專利名稱：用于免疫熒光的功能化的微流體裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于熒光分析檢測領(lǐng)域，特別是涉及用于FISH檢測的裝置。本發(fā)明還涉及一種通過使用本發(fā)明的裝置有效進行所述測試的方法。
背景技術(shù)：
目前微流控是一種涉及多學(xué)科的交叉科學(xué)，它處理的液體的體積非常小，從微升降低到飛升。它最早的應(yīng)用涉及噴墨打印頭，但是它被證實特別適合用于生物技術(shù)領(lǐng)域中的“實驗室芯片”技術(shù)的開發(fā)，其中樣品的特征是都具有非常小的量。分子生物學(xué)，酶分析， 基因分析，蛋白質(zhì)組學(xué)，臨床病理學(xué)，診斷學(xué)，環(huán)境分析等都是微流控被開發(fā)的潛在領(lǐng)域。在這種微觀層面，流體能夠顯示出不同于宏觀層面的非常不同的特性，當(dāng)設(shè)計微流體裝置或使用它們進行試驗的時候，這是必須要考慮進去的特點。例如，表面張力，能量損耗，流體阻力和擴散能夠很大程度上影響試驗的結(jié)果。出于這些因素，這些試驗的常規(guī)或慣用方案不能直接被用于微流體裝置中，而是必須要在試驗之前設(shè)計專用工藝以替代上述方案。與微流體的使用有關(guān)的優(yōu)點追溯到了通過這些裝置所實現(xiàn)的早期操作中，允許較高的流量控制，分析時間的縮短，隨著濃度和分子交互作用獲得的高控制性，對于試劑和廢棄產(chǎn)品的良好成本節(jié)約，因此使得它的使用更加環(huán)保并且由于儀器占地面積的減少能夠提供處理具有較小空間的更多樣品的能力。上述優(yōu)點使得使用微流體裝置的試驗是自動的，這從工業(yè)角度看來是非常有益的。特別是，微芯片生物技術(shù)從微流體中獲益最大，這要歸功于新開發(fā)的集成的工作流程。實驗室芯片裝置是幾平方毫米到幾平方厘米的芯片，在其上以微流路的形式在更小的級別上再現(xiàn)生物測試法。實驗室芯片裝置或用于所述裝置的微流路在以下文獻中被廣泛地描述。美國專利第6，613，560號公開了一種用于進行化學(xué)和生化工藝的小型化裝置，具體地，是一種進行DNA擴增的微反應(yīng)器；這篇文獻面臨的問題是在分析時由微反應(yīng)器的器壁引起的不期望的樣品的吸附，并建議制作微反應(yīng)器所使用的材料應(yīng)顯示對樣品中存在的化合物具有較少吸附的材料(或使用表面涂層)。國際專利申請第W095/22051號公開了一種流動池裝置，在該裝置的通道中具有固定化試劑，它們能對包含在測試樣品中的分析物產(chǎn)生電學(xué)或光學(xué)可檢測到的響應(yīng)。歐洲專利申請第1542010號公開了一種包括反應(yīng)區(qū)的微流體裝置，被設(shè)計成能夠容納在樣品中存在的至少一種成分和被固定在該反應(yīng)區(qū)中的至少一個特定物質(zhì)之間發(fā)生反應(yīng)，這樣能夠引起它與一種或多種預(yù)定物質(zhì)(目標成分)進行特異性或非特異性的相互作用。通過之前在所述壁上形成的中間固定薄膜(通常由有機化合物制作)使得特定物質(zhì)可靠固定在微流路的壁上。
實驗室芯片裝置已經(jīng)可用于各種分析技術(shù)中，例如電泳，色譜層析，染色，熒光血細胞計數(shù)，蛋白質(zhì)分析，聚合酶鏈反應(yīng)，血液分析等等，并進一步的被應(yīng)用到了熒光原位雜交(FISH)技術(shù)中。作為FISH的大體介紹，可以參看例如“Cytogenetic and FISH techniques in Myeloid Malignancies", L. J. Campbell, Methods in Molecular Medicine, 2006, Vol. 125，pp. 13-26 的文獻。更具體地，F(xiàn)ISH是用于基因組改變的檢測中的非常敏感的診斷工具。FISH是用于確定染色體重排或異常的非常有前景的診斷工具，而確定染色體重排或異常用其它常規(guī)技術(shù)是不能檢測到的。例如染色體改變的分析能夠預(yù)測未來的疾病或預(yù)測對治療的反應(yīng)。第一步，F(xiàn)ISH技術(shù)需要將細胞固定到載體上面，例如顯微鏡載玻片；然后，細胞經(jīng)過蛋白消化以去除細胞質(zhì)蛋白和染色體蛋白，從而進一步“接近”染色體DNA，需要進行變性，例如通過用甲醛基溶液進行培養(yǎng)。在使用乙醇基系列溶液進行細胞脫水之后，添加DNA 探針。然后在大約75°C，進行變性2-5分鐘并進行培養(yǎng)。用適合的雜交后溶液進行處理，以避免由于交叉雜交導(dǎo)致的非特異性的干擾結(jié)合。因此，通過熒光成像染色體序列中的異常位點變得明顯。在FISH方法之前，DNA的分析使用的是幾乎沒有成本效益的方法，然而，目前FISH 使得研究者能夠快速研究并了解許多疾病和癌癥的原因。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FISH方法可用于骨髓測試血癌例如白血病，淋巴瘤和骨髓瘤，實體瘤的淋巴結(jié)和外周血測試，植入前遺傳學(xué)診斷，產(chǎn)前和產(chǎn)后遺傳異常的篩查。作為一個共同的優(yōu)點，F(xiàn)ISH方法可以直接應(yīng)用于腫瘤樣品，例如活組織切片檢查， 部分或石蠟包埋的材料，它能夠提供高達單細胞水平的分辨率，能夠在適合的細胞樣品中檢測出罕見的事件。盡管由這一技術(shù)提供了很多重要的優(yōu)點，但是它的實際應(yīng)用目前由于一些缺點受到了阻礙。