專利名稱：可生物降解納米微球的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種藥用納米材料技術(shù)領(lǐng)域的產(chǎn)品及其制備方法，具體是一種具
有標(biāo)記和治療功能的可生物降解納米微球的制備方法。
背景技術(shù)：
具有良好的生物相容性的可降解聚乳酸/乙醇酸共聚物(poly lactide-co-glycolide， PLGA)納米微粒用于制備生物降解型緩釋或定向給藥體系已經(jīng)研 究了近30年，是國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。PLGA目前已獲美國(guó)FDA批準(zhǔn)用作手術(shù)縫合線，心血管 支架控釋藥物涂層，以及注射用微囊、微球、埋植劑等的材料。根據(jù)藥物的性質(zhì)、給藥途徑 和釋藥時(shí)間，選用不同分子量、不同光學(xué)活性的乳酸共聚，不同種丙交酯和乙交酯的聚合比 例，采用相應(yīng)的制備工藝來(lái)控制藥物達(dá)到不同的釋放模型；還可以通過(guò)PLGA優(yōu)選藥物的輸 送系統(tǒng)，從而獲得藥物的新劑型。納米粒能夠使給藥局部的藥物濃度長(zhǎng)時(shí)間維持在治療水 平，減少給藥次數(shù)和用藥量，從而在多個(gè)層面上防止或減輕毒副作用。聚乳酸水解的最終產(chǎn) 物是水和二氧化碳，中問(wèn)產(chǎn)物乳酸也是體內(nèi)正常糖代謝產(chǎn)物，故該聚合物無(wú)毒、無(wú)剌激性， 并具有很好的生物相溶性。 隨著生物技術(shù)的高速發(fā)展，多肽、蛋白質(zhì)、抗體等藥物不斷涌現(xiàn)，目前已有多種重 要治療藥物上市。生物技術(shù)藥物的基本劑型是凍干劑，常規(guī)制劑盡管其療效早為臨床所證 實(shí)，但由于半衰期短，在室溫情況下又非常不穩(wěn)定，需要長(zhǎng)期頻繁注射給藥，從患者心理和 經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)角度看，這些都較難接受，另外，有的藥物必須超過(guò)一定時(shí)間才能有效發(fā)揮作用。 所以，用PLGA為載體材料，包括多肽、蛋白質(zhì)、抗體等藥物制成微球，能在體內(nèi)達(dá)到緩釋、長(zhǎng) 效目的，是近十多年來(lái)各國(guó)學(xué)者大力研究的新領(lǐng)域。 對(duì)藥效的評(píng)價(jià)以及直觀觀察藥物所處的位置，需要對(duì)藥物進(jìn)行一定的標(biāo)記，目前 常用的標(biāo)記是核素標(biāo)記和熒光染料標(biāo)記，但是核素標(biāo)記存在輻射和污染，而染料標(biāo)記存在 需要特定的波長(zhǎng)和能量高的光源激發(fā)，發(fā)射光的光譜寬，并且紅光區(qū)有拖尾，光穩(wěn)定性差， 檢測(cè)本底高，靈敏度低等缺陷。量子點(diǎn)標(biāo)記的熒光分析原理和檢測(cè)技術(shù)與現(xiàn)有的熒光分析 技術(shù)相似，其顯著優(yōu)勢(shì)是具有良好的光穩(wěn)定性，在持續(xù)光照射下可以維持幾個(gè)小時(shí)，熒光壽 命長(zhǎng)，通過(guò)控制時(shí)間來(lái)抑制天然物質(zhì)自身的熒光干擾，靈敏度高。而對(duì)于緩釋藥物在體內(nèi)的 循環(huán)過(guò)程進(jìn)行監(jiān)控是個(gè)長(zhǎng)期復(fù)雜的過(guò)程，對(duì)其標(biāo)記需要長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)，量子點(diǎn)正是能滿足 這個(gè)需要，克服熒光染料很容易猝滅的缺陷，而且直接通過(guò)熒光成像觀察到藥物及其載體 所處的位置，對(duì)實(shí)時(shí)觀察藥物療效有很重要的作用。 經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，中國(guó)專利文獻(xiàn)號(hào)CN101327189A，記載了一種"具有 標(biāo)記和治療雙功能的納米乙醇脂質(zhì)體材料制備方法"，該技術(shù)將5-FU和親水性的量子點(diǎn)溶 解和分散在磷酸鹽緩沖溶液中。