專利名稱：一種膽固醇氧化酶親和介質(zhì)及其合成和大規(guī)模純化膽固醇氧化酶方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及診斷用酶生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，具體是指一種膽固醇氧化酶親和介質(zhì)及其合成和大規(guī)模純化膽固醇氧化酶方法。
背景技術(shù)：
膽固醇氧化酶(cholesterol oxidase, EC 11. 3. 6)簡(jiǎn)稱C0D，是膽固醇降解代謝過(guò)程中的第一個(gè)酶，能專一性地催化底物膽固醇生成膽留-4-烯-3-酮。微生物是膽固醇氧化酶最為主要的來(lái)源，其在臨床診斷、食品加工、生物制藥、生物化學(xué)和抗蟲(chóng)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。如利用膽固醇氧化酶測(cè)定血清中膽固醇的含量就成了臨床診斷中一個(gè)重要的參考指標(biāo)。在食品工業(yè)中利用膽固醇氧化酶酶法相較物理、化學(xué)法降解膽固醇而言，具有效率高毒副作用低的優(yōu)勢(shì)；同時(shí)其氧化產(chǎn)物在醫(yī)藥領(lǐng)域也有很好的應(yīng)用前景。Brevibacterium (短桿菌)，Streptomyces spp.(鏈霉菌)，Corynebacterium (棒狀桿菌)，Arthrobacter (節(jié)桿菌)，Pseudomonas (假單胞菌)禾口 Rhodococcus (紅球菌) 等微生物都可以生產(chǎn)膽固醇氧化酶。目前，多種膽固醇氧化酶基因已經(jīng)被克隆，并轉(zhuǎn)入 E. coli (大腸桿菌)等基因工程菌進(jìn)行表達(dá)。然而膽固醇氧化酶的分離純化步驟通常包括了多步的硫酸銨沉淀，表面活化劑處理，熱處理，離子交換層析，分子篩層析等。而過(guò)多的純化步驟，導(dǎo)致了純化時(shí)間較長(zhǎng)，蛋白和活性回收率較低的結(jié)果。為了大規(guī)模工業(yè)化地生產(chǎn)膽固醇氧化酶，必須減少分離純化的步驟。因此，需要提供一種快速高效的膽固醇氧化酶分離方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種膽固醇氧化酶親和介質(zhì)及其合成和大規(guī)模純化膽固醇氧化酶方法，利用該膽固醇氧化酶親和介質(zhì)可以大規(guī)?？焖俜蛛x純化膽固醇氧化酶，可在僅用一步親和層析的情況下，得到膽固醇氧化酶純品，整個(gè)純化步驟消耗時(shí)間段，蛋白和活性回收率較高，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種膽固醇氧化酶親和介質(zhì)，其特點(diǎn)是，所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)由膽固醇氧化酶親和配體和層析介質(zhì)連接而成。較佳地，所述膽固醇氧化酶親和配體是核黃素，所述層析介質(zhì)是^^11虹0^、殼聚糖或聚苯乙烯。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種上述的膽固醇氧化酶親和介質(zhì)的合成方法，其特點(diǎn)是，將所述膽固醇氧化酶親和配體和所述層析介質(zhì)通過(guò)三聚氯氰與乙二胺作為間隔臂進(jìn)行連接。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種利用上述的膽固醇氧化酶親和介質(zhì)大規(guī)模純化膽固醇氧化酶的方法，其特點(diǎn)是，將含有膽固醇氧化酶的溶液流經(jīng)所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)進(jìn)行親和吸附，然后采用清洗液沖洗所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)，最后用洗脫緩沖液洗脫所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)上吸附的膽固醇氧化酶，從而純化膽固醇氧化酶。較佳地，所述的含有膽固醇氧化酶的溶液是采用基因工程方法獲得的膽固醇氧化酶表達(dá)液。更佳地，所述膽固醇氧化酶表達(dá)液是采用來(lái)自于Brevibacterium sterolicum的膽固醇氧化酶基因，并由hcherichia coli BL21(DE3)表達(dá)得到。