第一，F(xiàn)ISH方法在實施該方案和進行成像分析所需的試劑費用以及工時和機時都非常昂貴。這一限制阻礙了 FISH方法成為一種大規(guī)模的篩查方法?？朔@一限制的適合方法就是通過開發(fā)微流體裝置的特點開發(fā)出小型化的方案。然而，能夠被預(yù)想出的FISH方案和裝置的另一個限制是微流體裝置中的細胞粘附的低效率；這是由于這樣一個事實，由于微流體通道的橫截面是非常有限的，因此相對的高壓必須被施加于流體樣品以實現(xiàn)它們在該裝置內(nèi)的移動，這反過來又導(dǎo)致相對高的流速° 例如，文獻"FISH and chips chromosomal analysis on microfluidic platforms，，， V. J. Sieben et al, IET Nanobiotechnologies，2007，1 (3)pp. 27_；35 描述了通過細胞離心的標準粘附方案，但是微流體裝置通道中目標分析物的保留量僅僅是20%。當(dāng)查找罕見突變時，這一特點會增加“假陰性”率。微流體裝置能夠有效地固定細胞，適合于進行FISH檢測，這將有助于擴大該技術(shù)的使用面。一些現(xiàn)有技術(shù)的文獻已經(jīng)以改進保留微流體裝置的通道中的分析物為任務(wù)。論文“Enforced Adhesion of Hematopoietic Cells to Culture Dish Induces Endomitosis and Polyploidy，，，X. Huang et al.，Cell Cycle，4(6)，pages 801-805 公幵了用聚-D-賴氨酸功能化的底物以用于提高細胞粘附；具有聚-D-賴氨酸涂層的底物可從BD生物科學(xué)公司購買，它目前被認為是用于細胞粘附的最先進技術(shù)并通常被用于這研究領(lǐng)域。以Alberta大學(xué)名義申請的國際專利申請第W02008/0312^號公開了一種能夠?qū)⒄掣郊毎陌俜直忍岣叩?5%的固定方案。微流體通道中的細胞的固定通過將溫度升高到 50到95°C—段時間，由人工操作干預(yù)確定足以讓一定比例的目的細胞固定而實現(xiàn)。結(jié)果， 盡管改進了粘附細胞的百分比，但是這一文獻中提及的方法仍然是受限的，因為固定步驟必須由人工操作進行控制，并且在這一步驟中需要的相對高的溫度可能損壞一些細胞。此外，該申請描述了微流體裝置的兩個實施例，分別被稱為“微芯片”和“循環(huán)微芯片”。被稱為“微芯片”的實施例由0. 5mm厚度的裝載該微流體的顯微鏡載玻片和0. 17mm厚度的蓋玻片制作，聲明必須形成用于高分辨率成像的最小工作距離。該裝置的這兩種組件都非常易碎并需要在組裝過程中非常小心的操作，從而阻止該裝置簡單的成比例放而大應(yīng)用在工業(yè)設(shè)備中。被稱為“循環(huán)微芯片”的實施例由兩個1. Imm厚度的顯微鏡載玻片和0. 254mm厚度的中間的PDMS層構(gòu)成。這一實施例克服了 “微芯片”的易碎問題，但是它的厚度對于圖像采集來說不能使用100X的鏡頭，因此阻礙了目前FISH標準需要的高分辨率圖像的獲得。歐洲專利申請第1215186號公開了一種用于固定低聚核苷酸的載體，它可用于微流體裝置的構(gòu)件；這一載體具有使用選自Η 2，Τ 02, Ta205, Zr02和它們的混合物中的氧化物進行功能化的表面，在它們沉積之后進行處理以使它們的表面具有親水性。然而這一文獻沒有提及細胞的固定。國際專利申請第W000/33084號公開了廣泛用于診斷學(xué)的裝置，其中的活性表面用有機化合物進行功能化，或者覆蓋了“凝膠網(wǎng)格狀”的氧化物。但是這篇文獻沒有提及關(guān)于細胞的實際保留量的任何信息。因此，需要能夠克服現(xiàn)有技術(shù)方法中的缺點如經(jīng)典的微流體的FISH裝置和方法。具體地，需要設(shè)計一種裝置和方法，它將是便宜的，易于操作的，可成比例放大和實施，能夠快速和有效實現(xiàn)的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種改進的微流體裝置，它能夠適合并有益地用于熒光分析技術(shù)中。 本發(fā)明還公開了一種使用所述裝置的簡化方案，獲得了驚人和預(yù)料不到的結(jié)果。本發(fā)明的第一目的是一種微流體裝置，包括至少一個載玻片和具有凹槽的一個部件，所述的載玻片和部件這樣排列通過它們的接合形成微通道，其特征在于至少所述載玻片面向所述微通道的的一面上的區(qū)域被用納米結(jié)構(gòu)的金屬氧化物進行功能化，所述的金屬氧化物優(yōu)選Ti氧化物，Zn氧化物或ττ氧化物。本發(fā)明的另一個目的是使用本發(fā)明的裝置用于進行熒光分析檢測。作為又一個目的，本發(fā)明涉及一種使用本發(fā)明的微流體裝置進行熒光分析檢測的方法。


圖1顯示了典型的微流體部件的平面圖和剖面圖；圖2顯示了在不同組裝階段本發(fā)明的經(jīng)組裝的裝置；