以磷脂作為載體，制備含有5-FU和量子點(diǎn)的納米乙醇脂質(zhì) 體。但是該技術(shù)存在藥物包封率低，并且容易泄漏等缺點(diǎn)，從而導(dǎo)致藥物及量子點(diǎn)的早期釋 放率高，從而不能達(dá)到緩釋的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種可生物降解納米微球的制備方 法，以生物降解材料PLGA作為載體材料，采用復(fù)乳的方法，結(jié)合量子點(diǎn)的熒光特性和多肽、 蛋白質(zhì)、抗體等藥物的藥效，制備成具有標(biāo)記和治療效果的可生物降解納米微球，具有緩釋 的效果。 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的將具有熒光特性的量子點(diǎn)和具有治療功能的 藥物包裹在可以生物降解的聚合物PLGA內(nèi)，并通過(guò)復(fù)乳技術(shù)，得到納米微球。
本發(fā)明具體包括以下步驟 第一步，將親水性量子點(diǎn)與多肽、蛋白質(zhì)或抗體中的一種溶解在磷酸鹽緩沖溶液 中，得到水相混合物。 所述的親水性量子點(diǎn)選用CdTe、 CdSe、 ZnS、 ZnSe或者CdSe/ZnS核/殼型半導(dǎo)體 量子點(diǎn)，其熒光發(fā)射波長(zhǎng)從488nm到605nm之間。所述的水相混合物中親水性量子點(diǎn)的濃度為0. 005 0. 03g/ii L、多肽、蛋白質(zhì)
或抗體的濃度為0. 1 0. 5g/ ii L。 所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH為7. 4。 第二步，將PLGA超聲溶解于有機(jī)溶劑后加入到水相混合物中并充分?jǐn)嚢?，然后?jīng) 超聲乳化處理后，得到油包水初乳。 所述的PLGA的濃度為l 5g/iiL，其中DL-LA : GA的摩爾比為90 : 10、80 : 20、 75 : 25、60 : 40或50 : 50。
所述的有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一種或其組合。
所述超聲乳化處理是指設(shè)定超聲功率40 100W進(jìn)行超聲分散1 5分鐘后在 700r/min條件下持續(xù)攪拌混合1小時(shí)。 第三步，將油包水初乳加入到聚乙烯醇中，經(jīng)常溫?cái)嚢杼幚砗?，離心過(guò)濾水洗，獲 得可生物降解納米微球。 所述的溫?cái)嚢杼幚硎侵冈谑覝丨h(huán)境下以700 1000rpm/min的轉(zhuǎn)速攪拌4 16 小時(shí)。 所述的聚乙烯醇的濃度為0. 5 10g/ii L。 所述的離心過(guò)濾水洗是指離心速度在6000 12000rpm/min之間，離心時(shí)間5 30分鐘，經(jīng)過(guò)濾后采用去離子水洗滌3次。 本發(fā)明主要是將水溶性的量子點(diǎn)和具有治療作用的藥物同時(shí)包裹在可生物降解 材料PLGA中，并通過(guò)復(fù)乳的方法制備成納米微球。利用量子點(diǎn)的熒光標(biāo)記作用，藥物的治 療作用，可生物降解載體的緩釋作用，以及復(fù)乳的制備方法，得到具有標(biāo)記和治療雙功能的 可生物降解納米微球。
具體實(shí)施例方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。 實(shí)施例1
第一步將0. 005%發(fā)射波長(zhǎng)為488nm水中分散的CdTe量子點(diǎn)和0. 01%胸腺肽溶 解在pH為7. 4磷酸鹽緩沖溶液中，得到水相混合物。 第二步將1X的PLGA(DL-LA : GA摩爾比為90 : 10)超聲溶解于氯仿中。在700r/ min攪拌條件下，加入到第一步的水相混合物中，40W功率超聲輔助乳化3分鐘，室溫下持續(xù) 攪拌1小時(shí)，得到油包水(W/0)初乳。 第三步在700r/min機(jī)械攪拌的條件下將第二步得到的W/0初乳加入到10毫升 0. 5g/yL的聚乙烯醇(PVA)中，室溫、持續(xù)攪拌10小時(shí)，氯仿完全揮發(fā)，乳滴開(kāi)始變硬成球， 過(guò)濾并水洗3遍，得到具有標(biāo)記和治療雙重功能的可生物降解納米材料。真空凍干得凍干
