專利名稱：脂多糖凈化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及脂多糖凈化領域。
背景技術：
當革蘭氏陰性菌如大腸桿菌(Escherichia coli)及腸沙門氏菌(Salmonella enterica)倍增或裂解時，即釋放脂多糖。它是一種強力細菌毒素，稱作內毒素，是許多種與 革蘭氏陰性菌感染有關的毒性及致免疫效應的根源。內毒素是從細菌制備的質粒脫氧核糖 酸中常見的污染物，因此必須在投入體內應用之前除去，以便防止任何不良炎癥應答。類似 地，必須對從革蘭氏陰性菌制備而來的其它生物分子(例如革蘭氏陰性菌莢膜多糖大腸桿 菌衍生的重組蛋白)和藥物用水進行純化，去除殘余內毒素。因此，在純化有生物醫(yī)藥用途的分子時需要能夠選擇性地去除脂多糖或內毒素。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供用于在純化有生物醫(yī)藥用途的分子的過程中選擇性地去除脂多糖的 材料和方法。因此，本發(fā)明提供用于吸附脂多糖的膜，其包含可結合脂多糖的聚合物基材。較佳 地，該聚合物基材至少對庚糖和2-酮基-3-脫氧辛酸(2-keto-deoxyoctonic acid)之一 具有選擇性。本發(fā)明還提供一種制備結合脂多糖的聚合物基材的過程，所述過程包括以下步 驟i.接觸均相聚合物溶液和模板溶液；ii.對所得溶液進行相轉化處理；以及iii.除去模板。本發(fā)明進一步提供制備結合脂多糖的聚合物基材的另一種過程，所述過程包括以 下步驟i.接觸單體溶液和模板溶液；ii.使單體中的交聯(lián)基團反應形成聚合物；以及iii.除去模板。較佳地，各過程進一步包括制作膜的步驟。除此之外，本發(fā)明提供一種從懸浮液中去除脂多糖的方法，包括以下步驟i.提供一種可結合脂多聚合物基材；以及使所述懸浮液接觸聚合物基材。附圖簡述


圖1顯示了在用Kdo印跡膜和非印跡膜過濾后的內毒素回收％。方塊是MIM的； 三角是匪IM的。X軸是濾液體積(ml)。圖2顯示了在用重復使用的Kdo印跡膜和非印跡膜過濾后的內毒素回收％。實心 條是MIM，空心條是匪IM。X軸是濾液體積(ml)。發(fā)明詳述革蘭氏陰性菌本發(fā)明涉及衍生自革蘭氏陰性菌的脂多糖。這些細菌中有許多品種是致病 的，該特性與細菌細胞的脂多糖層有特別關聯(lián)。革蘭氏陰性菌包括但不限于蛋白菌 (proteobacteria)，包括埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門菌屬(Salmonella)、以及其它腸 桿菌科、假單胞菌屬(Pseudomonas)、莫拉菌屬(Moraxella)、螺桿菌屬(Helicobacter)、寡 養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、蟲至弧菌屬(Bdellovibrio)、耳口爾森氏菌屬(Yersinia)、 醋酸菌和軍團菌屬(Legionella)；藍藻菌；螺旋體；綠色硫細菌和綠色非硫細菌。革蘭氏 陰性球菌包括淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)和粘膜炎莫拉氏菌(Moraxellacatarrhalis)。革蘭氏陰性桿菌包括流感 嗜血桿菌(Hemophilus influenzae)、月市炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、侵月市軍 團菌(Legionellapneumophila)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、大腸桿菌、 奇異變形菌(Proteus mirabilis)、陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、粘質沙雷氏菌 (Serratia marcescens)、幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)、腸炎沙門菌(Salmonella enteritidis)、和傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)。