0015000g離心510min，棄上清；(6.3)室溫風干1015分鐘，加入100200fiLTE溶液溶解，即得到基因組DNA。10、根據權利要求9所述的表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球應用于生物樣品中分離基因組DNA，其特征在于該生物樣品是全血，將表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球應用于全血中分離基因組DNA的方法中步驟(1.1)凍存血的用量為200nL，預冷紅細胞裂解液的用量為200pL，預冷紅細胞裂解液的成分為O.OlMTris-HCl、0.32M蔗糖、0.005MMgCl2和質量濃度為1%的TritonX-IOO，該預冷紅細胞裂解液的pH值為7.5;步驟(2)白細胞裂解液的成分是0.03MTris-HCl、0.8M鹽酸胍、0.03MEDTA和質量濃度為0.5%的TritonX-IOO，該白細胞裂解液的pH值為8.0;步驟(3)STET溶液的成分是0.01MTris-HCl、0.1MNaCl、0.001MEDTA和質量濃度為1%的TritonX-l00;步驟(4)清洗液的成分是O.OlMTris-HCl、0.4MNaCl禾卩l(xiāng)mMEDTA、該清洗液的pH值為8.0;步驟(5)洗脫液的成分是0.05MArg和l.OMNaCl;步驟(6.3)TE溶液的成分為0.01MTris和0.001MEDTA，該溶液的pH為8.0。全文摘要本發(fā)明涉及一種表面修飾二乙胺基乙基的磁性二氧化硅微球及其制備方法和用途，采用了溶膠凝膠法制備了以四氧化三鐵納米顆粒為核，以正硅酸乙酯作硅源為殼的磁性二氧化硅微球，以此微球作模板，以環(huán)氧烷偶聯(lián)劑3-縮水甘油醚氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)作為活化劑，二乙胺基乙基鹽酸鹽作為功能基團，制備成表面修飾二乙胺基乙基(DEAE)的磁性二氧化硅微球。該方法包括制備磁性二氧化硅微球、磁性二氧化硅微球的環(huán)氧基化、二乙胺基乙基表面修飾。解決了現(xiàn)有磁性微球與核酸結合能力不高，制備步驟繁瑣等技術問題，以該方法制備出的磁性微球結合核酸能力高，可用于從生物樣品中分離核酸。文檔編號B01J20/281GK101628224SQ20091002360公開日2010年1月20日申請日期2009年8月14日優(yōu)先權日2009年8月14日發(fā)明者馮國棟,崔亞麗,磊楊,胡道道,超陳申請人:陜西北美基因股份有限公司