專利名稱：生物芯片基底和制造生物芯片基底的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物芯片基底(substrate)，更具體地，用于制備將生物材料固定在基 底上預定位置的生物芯片以及用于獲得關于待檢測的各種生物樣品的信息的基底。本發(fā)明 特別涉及適合于通過直接在基底上化學合成探針DNA來制備DNA芯片的生物芯片基底。
背景技術：
“生物芯片”是以下裝置的通稱，在所述裝置中，與待檢測的生物物質以特異性方 式進行化學反應的生物物質被固定在芯片表面上的預定位置。DNA芯片是生物芯片的典型例子，它用于檢測包含在血液或者細胞提取物中的靶 DNA的類型和數(shù)量。DNA芯片具有例如以下結構，在所述結構中，數(shù)萬種探針DNA在基底如載玻片上排 成陣列，每個探針DNA都為已知序列的單鏈DNA。當含有熒光標記的靶DNA的待檢測液體補給到DNA芯片時，只有具有與探針DNA 序列互補的序列的靶DNA被固定，探針DNA與其形成氫鍵并形成雙鏈。其結果是，靶DNA所 固定的部分是熒光顯色的。通過測試在芯片上熒光顯色部分的位置和顏色強度，可以檢測 到靶DNA的類型和數(shù)量。為了制備以該方式使用的DNA芯片，必須將多個類型的具有預定序列的探針DNA 固定在基底表面上的預定位置。有兩種主要的固定探針DNA的方法。第一種方法稱為“微陣列方法”，在該方法中， 化學合成的或者由預期的活有機體中預先提取的探針DNA通過點滴或者印刷以陣列固定 在基底上。在另一種方法中，使用四個堿基胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)和鳥嘌呤 (G)，在基底上直接化學合成多個類型的探針DNA，每個所述探針DNA都為具有根據(jù)設計的 預定序列的單鏈DNA。在第二種固定方法中，要求反應區(qū)和非反應區(qū)在用于化學合成的基底的表面上應 該以明確不同的方式形成，在所述反應區(qū)發(fā)生合成預期探針DNA的反應，所述非反應區(qū)不 涉及合成反應。作為由第二種方法制備的DNA芯片，例如“基因芯片(Gene Chip) ”(由Affymetrix Inc.生產的產品名字)是已知的。就該芯片來說，石英用作基底材料，應用顯微光蝕刻(photolithography)以不同 的方式形成反應區(qū)和非反應區(qū)。而且，當化學合成探針DNA時，通過應用紫外線來活化在反 應區(qū)內的單鏈DNA，逐單元地形成單鏈DNA。在該芯片上，包含大約200，000個每個約20平方微米的點的反應區(qū)形成在單個基底上，約2，000, 000條的相同類型探針DNA的鏈都固定在一個點。在該芯片內，點以高密度形成于芯片上。因此，在一次測試中可以檢測到大量類型 的靶DNA。日文公布的PCT申請No.平成9-500568的圖2A所示的是如下所述的陣列平板 (array plate)0陣列平板制備如下首先，使Si基底的表面與氟代硅烷反應，在其上形成疏水的 氟代烷基硅氧烷薄層。然后，該薄層在規(guī)定的二維圖案內移除，所以Si基底的表面在薄膜 被移除的點處將會暴露。最后，將暴露的表面與羥基硅烷或者烷基硅烷反應，所以暴露的表 面將含有羥基。因此，在該陣列平板上，Si基底的表面包含具有大表面張力的疏水性薄膜的位點 和具有親水性羥基的位點。對于生物物質，前者用作非反應區(qū)，而后者用作反應區(qū)。當使用該陣列平板時，合成反應發(fā)生在親水性位點，然后，待檢測的液體補給到這 些位點。由于在親水性位點周圍的疏水薄膜的大的表面張力，待檢測的液體保存在親水性 位點。然而，在該陣列平板上，反應區(qū)和非反應區(qū)形成于Si基底的表面，相互之間幾乎 齊平。所以，它在保存所補給的待檢測液體方面沒有足夠的穩(wěn)定性，因此，它不容易使用。而且，反應區(qū)的形成和非反應區(qū)的形成都依賴于Si表面和其它的化學品之間的 化學反應。反應并不總是以100%的產率發(fā)生，因此，反應區(qū)和非反應區(qū)之間的界限模糊不 是不可能。另一問題是疏水性薄膜和親水性位點容易受外界的破壞。從保存待檢測的液體方面考慮，在基底上，具有能夠保存待檢測液體的結構的底 孔(bottomed well)分布在基底的表面上，所述基底對于具有上述結構的陣列平板是優(yōu)選。作為該類型的基底，日文公布的PCT申請No. 2002-537869公開了用于直接合成探 針DNA的基底和使用它化學合成探針DNA的方法。該基底的簡圖如

圖1所示?；?由Si晶片制成。在基底1的表面上，多個微管2形成在預定的陣列上。微 管2是凹陷的孔(底孔)，其直徑為約1 μ m到1000 μ m,孔深為約1 μ m到500 μ m,它用作用 于探針DNA的化學合成的反應區(qū)。除了這些孔之外的表面部分是非反應區(qū)。該基底A制備如下步驟ai 通過應用顯微光蝕刻和腐蝕于Si晶片1的表面Ia，形成如圖2所示的中 間體A1,在該中間體上，與待形成的底孔幾乎相同形狀的凹陷孔2A形成在底孔即將形成的 位置上。步驟a2 通過例如在中間體A1上的Si晶片表面1和凹陷孔2A表面(它們的底部 和側面)上進行熱氧化處理，形成如圖3所示的中間體A2，在該中體中，僅有這些表面的表 層部分轉變成厚度約0. 5 μ m的氧化硅層3。步驟a3 在中間體^的氧化硅層3的表面上進行硅烷化處理。具體地，通過應用 使用NaOH的Brown方法，氧化硅層3的表面用堿處理，然后，用例如具有環(huán)氧硅烷類基團的 活性硅烷化劑處理。然后，硅烷化劑和環(huán)氧樹脂的水解之間的聯(lián)系成功地建立起來。作為 結果，得到如圖4所示的中間體A3，在該中間體中，硅烷層4形成在氧化硅層3的表面上。在中間體A3中，由于硅烷的羥基存在于其整個表面，整個表面可以與DNA亞磷酰 胺反應。
步驟a4 通過應用亞磷酰胺方法于中間體A3的表面，用DNA亞磷酰胺T (胸腺嘧 啶)合成鏈長相應于約5個堿基的單鏈DNA的鏈。因此，形成具有如圖5所示的底孔的中 間體A4，在該中間體中，寡核苷酸(5T)間隔層形成在硅烷層4上。應注意的是，合成的寡核苷酸(5T)的末端用二甲氧基三苯甲基(DMT)來阻斷。中間體A4的整個表面覆蓋有用DMT阻斷的寡核苷酸(5T)的間隔層。然而，當通過 消除DMT阻斷末端(脫除三苯甲基)來激活寡核苷酸的末端時，在那里可以合成探針DNA。因此，就中間體^來說，當制備DNA芯片時，由寡核苷酸(5T)的間隔層5所形成 的整個表面用作反應區(qū)。然而，這不能滿足用于合成探針DNA的基底的條件，即如下條件底孔和其它部分 應該明確分開地分別用作反應區(qū)和非反應區(qū)。因此，在中間體A4的層5上需要進行處理，使底孔成為反應區(qū)，而使其它部分變成 非反應區(qū)。該處理就是下一步驟的加帽處理。步驟a5 如圖6所示，在中間體A4上，僅僅底孔充滿有樹脂滴(resindroplet) 6。 在這種情形下，在層5上進行加帽。具體地，通過在寡核苷酸(5T)的間隔層5上脫除三苯甲基處理，寡核苷酸(5T)的 末端被激活。然后，使用三氯乙酸、乙酸酐、二甲氨基吡啶等，被激活的寡核苷酸(5T)的末 端被阻斷和失活。然后，使用有機溶劑如四氫呋喃，填滿底孔的樹脂滴6溶解并且去除，所以層5在 底部孔處將會暴露。在加帽過程中，由于底孔填滿有樹脂，在底孔內的寡核苷酸(5T)的間隔層5并沒 有被加帽，而保持在能夠反應的狀態(tài)。同時，在除了被加帽的底孔以外的部分上，寡核苷酸 (5T)的間隔層變成不能進行合成反應的狀態(tài)。這樣，可以制備用于合成探針DNA的、如圖7所示截面結構的基底。在該基底A上，凹陷的底孔2以預定的圖案形成在Si晶片1的表面上。氧化硅層 3形成在Si晶片1上以覆蓋其整個表面，硅烷層4形成在氧化硅層3上以覆蓋其整個表面。在每個底孔2的底部2a和側面2b上，其末端用DMT阻斷的寡核苷酸(5T)的間隔 層5暴露出來。這些點形成用于合成探針DNA的反應區(qū)。同時，除了層5的這些點之外的 部分5a已經被加帽，形成非反應區(qū)。當通過亞磷酰胺方法，使用該基底A制備DNA芯片時，探針DNA的化學合成發(fā)生在 底孔2中。然而，該基底A存在以下所提到的問題。第一個問題是，在基底A上，反應區(qū)和非反應區(qū)之間的界限取決于在步驟a5中底 孔是如何填滿樹脂滴。通常，用樹脂滴填滿底孔是用壓電注射器(piezoinjector)來處理。填滿一個底 孔的樹脂滴的供應量是微小的，具體地說，在皮升到微升數(shù)量級。因此，在步驟a5中，有時 候，填滿底孔的樹脂滴的供應量太多，樹脂溢出底孔；有時候，樹脂滴的供應量太少，以致不 能完全填滿底部孔。在前者情況中，在底孔周圍部分的表面覆蓋有溢出底孔的樹脂。作為結果，在下一 步的加帽處理中，該周圍部分的表面不能進行加帽，保持能夠進行合成反應。