圖3A顯示了在本發(fā)明的第一實施例中的構(gòu)成本發(fā)明的裝置的幾個部件；圖;3B顯示了圖3A的經(jīng)組裝的裝置的剖面圖；圖4A顯示了在本發(fā)明的第二實施例中的構(gòu)成本發(fā)明的裝置的幾個部件；圖4B顯示了圖4A的經(jīng)組裝的裝置的剖面圖；圖5A顯示了在本發(fā)明的第三實施例中的構(gòu)成本發(fā)明的裝置的幾個部件；圖5B顯示了圖5A的經(jīng)組裝的裝置的剖面圖；圖6示意性地顯示了在根據(jù)本發(fā)明的功能化的載玻片以及在不是本發(fā)明的載玻片上培養(yǎng)細胞(U937)的粘附試驗的結(jié)果；圖7示意性地顯示了在完成微流體運行之后(延長剪切力程序)，在根據(jù)本發(fā)明的功能化的載玻片以及在不是本發(fā)明的載玻片上培養(yǎng)細胞(U937)的粘附試驗的結(jié)果；圖8A，8B和8C示意性地顯示了在根據(jù)本發(fā)明的用不同的納米結(jié)構(gòu)的金屬氧化物進行功能化的載玻片上以及在沒有本發(fā)明的金屬氧化物的載玻片上的原發(fā)性造血干細胞的粘附試驗的結(jié)果；圖9顯示了在本發(fā)明的兩種裝置上的粘附試驗的結(jié)果；圖10和11顯示了使用本發(fā)明的裝置在微通道中進行FISH檢測之后的培養(yǎng)細胞 (U937)。
具體實施例在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明涉及一種微流體裝置。發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的裝置可以應(yīng)用在熒光分析檢測領(lǐng)域中，特別是它能夠用于進行FISH檢測。相對于已知的裝置，本發(fā)明公開的裝置具有許多優(yōu)點，這將被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。本發(fā)明的改進的微流體裝置通過將至少一個載玻片和在其中存在凹槽的一個部件進行接合形成的，這(至少)兩種元件之間的接合限定了該裝置中的一個微通道。雖然能夠設(shè)計其它的結(jié)構(gòu)，但是這些裝置最共同的結(jié)構(gòu)是凹槽不沿存在凹槽的該部件的全長延伸，并且通過所述部件中形成的通孔(或在構(gòu)成完整裝置的其它可能的元件中)該微通道可以到達該裝置的頂部表面；本說明書的其它部分將參考這一共同結(jié)構(gòu)進行描述。在本發(fā)明中，能夠使用任何適合的載玻片，例如由玻璃，石英或某些塑料的透明材料制作的載玻片。特別地，由于玻璃的化學(xué)惰性，透明度，低成本，低多孔性，親水性和長期的穩(wěn)定性，因此玻璃是優(yōu)選的材料。為了方便，使用的可以是標準顯微鏡載玻片，優(yōu)選例如硼硅酸鹽，石英玻璃或堿石灰的玻璃的薄片形式，尺寸大約25X76Xlmm。用于本發(fā)明中的載玻片具有至少在完整裝置中形成微通道的壁的區(qū)域，其用納米結(jié)構(gòu)的金屬氧化物進行功能化以改進細胞粘附；在下文，納米結(jié)構(gòu)的金屬氧化物將被稱為 ns-ΜΟχ，其中M表示金屬。在ns-ΜΟχ中，優(yōu)選的金屬氧化物是辦氧化物(ns-&i0)，Zr氧化物(ns_Zr02)并且特別優(yōu)選的是納米結(jié)構(gòu)的薄膜形式的Ti氧化物(ns-Ti02)。使用透射電子顯微鏡(TEM)和原子力顯微鏡(AFM)觀察，這些氧化物薄膜由具有 2到50nm，優(yōu)選5到15nm的粒度分布的納米粒子構(gòu)成。使用石英晶體微天平OiCM)和AFM測量，納米粒子隨機組合以產(chǎn)生具有相當(dāng)于塊狀氧化物(bulk oxide)的質(zhì)量密度1/2到1/10質(zhì)量密度的多孔結(jié)構(gòu)；在ns-Ti02的情況時，該質(zhì)量密度通常是致密Ti02的質(zhì)量密度的大約1/7。通過TEM和X-射線衍射(XRD)顯示這些材料由納米晶體和非晶納米粒子組成。在 ns-Ti02的情況時，已經(jīng)觀察到銳鈦礦和金紅石相的共存(Raman光譜)。具有50nm厚度的薄膜在可見區(qū)域中的波長是透明的。特別是在ns-Ti02的情況時，在UV區(qū)域(UV-VIS光譜)，大約320nm光吸收變得明顯。通過吸收端特點，估計光學(xué)帶隙在3. 2到3. 6eV之間(Tauc模型)。ns-Ti02的折射率值是1. 6到1. 8之間，由于納米孔隙度(Lorentz-Lorenz模型)，其大大低于體相Ti02中任一種(銳鈦礦2. 5，金紅石2. 9)。本發(fā)明的納米結(jié)構(gòu)的薄膜具有20nm到200歷的厚度，優(yōu)選40nm到60nm，具有2nm 到30nm，優(yōu)選5nm到15nm的表面粗糙度。這種ns-MOx的薄膜通過多種技術(shù)被沉積在基底載玻片上，例如濺射法或脈沖激光沉積(PLD)；但是優(yōu)選的技術(shù)是通過使用脈沖微等離子體簇源(PMCQ的技術(shù)。這一技術(shù)允許納米結(jié)構(gòu)的薄膜的沉積并且它基于位于該源中的陰極的材料的燒蝕，通過注入到所述源室內(nèi)氣流與真空系統(tǒng)的界面產(chǎn)生的等離子區(qū)。該源和真空室之間的壓差允許產(chǎn)生納米粒子。PMCS技術(shù)的常用參考文獻可以參看例如歐洲專利申請第EP1031639號或Journal of Physics D, 32 (1999), L105-109。PMCS是優(yōu)選的技術(shù)，因為已證明它能確保沉積材料上產(chǎn)生需要的孔隙度特點。當(dāng)通過PMCS制備時，ns-MOx薄膜的表面特點符合彈道學(xué)聚集生長過程，特別是顯示出取決于厚度的表面粗糙度。對于40-60nm的厚度，表面粗糙度是5nm-15nm之間，優(yōu)選是 8nm-12nm(AFM)之間。優(yōu)選在沉積之后用氧等離子體處理該ns-MOx薄膜(100W處理150秒)，以增加潤濕能力并改善微通道的毛細管作用，從而有利于該微通道內(nèi)部的自發(fā)液體流動。