醫(yī)院革蘭氏陰性菌包括鮑氏不動桿 菌(Acinetobacter baumannii)。脂多糖革蘭氏陰性菌細胞膜的最外層主要地由脂多糖組成，不管衍生自何種細菌，其全 部具有共同的基本結構，由稱作脂質A的脂質成分以及親水的雜多糖組成。脂質A提供將 分子固定在膜內的錨，而多糖成分自表面凸出并與外部環(huán)境相互作用。脂多糖的雜多糖單元由兩部分組成寡糖芯和外部的O-特異性多糖側鏈，該側鏈 包含寡糖的復雜聚合物，其決定了脂多糖的抗原特異性，常稱作O-抗原。這個成分對于合 成它的特定細菌而言是特有的；不同的細菌合成在O-特異性多糖側鏈的長度以及精細結 構方面有差異的脂多糖分子。芯的內部部分包含特征性及不同尋常的成分庚糖(系L-甘 油-D-甘露-構型)和2-酮基-3-脫氧辛酸(或3-脫氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸)(Kdo).在本發(fā)明中，術語“庚糖，，應理解為是指“ L-甘油-D-甘露-庚糖，，而術語“ 2-酮 基-3-脫氧辛酮酸”應理解為是指“3-脫氧-D-甘露-辛-2-酮糖酸。，，較佳地，形成本發(fā)明的膜的聚合物基材至少對庚糖和2-酮基-3-脫氧辛酸之一具 有選擇性。如上所述，這些不同尋常的糖類是脂多糖的特征。能夠重新組織并且選擇性地 結合這些部分的聚合物基材可以從懸浮液中去除脂多糖。脂多糖的吸附本發(fā)明提供一種用于吸附脂多糖的膜，包括可結合脂多糖的聚合物基材。在本發(fā) 明的上下文中中，“膜”是一種溶液或懸浮液中的特定物質可以透過的薄層材料。本發(fā)明的 膜是一種用聚合物基材或基質制成的連續(xù)介質，可以形成平的、凹的或凸的片材，或者可以 是任何適當形狀。那些被阻止透過該膜的分子按其物理或化學性質而區(qū)別對待。本發(fā)明的用于從懸浮液中去除脂多糖的方法可以采用不同的聚合物基材排列方式，比如懸浮液中的 不連續(xù)顆?；蛭⑶蝮w?；蛘?，聚合物基材可以結合在固態(tài)支持物上，比如珠、板、柱、過濾器 或多孔固體。所發(fā)生的吸附可以是物理吸附或化學吸附或者二者兼而有之。吸附在了聚合物基 材的那些分子從正在處理的懸浮液中去除。在處理了懸浮液之后，吸附在了聚合物基材的 分子用本領域熟知的方法除去，以便使聚合物基材可以重新使用。聚合物基材可以用本領域熟知的任何合適的單體、聚合物及共聚物的組合來制 作。較佳地，聚合物基材通過分子印跡技術制作。該技術生產出能夠進行分子識別的聚合 物基材。聚合物基體能夠區(qū)別化學物質并結合那些展示特定官能團的物質，因而得到高水 平的選擇性。Another本發(fā)明的另一方面提供一種通過在模板存在下將一組功能單體聚合來形 成分子印跡聚合物基材方法。該功能單體可以包含能夠與模板形成結合性相互作用的功能 性頭基團以及能夠以共價鍵與其它單體結合的交聯(lián)基團。聚合反應步驟可以涉及鏈增長聚 合或者逐步增長聚合，可以用本領域熟知的任何方式引發(fā)。本發(fā)明是又一方面提供一種通 過將含有模板的均相聚合物溶液進行相轉化處理來形成分子印跡聚合物基材的方法。隨后將模板摘除則在聚合物基材中留下了與模板在大小、形狀和功能性方面互補 的空穴。該空穴能夠結合孤立的模板或者在其結構中引入了模板的功能性的分子(即包括 官能團的相同具體排列)。因而，在本發(fā)明中，庚糖和/或2-酮基-3-脫氧辛酸或包含其化 學結構的小的寡糖可以用作制造選擇性地結合脂多糖的聚合物基材的模板。形成聚合物基 材的方法涉及模板溶液的應用，其中的模板溶液較佳地包含庚糖和2-酮基-3-脫氧辛酸中 的至少一種，以便賦予聚合物基材所需的選擇性。這些分子印跡聚合物基材可以隨后做成 多孔膜，供本發(fā)明的生物分離之用。在一個優(yōu)選實施方式中，聚合物基材通過相轉化處理得到。