粉，密封后置于4t:保存。 本實(shí)施例制備得到的可生物降解納米微球，微球是由PLGA包裹量子點(diǎn)和胸腺肽， 經(jīng)熒光分光光度計(jì)測(cè)定，具有發(fā)射波長(zhǎng)在480 490nm的熒光，胸腺肽的包封率在40 70%之間，經(jīng)激光粒度儀測(cè)量，其平均粒徑在8 10微米。 本實(shí)施制備所得可生物降解納米微球，12天后釋放度為78% 。實(shí)驗(yàn)顯示所制備的
熒光藥物納米球體外能夠持續(xù)釋藥，具有明顯緩釋效果，并且保持良好的熒光性能。
實(shí)施例2 第一步，將0. 01 %熒光發(fā)射波長(zhǎng)為530nm的水溶性量子點(diǎn)CdTe@CdSe和0. 3%表 皮生長(zhǎng)因子(EGF)溶解在pH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，得到水相混合物。
第二步，將3X的PLGA(DL-LA : GA摩爾比為75 : 25)超聲溶解于丙酮中。在 700r/min攪拌條件下，加入到第一步的水相混合物中，60W超聲輔助乳化3分鐘，之后室溫 下持續(xù)攪拌1小時(shí)，得到油包水(W/0)初乳。 第三步，在機(jī)械攪拌的條件下將第二步得到的W/0初乳加入到一定體積、適宜濃 度的聚乙烯醇(PVA)中，室溫、800rpm/min攪拌4小時(shí)，丙酮完全揮發(fā)，乳滴開(kāi)始變硬成球， 離心并水洗3遍，即可制得具有熒光標(biāo)記和治療雙重功能的可生物降解納米微球。真空凍
干得凍干粉，密封后置于4t:保存。 本實(shí)施例制備得到的可生物降解納米微球，微球是由PLGA包裹量子點(diǎn)和表皮生 長(zhǎng)因子，經(jīng)熒光分光光度計(jì)測(cè)定，具有發(fā)射波長(zhǎng)在520 540nm之間的熒光，表皮生長(zhǎng)因子 的包封率在30 50%之間。經(jīng)激光粒度儀測(cè)量，其平均粒徑在500 800納米之間。
本實(shí)施制備所得可生物降解納米微球，體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)表明，第9天累積釋放 度51. 8%，并且保持良好的熒光性能，具有明顯緩釋效果和熒光性能。
實(shí)施例3 第一步，將O. 03%熒光發(fā)射波長(zhǎng)為605nm的水溶性量子點(diǎn)CdSe@ZnS和0. 005%單 克隆抗體藥物溶解在pH為7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，得到水相混合物。
第二步，將5X的PLGA(DL-LA : GA摩爾比為50 : 50)超聲溶解于乙酸乙酯中。 在700r/min攪拌條件下，加入到第一步的水相混合物中，超聲輔助乳化5分鐘，之后室溫下 持續(xù)攪拌1小時(shí)，得到油包水(W/0)初乳。 第三步，在機(jī)械攪拌的條件下將第二步得到的W/0初乳加入到10g/ ii L聚乙烯醇 (PVA) 10毫升中，在室溫、1000rpm/min下攪拌20小時(shí)，乙酸乙酯完全揮發(fā)，乳滴開(kāi)始變硬成 球，離心并水洗3遍，即可得到具有標(biāo)記和治療雙重功能的可生物降解納米微球。真空凍干
得凍干粉，密封后置于4t:保存。
本實(shí)施例制備得到的可生物降解納米微球，微球是由PLGA包裹量子點(diǎn)和單克隆 抗體藥物，經(jīng)熒光分光光度計(jì)測(cè)定，具有發(fā)射波長(zhǎng)在520 540nm之間的熒光，單克隆抗體 藥物的包封率在30 50%之間，經(jīng)激光粒度儀測(cè)量，其平均粒徑在100 500納米之間。
本實(shí)施制備所得可生物降解納米微球，體外藥物釋放實(shí)驗(yàn)表明，微球能夠持續(xù)釋 放BSA達(dá)35d以上，并且保持良好的熒光性能，具有明顯緩釋效果和熒光性能。
權(quán)利要求