對載玻片進行功能化的優(yōu)選材料是化學(xué)計量或非化學(xué)計量的ns-Ti02，優(yōu)選通過 PMCS技術(shù)獲得。二氧化鈦是高生物相容性和生物活性的材料；事實上，所述的材料被證明是不會干擾正常細胞活性的，例如細胞生長，并且是不與用于細胞培養(yǎng)的制備中的試劑互相作用的。此外，納米結(jié)構(gòu)的二氧化鈦顯示出了非常低的熒光背景信號(自體熒光)，這改進了在熒光測定中的信/噪比。納米結(jié)構(gòu)的二氧化鈦涂層以本申請人的名義公開于WO 2007/009994中。這篇文獻公開了用于固定病毒或細胞的底物；但是這篇文獻沒有提到在微流體領(lǐng)域中的應(yīng)用，并且沒有給出與其它用于這一特定領(lǐng)域的已知的粘附力促進材料相比ns-MOx可具有優(yōu)越性能的事實的技術(shù)啟示。存在凹槽的部件可以是使用不同的柔軟材料制作的襯墊，通常是例如硅樹脂或氯丁二烯橡膠或PDMS(聚二甲基硅氧烷)的聚合物；或者它可以是堅硬材料的薄片，通常是例如玻璃，石英等的無機材料。該凹槽通常具有毫米級的長度和幾十或幾百微米級的橫向尺寸的橫截面；孔和其它可能的腔還具有低于Imm的尺寸。這些特征通常由蝕刻產(chǎn)生，可以用現(xiàn)有技術(shù)中已知的不同技術(shù)制作，例如噴粉，化學(xué)蝕刻(例如HF蝕刻)，深反應(yīng)離子蝕刻或等離子體蝕刻，使用或不使用蝕刻掩膜。在聚合物襯墊的情況下，例如模制或鑄造的其它技術(shù)能夠可用于形成該凹槽。根據(jù)需要，該凹槽可以具有不同的幾何橫截面，例如正方形，圓形，六邊形等；最常見的橫截面是矩形。它還可以由不同數(shù)量的微通道組成。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的具有凹槽的部件是聚合物襯墊。具有微米凹槽的襯墊的例子在圖1中顯示；具體地，在該圖中，圖la)顯示了該襯墊的俯視圖，圖lb)顯示了同一個襯墊的仰視圖，和圖c)顯示了該襯墊的側(cè)視圖，沿平行于和包括凹槽的平面獲得的剖面。該實施例的襯墊尺寸是75. 6x 25. Ox 1. 0mm，實施例的凹槽尺寸是300 μ m χ 50 μ mx IOmm ；用于試劑，氣體和樣品注入的通孔的直徑是0. 7mm。使用取代平面載玻片的微流體裝置作為最先進的技術(shù)獲得了進行檢測所需的低量試劑。具體地，只需要非常低量的昂貴的FISH探針，這也是環(huán)境更安全的。此外，在根據(jù)本發(fā)明的微流體裝置中，用于粘附的表面與該微通道的底面具有相同的尺寸。這一表面比標準FISH檢測中的功能化的相應(yīng)的表面更小如果為本發(fā)明的細胞粘附提供了涂層，相似數(shù)量的細胞變得可用于分析并且需要很短的時間就獲得了結(jié)果圖像，從而減少了由于機時分配產(chǎn)生的費用。為了實現(xiàn)小型化的FISH檢測，具有不同粘度和密度的水基(或水溶)試劑必須連續(xù)使用因為該反應(yīng)在微通道中進行，微通道的毛細管作用是試劑流動和進行正確分析的必要的前提條件。這一條件可以通過制作含有疏水材料的襯墊或厚片(其中獲得了微通道)，或通過使用疏水ns-MOx薄膜將基底載玻片進行功能化而實現(xiàn)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，襯墊使用已知疏水的PDMS或硅樹脂制作，以避免該微通道中的液體的自發(fā)流動。因此，必須對ns-MOx涂層進行后處理，為了提供這樣的疏水性， 只要被沉積的薄膜是疏水的就可以，并由此利于該微通道中的水性試劑的流動。通過對ns-MOx的后處理，優(yōu)選通過增加表面電荷(例如在100W，通過等離子氧處理150秒)，通過接觸角分析測量，獲得了具有高潤濕度的ns-MOx涂層(在等離子處理過的涂層中，本發(fā)明人已經(jīng)獲得了一致的不大于10°的接觸角)。本發(fā)明人已經(jīng)觀察到了這種處理能夠在上下文中提及的微通道中呈現(xiàn)出毛細管作用，并且證明了液體在該微通道中的流動是自發(fā)的，不需要泵的輔助抽吸，從而證明了該裝置的毛細管作用。本發(fā)明的微流體裝置的第一個最簡單的實施例包括結(jié)合有PDMS或硅樹脂襯墊的功能化的顯微鏡載玻片，其中該襯墊具有微米級凹槽。該結(jié)合可以在PDMS或硅樹脂和玻璃之間產(chǎn)生至少部分的自發(fā)粘附。但是這種粘附是可逆的，允許在檢測結(jié)束時將兩個部件輕易的分離。進行該組裝使得該微通道與該載玻片表面的功能化區(qū)域相對應(yīng)。由于載玻片和襯墊之間可逆的結(jié)合，襯墊可以在雜交階段的最后被去除，從而在載玻片上直接獲得熒光成像，而不需要對樣品進行必要的進一步的處理。出乎意料地，已經(jīng)觀察到了所述第一步的結(jié)合和所述后面的分離步驟在進行FISH 檢測之前或之后都不影響細胞粘附到載玻片的功能化層的程度。一旦分離，該載玻片可以直接被放置在顯微鏡“下面”，顯微鏡的物鏡朝向固定樣品的載玻片一側(cè)。這可以正確地設(shè)定工作距離，使用100X的物鏡進行圖像采集，從而獲得了 FISH常用標準需要的圖像分辨率。同時，例如，可以使用Imm厚度的標準顯微鏡載玻片以獲得堅固的足以容易操作的裝置。如上述所公開的，圖2顯示了本發(fā)明的經(jīng)組裝的裝置在不同組裝階段的俯視圖。 在該圖中，圖a)表示基底；圖b)表示具有該功能化的載玻片的基底，其中以較深陰影表示的中間區(qū)域是功能化的區(qū)域；圖c)是具有該功能化的載玻片以及微流體襯墊的基底，其中該微流體襯墊位于載玻片的上面；圖d)是最終經(jīng)組裝的裝置，在該微流體的入口處設(shè)置封由于PDMS或硅樹脂和玻璃之間的自發(fā)粘附，如果使用由由上述聚合物中的一種來制作的微流體襯墊，該描述的組裝可能是不必要的。