聚合物基材可以包含一個或多個極性基團。例如，聚合物基材可以包含一個或多 個胺、羥基或巰基，特別是羥基。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，包含羥基的聚合物基材能夠結合脂多糖。例 如，聚合物基材可包含聚(乙烯-共-乙烯醇)(polykthylene-co-vinyl alcohol))，這 是一種可以用在通過相轉化處理來形成分子印跡聚合物基材的方法中的共聚物。以商品名 EVAL 出售的這種共聚物的性質通過控制單體組分乙烯和乙烯醇的聚合比例以及在聚合反 應過程中所達到的聚合度來決定。所得的無規(guī)晶狀聚合物用以下分子式表示- (CH2-CH2) m- (CH2-CHOH) n-式中m和η是整數(shù)?？梢允褂萌魏芜m當比例的乙烯共-乙烯醇。特別地，可以 使用30-60 70-40的比例，特別是40-50 60-50的比例。例如，比例30 70,31 69、 32 68,33 67,34 66,35 65,36 64,37 63,38 62,39 61,40 60,41 59、 42 58,43 57,44 56,45 55,46 54,47 53,48 52,49 51,50 50,51 49、 52 48,53 47,54 46,55 45,56 44,57 43,58 42,59 41 或 60 40 皆可使 用，尤其是比例 40 60,41 59,42 58,43 57,44 56,45 55,46 54,47 53、 48 52,49 51或50 50。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，比例44 56適合結合脂多糖。本發(fā)明的另一個方面提供一種從懸浮液中去除脂多糖的方法，包括使懸浮液與如 上所述的結合脂多糖的聚合物基材相接觸。聚合物基材的形式可以是膜或者是不連續(xù)顆?；蛘呤歉街诠虘B(tài)支持物上。較佳地，懸浮液包含水，例如生物流體的形式。懸浮液最好包 含藥物成份。更加優(yōu)選的是，該藥物成份是細菌疫苗。LPS可以從中去除的其它材料是用在 制備和/或配制包含該藥物成份的最終劑型的材料。概述術語“含有”包括“包含”以及“由…組成”，例如“含有” X的組合物可僅由X組成 或可包含其它物質，例如X+Y。術語“懸浮液”囊括了溶液以及任意的膠體分散體，其中一個物質或者保持懸浮在 溶劑中或者變成溶劑化物形成均一的混合物。術語“藥物成份”是指供人用或獸用的藥品。本發(fā)明的方法可以用于制備和/或分析目的。提及“制備”等時應當理解為排除 了分析方法。術語“細菌疫苗”是指能夠施用以便感生免疫應答用于預防或治療細菌性疾病的 細菌懸浮液、減毒或殺滅細菌、其抗原衍生物。術語“寡糖”是指含有少量的(通常3至20個)成分糖的糖聚合物?！肮虘B(tài)支持物”是在特定溶劑體系(例如水或有機溶劑)中不溶解的某種東西?？?能是由上面可以結合聚合物基材的玻璃、陶瓷、金屬、塑料、木頭、或任何其它材料組成的。應該明白，在此描述的化合物中的可離子化基團可以是處于中性形式或者帶電荷 的形式，例如取決于PH值。例如，羧基-COOH可以失去質子得到陰離子-C00_基團。本發(fā) 明中可以采用帶電荷分子的任何鹽。
具體實施例方式用于LPS俘獲的分子印跡膜的制備、表征及測試引言用于特異性識別Kdo的膜利用分子印跡技術制備。該膜利用相轉化法制作。用于 制造這個膜的聚合物溶液是EVAL (聚(乙烯-共-乙烯醇))，乙烯共-乙烯醇比例是 44 56。模板溶液包含Kdo。膜的制備匪IM-非印跡(對照)膜(在無模板的情況下制備)。15 %的配制在DMSO中的 EVAL 懸浮液在IOCTC攪拌加熱，直至獲得均相溶液。將2至3. 5ml的該溶液傾至8. 5x14cm2 的玻片支持物上，用刀切割得到400 μ m厚的均相層。該層用400毫升由H20/DMS0(50/50 ν/ν)構成的第一凝固(轉化)浴進行凝固處理1個小時。然后將膜置于400毫升的水中6 個小時。在轉化步驟結束時，將膜干燥并凍干。所得膜的厚度是200 μ m。MIM-印跡(測試)膜(在有模板的情況下制備)。該膜以與以上相同的步驟制備， 但起始懸浮液是3毫升15%的用DMSO配制的EVAL 懸浮液，含有50毫克Kdo。在膜制備 之后，通過利用再循環(huán)系統(tǒng)在0. 2巴的壓力下用水對膜進行廣泛沖洗，去除殘余的模板。測試膜對Kdo的容量為測定MIM對Kdo的結合容量，使100毫升10 μ g/ml的Kdo水溶液通過安裝在過 濾裝置上的MIM再循環(huán)過夜?；谌芤旱目傮w積和再循環(huán)期間使用的膜的重量，用0時和再 循環(huán)結束時再循環(huán)溶液中Kdo濃度的差值計算對Kdo的結合容量。觀察到的值是大約每毫
7克膜8yg。在一個類似實驗中，匪IM對Kdo沒有顯著的結合容量。為了測試MIM膜對Kdo 的選擇性，進行了一個類似的實驗，其中用唾液酸置換Kdo。未觀察到對唾液酸有顯著結合 容量(每毫克膜1 μ g)。唾液酸和Kdo濃度是用Osborn (1963) PNAS，50 =499-506的過程確 定的。LPS結合實驗切割出一段MIM膜并裝到過濾支架上，使過濾面積為4. 9cm2。然后使用注射器以 無熱原蒸餾水沖洗該系統(tǒng)，隨后是0. IM的NaOH，并再次用蒸餾水，直至滲透物呈中性pH。用注射器使10毫升濃度為50UI/ml (總共500UI)的標準大腸桿菌脂多糖(LPS)溶 液通過膜。收集4份2. 5ml流分，從每一份取0. 7ml樣品進行內毒素濃度的鱟變形細胞裂 解物(LAL)分析。這些流分隨后倒在一起(收集池1)，從倒在一起的總滲透物中取0.7ml 樣品用于分析。使6ml倒在一起的滲透物再次通過膜。這一次收集4份1. 5ml流分，從每一份取 0. 7ml樣品用于分析。這些流分隨后倒在一起(收集池2)，再取0. 7ml樣品用于分析。在使用之后，膜用蒸餾水、0. IM NaOH、并再次用蒸餾水沖洗，直至滲透物呈中性 pH。對濾器上的起始材料(SM)以及其它樣品的內毒素濃度做了分析(表1)。表1 印跡膜(MIM)Kdo結合實騎
樣品體積 (ml)UI/ml總UI回收％起始材料加載量1041. 8418100洗滌過濾器< 0. 05流分1/12. 55. 2213. 053. 1流分2/12. 59. 3723.4255. 6流分3/12. 59. 3923.4755. 6流分4/12. 58. 5321.3255. 1流分1-4份總UI81. 2719. 4收集池1104. 9149. 111. 7收集池164. 9129. 46流分1/21. 54. 636. 94523. 6
8 用匪IM膜進行同樣條件下的實驗(表2)。表2 非印跡膜(匪IM) Kdo結合實驗 這兩個實驗的結果匯總在圖1中。這兩個實驗用相同的(即使用過的)MIM和匪IM 膜重復(表3，圖2)。表3 用寸的MIM和NMIM臘講行的結合實齡 討論能夠選擇性地結合Kdo (LPS的一種保守成分)的膜已經制備出來了。
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新制備的印跡膜(MIM)對LPS的潛在結合容量約為初始載量的約80%。對照膜 (匪IM)未表現(xiàn)出任何顯著的LPS結合(比較表1和2，圖1)。MIM濾液包含約12%的初始 LPS載量(表1，收集池1)。然而，在膜用蒸餾水沖洗并再次加載LPS后，未觀察到進一步的 LPS結合(表1，收集池2)。這表明膜已被LPS飽和。當重新使用該膜時，觀察到不同的性能(表3)。兩個膜似乎保留了大約50-60%的 初始LPS載量。然而，對LPS累積回收的分析表明，印跡膜仍然顯示出對LPS的較大結合， 至少在過濾過程開始時如此(圖2)。用再使用的膜觀察到的結果表明，膜的再利用并非首 選。不希望被理論所限制，有可能在膜的首次使用之后發(fā)生了結構性變化，這種變化給了膜 不同的性質，或許是無特異性結合。作為替換/除此之外，有可能是在再使用之前對MIM膜 的洗滌步驟進行的不充分，不足以去除所有的結合LPS，即并非所有的初始Kdo結合位點皆 可用。這些結果證實，能夠用分子印跡技術的原理制造識別并結合水溶液中LPS的過濾膜。應理解，僅以舉例的方式描述了本發(fā)明，可以進行修改而仍在本發(fā)明的范圍和構 思內。