通常培養(yǎng)液需經(jīng)過(guò)離心和超聲破碎處理，破碎后再進(jìn)行離心去沉淀。較佳地，所述膽固醇氧化酶親和配體是核黃素，所述層析介質(zhì)是^^11虹0^、殼聚糖或聚苯乙烯。較佳地，所述親和吸附的條件為pH值7. 5 8. 0，電導(dǎo)率為2 5mS/cm。較佳地，采用清洗液沖洗所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)的清洗條件為pH值7. 5 8. 0，電導(dǎo)率 5 10ms/cm。較佳地，用洗脫緩沖液洗脫所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)上吸附的膽固醇氧化酶的洗脫條件為pH值7. 5 8. 0，電導(dǎo)率40 80ms/cm。本發(fā)明的有益效果具體如下1、本發(fā)明通過(guò)采用FAD片段核黃素作為膽固醇氧化酶親和配體，與層析介質(zhì)連接合成膽固醇氧化酶親和介質(zhì)，可快速高效純化膽固醇氧化酶，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用；2、本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化蛋白質(zhì)吸附條件使得膽固醇氧化酶的純化效率顯著增加，具有較大工業(yè)應(yīng)用潛力，體現(xiàn)出較大的經(jīng)濟(jì)效益。


圖1是本發(fā)明的膽固醇氧化酶親和介質(zhì)的一具體實(shí)施例的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是以kpharose-核黃素為膽固醇氧化酶親和介質(zhì)時(shí)pH值對(duì)膽固醇氧化酶吸附量的影響。圖3是中性條件下為膽固醇氧化酶親和介質(zhì)kpharose-核黃素對(duì)膽固醇氧化酶的吸附量。圖4是以kpharose-核黃素為膽固醇氧化酶親和介質(zhì)時(shí)洗脫緩沖液對(duì)膽固醇氧化酶回收率的影響。圖5是以聚殼聚糖-核黃素為膽固醇氧化酶親和介質(zhì)時(shí)PH值對(duì)膽固醇氧化酶吸附量的影響。圖6是中性條件下為膽固醇氧化酶親和介質(zhì)聚殼聚糖-核黃素對(duì)膽固醇氧化酶的吸附量。圖7是以聚殼聚糖-核黃素為膽固醇氧化酶親和介質(zhì)時(shí)洗脫緩沖液對(duì)膽固醇氧化酶回收率的影響。圖8是以D840-核黃素為膽固醇氧化酶親和介質(zhì)時(shí)pH值對(duì)膽固醇氧化酶吸附量的影響。圖9是中性條件下為膽固醇氧化酶親和介質(zhì)D840-核黃素對(duì)膽固醇氧化酶的吸附量。圖10是以D840-核黃素為膽固醇氧化酶親和介質(zhì)時(shí)洗脫緩沖液對(duì)膽固醇氧化酶回收率的影響。
具體實(shí)施例方式為了能夠更清楚地理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，特舉以下實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明。下述實(shí)施例1 -3和對(duì)比例1 -3所用的膽固醇氧化酶溶液的制備將來(lái)自于Brevibacteriumsterolicum的膽固醇氧化酶基因在大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3)中進(jìn)行表達(dá)從而表達(dá)出膽固醇氧化酶，取20ml培養(yǎng)的大腸桿菌菌液，加入20ml 破碎緩沖液(pH 7. 8，電導(dǎo)率2 5ms/cm)，超聲破碎，功率400w，超聲k間隔ls，共超聲 99個(gè)循環(huán)。取破碎液12000rpm離心15min，取上清使用。涉及的采用清洗液為沖洗所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)的清洗條件為pH值7. 5 8. 0，電導(dǎo)率 5 10ms/cm。實(shí)施例1 :kphar0Se-核黃素的合成及應(yīng)用Sepharose CL 4B(100g)用10倍體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于 50ml活化緩沖液(0. 8MNa0H，20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷)40°C搖床震蕩2.釙，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過(guò)每次10倍體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，在抽干成濕餅狀。SKWkpharose CL 4B介質(zhì)懸浮于500ml0. IM NaOH溶液，加入20ml乙二胺溶液，凝膠在攪拌OOOrpm)下30°C恒溫12h。用去離子水清洗。NH2-Sepharose CL 4B 懸浮在350ml 50% (ν/ν)冰浴丙酮溶液中，隨后將4g三氮嗪溶于80ml-20°C預(yù)冷丙酮，快速加入介質(zhì)懸浮液，實(shí)時(shí)檢測(cè)PH值，用飽和NaHCO3將pH維持在6. 5-7. O之間，反應(yīng)溫度維持在0-4°C繼續(xù)攪拌2-4h，至白色消失，混合物呈透明狀停止反應(yīng)。用3倍介質(zhì)體積的丙酮， 丙酮去離子水(1 1)，去離子水，順序洗滌反應(yīng)，得二氯三氮嗪-氨基-S^harose CL4B。 稱取40g 二氯三氮嗪-氨基-S^harose CL 4B，稱取IOg核黃素，溶解于80ml去離子水中， 50-60°C振蕩Mh，反應(yīng)過(guò)程中時(shí)常檢查pH，用IMNaOH使溶液保持在11-12之間。反應(yīng)完畢， 用500ml去離子水充分洗滌，抽干。(1)最佳吸附pH值的確定取膽固醇氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水稀釋至濃度為600 μ g/ml，分為6組，每組溶液調(diào)節(jié)PH值為3. 8，4. 7，6. 3，7. 4，7. 8，8. 7，9. 6體積1ml，分別加入0. Olg濕介質(zhì)，4°C充分振蕩池后，測(cè)定上清膽固醇氧化酶濃度，計(jì)算介質(zhì)的吸附量，選擇最佳吸附的pH值。初始膽固醇氧化酶 0. 6mg/l，在不同pH值下與介質(zhì)充分振蕩池后，大量膽固醇氧化酶被親和介質(zhì)吸附，上清中的含量降低，吸附量與PH值關(guān)系見(jiàn)圖2。較佳吸附條件為， 溫度為4°C，pH為7. 5-8. 0，電導(dǎo)率為2 5mS/cm。最佳吸附條件為，溫度為4°C，pH為7. 8， 電導(dǎo)率為2 5ms/cm。(2)介質(zhì)最大吸附量的確定在pH值優(yōu)化的基礎(chǔ)上，確定介質(zhì)的最大吸附量。取膽固醇氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水稀釋至濃度為 100，200，300，400，500，600，700，800，900 μ g/ml，調(diào)節(jié) pH 值為 7. 8，分別加入0. Oig濕介質(zhì)，4°C充分振蕩ai后，測(cè)定上清膽固醇氧化酶濃度，計(jì)算介質(zhì)的最大吸附量。吸附量與上清蛋白濃度關(guān)系，見(jiàn)圖3，計(jì)算單位介質(zhì)最大吸附量為74. 5mg/g介質(zhì)。(3)最佳洗脫條件的確定在培養(yǎng)吸附條件和最大吸附量的基礎(chǔ)上，考察洗脫液離子強(qiáng)度對(duì)洗脫結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖中可見(jiàn)，較佳洗脫調(diào)節(jié)為pH值7. 5 8. 0，電導(dǎo)率40 80mS/cm ；最適洗脫條件為PH值為7. 8，電導(dǎo)率60mS/Cm。對(duì)比例1 :kphar0Se-光黃素的合成及應(yīng)用Sepharose CL 4B(100g)用10倍體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于 50ml活化緩沖液(0. 8M NaOH，20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷)40°C搖床震蕩2.釙，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過(guò)每次10倍體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，在抽干成濕餅狀。SKWkpharose CL 4B介質(zhì)懸浮于500ml0. IM NaOH溶液，加入20ml乙二胺溶液，凝膠在攪拌OOOrpm)下30°C恒溫12h。用去離子水清洗。NH2-kphar0Se CL 4B懸浮在350ml 50% (ν/ν)冰浴丙酮溶液中，隨后將4g三氮嗪溶于80ml-20°C預(yù)冷丙酮， 快速加入介質(zhì)懸浮液，實(shí)時(shí)檢測(cè)PH值，用飽和NaHC03將pH維持在6. 5-7. O之間，反應(yīng)溫度維持在0-4°C繼續(xù)攪拌2-4h，至白色消失，混合物呈透明狀停止反應(yīng)。用3倍介質(zhì)體積的丙酮，丙酮去離子水(1 1)，去離子水，順序洗滌反應(yīng)，得二氯三氮嗪-氨基-S印harose CL4B。稱取40g 二氯三氮嗪-氨基-S^harose CL4B，稱取IOg光黃素(或光色素)，溶解于80ml去離子水中，50-60°C振蕩Mh，反應(yīng)過(guò)程中時(shí)常檢查pH，用IM NaOH使溶液保持在 7. 5-8. 0之間。反應(yīng)完畢，用500ml去離子水充分洗滌，抽干。采用kpharose-光黃素進(jìn)行最佳吸附pH值的確定、介質(zhì)最大吸附量的確定及最佳洗脫條件的確定，實(shí)驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例1中相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，結(jié)果顯示kpharose-光黃素基本無(wú)吸附能力。采用kpharose-光色素進(jìn)行最佳吸附pH值的確定、介質(zhì)最大吸附量的確定及最佳洗脫條件的確定，實(shí)驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例1中相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，結(jié)果顯光黃素基本無(wú)吸附能力。實(shí)施例2 聚殼聚糖-核黃素的合成及應(yīng)用聚殼聚糖(IOOg)用10倍體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于50ml活化緩沖液(0. 8MNa0H，20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷)40°C搖床震蕩2. 5h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過(guò)每次10倍體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，在抽干成濕餅狀。SKWkpharose CL4B介質(zhì)懸浮于500ml0. IMNaOH溶液，加入20ml乙二胺溶液，凝膠在攪拌OOOrpm)下30°C恒溫12h。用去離子水清洗。NH2-^ipharose CL 4B懸浮在350ml 50% (ν/ν)冰浴丙酮溶液中，隨后將4g三氮嗪溶于80ml-20°C預(yù)冷丙酮，快速加入介質(zhì)懸浮液，實(shí)時(shí)檢測(cè)PH值，用飽和NaHCO3將pH維持在6. 5-7. 0之間，反應(yīng)溫度維持在0_4°C繼續(xù)攪拌2-4h，至白色消失，混合物呈透明狀停止反應(yīng)。用3倍介質(zhì)體積的丙酮，丙酮去離子水(1 1)，去離子水，順序洗滌反應(yīng)，得二氯三氮嗪-氨基-S^harose CL 4B。稱取40g 二氯三氮嗪-氨基-S^harose CL 4B，稱取IOg核黃素，溶解于80ml去離子水中，50_60°C振蕩Mh，反應(yīng)過(guò)程中時(shí)常檢查pH，用IM NaOH使溶液保持在11-12之間。反應(yīng)完畢，用500ml 去離子水充分洗滌，抽干。(1)最佳吸附pH值的確定取膽固醇氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水稀釋至濃度為600 μ g/ml，分為6組，每組溶液調(diào)節(jié)PH值為3. 8，4. 7，6. 3，7. 4，7. 8，8. 7，9. 6體積1ml，分別加入0. Olg濕介質(zhì)，4°C充分振蕩池后，測(cè)定上清膽固醇氧化酶濃度，計(jì)算介質(zhì)的吸附量，選擇最佳吸附的pH值。初始膽固醇氧化酶 0. 6mg/l，在不同pH值下與介質(zhì)充分振蕩池后，大量膽固醇氧化酶被親和介質(zhì)吸附，上清中的含量降低，吸附量與PH值關(guān)系見(jiàn)圖5。較佳吸附條件為，溫度為4°C，pH為7. 5-8. 0，電導(dǎo)率為2 5mS/cm。最佳吸附條件為，溫度為4°C，pH為7. 8， 電導(dǎo)率為2 5ms/cm。(2)介質(zhì)最大吸附量的確定在pH值優(yōu)化的基礎(chǔ)上，確定介質(zhì)的最大吸附量。取膽固醇氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水稀釋至濃度為 100，200，300，400，500，600，700，800，900 μ g/ml，調(diào)節(jié) pH 值為 7. 8，分別加入0. Oig濕介質(zhì)，4°C充分振蕩ai后，測(cè)定上清膽固醇氧化酶濃度，計(jì)算介質(zhì)的最大吸附量。吸附量與上清蛋白濃度關(guān)系，見(jiàn)圖6，計(jì)算單位介質(zhì)最大吸附量為60. 5mg/g介質(zhì)。(3)最佳洗脫條件的確定在培養(yǎng)吸附條件和最大吸附量的基礎(chǔ)上，考察洗脫液離子強(qiáng)度對(duì)洗脫結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖7。從圖中可見(jiàn)，較佳洗脫調(diào)節(jié)為pH值7. 5 8. 0，電導(dǎo)率40 80mS/cm ；最適洗脫條件為PH值為7. 8，電導(dǎo)率60mS/Cm。對(duì)比例2 聚殼聚糖-光黃素(光色素)的合成及應(yīng)用聚殼聚糖(IOOg)用10倍體積的去離子水洗滌，抽干成濕餅狀；懸浮于50ml活化緩沖液(0. 8MNa0H，20%二甲亞砜，10%環(huán)氧氯丙烷)40°C搖床震蕩2. 5h，然后倒入玻璃磨砂漏斗中，在抽濾下經(jīng)過(guò)每次10倍體積的蒸餾水洗滌，直到洗滌液pH至中性，在抽干成濕餅狀。SKWkpharose CL 4B介質(zhì)懸浮于500ml0. IM NaOH溶液，加入20ml乙二胺溶液，凝膠在攪拌OOOrpm)下30°C恒溫12h。用去離子水清洗。NH2-^pharose CL 4B懸浮在350ml 50% (ν/ν)冰浴丙酮溶液中，隨后將4g三氮嗪溶于80ml-20°C預(yù)冷丙酮，快速加入介質(zhì)懸浮液，實(shí)時(shí)檢測(cè)PH值，用飽和NaHCO3將pH維持在6. 5-7. O之間，反應(yīng)溫度維持在 0-4°C繼續(xù)攪拌2-4h，至白色消失，混合物呈透明狀停止反應(yīng)。用3倍介質(zhì)體積的丙酮，丙酮去離子水(1 1)，去離子水，順序洗滌反應(yīng)，得二氯三氮嗪-氨基-S^harose CL4B。 稱取40g 二氯三氮嗪-氨基-S印harose CL 4B，稱取IOg光黃素(或光色素)，溶解于80ml 去離子水中，50-60°C振蕩Mh，反應(yīng)過(guò)程中時(shí)常檢查pH，用IM NaOH使溶液保持在6. 5-8.0 之間。反應(yīng)完畢，用500ml去離子水充分洗滌，抽干。采用聚殼聚糖-光黃素進(jìn)行最佳吸附pH值的確定、介質(zhì)最大吸附量的確定及最佳洗脫條件的確定，實(shí)驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例2中相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，結(jié)果顯示聚殼聚糖-光黃素基本無(wú)吸附能力。采用聚殼聚糖-光色素進(jìn)行最佳吸附pH值的確定、介質(zhì)最大吸附量的確定及最佳洗脫條件的確定，實(shí)驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例2中相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，結(jié)果顯示聚殼聚糖-光黃素基本無(wú)吸附能力。實(shí)施例3 :D840-核黃素的合成及應(yīng)用D840介質(zhì)(聚苯乙烯介質(zhì)，擁有游離的氨基)懸浮在350ml 50% (ν/ν)冰浴丙酮溶液中，隨后將4g三氮嗪溶于80ml-20°C預(yù)冷丙酮，快速加入介質(zhì)懸浮液，實(shí)時(shí)檢測(cè)pH值， 用飽和NaHCO3將pH維持在6. 5-7. 0之間，反應(yīng)溫度維持在0_4°C繼續(xù)攪拌2_4h，至白色消失，混合物呈透明狀停止反應(yīng)。用3倍介質(zhì)體積的丙酮，丙酮去離子水(1 1)，去離子水，順序洗滌反應(yīng)，得二氯三氮嗪-氨基-S印harose CL 4B。稱取40g 二氯三氮嗪-氨基-S印harose CL 4B，稱取IOg核黃素(或光黃素，光色素等)，溶解于80ml去離子水中， 50-60°C振蕩Mh，反應(yīng)過(guò)程中時(shí)常檢查pH，用IM NaOH使溶液保持在11-12之間。反應(yīng)完畢，用500ml去離子水充分洗滌，抽干。
(1)最佳吸附pH值的確定取膽固醇氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水稀釋至濃度為600μ g/ml，分為6組，每組溶液調(diào)節(jié)PH值為3. 8，4. 7，6. 3，7. 4，7. 8，8. 7，9. 6體積1ml，分別加入0. Olg濕介質(zhì)，4°C充分振蕩池后，測(cè)定上清膽固醇氧化酶濃度，計(jì)算介質(zhì)的吸附量，選擇最佳吸附的pH值。初始膽固醇氧化酶 0. 6mg/l，在不同pH值下與介質(zhì)充分振蕩池后，大量膽固醇氧化酶被親和介質(zhì)吸附，上清中的含量降低，吸附量與PH值關(guān)系見(jiàn)圖8。較佳吸附條件為， 溫度為4°C，pH為7. 5-8. 0，電導(dǎo)率為2 5mS/cm。最佳吸附條件為，溫度為4°C，pH為7. 8， 電導(dǎo)率為2 5ms/cm。(2)介質(zhì)最大吸附量的確定在pH值優(yōu)化的基礎(chǔ)上，確定介質(zhì)的最大吸附量。取膽固醇氧化酶標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水稀釋至濃度為 100，200，300，400，500，600，700，800，900 μ g/ml，調(diào)節(jié) pH 值為 7. 8，分別加入0. Oig濕介質(zhì)，4°C充分振蕩ai后，測(cè)定上清膽固醇氧化酶濃度，計(jì)算介質(zhì)的最大吸附量。吸附量與上清蛋白濃度關(guān)系，見(jiàn)圖9，計(jì)算單位介質(zhì)最大吸附量為40mg/g介質(zhì)。(3)最佳洗脫條件的確定在培養(yǎng)吸附條件和最大吸附量的基礎(chǔ)上，考察洗脫液離子強(qiáng)度對(duì)洗脫結(jié)果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。從圖中可見(jiàn)，較佳洗脫調(diào)節(jié)為pH值7. 5 8. 0，電導(dǎo)率40 80mS/cm ；最適洗脫條件為PH值為7. 8，電導(dǎo)率60mS/Cm。對(duì)比例3 :D840-光黃素(光色素)的合成及應(yīng)用D840介質(zhì)(聚苯乙烯介質(zhì)，擁有游離的氨基)懸浮在350ml 50% (ν/ν)冰浴丙酮溶液中，隨后將4g三氮嗪溶于80ml-20°C預(yù)冷丙酮，快速加入介質(zhì)懸浮液，實(shí)時(shí)檢測(cè)pH值， 用飽和NaHC03將pH維持在6. 5-7. O之間，反應(yīng)溫度維持在0_4°C繼續(xù)攪拌2_4h，至白色消失，混合物呈透明狀停止反應(yīng)。用3倍介質(zhì)體積的丙酮，丙酮去離子水(1 1)，去離子水，順序洗滌反應(yīng)，得二氯三氮嗪-氨基-S^harose CL 4B。稱取40g 二氯三氮嗪-氨基-S印harose CL 4B，稱取IOg光黃素(或光色素)，溶解于80ml去離子水中，50_60°C振蕩 Mh，反應(yīng)過(guò)程中時(shí)常檢查pH，用IM NaOH使溶液保持在6. 5-8.0之間。反應(yīng)完畢，用500ml 去離子水充分洗滌，抽干。采用D840-光黃素進(jìn)行最佳吸附pH值的確定、介質(zhì)最大吸附量的確定及最佳洗脫條件的確定，實(shí)驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例2中相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，結(jié)果顯示D840-光黃素基本無(wú)吸附能力。采用D840-光色素進(jìn)行最佳吸附pH值的確定、介質(zhì)最大吸附量的確定及最佳洗脫條件的確定，實(shí)驗(yàn)過(guò)程同實(shí)施例2中相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程，結(jié)果顯示D840-光黃素基本無(wú)吸附能力。因此，本發(fā)明提供了一種具有工業(yè)應(yīng)用潛力的分離純化膽固醇氧化酶的方法，其使用s印harose-核黃素親和層析一步分離純化膽固醇氧化酶，蛋白回收率為 10%，活性回收率為 90%，比活性為 16U/mg。使用殼聚糖-核黃素親和層析一步分離純化膽固醇氧化酶，蛋白回收率為 10 %，活性回收率為 91 %，比活性為 16U/mg。使用D840-核黃素親和層析一步分離純化膽固醇氧化酶，蛋白回收率為 8%，活性回收率為 85%，比活性為 16U/mg。在此說(shuō)明書(shū)中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出
8各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說(shuō)明書(shū)和附圖應(yīng)被認(rèn)為是說(shuō)明性的而非限制性的。
權(quán)利要求
1.一種膽固醇氧化酶親和介質(zhì)，其特征在于，所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)由膽固醇氧化酶親和配體和層析介質(zhì)連接而成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽固醇氧化酶親和介質(zhì)，其特征在于，所述膽固醇氧化酶親和配體是核黃素，所述層析介質(zhì)是kpharose、殼聚糖或聚苯乙烯。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽固醇氧化酶親和介質(zhì)的合成方法，其特征在于，將所述膽固醇氧化酶親和配體和所述層析介質(zhì)通過(guò)三聚氯氰與乙二胺作為間隔臂進(jìn)行連接。
4.一種利用根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽固醇氧化酶親和介質(zhì)大規(guī)模純化膽固醇氧化酶的方法，其特征在于，將含有膽固醇氧化酶的溶液流經(jīng)所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)進(jìn)行親和吸附，然后采用清洗液沖洗所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)，最后用洗脫緩沖液洗脫所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)上吸附的膽固醇氧化酶，從而純化膽固醇氧化酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的含有膽固醇氧化酶的溶液是采用基因工程方法獲得的膽固醇氧化酶表達(dá)液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述膽固醇氧化酶表達(dá)液是采用來(lái)自于 Brevibacterium sterolicum 的膽固醇氧化酶基因，并由 Escherichia coli BL21(DE3)表達(dá)得到。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述膽固醇氧化酶親和配體是核黃素，所述層析介質(zhì)是kpharose、殼聚糖或聚苯乙烯。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述親和吸附的條件為pH值7.5 8. 0， 電導(dǎo)率為2 5ms/cm。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，采用清洗液沖洗所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)的清洗條件為pH值7. 5 8. 0，電導(dǎo)率5 10ms/cm。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，用洗脫緩沖液洗脫所述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)上吸附的膽固醇氧化酶的洗脫條件為pH值7. 5 8. 0，電導(dǎo)率40 80mS/cm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種膽固醇氧化酶親和介質(zhì)，由膽固醇氧化酶親和配體和層析介質(zhì)連接而成，較佳地，膽固醇氧化酶親和配體是FAD片段核黃素，所述層析介質(zhì)是Sepharose、殼聚糖或聚苯乙烯，還提供了上述膽固醇氧化酶親和介質(zhì)的合成方法，以及利用上述的膽固醇氧化酶親和介質(zhì)大規(guī)模純化膽固醇氧化酶的方法，利用本發(fā)明的膽固醇氧化酶親和介質(zhì)可以大規(guī)?？焖俜蛛x純化膽固醇氧化酶，可在僅用一步親和層析的情況下，得到膽固醇氧化酶純品，整個(gè)純化步驟消耗時(shí)間段，蛋白和活性回收率較高，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)B01J20/30GK102380347SQ201010273489
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2010年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者仝艷軍, 夏小樂(lè), 張玉然, 張玲, 楊海麟, 王武, 辛瑜 申請(qǐng)人:江南大學(xué)