但是，如果沒有使用這類聚合物，必須在各部件之間提供壓緊，特別是對于下面的本發(fā)明的實施例，例如下面將要描述的并被稱為“墊片1”，“墊片2”和“墊片3”的那些實施例。圖3A和;3B中表示了 “墊片1”實施例。圖3A顯示出根據(jù)第一實施例構(gòu)成的微流體裝置的三個元件，即上面的載玻片31，其設(shè)置有試劑和樣品注入的微流體的入口(這可以使用任何適合的有機或無機硬質(zhì)材料，例如玻璃來實現(xiàn))；襯墊32，在其中設(shè)置開口 ；以及部件33，部件33是功能化的載玻片。圖:3B顯示了通過將圖3A的元件31，32和33連接獲得的裝置30的剖面圖，所述剖面是指沿著垂直于該裝置的微通道中的流體的流動方向的平面。對于圖3B的構(gòu)造，載玻片31和襯墊32的組裝定義了凹槽，并且載玻片31可以輕微地壓緊在襯墊32上，從而作為墊片，確保液體能夠被緊密地密封到該裝置中。具體地，所述襯墊32可以由聚合物材料，例如PDMS，硅樹脂或氯丁二烯橡膠實現(xiàn)。進行本發(fā)明的裝置的組裝，使得載玻片33的功能化的區(qū)域與襯墊32的開口對應(yīng)。圖4A和4B顯示了被稱為“墊片2”的本發(fā)明的微流體裝置的又一個特定的實施例 (圖4B中的裝置40)；圖4A和圖4B中的視圖之間的關(guān)系與圖3A和中的視圖之間的關(guān)系相同。在這個例子中，微通道在圖4A中的載玻片41中實現(xiàn)。在這一實施例中，功能化的載玻片43與設(shè)置有凹槽和用于進入微通道的開口的載玻片41接合。為了使液體緊密的密封在載玻片41和43之間，在它們之間存在密封件 42。具體地，所述密封件以例如PDMS，硅樹脂或氯丁二烯橡膠的聚合物材料實現(xiàn)。所述密封件42設(shè)置有適合的孔，從而不會覆蓋圖4A中的載玻片43的功能化的區(qū)域。進行組裝，使得載玻片41的微通道與載玻片43的功能化的區(qū)域?qū)?yīng)。圖5A和5B顯示了被稱為“墊片3”的本發(fā)明的微流體裝置的再一個的實施例(圖 5B中的裝置50)；同樣，圖5A和圖5B中的視圖之間的關(guān)系與圖3A和中的視圖之間的關(guān)系相同。在這個例子中，該裝置由圖5A中所示的第一載玻片51和功能化的載玻片53形成； 載玻片51設(shè)置有凹槽和用于試劑，氣體和樣品注入的孔。通過薄的聚合物層(52，在圖5A 中未示出)獲得載玻片51和53之間的液體的緊密密封，所述連接到載玻片51的薄的聚合物層優(yōu)選幾微米厚，并且不會覆蓋具有凹槽的載玻片的凹槽部分。用于上述實施例的所有的載玻片可以是任何適合的載玻片，例如像顯微鏡載玻片的玻璃載玻片。在所有實施例中的本發(fā)明的裝置出乎意料地被證實解決了現(xiàn)有技術(shù)中所公開的主要的技術(shù)問題。事實上，被證明90%或更多的最初細胞粘附在該功能化的基底上，這相對于現(xiàn)有最先進的技術(shù)水平是驚人的。出乎意料地，當(dāng)處理例如U937的造血細胞時，也已經(jīng)獲得了這樣的粘附百分比，造血細胞是淋巴瘤細胞，通常被定義為非粘附細胞。因此，甚至可以使用具有低數(shù)量細胞的樣品，都將具有合理預(yù)期的再現(xiàn)性和足夠信息的采集。這是最應(yīng)關(guān)注的，特別是當(dāng)不能處理大量樣品時，例如循環(huán)腫瘤細胞樣品。此外，由于在處理過程中，樣品細胞的損失非常有限，因此同樣可以確定罕見細胞突變，從而減少了假陰性的風(fēng)險。此外，由于粘附到載玻片上的細胞保持著它們的3D構(gòu)象，而不是像傳統(tǒng)方法一樣分散和按壓到載玻片上，可以通過收集來自樣品的不同距離的數(shù)據(jù)獲得3D圖像。當(dāng)處理罕見細胞突變或低細胞數(shù)量的樣品時這一優(yōu)點也是主要關(guān)注的，同樣在Z軸獲得了識別信號，從而不會由于幾何學(xué)問題忽視潛在的有價值的信息。作為本發(fā)明的第二個目的，提供了一種在熒光分析檢測，特別是在進行FISH檢測中使用本發(fā)明的裝置的方法。為了本發(fā)明的這一目的，特別是，可以使用細胞懸液，由來自生物樣品，體外培養(yǎng)的，從組織或體液中提取的細胞構(gòu)成。已經(jīng)實施了簡化的方案，相對于任何其它的所使用的現(xiàn)有方法和/或材料獲得了意外的且驚人的效果。事實上，該方法可以分析非常小尺寸和低密度的樣品，濃度大約10細胞/ml左右。具體地，該檢測可在不同種類的細胞上進行，例如腫瘤細胞，循環(huán)腫瘤細胞，造血細胞，上皮細胞，羊水和通常任何的培養(yǎng)細胞或哺乳動物和非哺乳動物種類的細胞，活的或之前使用任何適合的細胞固定劑固定的細胞，通常如上述的被分類為粘附或非粘附細胞。 活的或固定的，粘附或非粘附細胞可以不同程度被固定到功能化的載玻片上。在優(yōu)選的實施例中，本發(fā)明的熒光分析檢測是在U937活細胞上進行的，該細胞通常被定義為非粘附細胞。通過活的細胞懸液的使用，本發(fā)明的方法不需要使用固定試劑預(yù)處理細胞也不用裂解細胞，因此可以使用完整細胞。在時間，費用和毒性試劑的體積方面是特別關(guān)注的；此外，可以進行細胞的生理學(xué)條件的分析。在本發(fā)明中公開的方法特別適合使用本發(fā)明的裝置進行。本發(fā)明將通過下面的例子進行進一步的說明。例 1這個例子是根據(jù)本發(fā)明制備和組裝具有微通道的微流體裝置。a)用ns-MOx將基礎(chǔ)載玻片功能化經(jīng)超聲波清潔的顯微鏡玻璃載玻片(例如khott Nexterion D)被放入裝備有 PMCS的真空系統(tǒng)的沉積室中。載玻片暴露于由PMCS產(chǎn)生的團簇束，這通過位于PMCS源和載玻片之間的合適的模板掩膜產(chǎn)生，以允許所需的材料僅僅沉積在該載玻片上的有限區(qū)域。為了獲得具有相同厚度的沉積層，該載玻片被不斷在團簇束的前面進行柵格化；為了監(jiān)控生長層的厚度，同樣將石英晶體微天平OiCM)暴露于團簇束。沉積在室溫進行，通常10-6 托的壓力，并在每個載玻片持續(xù)大約1分鐘，設(shè)置的源-載玻片之間的距離大約是lm。對載玻片進行功能化所選擇的材料是Ti02。得到的ns-Ti02薄膜具有大約50nm的平均厚度。在沉積階段之后，載玻片被暴露在100W的氧等離子中150秒。
b)將凹槽與載玻片接合提供圖1所示種類的PDMS襯墊，其中具有微米級凹槽，具有Icm的長度，300 μ m的寬度和50的μπι高度。使用適合的機械中心定位器(centerer)接合襯墊和功能化的載玻片，將凹槽的位置設(shè)置在載玻片的功能化的區(qū)域上，從而形成根據(jù)本發(fā)明的微通道。通過施加輕微的壓力獲得這兩個部件之間的粘附。例2(對照例)通過將在例1中使用的一樣的PDMS襯墊和非功能化的顯微鏡玻璃載玻片接合制作微流體裝置；在這個例子中，通過簡單地對這兩個部件施加輕微的壓力獲得該襯墊和載玻片之間的粘附。例3(對照例)重復(fù)例2的步驟，在這個例子中，載玻片用致密的，非納米結(jié)構(gòu)的Ti02薄膜功能化，該薄膜是通過標準濺射沉積方法獲得的；得到的薄膜具有大約50nm的厚度。在這個例子中，通過按壓這兩個部件獲得該襯墊和載玻片之間的粘附。例4(對照例)重復(fù)例2的步驟，在這一例子中使用了用聚-D-賴氨酸層功能化的載玻片，其通過將載玻片在室溫用15 μ g/ml的聚-D-賴氨酸(SIGMA公司)溶液處理30分鐘，然后用IX 杜氏磷酸緩沖液(DPBS)沖洗，空氣干燥并用于此試驗；在這個例子中，通過按壓這兩個部件獲得該襯墊和載玻片之間的粘附。例 5這一例子顯示了在例1-4的微流體裝置上進行的細胞粘附試驗的結(jié)果。該微流體裝置在37°C的熱板的頂部預(yù)處理2分鐘。為了制備測試樣品，將培養(yǎng)的U937細胞(Iml的指數(shù)生長的細胞)放置在1. 5ml的試管中并使用UDPBS清洗3次，計數(shù)并最后以10000細胞/μ 1的濃度重懸浮。1. 5μ 1的細胞懸液被裝入每個微流體裝置的微通道的入口，同時使用注射泵(KDS120，KD Scientific 公司)以1. 7μ 1/s的速度從該微通道的出口進行抽吸；然后，細胞粘附到微通道的底部幾分鐘并立刻通過添加3 1比例的甲醇/乙酸溶液進行固定。在粘附之后，添加DCDPBS以沖洗該固定劑，同時使用真空泵進行抽吸；這一方法使細胞受到有限的剪應(yīng)力。在該方法的最后，將襯墊移除，該載玻片使用DAPI (4，6- 二脒基-2-苯基吲哚，SIGMA公司)染色，并安裝用于顯微鏡分析。在分析中，對固定在載玻片上的細胞數(shù)量進行計數(shù)。結(jié)果在圖6中顯示由這張圖中清楚的可見，在試驗條件下，粘附到對照例2-4的載玻片表面的U937細胞的數(shù)量是相似的，并且相當(dāng)于大約600個固定的細胞，即，大約上樣細胞的40% ；另一方面，粘附到本發(fā)明(例1)的功能化的載玻片上的細胞數(shù)量大約是1400，也就是說，高于對照例載玻片的130%，相當(dāng)于上樣細胞大約93%。例 6這一例子顯示了在比例5更大的剪應(yīng)力的條件下，在例1-4的微流體裝置上進行的第二細胞粘附試驗的結(jié)果。重復(fù)例5的方法直到使用3 1的甲醇/乙酸溶液的固定步驟；然后將該樣品進行下面的稱為“延長的剪應(yīng)力”步驟，該步驟包括將固定在載玻片上的細胞與用于生物學(xué)檢測中的若干試劑接觸。具體地，用吸量管順序量取下面的溶液，在所示時間和溫度進行培養(yǎng)并用真空泵抽吸2X生理鹽水檸檬酸鈉緩沖液(SSC)，30分鐘，37°C ；具有酶的緩沖液 (0.005% 胃蛋白酶，0. OlN 的 HC1，SIGMA 公司)，15 分鐘，37°C ； 1)(DPBS，5 分鐘，室溫(RT)； 后固定劑(50mM的MgCl 2，SIGMA公司)；IXDPBS中0. 95%的甲醛(SIGMA公司)，5分鐘， 室溫；1)(DPBS，5分鐘，室溫；用70%，85%和100% (BDH)的KOH進行三次連續(xù)沖洗，每次 1分鐘，室溫；變性溶液(70%的甲酰胺，SIGMA公司，2x SSC SIGMA公司)，5分鐘，75°C ；用 70%，85%和100%的KOH進行三次連續(xù)沖洗，每次1分鐘，室溫。在純的KOH被完全吸入之后，載玻片被放置于60°C，2分鐘以完全干燥，并且用
0.3μ 1的雜交混合物裝載(15ml 7.5ml的超純甲酰胺，6. Oml的25%的硫酸葡聚糖，
1.5ml20x SSC)。然后，將微通道井口用一滴礦物油(SIGMA公司)密封以防止蒸發(fā)，并在 37°C培養(yǎng)10分鐘。在培養(yǎng)之后，去除襯墊并且載玻片在含有沖洗液A(0. 3%的NP40，非離子物質(zhì)，非變性清潔劑辛基苯氧基聚乙烯醇(octyl phenoxylpolyethoxylethanol) ,0. 4x SSC(SIGMA公司))的染色缸中在73°C浸泡2分鐘，并在沖洗液Β(0. 1%ΝΡ40，2χ SSC)中室溫浸泡1分鐘，空氣干燥并加入DAPI IKAbbot t Molecular公司)用于顯微鏡分析。為了進行細胞計數(shù)，每個載玻片用DAPI濾波器成像并用karTR采集，用于成像掃描的顯微鏡自動化平臺(Olympus Europa，德國)裝配有Hamamatsu ORCA-AG型攝像機，使用10X物鏡掃描13個相鄰的圖像；然后在設(shè)定適合的端值并排除15-75平方像素范圍以外的物體之后， 使用ImageJ軟件“分析粒子”函數(shù)對細胞進行計數(shù)。使用Excel軟件輸出并分析數(shù)據(jù)。該結(jié)果在圖7中的圖表中顯示。由該圖中可見，在Si02載玻片上的細胞數(shù)量明顯減少到大約100細胞/微通道，而在涂覆有ns-Ti02和聚-D-賴氨酸的載玻片上的細胞數(shù)量未明顯變化。但是，由于原始細胞固定的效率不同(見例幻，在延長的剪應(yīng)力試驗的最后，總細胞數(shù)量在ns-Ti02和聚-D-賴氨酸之間是明顯不同的(1400細胞對600細胞)，是涂覆有ns-Ti02的載玻片上2倍多。例 7這個例子顯示了在與例6相同的條件下，在例1-4的微流體裝置上進行的第三細胞粘附試驗的結(jié)果，在這個例子中，使用了來自人體捐贈的造血細胞的樣品。與例5 —樣，微流體裝置在熱板的頂部在37°C預(yù)處理2分鐘。為了制備測試樣品，正常捐贈者的1等份外周血液(PB) (0. 5-lml)用紅細胞裂解 (RBL)緩沖液(SIGMA 公司的 0. 15M NH4C1，9. 93mM 的 KHC03，0. 13mM 的 EDTA)處理獲得 IOml 的總體積；該懸液在4°C保持5分鐘，然后以1500rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。去掉上清液并將被分離出的造血細胞重懸在IOml的RBL緩沖液中，然后以1800rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘。細胞重懸在Iml的DCDPBS中并被轉(zhuǎn)移到1. 5ml的試管中，在DCDPBS中沖洗兩次，并最后以 15000-25000細胞/ μ 1的濃度重懸浮。1. 5 μ 1的由此獲得的懸液被裝入每個微流體裝置的微通道的入口中。20 μ 1 的 Carnoy 固定劑(3 1 的甲醇(SIGMA 公司)/ 乙酸(Carlo Erba 公司)) 被添加到入口并擴散進入以固定細胞。在2分鐘之后細胞被固定。然后微通道受到例6中所示的方法的延長的剪應(yīng)力。試驗結(jié)果在圖8中顯示保持在本發(fā)明的裝置上面的細胞數(shù)量范圍是保留在對照裝置上面的細胞數(shù)量的1. 8到2. 5倍。例 8這是關(guān)于本發(fā)明的裝置性能的對照例，其中在沉積之后，該ns-Ti02薄膜經(jīng)過后處理后或未經(jīng)處理的。如例1的點a)描述的所制作的載玻片的功能化表面在100W受到氧等離子的處理 150 秒。因此處理后的載玻片和未經(jīng)過后處理的載玻片與例1中的PDMS襯墊組裝，然后進行例6的方法，在這個例子中使用固定細胞(U937)作為試驗樣品。試驗結(jié)果在圖9中顯示， 并顯示出了本發(fā)明的兩種裝置表現(xiàn)為細胞的高保有度，但是在經(jīng)過后處理的ns-Ti02薄膜例子中，細胞更均勻分布在對應(yīng)于微通道的底部的表面上。這有利于數(shù)據(jù)的解釋。例 9這是關(guān)于使用本發(fā)明的微流體裝置實施完整FISH檢測方案的例子。根據(jù)例1制作的微流體裝置用于根據(jù)本發(fā)明的方案進行FISH檢測。1 等份的 U937 細胞(ATCC American Type Culture Collection)以 600rpm 的轉(zhuǎn)速離心5分鐘并在37°C在Ix DPBS中懸浮達到10000細胞/ μ 1的細胞濃度。使用標準試驗室吸量管將細胞懸液手動移液到裝置中并培養(yǎng)4分鐘。添加含有乙醇和弱羧酸的固定劑(甲醇/乙酸3 1)，并且固定進行2分鐘；然后使用真空泵進行抽吸。將37°C預(yù)加熱的30 μ 1的h SSC溶液(由20x SSC的濃縮液，3. OM的NaCL，0. 3M 的檸檬酸鈉制備)移液進入微通道并在37°C加熱的熱板上培養(yǎng)15分鐘。在培養(yǎng)之后，含有0. 005%的胃蛋白酶的溶液被移液并在熱板上培養(yǎng)15分鐘進入該微通道。胃蛋白酶溶液被泵出，Ix DPBS (磷酸緩沖液，Lonza Group)被移液，培養(yǎng)5分鐘， 然后含有甲醛的溶液(對于50ml的溶液1. 3ml的37%的甲醛，0. 23g的MgCl2，48. 7ml的 PBS)被培養(yǎng)5分鐘，用Ix DPBS沖洗并培養(yǎng)5分鐘。DPBS從該微通道被泵出，進行干燥。70%，85%和100%的系列乙醇溶液被順序移液并且每種溶液被培養(yǎng)1分鐘。73°C預(yù)加熱的變性溶液(對于50ml的溶液:35ml的37%的甲醛，5ml的20x SSC, PH值7-8的IOml的H20)被移液，在73°C加熱的熱板上進行5分鐘的培養(yǎng)。然后該裝置從熱板去除并冷卻，隨后將變性溶液泵出，重復(fù)使用乙醇溶液進行處理。該裝置被放置于45°C的熱板上并且通過泵出將乙醇在1分鐘內(nèi)完全去除。該裝置從熱板去除并裝載上標記有Cy3的變性探針。然后該微通用一滴礦物油 (Sigma公司)密封并在保持在37°C的平板上隔夜培養(yǎng)。在培養(yǎng)之后，襯墊與載玻片分離然后載玻片在染色缸中用含有0. SSC和 0. 3%的NP40的溶液沖洗，所述溶液在73°C預(yù)加熱；然后在室溫使用含有h SSC和0.
的NP40的溶液沖洗1分鐘。最后，載玻片被空氣干燥1分鐘。然后玻璃蓋玻片使用含有DAPI (4,6- 二脒基_2_苯基吲哚，SIGMA公司)的溶液處理。這樣載玻片可用于使用油浸IOOx物鏡采集圖像(見圖10和圖11)。圖10顯示通過FISH檢測由Cy2標記的特異性位置探針(見兩個亮點/核)對染色體的細胞核的精確檢測，甚至對于基因檢測使用了低豐度序列探針，都證實了測試的有效性。
圖11顯示通過FISH檢測由Cy3標記的著絲粒特異性探針(見兩個亮點/核)對染色體的細胞核的精確檢測，證實了測試的最佳性能。
權(quán)利要求
1.一種微流體裝置，包括載玻片和其中至少存在一個凹槽的部件，所述載玻片和所述部件存在的方式是通過它們的接合形成微通道，其特征在于，至少所述載玻片面向所述微通道的表面區(qū)域被納米結(jié)構(gòu)的金屬氧化物功能化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中所述的納米結(jié)構(gòu)的金屬氧化物由具有 2-50nm，優(yōu)選5-15nm范圍的尺寸分布的納米粒子組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求ι所述的微流體裝置，其中所述的金屬氧化物選自Ti氧化物，ai氧化物或&氧化物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中所述的納米結(jié)構(gòu)的金屬氧化物是薄膜形式。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微流體裝置，其中所述的薄膜具有20nm-200nm之間的厚度。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微流體裝置，其中所述的薄膜具有40nm-60nm之間的厚度并具有5nm-15nm之間的表面粗糙度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中所述的納米結(jié)構(gòu)的金屬氧化物具有多孔結(jié)構(gòu)，其質(zhì)量密度是相應(yīng)的塊狀氧化物的質(zhì)量密度的1/2-1/10。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的微流體裝置，其中所述的氧化物是Ti氧化物，其質(zhì)量密度是致密TW2質(zhì)量密度的1/7，光學(xué)帶隙在3. 2-3. 6eV之間，以及折射率在1. 6-1. 8之間。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的微流體裝置，其中所述的薄膜通過PMCS技術(shù)進行沉積。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中所述的氧化物通過等離子處理使其具有親水性。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置，其中具有凹槽的所述部件是由軟質(zhì)材料制作的襯墊或是硬質(zhì)材料制作的薄板。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的微流體裝置，其中所述的部件是由硅樹脂，氯丁二烯橡膠或聚二甲基硅氧烷(PDMS)制作的襯墊。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的微流體裝置，其中所述的襯墊與所述載玻片可逆地接合。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置(30)，包括上載玻片(31)，所述上載玻片(31) 設(shè)置有用于試劑，氣體和樣品注入的微流體進入孔，包括襯墊(32)，所述襯墊(3 中具有開口，和包括功能化的載玻片(33)，使所述的上載玻片和襯墊(3 的組裝限定所述的凹槽，并且所述襯墊作為墊片確保液體緊密地密封到所述裝置中。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置(40)，包括載玻片(41)，所述載玻片設(shè)置有凹槽和用于進入所述微通道的開口，包括功能化的載玻片G3)和位于所述載玻片之間的密封件(42)，所述的密封件與設(shè)置有凹槽的載玻片中的適合的腔匹配并且所述的密封件上設(shè)置有孔從而不能覆蓋所述的功能化的載玻片的功能化區(qū)域。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微流體裝置(50)，包括設(shè)置有凹槽和用于進入所述微通道的開口的載玻片(51)，和包括功能化的載玻片(53)，其中聚合物層(52)被粘附到具有凹槽的載玻片上凹槽存在的一面，所述的聚合物層設(shè)置有孔，從而不能覆蓋所述的功能化的載玻片的功能化區(qū)域。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求中任何一項所述的微流體裝置在熒光分析檢測中的用途。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的用途，其中所述的檢測是FISH檢測法。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途，其中所述的FISH檢測法根據(jù)包括以下步驟的方案進a)將細胞樣品裝載到權(quán)利要求1-16中任意一項所述的微流體裝置的所述微通道中；b)培養(yǎng)所述的細胞；c)用乙醇和弱羧酸的溶液固定所述的細胞；d)用SSC沖洗；e)用胃蛋白酶溶液沖洗；f)用甲醛溶液后序固定；g)加入一系列乙醇溶液；h)加入變性劑溶液；i)重復(fù)一次步驟g)；j)加入標記探針并進行培養(yǎng)； k)從所述載玻片上移除構(gòu)成所述微通道的所述部件； i)用含有SSC和NP40的溶液進行沖洗， 其中所述的細胞樣品是細胞懸液的形式。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的用途，其中所述的細胞懸液是非粘附細胞的懸液。
21.根據(jù)權(quán)利要求19或20所述的用途，其中所述的非粘附細胞是活細胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中所述的細胞是固定細胞。
全文摘要
本申請要求保護適用于免疫熒光分析的微流體裝置和相應(yīng)的方法。所述的裝置包括兩個平面組件，其中一個組件的一個表面上具有凹槽。當(dāng)這兩個平面組件組合時，所述的凹槽變成一個通道。沒有凹槽的組件用金屬氧化物的納米粒子進行功能化在組裝所述的裝置時被金屬氧化物的納米粒子功能化的這一層構(gòu)成所述通道的底部。功能化的目的是使細胞更好的粘附在通道底部，以便于進行熒光測試，特別是在所述裝置上進行FISH測試。
文檔編號B01L3/00GK102308005SQ201080005400
公開日2012年1月4日 申請日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月26日
發(fā)明者伊曼紐爾·巴爾博里尼, 羅伯塔·卡博尼, 達里奧·班迪耶拉 申請人:泰希斯有限公司