1權利要求
用于吸附脂多糖的膜，其包含可結合脂多糖的聚合物基材。
2.如權利要求1所述的膜，其特征在于，所述聚合物基材至少對庚糖和2-酮基-3-脫 氧辛酸之一具有選擇性。
3.如權利要求1或2所述的膜，其特征在于，所述脂多糖來自革蘭氏陰性菌。
4.如權利要求3所述的的膜，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌是蛋白菌、藍藻菌、螺旋 體、綠色硫細菌、綠色非硫細菌、圓齒古細菌(crenarchaeota)、球菌、桿菌或醫(yī)院細菌。
5.一種形成結合脂多糖的聚合物基材的過程，所述過程包括以下步驟 i.接觸均相聚合物溶液和模板溶液； .對所得溶液進行相轉化；以及 iii.除去所述模板。
6.一種形成結合脂多糖的聚合物基材的過程，所述過程包括以下步驟 i.接觸單體溶液和模板溶液； .使所述單體中的交聯(lián)基團反應形成聚合物；以及 iii.除去所述模板。
7.如權利要求5或6所述的過程，還包括制作膜的步驟。
8.如權利要求5至7中任一項所述的過程，其特征在于，所述模板溶液包含庚糖和 2-酮基-3-脫氧辛酸中的至少一種。
9.一種從懸浮液中去除脂多糖的方法，所述方法包括以下步驟 i.提供一種結合脂多糖的聚合物基材；以及 .使所述懸浮液接觸所述聚合物基材。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述聚合物基材是膜的形式。
11.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述聚合物基材是不連續(xù)顆粒的形式。
12.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述聚合物基材附著在固態(tài)支持物上。
13.如權利要求9至12中任一項所述的方法，其特征在于，所述聚合物基材至少對庚糖 和2-酮基-3-脫氧辛酸之一具有選擇性。
14.如權利要求9至13中任一項所述的方法，其特征在于，所述脂多糖來自革蘭氏陰性菌。
15.如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述革蘭氏陰性菌是蛋白菌、藍藻菌、螺 旋體、綠色硫細菌、綠色非硫細菌、圓齒古細菌或醫(yī)院細菌。
16.如權利要求9至15中任一項所述的方法，其特征在于，所述懸浮液包含水。
17.如權利要求9至16中任一項所述的方法，其特征在于，所述懸浮液包含藥物成份。
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述藥物成份是細菌疫苗。
19.如前述任一項權利要求所述的膜、過程或方法，其特征在于，所述聚合物基材包含 一個或多個極性基團。
20.如權利要求19所述的膜、過程或方法，其特征在于，所述聚合物基材包含一個或多 個羥基。
21.如前述任一項權利要求所述的膜、過程或方法，其特征在于，所述聚合物基材包含 聚(乙烯-共-乙烯醇).
22.如權利要求21所述的膜、過程或方法，其特征在于，所述聚(乙烯-共-乙烯醇)中乙烯共-乙烯醇的比例為30-60 70-40。
23. 一種用權利要求5-7中任一項所述過程制得的聚合物基材。
全文摘要
在純化有生物醫(yī)藥用途的分子的過程中選擇性除去脂多糖的材料和方法，所述材料和方法基于結合脂多糖的聚合物基材。優(yōu)選地，所述聚合物基材選自庚糖和2-酮基-3-脫氧辛酸中的至少一種。所述基材可通過包括以下步驟的過程形成(i)接觸均相聚合物溶液和模板溶液；(ii)對所得溶液進行相轉化；以及(iii)除去所述模板。
文檔編號B01J20/26GK101909742SQ200980102069
公開日2010年12月8日 申請日期2009年1月7日 優(yōu)先權日2008年1月7日
發(fā)明者G·西雅德利, N·巴巴尼, P·科斯坦蒂諾 申請人:諾華有限公司