因此，當制備DNA芯片時，探針DNA也在底孔周圍部分的表面上化學合成。作為結 果，當靶DNA使用所制備的DNA芯片來檢測時，熒光顯色不僅發(fā)生在底部孔，而且發(fā)生在樹 脂溢出的底孔周圍部分。這會阻礙準確地讀取熒光標記。而且，在供應的樹脂滴的量太少以致不能填滿底孔的情況中，覆蓋在底孔內表面 的樹脂的厚度很薄，因此，樹脂容易被在加帽過程中所使用的酸溶液腐蝕。其結果是，位于 底孔的部分寡核苷酸(5T)間隔層可以被加帽。因此，當制備DNA芯片時，探針DNA不能在該底孔進行滿意地化學合成。其結果是， 當檢測靶DNA時，熒光顯色在該底孔不能產生足夠的顯色強度。而且，如果在步驟a5中的加帽不足，它還可以引起以下問題當制備和使用DNA芯 片時，熒光顯色不僅發(fā)生在底孔，而且發(fā)生在加帽不足的部分。換句話說，容易發(fā)生背底噪
曰° 而且，當在步驟 中形成凹陷孔2A (所述凹陷孔2A將形成底孔)時，凹陷孔2A的 深度由腐蝕時間的長度來確定。因此，如果腐蝕時間控制處理不準確，不能形成根據(jù)設計標 準的準確深度的底孔。發(fā)明公開本發(fā)明目的是提供一種可以不需要加帽來制備的生物芯片基底，所述加帽是用于 制備描述為具有底孔的生物芯片基底的例子的基底A所必不可少的步驟(步驟a5)，并且在 該生物芯片基底中，反應區(qū)和非反應區(qū)之間的界限是清楚的。本發(fā)明另一目的是提供一種生物芯片基底，與在傳統(tǒng)的基底中相比，在所述生物 芯片基底中，具有根據(jù)設計標準的準確深度的底孔能夠更容易地形成。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種生物芯片基底，其包括含有反應區(qū)和非反應 區(qū)的基底表面，所述反應區(qū)能夠與生物物質反應，所述非反應區(qū)不與生物物質反應，凹陷的 底孔形成在基底表面上；以及能夠與生物物質反應的材料層，其具有僅僅在底孔的底部暴 露的表面，暴露的表面形成反應區(qū)。特別是，本發(fā)明提供以下生物芯片基底，在所述生物芯片基底上，能夠與生物物質 反應的材料層是氧化硅層，并且氧化硅層的表面是硅烷化的。本發(fā)明另一方面就是根據(jù)本發(fā)明的實施方式的生物芯片基底，所述生物芯片基底 具有使表面羥基化的第一層和沉積在第一層上的第二層，第二層具有抵達第一層的許多個 孔和用相同的溶液填滿孔而形成的許多個凹槽。本發(fā)明的另一方面就是用于制備根據(jù)本發(fā)明實施方式的生物芯片基底的方法，所 述方法使沉積在第一層上的第二層的部分腐蝕，以顯露出第一層，將第一層浸漬在氫氧化 鈉溶液中，以引入多個羥基在第一層上。圖1.是用于合成探針DNA的基底的實施例的透視圖；圖2.是在形成用于合成探針DNA的傳統(tǒng)基底中的中間體A1的截面圖；圖3.是在形成基底A中的中間體A2的截面圖；圖4.是在形成基底A中的中間體A3的截面圖；圖5.是在形成基底A中的中間體A4的截面圖；圖6.是在形成基底A中的中間體A5的截面圖；圖7.是用于合成探針DNA的傳統(tǒng)基底的實施例A的截面圖8.是根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的基底的基底結構實施例Btl的截面圖；圖9.是根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的用于合成探針DNA的基底的實施例B1的截面 圖；圖10.是用于形成基底B1的原材料的截面圖11.是在其表面上形成有抗蝕劑的圖10所示材料的截面圖12.是如圖11所示的材料并在其中的抗蝕劑上形成開口的截面圖13.是以下材料的截面圖，在所述材料中，形成用于孔的孔洞以使氧化硅層的表面暴露；
圖14.是以下材料的截面圖，在所述材料中，硅烷層形成在氧化硅層表面上；
圖15.是根據(jù)本發(fā)明的第一實施方式的另一基底B2的截面圖16.是根據(jù)本發(fā)明的第一實施方式的另一基底B3的截面圖17.是根據(jù)本發(fā)明的第一實施方式的另一基底B4的截面圖18.是基底B1的結構的示意性截面圖19.是基底B1的示意性截面圖，其中，孔填滿有樹脂滴以掩蔽寡核苷酸(5T)的間隔層O
圖20.是基底B1的示意性截面圖，其中，在開口的底孔內，DMT已經從寡核苷酸
(5T)的間隔層的末端消除。圖21.是基底B1的示意性截面圖，其中，填滿底孔的樹脂已經被溶解并且去除。圖22.是基底B1的示意性截面圖，其中，DNA亞磷酰胺(C)化學結合到DMT已經被 去除的寡核苷酸(5T)上；圖23.是用DNA芯片檢測靶DNA的結果的圖片，所述DNA芯片是用本發(fā)明第一實 施方式的基底B1來制備；圖24.是用DNA芯片檢測靶DNA的結果的圖片，所述DNA芯片是用傳統(tǒng)的基底A 來制備；圖25.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的生物芯片基底的平面圖；圖26.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的生物芯片基底的、沿圖25中線XXVI-XXVI的 第一截面圖；圖27.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的生物芯片基底的、沿圖25中的線 XXVII-XXVII的截面圖；圖28.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的生物分子層的放大截面圖；圖29.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的生物芯片基底的、沿圖25中的線XXVI-XXVI 的第二截面圖；圖30.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的硅烷膜和生物分子層的第一放大截面圖；圖31.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的硅烷膜和生物分子層的第二放大截面圖；圖32.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的覆蓋平板的平面圖；圖33.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的覆蓋平板、沿圖32中的線XXXII-XXXII的截 面圖；圖34.是在依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的生物芯片基底上沉積的覆蓋平板的截面 圖35.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第一截面 圖；圖36.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第二截面 圖；圖37.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第三截面 圖；圖38.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的平面圖；圖39.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、沿圖38中的線 XXXIX-XXXIX的第四截面圖； 圖；
圖；
面面面面面圖；
面圖；
面圖40.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第五截面 圖41.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第六截面 圖42.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式 制備方法的、生物芯片基底的第七截面 圖43.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第八截面 圖44.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第九截面 圖45.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第十截面 圖46.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第十一截 圖47.圖示依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的被保護的堿基；
圖48.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第十二截 圖49.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第十三截 圖50.圖示依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的亞磷酰胺；
圖51.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第十四截 圖52.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第十五截 圖53.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第十六截 圖54.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第十七截 圖55.圖示依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的去保護的堿基；
圖56.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的制備方法的、生物芯片基底的第十八截面圖；圖57(a)所示的是在依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的生物芯片基底上的熒光圖像；圖 57(b)所示的是在早期的生物芯片基底上的熒光圖像；圖58.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的第一次改進的制備方法的、生物芯片基 底的第一截面圖；圖59.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的第一次改進的制備方法的、生物芯片基 底的第二截面圖；圖60.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的第一次改進的制備方法的、生物芯片基 底的第三截面圖；圖61.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的第一次改進的制備方法的、生物芯片基 底的第四截面圖；圖62.是描述依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的第一次改進的制備方法的、生物芯片基 底的第五截面圖；圖63.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的第二次改進的生物芯片基底的平面圖；圖64.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的第二次改進的生物芯片基底的、沿圖63中的 線LXIV-LXIV的第一截面圖；圖65.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的第二次改進的覆蓋平板的平面圖；圖66.是依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的第二次改進的覆蓋平板的、沿圖65中的線 LXVI-LXVI的第二截面圖；圖67.是在依據(jù)本發(fā)明第三實施方式的第二次改進的生物芯片基底上的覆蓋平 板的截面圖。發(fā)明最佳實施方式在本發(fā)明的生物基底上，能夠與生物物質反應的反應區(qū)和不與生物物質反應的非 反應區(qū)以明確地不同的方式形成在基底表面上。此處，術語“生物物質”用來表示具有與待檢測物質反應或者結合的位點的生物分 子或者生理上活性的物質。而且，術語“生物物質”用于此處包括與以上意義上的生物物質 有親合力的物質。生物物質并不限制于特定的物質。例如，可以提及地物質有具有與核酸 如寡核苷酸、多核苷酸、脫氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)結合的位點的物質；具有生 理學上或者藥理學上活性位點的物質如酶、維生素、肽、蛋白質、荷爾蒙、內分泌干擾化學試 劑(endocrine disturbing chemicals)、糖和脂質；RNA和蛋白質的復合物以及蛋白質如凝 集素和糖的復合物。通過將與待檢測的生物物質以特定方式反應的生物物質固定在本發(fā)明的生物芯 片基底的反應區(qū)上，可以制成不同類型的芯片。使用用于合成探針DNA的基底作為例子，本發(fā)明的生物芯片基底將描述如下。根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的基底類似于上述的圖7的基底A，其中，基底的表面包 含有反應區(qū)和非反應區(qū)，在所述反應區(qū)，使用DNA亞磷酰胺能夠發(fā)生形成探針DNA的反應， 在所述非反應區(qū)，并不發(fā)生該反應。然而，在基底A上，非反應區(qū)通過加帽形成。同時，在本發(fā)明第一實施方式的基底 上，反應區(qū)由反應活性材料組成，而其它的區(qū)域由在反應中非活性的材料組成。因此，根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的基底的最重要特征是，反應區(qū)和非反應區(qū)以明確地不同的方式形 成，而沒有進行表面失活處理如加帽。首先，根據(jù)本發(fā)明第一實施方式，基底的基本結構的實施例Btl如圖8所示?；譈tl是平板狀的片，它具有包括兩個Si層131、131和在它們之間的氧化硅層 132的夾層結構，其中，抵達氧化硅層132的表面132a的孔13A以預定的陣列圖案形成在其 中的一硅層131上，所述孔13A用作底孔。因此，在基底B。上，僅僅在孔13A的底部暴露氧化硅層132的表面132a，而基底B。 的其它表面是在Si中。僅僅氧化硅層132的表面用作用于合成例如單鏈DNA的反應區(qū)，而 基底Btl的所有其它表面用作非反應區(qū)。圖9所示的是使用上述基底Btl制備的另一基底的實施例Bp在該基底B1中，硅烷層14僅僅形成在基底Btl中的孔13A的底部。在硅烷層14上， 形成寡核苷酸(5T)的間隔層135，每個通過成功地合成5個單元的DNA亞磷酰胺T來形成。 其結果是，孔13A用作底孔13。在基底B1中，僅僅在底孔13的底部135a暴露能夠合成探針DNA的寡核苷酸(5T) 間隔層135，而底孔13的側面135b和硅層131的表面131a則保持在硅中。因此，在基底B1中，僅僅底孔13的底部用作用于合成探針DNA的反應區(qū)，而其它 部分包括底孔13的側面和基底表面則在化學合成探針DNA中為非反應區(qū)，實際上，即沒有 進行表面失活處理如加帽。應該注意的是，在基底&上提供硅烷層14，所以寡核苷酸(5T)間隔層135能夠有 效地合成，然而在基底B1上提供硅烷層14并不是必不可少的，因為寡核苷酸(5T)間隔層 135可以直接合成在氧化硅層132的表面132a上?；譈1制備如下首先，如圖10所示，制備以下結構的平板狀片，在所述結構中，氧化硅層132夾入 在兩硅層131、131之間。應該注意的是，其中一硅層131應該具有幾乎等于待形成的底孔 的深度的厚度。作為該類型的平板狀片，SOI (硅層在絕緣體上)晶片可以由Shin-EtsuChemical Co. Ltd 購買。接著，如圖11所示，其中一硅層的整個表面131a覆蓋有抗蝕劑16。具有與待形成 的底孔有相同直徑的開口的遮光板(mask)放置在抗蝕劑上，并應用紫外射線。然后，去除 遮光板，整個基底逐漸形成。其結果如圖12所示，與待形成的底孔有相同直徑的開口形成在抗蝕劑16上，在這 些開口處，暴露硅層131的表面131a。然后，使用抗蝕劑16作為掩蔽，在硅層131上用硅腐蝕劑進行腐蝕，形成抵達氧化 硅層132的表面132a的孔13A。當去除硅層到達氧化硅層132的表面132a時，腐蝕自動停止。其結果如圖13所示，獲得以下的片，在所述片中，僅僅在孔13A的底部暴露氧化硅 層132的表面132a，其它表面部分由硅組成。應該注意的是，在該片上的孔13A具有與待形 成的底孔相同的直徑和深度。然后，進行硅烷化處理。在氧化硅層表面上發(fā)生硅烷化反應，所以硅烷層14僅僅形成在孔3A的底部132a上(圖14)。 最后，通過應用亞磷酰胺方法，使硅烷層14與DNA亞磷酰胺T反應，形成寡核苷酸 (5T)的間隔層135，每個都為5個T的單鏈DNA的鏈。因此，獲得如圖所示的基底&。
在該方法中，DNA亞磷酰胺在硅烷層上僅與羥基形成共價鍵連。因此，合成反應僅 發(fā)生在底孔的底部132a上。同時，由于DNA亞磷酰胺T不與Si暴露的部分反應，盡管沒有 進行加帽處理，該部分保持為非反應區(qū)，它不像使用基底A的情形。制備基底B1 (B0)的方法和制備傳統(tǒng)基底A的方法之間的比較揭示如下首先，就基底A來說，在步驟a2中，必須在Si晶片的表面上進行熱氧化處理，以形 成氧化硅層。同時，根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的基底B1(Btl)則不要求步驟a2。而且，就基底A來說，在步驟a5中，一系列處理即用樹脂滴填滿底孔、加帽、分解和 去除樹脂是不可缺少的。同時，根據(jù)本發(fā)明第一實施例的基底B1根本不要求這些處理。因此，就基底B1(Btl)來說，由供應給底孔太多或者太少量的樹脂滴所產生的問題 可以消除，反應區(qū)和非反應區(qū)之間的界限清楚。而且，反應區(qū)僅僅包含由應用顯微光蝕刻和 腐蝕所形成的孔13A的底部，其它表面部分形成在非反應區(qū)。因此，當使用由該基底制成的 DNA芯片時，它允許高準確率地讀取熒光標記，并可防止背底噪音。進一步地，就基底A來說，為了形成具有根據(jù)設計標準深度的底孔，必須準確地控 制在步驟 中的用于腐蝕的腐蝕時間。同時，就基底B1 (Btl)來說，去除部分Si層131的腐 蝕自動地停止在去除抵達氧化硅層的表面的時刻。所形成的孔的深度唯一地由所使用的Si 層厚度來決定。因此，所形成的底孔具有非常準確的深度。基底的另一實施例B2如圖15所示。在基底B2中，例如通過熱氧化，在Si平板141的一側僅表層部分變成氧化硅層 141a。在該氧化硅層141a上，形成預定厚度的材料層142，所述材料不與生物物質如DNA亞 磷酰胺T反應，并且不被在合成DNA中所使用的有機溶劑、酸溶液、堿溶液等腐蝕。通過整個 層142的厚度，預定直徑的孔23以預定陣列圖案的方式形成在氧化硅層141a的表面141b 上。在氧化硅層141a的表面141b上，以該順序形成硅烷層14和寡核苷酸(5T)的間 隔層135，所述寡核苷酸每個都為由硅烷層14和DNA亞磷酰胺T反應所形成的5個核苷酸 的單鏈DNA的鏈。就基底B2來說，能夠與DNA亞磷酰胺T反應的寡核苷酸(5T)間隔層135的表面 僅僅在孔23的底部暴露出來，以形成反應區(qū)。所有的其它部分為由不與DNA亞磷酰胺T反 應的材料組成的非反應區(qū)，盡管它沒有進行失活處理。此處，用于層142 (形成非反應區(qū))的材料例如單晶硅、不容易形成氧化物的金屬 如鉬、氮化物如氮化硅、沒有反應活性的官能團的塑料如聚乙烯和聚苯乙烯可以提及到。層 142可以通過以下膜形成方法來形成，如將如上述的材料連接到氧化硅層上、將如上述材料 真空沉積或者化學氣相沉積(CVD)在氧化硅層的表面上、氣相聚合單體。孔23可以例如通 過應用顯微光蝕刻和腐蝕來形成?；椎牧硪粚嵤├鼴3如圖16所示。在基底B3中，與基底B2的層相同的層142形成在玻璃平板151的表面上。通過層 142的整個厚度，抵達玻璃平板151的表面151a的孔152形成為底孔，僅僅在孔152的底部暴露的玻璃平板表面1513上，形成硅烷層14和寡核苷酸(5T)的間隔層135。就基底B3來說，寡核苷酸(5T)間隔層135的表面僅僅在孔152的底部151a處暴 露以形成反應區(qū)。底孔的側面和層142的表面形成非反應區(qū)，盡管它們沒有進行失活處理。基底的另一實施例B4如圖17所示。在基底B4中，預定直徑和深度的孔形成在由相同類型的材料組成的平板狀片161 的表面161a上，所述材料不與DNA亞磷酰胺T反應，并且不被在合成DNA中所使用的有機 溶劑、酸溶液、堿溶液等腐蝕。通過在孔的底部1623上形成氧化硅層163，然后在氧化硅層 163上以該次序形成硅烷層14和寡核苷酸(5T)間隔層，將這些孔制成底孔。還就基底B4來說，位于底孔的底部的寡核苷酸(5T)間隔層135僅僅是能與DNA亞 磷酰胺T反應的部分，而其它部分為非反應區(qū)。作為形成非反應區(qū)的材料，例如Si和碳化物如氮化硅可以提及。當使用平板狀的Si片時，通過應用干燥腐蝕如反應性的離子腐蝕或者離子研磨 (ion milling)、或者例如濕腐蝕，可以形成上述底孔。底孔可以形成如下通過應用SIMOX (通過注入氧來分隔)的方法使氧離子進入至Si平板表面以下的 位置，在從Si平板表面的一定深度處形成氧化硅層。然后，通過從Si平板表面到氧化硅層 形成孔，可以獲得底孔?？蛇x擇地，底孔可以形成如下Si平板的表面被一次氧化。然后，通過應用顯微 光蝕刻和腐蝕于所得到的氧化硅表面層，以預定的陣列圖案形成開口。然后，通過上述的 SIMOX方法，使氧離子進入至在開口處暴露的Si表面以下的位置，然后，氧化硅表面層通過 腐蝕來去除。作為結果，獲得如下結構，在所述結構中，恰好在開口的位置摻雜的氧化硅層 形成在從Si平板表面的一定深度處。然后，通過在開口的位置形成從Si平板表面到氧化 硅層的孔，可以獲得底孔。接著，使用本發(fā)明第一實施方式的生物芯片基底來制備生物芯片的方法將使用以 下實施例來描述，在所述實施例中，通過亞磷酰胺方法使探針DNA固定的DNA芯片是用如圖 9所示的基底B1來制備。首先，制備基底Bp如圖18中以簡化方式所示的，在以陣列排列在基底&上的每 個底孔13中，用DMT阻斷其末端的寡核苷酸(T5)間隔層135僅僅固定在底孔的底部。步驟Id1 對底孔進行樹脂掩蔽處理。具體地，在所排列的底孔中，除了那些應該與 DNA亞磷酰胺C (胞核嘧啶)進行化學反應的所有底孔例如填滿樹脂滴6。正如圖19所示，在填滿樹脂滴6的底孔中的寡核苷酸(5T)間隔層通過樹脂來阻 斷，而在未填滿樹脂滴6的底孔中的寡核苷酸(5T)間隔層處于其末端的DMT可以被消除的 狀態(tài)。步驟b2 通過將酸溶液如三氯乙酸均勻地供給在基底的整個上表面上進行脫除三 苯甲基(detritilation)處理。其結果如圖20中所示，在未填滿樹脂滴6的底孔中，從寡核苷酸(5T)間隔層上消 除DMT，所以那些寡核苷酸(5T)間隔層被激活。因此，在基底B1的表面上所排列的底孔中，僅有特定的孔(未填滿樹脂滴的孔)處 于能夠與DNA亞磷酰胺反應的狀態(tài)。
步驟b3 通過給基底表面供應有機溶劑，填滿底孔的樹脂滴被溶解和去除。其結果是如圖21中所示，在基底上所排列底孔的底部中，激活的寡核苷酸(5T)間 隔層和用DMT阻斷其末端的寡核苷酸(5T)間隔層暴露出來。步驟b4 通過將包含用DMT阻斷其末端的DNA亞磷酰胺C的試劑均勻地供給在基 底的整個表面上進行DNA耦合處理。其結果是如圖22中所示，在特定的底孔中，發(fā)生激活的寡核苷酸(5T)間隔層與所 供給的DNA亞磷酰胺C之間的合成反應，所以，寡核苷酸增長一個核苷酸，增長的寡核苷酸 的末端用DMT阻斷。同時，在其它的底孔中，暴露的寡核苷酸(5T)間隔層使其末端用DMT阻斷，所以， 它們是非活性的。因此，它們不與供給的DNA亞磷酰胺C反應。通過進行該DNA合成反應，在所述反應中，步驟Id1到b4形成一個循環(huán)，僅僅在未填 滿樹脂滴的底孔中，寡核苷酸在一個循環(huán)中增長一個核苷酸。同時，填滿樹脂珠的底孔保持 如同它們在開始該合成反應之前的狀況。有四種DNA亞磷酰胺T、A、C和G與寡核苷酸反應。因此，通過進行上述循環(huán)處理 四次，固定在底孔上的寡核苷酸可以增長一個核苷酸。這樣，具有設計序列的探針DNA可以僅固定在基底B1上的底孔的底部中。當使用基底B1來制備DNA芯片時，DNA合成反應僅僅發(fā)生在底孔的底部中，其它部 分根本不涉及合成反應。因此，例如即使在步驟1^中，填充底孔的樹脂滴溢出底孔，這根本 不影響DNA合成反應，除非樹脂流入鄰近的底孔中，所以對熒光標記物的讀取根本沒有反 作用。而且，在基底A的情況中所進行的失活處理(加帽)不再需要處理。在以上描述中，所有的基底Bi、B2、B3和B4都是用于DNA芯片的基底，在該基底上， 在基底Btl的氧化硅層表面上硅烷層的形成使探針DNA的合成反應能夠進行。然而，根據(jù)本發(fā)明第一實施方式的生物芯片基底并不限制于該類型。通過用于形 成底孔的底部(反應區(qū))的材料選擇為能夠將與待檢測的生物物質以特定方式結合的生物 物質固定的材料，可以制備不同種類的芯片。例如，如果以特定方式結合到待檢測生物物質的連接物質被固定在如圖8所示的 基本結構的基底Btl的氧化硅層表面上，連接物質所固定的部分能夠用作反應區(qū)，所述反應 區(qū)專用于與生物物質的反應。該情況中，基底的其它部分形成生物物質的非反應區(qū)，兩個區(qū) 域由明確的邊界分開。例如，當硅烷偶聯(lián)劑如氨丙基甲氧基硅烷或者具有官能團如環(huán)氧基、甲苯磺酰基、 激活的羰基、氨基、硫醇基或者溴氨基(bromoatoamido)的物質用作連接物質時，在其末端 有氨基、硫醇基、羥基、羰基、溴氨基(bromoatomamido)等的生物物質通過使用連接物質可 以固定在基底Btl的氧化硅層表面上。而且，通過將雙鏈DNA、蛋白質、肽、糖、RNA-蛋白質復合物或者糖-蛋白質復合物 用作生物物質，可以制備用于檢測轉錄因子(確定雙鏈DNA的特定堿基序列并且結合到生 物物質上)的芯片、用于檢測肽的芯片、用于檢測蛋白質的芯片、用于檢測糖的芯片、用于 消化蛋白質的芯片等。使用SOI晶片(由Shin-Etsu Chemical Co. Ltd.生產)作為原材料，具有如圖9 所示最終結構的基底B1通過在圖10-14中所示的方法來制備。
基底B1的說明如下尺寸=IcmXlcm;底孔的形狀直徑為300 μ m，深為20 μ m ；底孔在基底上以柵格 圖案方式排列，其中，9孔為一列，14孔為一排。硅烷層用5，6-環(huán)氧三乙氧基硅烷(5，6ipoxytriethoxysilane)來形成，寡核苷 酸間隔層通過使用DNA合成試劑(由Proligo Japan K. K.生產)的亞磷酰胺方法來形成。使用基底B1和應用亞磷酰胺方法，制備DNA芯片，其中，具有以下序列的探針DNA 在孔中合成。1.3' -ATCTCACACGTCAAATAG-5 ‘2. 3 ‘ -ATCTCACTCAAATAG-5‘3.3' -ATCTCACGCAAATAG-5 ‘4. 3 ‘ -ATCTCACCCAAATAG-5‘5. 3 ‘ -ATCTCACACAAATAG-5‘6. 3 ‘ -ATCTCACCAAATAG-5‘使用該DNA芯片，進行熒光標記的靶DNA檢測測試。圖23是顯示其結果的圖片。正如圖23中所看到的，相應于探針4的點的熒光強度最高。由此，證明靶DNA的 序列為 5' -TAGAGTGGGTTTATC-5‘。在2、3和4的每個探針中，位于序列中間的堿基產生錯配。在探針1中，堿基序列 太長，并產生錯配；而在探針6中，堿基序列太短，并產生錯配。為了比較，根據(jù)在日文公布的PCT申請No. 2002-537869中所公開的方法，具有如 圖7所示結構的基底A通過加帽處理來制備。使用基底A，DNA芯片以與在實施例中相同的方式來制備，在所述DNA芯片中，具有 上述6序列的探針DNA被固定。靶DNA檢測測試以與在實施例中相同的方式來進行，圖24所示的是其結果。 還有在DNA芯片中，相應于探針4的點的熒光強度最高。因此，也可從該DNA芯片， 證明靶 DNA 的序列為 5 ‘ -TAGAGTGGGTTTATC-5 ‘。應該注意的是，如圖24中所到的，在由基底A制備的DNA芯片上，圍繞在每個點的 部分是熒光顯色的，就是說，產生背底噪音，這使在熒光顯色的點和基底表面之間的界限不清楚。這由以下事實所引起，即當在制備基底的方法中孔填滿樹脂滴時，樹脂從孔溢出 至它們周圍部分，所以這些周圍部分沒有進行加帽。在相應于探針4的點中，每個點的中部的熒光顏色很弱。這由以下事實所引起，即 供給太少量的樹脂滴來填充孔。同時，作為整體每個點的熒光強度高，這是因為固定這些點 的探針DNA與靶DNA互相補充。與基底A相比，就基底B來說，所述基底B是本發(fā)明的第二實施方式的實施例，熒 光顯色點與基底表面之間的界限很清楚，幾乎不產生背底噪音。而且，每個熒光顯色的點顯示出均勻的熒光強度，測試的數(shù)據(jù)穩(wěn)定。(第三實施方式)參閱圖25和26，根據(jù)本發(fā)明第三實施方式的生物芯片基底有半導體基底15，第 一層13具有待羥基化的表面，它沉積在半導體基底15上，第二層11沉積在第一層13上。第二層 11 有許多孔 41a、41b、41c、41d、41e、41f、41g、41h、41i、42a、42b、42c、42d、42e、42f、 42g、42h、42i、43a、43b、43c、43d、43e、43f、43g、43h、43i、44a、44b、44c、44d、44e、44f、44g、 44h、44i、45a、45b、45c、45d、45e、45f、45g、45h、45i、46a、46b、46c、46d、46e、46f、46g、46h、 46i、47a、47b、47c、47d、47e、47f、47g、47h、47i、48a、48b、48c、48d、48e、48f、48g、48h、48i、 49a、49b、49c、49d、49e、49f、49g、49h、49i。41a_49i 的每個孔抵達第一層 13。而且，如圖25所示的第二層11有多個凹槽31a、31b、31c、31d、31e、31f、31g、 31h、31i、32a、32b、32c、32d、32e、32f、32g、32h、32i、33a、33b、33c、33d、33e、33f、33g、33h、 33i、34a、34b、34c、34d、34e、34f、34g、34h、34i、35a、35b、35c、35d、35e、35f、35g、35h、35i、 36a、36b、36c、36d、36e、36f、36g、36h、36i、37a、37b、37c、37d、37e、37f、37g、37h、37i、38a、 38b、38c、38d、38e、38f、38g、38h、38i、39a、39b、39c、39d、39e、39f、39g、39h 勾畫在第二層 11 上。每個凹槽 31a-39h 連接到 41a-41i、42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a_46i、 47a-47 i、48a-48 i、49a_49 i，用相同的溶液填滿孔 41 a_49 i。第一層13由二氧化硅(SiO2)組成，第二層11由不同于第一層13的材料組成。例 如，第二層11由結晶硅組成。第一層13比第二層11具有更高的親水性，因此，第一層13 與第二層11相比容易羥基化。參閱圖26和27，凹槽31a連接孔41a和孔41b。類似地，每個其它凹槽31b_31i、 32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h 連接孔 4lb-41i、42a-42i、43a-43i、44a_44i、45a-45i、46a_46 i、47a-47i、48a_48 i、49a_49 i。在圖26中，每個生物分子層91a、91b、91c、91d、91e、91f、91g、91h、91i都沉積在由 41a-41i每個孔所顯露的第一層13的表面上。在91a_91i每個生物分子層，通過在第一層 13上探針生物分子中的官能團與羥基(-0H)之間形成共價鍵，許多探針生物分子共價鍵連 到第一層13。每個“探針生物分子”可以涉及脫氧核糖核酸(DNA)鏈、核糖核酸(RNA)鏈、 肽核酸核糖核酸(PNA)鏈或者蛋白質。在探針生物分子是DNA鏈、RNA鏈或者PNA鏈的情 況中，每個探針生物分子序列設計成與靶生物分子互補。圖28描述了在生物分子層91a的 DNA鏈共價鍵連到第一層13。應該注意的是，第三實施方式不限于每個生物分子層91a_91i直接沉積在第一層 13上的情況。參考圖29，許多硅烷膜81a、81b、81c、81d、81e、81f、81g、81h、81i沉積在由 41a-41i每個孔所顯露的第一層13上。在81a_81i每個硅烷膜中，多個硅烷偶聯(lián)劑在第一 層13上形成基質(matrix)。參看圖30，共價鍵由在每個硅烷偶聯(lián)劑中的甲氧基(-OCH3)與 羥基的酸_堿反應形成在第一層13上。例如，3-縮水甘油醚丙基三甲氧基硅烷、3-縮水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基 硅烷、3-縮水甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷、N-2 (氨乙基)3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷、 N-2 (氨乙基)3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷可以用于每個硅烷偶聯(lián)劑。再參看圖29，每個生物分子層91a、91b、91c、91d、91e、91f、91g、91h、91i沉積在每 個硅烷膜81a-81i上。在每個生物分子層91a-91i與每個硅烷膜81a_81i之間的界限中， 氨鍵(-NH-C0-)由引入到每個探針生物分子的活性酯與例如圖30中所示的硅烷偶聯(lián)劑的 每個氨基(-NH2)之間的反應來形成。而且，每個硅烷偶聯(lián)劑與每個探針生物分子之間通過使用交聯(lián)劑的連接是可 選擇的。蛋白質如受體、配體、拮抗物、抗體和抗原包含官能團如在賴氨酸(Lys)中的氨基(-NH2)、在天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(GIu)中的羰基、在酪氨酸(Tyr)中的酚基 (-C6H4 (OH))、在組氨酸(His)中的咪唑基(-C3H3N2)和在半胱氨酸中的硫醇基(-SH)。因此， 對兩端的氨基為反應活性的交聯(lián)劑如辛二酸二琥珀酰亞胺酯(DSS)、辛二酸二磺基琥珀酰 亞胺酯(BS3)、二甲基辛二酸亞安酯·鹽酸(DMS)、戊二酸二琥珀酰亞胺酯(DSG)、Loman試 劑、3，3' -二硫代[丙酸磺基琥珀酰亞胺酯](DTSSP)、乙二醇二 [琥珀酸琥珀酰亞胺酯]可 以用于連接探針生物分子和硅烷偶聯(lián)劑。還有，對氨基和羰基為反應活性的交聯(lián)劑如ι-乙 基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳酰二亞胺鹽酸鹽(EDC)可以使用。
進一步地，對氨基和硫醇基為反應活性的交聯(lián)劑如間-馬來酰亞胺基苯甲 基-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、琥珀酰亞胺4-[N-馬來酰亞胺基甲基]-環(huán)己胺-1-羧酸酯 (SMCC)、4_對-馬來酰亞胺基苯基-丁酸琥珀酰亞胺酯(SMPB)、N-琥珀酰亞胺3-[2_吡啶基 二硫]丙酸酯(SPDP)、Ν-[ γ -馬來酰亞胺基氧化丁酰]琥珀酰亞胺磺酸酯(Sulfo-GMBS)、 磺基琥珀酸亞胺6-[3' -(2-吡啶基二硫)_丙酰胺]己酸酯(Sulfo-LC-SPDP)、間-馬來 酰亞胺基苯甲基-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(Sulfo-MBS)、磺基琥珀酰亞胺4-[N-馬來酰亞 胺基甲基]-環(huán)己胺-1-羧酸酯(Sulf0-SMCC)、4_對-馬來酰亞胺基苯基-丁酸磺基琥珀 酰亞胺酯(Sulfo-SMPB)、可以用于連接探針生物分子和硅烷交聯(lián)劑。在圖31中，硅烷交聯(lián)劑的每個氨基和抗體95a，95b，95c的每個氨基與DSS偶聯(lián)。在圖25 中所示的每個其它孔 42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a-46i、 47a-47i、48a-48i、49a-49i的截面圖與圖26或者圖28相類似。應該注意的是，二氧化硅玻璃也可以用作圖26和圖29中的第一層13。在這種情 況中，半導體基底15可以被排除。還有，樹脂如聚四氟乙烯和不溶解的環(huán)氧抗蝕劑可以用 于第二層11。圖25-31中所示的生物芯片基底的表面覆蓋有如圖32和33中所示的蓋板25。蓋 板25有開口 27、28、蓋板由例如熔合的二氧化硅、丙烯酸樹脂和聚碳酸酯組成。圖34所圖 示的是在蓋板25沉積在如圖25所示的生物芯片基底上的情況中的截面圖。當通過生物芯片基底進行雜交測試時，制備含有用熒光染料如Cy3或者Cy5標記 的許多樣品生物分子的樣品溶液。該樣品溶液可以分配到開口 27中。通過抽吸開口 28的 空氣，如圖34所示的每個孔41a-41i和每個31a_31i依次填滿樣品溶液。而且，如圖25所 示的每個其它孔 42a-42 i、43a-43 i、44a_44i、45a_45 i、46a_46 i、47a_47 i、48a_48 i、49a_49 i 和每個其它凹槽 32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h 也依次填滿樣品溶液。在樣品生物分子含有許多靶生物分子的情況中，所述靶生物分子與在生物分子 層91a-91i中的探針生物分子補充結合，靶生物分子可以誘捕在生物分子層91a-91i上。 抽吸樣品溶液以后，孔 41 a-41 i、42a-42 i、43a-43 i、44a_44i、45a_45 i、46a_46 i、47a_47 i、 48a-48i、49a-49i 和凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a_36i、 37a-37i、38a-38i、39a-39h用緩沖溶液洗凈。此后，通過觀察熒光反應，可能能檢測樣品 生物分子是否包含靶生物分子。在每個孔41a-41 i、42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、 46a-46i、47a-47i、48a_48i、49a_49i的直徑大于600 μ m的情況下，熒光反應肉眼可見。如以上所述，由于如圖25-34所示的生物芯片基底具有勾畫在第二層11上的孔 41a-41i、42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a-46i、47a-47i、48a-48i、49a-49i andthe grooves 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a_38i、 39a-39h，可能能消除在生物芯片基底上的蓋板25的精確隊列。而且，所需要樣品溶液的 體積等于孔 41a-41i、42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a-46i、47a-47i、48a-48i、 49a-49i 和凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a_37i、 38a-38i、39a-39h的總體積。因此，減少樣品體積是可能的。還有，凹槽31a-31i、32a-32i、 33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h 可以排除以下需求，即 用樣品溶液通過點樣儀器來填滿每個孔41 a-41 i、42a-42 i、43a-43 i、44a_44i、45a_45 i、 46a-46 i、47a-47 i、48a_48 i、49a_49 i。因此，縮短雜交測試的時間是可能的。接著參看圖35-56，描述用于制備第三實施方式的生物芯片基底的方法。在圖35中，制備SOI (硅在絕緣體上)基底，所述基底具有半導體基底15，第一層 13由SiO2組成，并沉積在半導體基底15上，第二層11有結晶硅組成，并沉積在第一層13 上，自然形成的氧化物膜12沉積在第二層11上。然后，抗蝕劑21通過旋涂機涂覆在自然 形成的氧化物膜12上，如圖36所示。部分抗蝕劑21通過使用顯微光蝕刻方法來選擇性地腐蝕。從而，多個開口 51a、 51b、51c、51d、51e、51f、51g、51h、51i形成在抗蝕劑21上，如圖37所示。此后，被開口 51a-51i所顯露的自然形成的氧化物膜12和部分第二層11被選擇性地腐蝕。因此，凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h 勾畫在 第二層11上，如圖38和39所示。在圖40中，抗蝕劑22通過旋涂機涂覆在自然形成的氧化物膜12上。此后，部分抗 蝕劑22通過使用顯微光蝕刻方法被選擇性地腐蝕。因此，許多開口 61a、61b、61C、61d、61e、 61f、61g、61h、61i形成在抗蝕劑22上，如圖41所示。此后，被開口 61a_61i所顯露的自然 形成的氧化物膜12和部分第二層11被選擇性地腐蝕，直到第一層13顯露出來。因此，孔 41a-41i勾畫在第二層11上，如圖42所示。SOI基底在室溫條件下浸入攪拌的氫氧化鈉溶液兩小時。氫氧化鈉溶液通過混和 98g的氫氧化鈉、294ml的蒸餾水和392ml的乙醇來制備。通過將SOI基底浸入到氫氧化鈉 溶液中，在第二層11上的自然形成的氧化物膜12被去除，如圖43所示。而且，被孔41a-41i 所顯露的第一層13的部分表面被羥基化。因此，許多個羥基(-0H)引入到第一層13的部 分表面上，如圖44所示。具有環(huán)氧基的硅烷偶聯(lián)劑如3-縮水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷、3-縮水 甘油醚氧基丙基三乙氧基硅烷或者具有氨基的硅烷偶聯(lián)劑如N-2 (氨乙基)3-氨丙基三乙 氧基硅烷和3-氨丙基三甲氧基硅烷分配在被孔41a-41i所顯露的第一層13部分表面上， 如圖43所示。因此，硅烷膜81a、81b、81c、81d、81e、81f、81g、81h、81i形成在第一層13上， 如圖45所示。當3-氨丙基三甲氧基硅烷滴在第一層13上時，許多氨基(-NH2)引入在第 一層13的表面上，如圖46所示。此后，在第一層13上的剩下的自由羥基(-0H)被加帽，防 止參加其余的合成反應。例如，剩下的自由羥基(-0H)通過乙酸酐和1-甲基咪唑(四氫呋 喃溶液)來乙?；?。制備包含具有活性酯的第一核苷的溶液。每個第一核苷在5'-羥基端用二甲氧 基三苯甲基(DMTr)來阻斷。在第一核苷的每個堿基中，腺嘌呤或者胞核嘧啶的氨基使用苯 甲酰基來保護，鳥嘌呤的氨基用異丁基來保護，如圖47所示。含有第一核苷的溶液分配在硅烷膜81a上，如圖46所示。因此，第一核苷的每個活性酯與硅烷偶合劑的每個氨基反應， 形成氨鍵(-NH-CO-)，如圖48所示。此后，第一核苷的每個DMTr被3%的在二氯甲烷(DCM) 中的三氯乙酸來去除。在圖49中，5'羥基(-0H)是在每個第一核苷上唯一的反應性基團。 包含四唑和許多亞磷酰胺的溶液分配在硅烷膜81a-81i上，所述亞磷酰胺是如圖50所示的 另一核苷的的衍生物。在圖51中，第一核苷的每個活性5'羥基(-OH)和第二核苷的每個 N,N- 二異丙基胺通過縮合反應來形成不穩(wěn)定的亞磷酸鹽的連接。此后，第一核苷的非結合 的活性5'-羥基(-OH)通過加入乙酸酐和1-甲基咪唑到第一層13上來乙?；?為了使不穩(wěn)定的亞磷酸鹽連接變得穩(wěn)定，稀釋的碘在水、嘧啶和四氫呋喃中的溶 液加入到第一層13。在圖52中，不穩(wěn)定的亞磷酸鹽連接被氧化，形成更多穩(wěn)定的磷酸鹽連 接。此后，第二核苷的每個DMTr被去除，重復該濃縮反應，直到鏈延長完成，如圖53所示。在圖54中，保護磷酸鹽連接的每個氰乙基被濃縮氨劈開。還有，每個雜環(huán)保護基 團如圖47所示的苯甲?；彤惗』粷饪s氨劈開，每個雜環(huán)伯胺被去保護，如圖55所示。 而且，在很末尾的堿基上的每個DMT被劈開，如圖56所示。用圖48-56所解釋的方法也可 以在如圖45所示的硅烷膜81b-81i上處理，形成生物分子層91a-91i，如圖29所示。如上所述，用于制備根據(jù)第三實施方式的生物芯片基底的方法涉及用氫氧化鈉溶 液處理SOI基底。因此，羥基(-0H)僅僅引入到第一層的表面上。還有，在第二層11由Si 組成的情況中，自然形成的氧化物膜12的厚度通常為2nm或者更低。氫氧化鈉溶液在室溫 條件下經過兩個小時有效地去除這種自然形成的氧化物膜12。因此，后來加入的硅烷偶聯(lián) 劑僅僅與第一層13上的羥基(-0H)反應，并不結合到第二層11的表面上。在早期的方法 中，硅烷偶聯(lián)劑可以與剩余的自然形成的氧化物膜12反應。因此，用熒光染料標記的靶生 物分子也可以固定在自然形成的氧化物膜上。在自然形成的氧化物膜上的這種固定的靶生 物分子產生背底噪音。特別是在微觀分析中，渴望開發(fā)出以下方法，所述方法僅僅將靶生物 分子固定在孔 41 a-41 i、4lb-41 i、42a-42i、43a-43i、44a_44i、45a_45i、46a_46i、47a_47 i、 48a-48i、49a-49i的底部，并防止靶生物分子結合到第二層11的表面，這是因為該方法改 進了在熒光分析中的對比度。用于制備生物芯片基底的方法滿足該要求，因為羥基(-0H) 僅僅引入在第一層13的表面上，自然形成的氧化物膜12被去除掉第二層11的表面。因此， 制備可以排除背底噪音的生物芯片基底是可能的。圖57(a)所示的是實施例的顯微照片，當如圖25所示的孔41a-42i、42a_42i暴露 在包含樣品DNA的樣品溶液中，所述樣品DNA用熒光染料標記，并具有與固定在如圖28所 示的生物分子層91a上的DNA序列互補的序列。圖57 (b)所示的是實施例的顯微照片，當 如圖27所示的早期的生物芯片基底暴露在樣品DNA中，所述樣品用熒光染料來標記，并具 有與在基底上的序列互補的序列。在早期的基底中，樣品DNA不僅與孔的底部結合，而且在 其它區(qū)域結合。還有，在孔的底部探測到污染物。然后，根據(jù)第三實施方式的生物芯片基底 使靶DNA僅僅在如圖57(a)所示的孔的底部上雜交稱為可能。還有，實現(xiàn)了在孔上熒光的 均勻性。在圖37-42 中，凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a_36i、 37a-37i、38a-38i、39a-39h 提前勾畫在第二層 11 上，然后，孔 41a-41i、41b_41i、42a_42i、 43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a-46i、47a-47i、48a-48i、49a-49i 勾畫在第二層 11 上。相 反地，應該注意的是，提前形成孔 41a-41i、41b-41i、42a-42i、43a-43i、44a-44i、45a-45i、46a-46i、47a_47i、48a_48i、49a_49i，然后形成凹槽 3la_31 i、32a_32i、33a_33i、34a_34i、 35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h也是可以選擇的。然而，由于每個凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h 的深 度比每個孔 41a-41i、41b-41i、42a-42i、43a-43i、44a-44ix、45a-45i、46a-46i、47a-47i、 48a-48i、49a-49i 的深度更淺，提前形成凹槽 31a_31i、32a-32i、33a-33i、34a_34i、 35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h使在第二層11上均勻地涂覆抗蝕劑更容易。還有，在圖45-56中，生物分子層91a_91i在硅烷膜81a_81i形成在第一層13上 之后形成。然而，在沒有硅烷膜81a-81的情況下，在第一層13上將生物分子與羥基連接， 并且形成共價鍵連也是可以選擇的。進一步地，盡管制備如圖35所示的SOI基底，通過使用包含玻璃基底和聚四氟乙 烯基底的層壓板制備生物芯片基底，也是可行的。在該情況中，玻璃基底用作第一層13，聚 四氟乙烯基底用作第二層11。(第三實施方式的第一次修改)用于制備生物芯片基底的方法并不限制于上述的第三實施方式。參看圖58-62，描 述了用于通過使用環(huán)氧負性抗蝕劑來制備生物芯片基底的方法。在圖58中，由環(huán)氧負性光抗蝕劑組成的第一抗蝕劑111通過例如旋涂機涂覆在由 玻璃組成的第一層上。此后，制備如圖59所示的第一光掩模40。第一光掩模40有許多光 屏蔽圖案140a、140b、140c。光屏蔽圖案140a-140c符合在第一抗蝕劑111上待制備孔的形 狀。然后，光照射在第一光掩模40上，部分第一抗蝕劑111暴露在光中。在圖60中，由環(huán) 氧負性光抗蝕劑組成的第二抗蝕劑211通過旋涂機涂覆在第一抗蝕劑111上。因此，第一 抗蝕劑111和第二抗蝕劑211形成第二層11。在圖61中，制備第二光掩模50。第二光掩 模50有光屏蔽圖案150。光屏蔽圖案150符合在第二層11上所形成的孔和凹槽的形狀。 然后，光照射在第二光掩模50上，部分第二抗蝕劑211暴露在光中。烘烤暴露的第一抗蝕劑111和暴露的第二抗蝕劑211。應該注意的是，無掩蔽的烘 烤使第一抗蝕劑111和第二抗蝕劑211不溶解于緩沖溶液中。此后，第一抗蝕劑111和第二 抗蝕劑211用堿性顯影劑來顯影。因此，孔41a-41i和凹槽31a-31i形成在第二層11上， 如圖62所示。隨后，實施由圖44-56所解釋的方法，用于制備生物芯片基底的方法完成。(第三實施方式的第二次修改)參看圖63和圖64，根據(jù)本發(fā)明第三實施方式的第二次修改的生物芯片基底與在 圖25和圖26中所示的基底不同，在圖25和圖26中所示的基底沒有勾畫在第二層11上的 凹槽 31a-31i、32a-32i、33a-33i、34a-34i、35a-35i、36a-36i、37a-37i、38a-38i、39a-39h。 接著參看圖65和圖66，根據(jù)第三實施方式的第二次修改的蓋板125不同于在圖32和圖 33中所示的蓋板25，在圖32和圖33中所示的蓋板25存在有如圖65和圖66所示的凹槽 300。在蓋板125放置在圖63和圖64所示的基底上的情況中，凹槽300連接到孔41a_41i、 4lb-41i、42a-42i、43a-43i、44a_44i、45a_45i、46a_46i、47a_47i、48a_48i、49a_49i。圖 67 描述了以下情況中的截面圖，在所述情況中，在圖65中所示的蓋板25沉積在如圖63所示 的生物芯片基底上。分配到開口 27中的樣品溶液可以填滿孔41a。此后，樣品溶液流過凹 槽300，依次填滿孔41b-41i。因此，類似于第三實施方式，如圖63所示的生物芯片基底和 如圖所示的蓋板25使減少樣品溶液的體積稱為可能。
該申請基于并要求2004年7月8號提出的歐洲專利申請04291742. 7的優(yōu)先權，該專利申請的整個內容此處引入作為參考。工業(yè)適用性正如由用于合成探針DNA的基底的描述所清楚的，在本發(fā)明的生物芯片基底中， 用于合成生物物質的反應區(qū)和非反應區(qū)之間的界限是相當?shù)厍宄?。因此，用該基底制備?生物芯片使穩(wěn)定地和以高準確性檢測待檢測的生物物質成為可能。而且，在本發(fā)明基底的情況中，形成反應區(qū)的位點在制備基底的過程中通過顯微 光蝕刻和腐蝕來形成。這增加了形成過程的自由度，并能夠形成精細圖案，因此，能夠高密 度地形成反應區(qū)。而且，由于制備方法不需要包括用樹脂滴填滿底孔，然后進行失活處理的 的步驟，降低了整個生產成本。作為用于制備DNA芯片、RNA芯片、蛋白質芯片、抗體芯片、糖鏈固定芯片、生物反 應器等的基底，該生物芯片基底具有大的工業(yè)價值。
權利要求
一種用于制備生物芯片基底的方法，其包括在布置在第一層上的第二層中形成凹槽，以及在所述第二層中形成多個孔，所述多個孔抵達所述第一層，其中，所述第一層在所述多個孔的每個孔底部被暴露出來并且所述第一層所述多個孔的每個孔底部被羥基化，其中，所述凹槽被配置以連接所述多個孔，其中，所述凹槽的深度淺于所述多個孔的每個孔深度，其中，所述孔和所述凹槽覆蓋有蓋板，以及其中，所述被暴露的第一層被生物分子所修飾。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，該方法進一步地包括將第二層浸入氫氧化鈉溶 液，去除在第二層上自然形成的氧化物膜。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，該方法進一步地包括將許多探針生物分子的每 個與每個羥基基團連接。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中，每個探針生物分子與每個羥基連接進一步地包 括將硅烷偶聯(lián)劑與每個羥基結合。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物芯片基底和制造生物芯片基底的方法，該方法包括在布置在第一層上的第二層中形成凹槽；以及在所述第二層中形成多個孔，所述多個孔抵達所述第一層，其中，所述第一層在所述多個孔的每個孔底部被暴露出來并且所述第一層所述多個孔的每個孔底部被羥基化，所述凹槽被配置以連接所述多個孔，所述凹槽的深度淺于所述多個孔的每個孔深度，所述孔和所述溝槽覆蓋有蓋板，以及所述被暴露的第一層被生物分子所修飾。
文檔編號B01L3/00GK101884898SQ20101022079
公開日2010年11月17日 申請日期2004年12月16日 優(yōu)先權日2004年7月8日
發(fā)明者五所尾康博, 小原大輔, 山崎信介, 弗朗索瓦斯·維內, 石川尚弘, 黑巖孝朗 申請人:株式會社山武