一種可生物降解納米微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟第一步，將親水性量子點(diǎn)與多肽、蛋白質(zhì)或抗體中的一種溶解在磷酸鹽緩沖溶液中，得到水相混合物；第二步，將PLGA超聲溶解于有機(jī)溶劑后加入到水相混合物中并充分?jǐn)嚢瑁缓蠼?jīng)超聲乳化處理后，得到油包水初乳；第三步，將油包水初乳加入到聚乙烯醇中，經(jīng)常溫?cái)嚢杼幚砗?，離心過(guò)濾水洗，獲得可生物降解納米微球。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可生物降解納米微球的制備方法，其特征是，所述的親水性 量子點(diǎn)選用CdTe、CdSe、ZnS、ZnSe或者CdSe-ZnS核殼型半導(dǎo)體量子點(diǎn)，其熒光發(fā)射波長(zhǎng)從 488nm至lj 605nm之間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可生物降解納米微球的制備方法，其特征是，所述的水相混 合物中親水性量子點(diǎn)的濃度為0. 005 0. 03g/ii L、多肽、蛋白質(zhì)或抗體的濃度為0. 1 0. 5g/ii L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可生物降解納米微球的制備方法，其特征是，所述的磷酸鹽 緩沖溶液的pH為7.4。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可生物降解納米微球的制備方法，其特征是，所述的PLGA的 濃度為1 5g/ii L，其中DL-LA : GA的摩爾比為90 : 10、80 : 20、75 : 25、60 : 40或 50 : 50。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可生物降解納米微球的制備方法，其特征是，所述的有機(jī)溶劑為氯仿、二氯甲烷、丙酮、乙醇或乙酸乙酯中的一種或其組合。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可生物降解納米微球的制備方法，其特征是，所述超聲乳化 處理是指設(shè)定超聲功率40 100W進(jìn)行超聲分散1 5分鐘后在700r/min條件下持續(xù)攪 拌混合1小時(shí)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可生物降解納米微球的制備方法，其特征是，所述的溫?cái)嚢?處理是指在室溫環(huán)境下以700 1000rpm/min的轉(zhuǎn)速攪拌4 16小時(shí)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的可生物降解納米微球的制備方法，其特征是，所述的離心過(guò) 濾水洗是指離心速度在6000 12000rpm/min之間，離心時(shí)間5 30分鐘，經(jīng)過(guò)濾后采用 去離子水洗滌3次。
全文摘要
一種藥用納米材料技術(shù)領(lǐng)域的可生物降解納米微球的制備方法，包括將親水性量子點(diǎn)與多肽、蛋白質(zhì)或抗體中的一種溶解在磷酸鹽緩沖溶液中，得到水相混合物；將聚(乳酸羥基乙酸)共聚物超聲溶解于有機(jī)溶劑后加入到水相混合物中并充分?jǐn)嚢?，然后?jīng)超聲乳化處理后，得到油包水初乳；將油包水初乳加入到聚乙烯醇中，經(jīng)常溫?cái)嚢杼幚砗?，離心過(guò)濾水洗，獲得可生物降解納米微球。本發(fā)明以生物降解材料PLGA作為載體材料，采用復(fù)乳的方法，結(jié)合量子點(diǎn)的熒光特性和多肽、蛋白質(zhì)、抗體等藥物的藥效，制備成具有標(biāo)記和治療效果的可生物降解納米微球，可生物降解，具有緩釋的效果。
文檔編號(hào)B01J13/08GK101693179SQ20091030938
公開(kāi)日2010年4月14日 申請(qǐng)日期2009年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月6日
發(fā)明者崔大祥, 賀蓉, 阮靜 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué);