專利名稱：細(xì)胞、顆粒和其它分析物的多重分析的制作方法
細(xì)胞、顆粒和其它分析物的多重分析相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2009年4月21日提交的美國臨時申請?zhí)?1/171，275的權(quán)益，其通過引用結(jié)合到本文中。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及細(xì)胞例如微生物和其它分析物例如生物分子的分析的領(lǐng)域。環(huán)境、食物和臨床樣品中病原生物、其它細(xì)胞和生物分子的分析例如檢測和鑒定對人和動物安全、健康和福利是重要的。由于人口統(tǒng)計和其它因素，暴露于環(huán)境中的病原體導(dǎo)致越來越多的健康問題。因素包括人口增長和城市化、大氣和水資源污染增加、由遷移、國際貿(mào)易和與動物種群接觸導(dǎo)致的病原體傳播。細(xì)菌和真菌污染是包括制藥、美容、眼護理產(chǎn)品和半導(dǎo)體在內(nèi)許多行業(yè)的重大關(guān)注。細(xì)菌污染的疑似和實際發(fā)生事件已導(dǎo)致昂貴和損害性的產(chǎn)品召回。同樣，由食物傳播的病原體導(dǎo)致的疾病是重大健康問題。據(jù)估計，在美國受污染食物每年致使7. 6X IO7例疾病、325，000例住院治療和5000例死亡(Mead, PS等，1999，Emerging Infectious Diseases 5(5) :607-625)。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的2001世界衛(wèi)生報告，傳染病和寄生蟲病是世界上的第二大死因。用于檢測和鑒定病原生物體的方法對于這些生物體定居并因而給他們自身(例如手術(shù)期間)或其他人(在療養(yǎng)院和醫(yī)院)造成威脅的個體的篩查，以及對于受感染個體中感染的診斷都是必需的。因此，存在用于寬范圍樣品中病原生物體、其它細(xì)胞和生物分子的分析例如檢測、鑒定和計數(shù)的改進方法的必要。發(fā)明概述總體而言，本發(fā)明特征為用于多孔膜上細(xì)胞、顆粒和其它分析物的分析的多重裝置、系統(tǒng)、方法和試劑盒。優(yōu)選裝置檢測、鑒定并定量復(fù)雜生物樣品例如血液中低水平的微生物。因此，在一方面，本發(fā)明特征為裝置，其包括具有與多個通道流體連通的流體入口的殼體(housing)，其中每一通道與容納用于分析的細(xì)胞、顆粒或與顆粒結(jié)合的分析物的儲存器；一個或多個基本上平面的多孔膜，所述細(xì)胞或顆粒不通過該膜；一個或多個出口(例如允許氣體而不是液體通過的出口)，其中遠(yuǎn)離入口流動的液體在通道間被分開且經(jīng)一個或多個膜流向出口，并且其中儲存器安置在一個或多個膜的上游，即朝向入口。在一個實施方案中，分析試劑結(jié)合到與顆粒結(jié)合的靶分析物。本發(fā)明的任何裝置還可包括用于顆粒的至少一個儲存器，其中所述儲存器安置在入口和一個或多個膜之一之間，并且其中顆粒的儲存器與多個通道的至少一個流體連通。在本發(fā)明的任何裝置中，殼體可包括一部分，通過該部分，在所述膜之一上可進行細(xì)胞或顆粒的光學(xué)分析。本發(fā)明的任何裝置還可包括鄰近膜安置或在膜上安置的用于細(xì)胞或顆粒電分析的電極。本發(fā)明的任何裝置還可包括與膜鄰近的用于細(xì)胞或顆粒磁弛豫分析的磁共振檢測器。本發(fā)明的任何裝置還可包括安置在膜和出口之間的廢料儲存器。本發(fā)明的任何裝置還可包括容納液體試劑的儲存器，其安置在入口和膜之間且通過閥與通道分開。本發(fā)明的任何裝置可包括安置在入口和膜之間且與通道流體連通的容納樣品的儲存器，任選還包括通過閥與所述樣品儲存器分開的容納液體試劑的儲存器。本發(fā)明的任何 裝置還可包括安置在入口和膜之間的溫度傳感器、加熱或冷卻元件、和/或被動混合器或主動混合器元件。在某些實施方案中,通道具有基本上相同的流體抗性(fluidic resistance)。在其它實施方案中，容納分析試劑的儲存器安置在通道內(nèi)。替代地或此外，儲存器通過閥與通道分開。本發(fā)明的任何裝置還可包括多個分析試劑的儲存器，其中每一儲存器與多個通道中的至少一個流體連通。例如，多個儲存器中的每一個與多個通道的一個且僅一個流體連通。這樣的儲存器可與通道安置或通過儲存器閥分開。當(dāng)通過儲存器閥分開時，裝置還可包括多個通道閥，當(dāng)其關(guān)閉時，防止通道和入口之間的流動。在某些實施方案中，分析試劑的儲存器與每一通道流體連通，使得分析試劑遠(yuǎn)離A口的流動在通道間被分開。用于本發(fā)明裝置的膜優(yōu)選基本上非熒光的和/或通過醇、酸或堿抵抗降解。本發(fā)明的任何裝置還可包括樣品室和液體試劑室，其中所述樣品室和液體試劑室通過閥分開并且安置在入口和多個通道之間。在某些實施方案中，裝置的任何儲存器或室可為機械可變形室，其中所述室的壓縮排出其內(nèi)容物。在相關(guān)方面，本發(fā)明特征為具有用于與本發(fā)明任何裝置配合(mate)(例如插入)的容器(receptacle)的系統(tǒng)并且包括用于將流體從裝置入口泵向裝置出口的致動器；配置為與裝置對接(interface)的溫度控制器，以控制所述裝置中至少一部分的溫度；和配置為與用于分析膜上細(xì)胞、顆?；蚺c顆粒結(jié)合分析物的裝置對接的檢測器(例如光學(xué)檢測器、電檢測器、或者磁弛豫或磁共振檢測器)。該系統(tǒng)還可包括配置為與裝置對接的主動混合器元件，以混合入口和膜之間的兩種流體。該系統(tǒng)還可包括流體儲存器和泵，以將流體從所述儲存器遞送到所述裝置的所述入口。本發(fā)明特征還為使用本發(fā)明的裝置分析樣品(包括細(xì)胞、顆?；蚺c顆粒結(jié)合的分析物)的方法。所述方法包括將樣品引入裝置，允許分析試劑與細(xì)胞、顆?；蚍治鑫锝佑|；捕獲膜上的細(xì)胞或顆粒；并且分析所述膜上的細(xì)胞或顆粒，例如用于檢測、計數(shù)和/或鑒定。用于分析的優(yōu)選試劑包括針對核酸或抗體的探針(例如PNA、DNA或LNA)。所述方法還可包括使細(xì)胞、顆粒或與所述顆粒結(jié)合的分析物與結(jié)合探針或抗體的試劑接觸，從而導(dǎo)致信號放大。分析試劑可經(jīng)標(biāo)記用于光學(xué)、電、放射性或磁檢測。分析試劑還可包括光學(xué)上可區(qū)分的并且與不同細(xì)胞、顆?；蚪Y(jié)合至顆粒的分析物結(jié)合的多種試劑。方法還可包括在檢測前用液體試劑處理樣品。如本文所述的，所述液體試劑可通過主動或被動混合器與樣品混合。在一個實施方案中，裝置包括樣品儲存器和由閥與樣品儲存器分開的液體試劑儲存器，并且主動混合包括致動所述閥并且將液體試劑轉(zhuǎn)移至樣品儲存器或?qū)悠忿D(zhuǎn)移至液體試劑儲存器。還可重復(fù)該過程以移去兩個儲存器之間的液體體積直至達(dá)到所需混合水平。
在其它實施方案中，方法還可包括在裝置中用液體試劑處理樣品(例如稀釋劑、裂解緩沖液或具有與分析物例如生物分子結(jié)合的部分的顆粒)。這樣的處理可用于處理樣品使得目標(biāo)顆粒(例如與分析物結(jié)合的)或細(xì)胞滯留在膜表面上而樣品的剩余部分流過膜。樣品可具有高含量的干擾細(xì)胞，例如可阻塞膜的血液。在一些情況下，樣品可另外包含粘液例如支氣管樣品或蛋白質(zhì)例如尿樣品，其可導(dǎo)致濾器阻塞。如本文所述的，可使用去污劑和酶的組合，以裂解血液細(xì)胞并且溶解細(xì)胞碎片、粘液和/或蛋白質(zhì)而留下基本上完好無損的微生物，例如細(xì)菌和酵母。在這 樣的實施方案中，裝置可包括被動混合器，其經(jīng)安置使得在流經(jīng)裝置的同時并且在接觸膜之前液體試劑與樣品混合。替代地或此外，處理步驟可包括將樣品與液體試劑主動混合。處理步驟還可包括使液體試劑和樣品混合物的溫度在預(yù)設(shè)時間長度內(nèi)提高至指定溫度(例如37°C )。在某些實施方案中，裝置包括樣品儲存器和通過閥與樣品儲存器分開的液體試劑儲存器，其中將樣品引入樣品儲存器，液體試劑儲存于液體試劑儲存器中，并且主動混合包括致動所述閥和將液體試劑轉(zhuǎn)移至樣品儲存器或?qū)悠忿D(zhuǎn)移至液體試劑儲存器。在其它實施方案中，將樣品與具有結(jié)合部分的顆粒在如下條件下接觸其中樣品的分析物例如生物分子與顆粒結(jié)合，顆粒然后由膜捕獲。樣品還可與對照顆粒接觸，對照顆粒隨后在多個通道之間與樣品成比例地被分開，其中所述對照顆粒由膜捕獲。分析試劑儲存器可安置在多個通道內(nèi)的每一個中，其中試劑通過相鄰液體的流動從儲存器釋放?；蛘呋虼送猓治鲈噭┑膬Υ嫫魍ㄟ^閥與多個通道的每一個分開并且致動所述閥導(dǎo)致樣品與試劑接觸。本發(fā)明還括試劑盒，其包括本發(fā)明的裝置和稀釋劑、裂解緩沖液、雜交緩沖液或?qū)φ疹w粒。用于本發(fā)明的示例性樣品是培養(yǎng)物、環(huán)境樣品或生物樣品。示例性細(xì)胞是微生物和/或受試者由于疾病而產(chǎn)生的那些。本文將更詳細(xì)描述本發(fā)明的具體用途。例如，本發(fā)明可用于分析導(dǎo)管相關(guān)血流感染(CR-BSI)或酵母物種(yeast speciation)。本發(fā)明的多重性還得以在裝置的每一通道分析多于一種生物體。例如，裝置可包括4個通道，每個通道包括6種不同試劑，其具有至少3種不同標(biāo)記且在每一通道中可相同或不同。另一裝置包括6個通道，每個通道包括6種不同試劑，其具有至少3種不同標(biāo)記且在每一通道中可相同或不同。本發(fā)明省去了動手步驟；允許對單個樣品進行多重測試；自動對測定評分；增加測試靈敏度以允許直接分析樣品例如血液中低水平的分析物，例如生物分子和細(xì)胞，例如微生物；提供細(xì)胞計數(shù)；并且使得能夠現(xiàn)場護理(point-of-care)和現(xiàn)場試驗(point-of-test)應(yīng)用。本發(fā)明在高度濃縮細(xì)胞樣品例如血液中對酵母的靈敏度為至少1-lOcfu/mL，對細(xì)菌的靈敏度為10-100Cfu/mL。本發(fā)明還為各種類型細(xì)胞提供寬動態(tài)范圍的靈敏度。本發(fā)明微生物的分析例如檢測和鑒定允許采取預(yù)防和改善行動并且做出醫(yī)療處理決定。此外，本發(fā)明樣品細(xì)胞例如微生物的計數(shù)可提供決策必需的信息。在臨床微生物學(xué)中，例如尿、支氣管灌洗液和其它身體樣本中的細(xì)菌通常必須以超過預(yù)設(shè)閾值水平的濃度存在，以便認(rèn)為是需要臨床介入的真感染。在輸液醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，測試血小板濃縮物的細(xì)菌存在情況。根據(jù)FDA指導(dǎo)方針，細(xì)菌水平低于lOOOcfu/ml的濃縮物被認(rèn)為可接受用于輸液用途。定量分析還允許測定時間趨勢、空間分布和化學(xué)靈敏度。從以下描述、附圖和權(quán)利要求中，其它特征和優(yōu)點將變得明顯?！皟Υ嫫鳌笔侵秆b置中的容量(volume)，所述裝置中以液體、凝膠或固體形式儲存試劑或容納一定體積的流體(例如樣品或緩沖液)。儲存器可為裝置內(nèi)的室，其與裝置內(nèi)的通道物理分開并且需要致動來打開，以使試劑或流體量與裝置的另一部分接觸。或者，儲存器可為試劑的受限等分試樣，例如經(jīng)干燥或其它方式與通道壁粘附，在此情況下，流經(jīng)裝置的液體將在不致動(不同于流動所需要的)情況下與儲存器接觸。“與……流體連通”是指允許與流體接觸或流體之間的流動。根據(jù)本發(fā)明所用的術(shù)語，通過關(guān)閉閥(例如夾閥或脆性密封(frangible seal))分開的裝置區(qū)域彼此流體連通。
“靶細(xì)胞或顆粒不通過的多孔膜”是指具有一定大小的孔的膜，以防止靶細(xì)胞或顆粒在未裂解或破碎的情況下通過?！肮鈱W(xué)檢測可通過其進行”是指允許所檢測波長的光在例如紅外、可見光、紫外光譜中透過?！氨粍踊旌稀笔侵覆恍枰芰枯斎氲幕旌?，其不同于在其它固定流體結(jié)構(gòu)中流體流動所需的?！爸鲃踊旌稀笔侵感枰绱诺幕驒C械的能量輸入的混合，其不同于流體流動所需的。附圖簡述

圖1A-1C是本發(fā)明裝置的底部、橫截面和頂部的示意圖。圖2是本發(fā)明備選裝置的展開圖。圖3是本發(fā)明另一裝置的流體通道、閥和儲存器的示意圖。圖4A-4B是本發(fā)明裝置的側(cè)視圖和頂視圖。圖5是圖4A-4B裝置的流體通道、閥和儲存器的示意圖。圖6是用于混合流體的通道結(jié)構(gòu)示意7A-7B是圖6所示通道中流體混合以及結(jié)合到此通道的裝置的圖解描述。圖8A-8B是在有背光和沒有背光的情況下，部分涂有鋁的膜上的熒光顯微照片。圖9用于支持膜以確保平面性的結(jié)構(gòu)的圖解描述。圖10A-10D是通道中點樣(spot)的試劑的溶解圖。圖11A-11F是4-通道裝置中所用分析試劑的圖解描述以及用各種樣品獲得的結(jié)果。圖12A-12I是使用圖IA-1C裝置的方法的圖解描述。圖13是一系列熒光顯微照片，其顯示隨著細(xì)胞與雜交試劑接觸并隨后被洗滌的圖像變化。圖14A-14B是熒光顯微照片，其顯示在6-通道裝置中對含有不同酵母菌株的樣品進行試驗的結(jié)果。圖15是本發(fā)明的系統(tǒng)的示例性框圖。發(fā)明詳述本發(fā)明提供用于多重分析細(xì)胞例如微生物和其它分析物例如生物分子的裝置、相關(guān)系統(tǒng)、試劑盒和它們的使用方法。裝置總體而言，本發(fā)明提供多重裝置，其將樣品分為兩個或更多個等分試樣用于在一個或多個流通道中平行或連續(xù)分析。裝置還采用多孔膜，以使樣品中生物細(xì)胞或顆粒與溶解或更小組分分離。在與儲存在裝置上的一種或更多種試劑接觸后，細(xì)胞被分析例如經(jīng)光學(xué)分析。通道可經(jīng)設(shè)計，例如通過全長或橫截面面積設(shè)計以均等或不均等分開樣品。裝置的多重性允許連續(xù)或平行測定單個樣品的許多不同生物體。替代地或者此夕卜，多重裝置允許對同一樣品進行重復(fù)測定。裝置上樣品分開允許在不同條件下平行測定同一樣品的等分試樣。例如樣品的每一等分試樣可與不同試劑一起使用、采用不同分析技術(shù)或采用不同樣品處理條件(例如溫度或化學(xué)修飾)或采用不同多孔膜(例如以阻留不同大小的細(xì)胞或其它分析物)。通過使用多種分析技術(shù)可增加 多重性。例如通過使用針對不同分析物具有可區(qū)分顏色的試劑，用多種波長的光學(xué)檢測將允許在每一流通道中對多于一種分析物進行分析。當(dāng)預(yù)期不同類型的細(xì)胞以不同數(shù)目存在于樣品中時，可使用不均等樣品分開。不均等樣品分開允許遞送適當(dāng)體積用于測定；例如以較大數(shù)目存在的細(xì)胞所需體積小于以較小數(shù)目存在的細(xì)胞所需體積。不均等樣品分開還允許在靈敏度范圍內(nèi)測定單個樣品的相同類型細(xì)胞，例如當(dāng)樣品中可能存在的細(xì)胞數(shù)目高度變化時。參考具體實施例，現(xiàn)在將更詳細(xì)描述本發(fā)明。圖1A-1C顯示本發(fā)明的裝置。裝置包括用透明帶密封的模制體外殼。在該實施方案中，裝置經(jīng)設(shè)計使得僅需一個模制部件來限定多個通道。多孔膜如所示的粘附到體部。單次使用的盒(cartridge)包含所有分析試劑并儲存生成的廢料。該裝置包括由其載入樣品的單個入口和分開樣品并將樣品體積的一部分引導(dǎo)至多個(例如6個)通道的每一個的結(jié)構(gòu)。這些通道的每一個包括試劑儲存器，其經(jīng)干燥或另外沉積在通道表面上用于分析細(xì)胞、顆粒或其它分析物。試劑與靶細(xì)胞或顆粒(例如結(jié)合的分析物)中的組分相互作用例如結(jié)合并且允許例如用熒光成像分析。該裝置允許例如通過對每一通道不同膜區(qū)域成像來分析。備選的裝置示于圖2和3。這些裝置包括儲存測定中所用液體試劑的泡罩包(blister pack)即儲存器。如本領(lǐng)域公知的，泡罩包是廣泛用于儲存處方和非處方藥丸和膠囊的結(jié)構(gòu)。泡罩包還可用于儲存流體，例如在美國專利5，374，395中所描述的。泡罩包可通過冷成型鋁和聚合物層壓件制成，以產(chǎn)生空腔和熱結(jié)合兩層或更多層從而形成密封室和流通道?？蛇M行熱結(jié)合使得特定區(qū)域的結(jié)合是脆性的。當(dāng)在泡罩的內(nèi)容物中生成足夠壓力時，充當(dāng)閥的脆性結(jié)合經(jīng)設(shè)計將產(chǎn)生通道。脆性結(jié)合的存在為泡罩包提供密封形式的長儲存期，同時允許內(nèi)容物排出到裝置的流通道。還可使用用于儲存液體試劑的其它室結(jié)構(gòu)(例如剛性室，其內(nèi)容物通過活塞、泵或其它力排出)。圖2和3的裝置可包括殼體，其具有用透明帶和泡罩箔密封的單個模制體。將這些裝置中多個樣品通道的每一個連接至儲存分析試劑的儲存器(例如含肽-核酸(PNAs)的雜交緩沖液(Hybe))和用于分離用于分析的細(xì)胞、顆?；蚱渌治鑫?例如與顆粒結(jié)合的分析物)的多孔膜。儲存器通過閥與通道分離，例如破裂閥，例如脆性密封，其在致動前保持關(guān)閉。裝置還可包括用于其它試劑例如所示的push試劑、裂解試劑和洗滌緩沖液的一個或多個儲存器。該裝置包括閥例如夾閥，其用于分離每一通道與裝置的其它部分。當(dāng)分析試劑儲存器和洗滌緩沖液儲存器被致動時，這些閥關(guān)閉以防止回流。本發(fā)明的裝置還可包括不通過膜的通道，如圖3所示，允許用于壓力釋放或用于樣品或試劑溢流的替代途經(jīng)。另一裝置示于圖4A-4B和5。該裝置還使用用于容納試劑(雜交緩沖液)和任選洗滌緩沖液的儲存器。此外，該裝置包括用于裂解緩沖液和“push”緩沖液的儲存器。此外，這些儲存器保持分離狀態(tài)直至閥例如破裂閥致動。該裝置允許血液細(xì)胞(或與分析試劑接觸前，其它樣品處理)的裝置上裂解?？蓪⑺鰳悠芬胫翗悠防缪?、室并與裂解試劑或其它試劑混合?；旌衔锟呻S后在裝置上兩個儲存器之間例如混合物和樣品儲存器之間移動，以確保兩種流體的完全混合。在該實例中，使用壓力口，流體可在儲存器之間移動，其中一個儲存器中的正壓力使液體移向另一儲存器?；蛘撸?fù)壓力可用于將一個儲存器的液體牽引至另一儲存器?！皃ush”儲存器中的流體還可用來確保全部樣品被推動經(jīng)過膜。一旦載入樣品，該裝置能夠儲存完成測定必需的所有流體和試 劑。試劑可按干燥的形式儲存于裝置中?？蓪⒃噭┤芤狐c樣(spot)在裝置中的一個或多個通道壁上并且在制造過程中干燥?；蛘?，在制造期間經(jīng)干燥試劑的珠可加入裝置中。流體儲存器的使用和在儲存器之間來回移動流體的能力還可與經(jīng)干燥試劑聯(lián)合使用，所述經(jīng)干燥試劑儲存于裝置中并且可在適當(dāng)時間在裝置上溶解以進行測定。除使用用于混合兩種流體的多個室之外，還可使用任何其它合適的混合技術(shù)。被動混合技術(shù)在圖6中說明。在該技術(shù)中，通道包括使用無序混合(chaotic mixing) (Leong等Phys Rev Lett. 1990 ;64 :874-877)來被動混合兩種流體的結(jié)構(gòu)(Stroock等Anal.Chem. 2002 ；74 =5306-5312)。這樣的通道可并入如圖7A-7B所示的蛇紋設(shè)計中。還可使用主動混合技術(shù)，例如機械或磁攪拌棒、機械振搖或超聲混合的使用。在這樣的實施方案中，主動混合器元件可包括在裝置中，例如在樣品儲存器、裂解液儲存器、混合物儲存器或通道中。例如裝置可包括磁攪拌棒或機械旋轉(zhuǎn)組件，其由裝置中其它元件致動或與裝置配合，所述裝置例如為用于機械攪拌的旋轉(zhuǎn)磁鐵或旋轉(zhuǎn)馬達(dá)。本發(fā)明的裝置可由任何合適材料制成。例如裝置的殼體通過熱壓紋(hotembossing)并用聚烯烴帶(3M 9795R)密封以環(huán)烯烴共聚物(例如Topas 5013或Zeonex)制成。該帶結(jié)合了基于硅氧烷的粘合劑，其適用于其中使用含有醇的緩沖液的裝置。還可使用其它聚合物例如環(huán)烯烴聚合物、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯。除了熱壓紋之外，還可使用其它制造技術(shù)例如注塑。本發(fā)明的裝置還包括一個或多個出口以允許流體泵送期間液體或氣體逸出。優(yōu)選地，裝置包括用于儲存廢料液體和試劑的儲存器例如以允許阻封潛在生物危害的廢料和便于處理。出口可用合適材料覆蓋以防止(或基本上阻礙)液體流過而允許氣體逸出。膜。本領(lǐng)域公知用于分離細(xì)胞、其它顆粒和其它分析物(例如與顆粒結(jié)合的分析物)與流體和更小碎片的合適膜。通常，這樣的細(xì)胞或顆粒尺寸將大于0.1 ym?？墒褂谜澈蟿?、熱結(jié)合、超聲焊接、激光焊接或壓配合使膜粘附到裝置。用于各通道的膜可作為裝置中的單個元件(例如跨越所有通道的單個條帶材料)或多個元件提供。當(dāng)膜是單個元件時，所用材料優(yōu)選不具有側(cè)向孔隙率(lateral porosity)，使得在裝置中各自的等分試樣不混
口 o示例性膜示于表I。徑跡蝕刻膜具有通過蝕刻穿過聚碳酸酯(或聚脂)的膜而生成的圓柱狀孔。Anopore氧化鋁膜通過鋁上電解氧化物形成隨后鋁溶解而產(chǎn)生。這些膜是平整的并且具有高的孔隙率。基底(substrate)易碎,這可能是缺點。Black Nylon是碳顆粒摻入尼龍線的深度濾器(cbpth filter)。它不像其它濾器那么平整。表I.
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化鋁剛硬粘合的Black Nylon CUNO (3M) 低吸收劑有織紋的枯合的超
(textured) 聲 柔順膜的優(yōu)選特性包括孔徑大小0. 4至0. 8 ii m ;孔密度> 3X107/cm2 ;平整和光滑表面；通過任何合適方法可與塑料結(jié)合；背景熒光低；入射光吸收足夠低使得光學(xué)檢測期間的膜加熱不會過度。膜還優(yōu)選對分析試劑的非特異性結(jié)合有抗性。7_2的面積通常足以用于分析處理ImL樣品例如血液的6-通道裝置的每一通道中的細(xì)胞。膜可用染料(例如依加侖黑(irgalan black))處理或經(jīng)涂覆用于減少背景突光和改善成像。依加侖黑-染色的聚碳酸酯膜濾器從若干供應(yīng)商(Sterlitech,SPI Supplies等)購得。示例性涂料包括炭黑、無電鍍鎳、派踱金或金-鈕和蒸發(fā)招(Durtschi等Journalof Medical Microbiology 2005 ;54 :843-850 和 Nishimura 等 Fisheries Science 2006 ；72 :723-727)。具體的膜包括孔徑大小為0. 6 ii m、9 ii m厚和3 X IO7孔/cm2的徑跡蝕刻聚碳酸酯膜；涂有50nm鋁涂料的PVP (聚乙烯吡咯烷酮)；以及孔徑大小為0. 4 y m、10 y m厚、I X IO8孔/cm2、不含PVP、涂有50nm鋁涂料的徑跡蝕刻聚碳酸酯膜。鋁涂層具有顯著優(yōu)點，包括背景熒光低；激發(fā)光的吸收低并因此產(chǎn)熱少，允許快速成像；表面光滑；無浸出(no leaching);孔開放并且可伸縮；制造成本低。圖8A-8B顯示涂覆和未涂覆膜上細(xì)胞的顯微照片。鋁在高和低pH時具有反應(yīng)性。鋁涂層可受到堿或酸介質(zhì)腐蝕。若在測定中使用堿或酸介質(zhì)，則可用SiO2外涂層使鋁免受腐蝕?？讖酱笮?. 8 i! m、9 i! m厚和3 X IO7孔/cm2、涂有50nm招和50nmSi02的徑跡蝕刻聚碳酸酯膜適合與堿性介質(zhì)使用。對于光學(xué)檢測，膜優(yōu)選基本上為平面的。如圖9所示，支持結(jié)構(gòu)可用于保持平面性。也合乎需要的是，膜和成像光學(xué)器件(optic)之間液體量的最小化例如通過使通道深度最小化。到膜表面的光學(xué)通路通過透明層或壁提供。該層可為密封帶、模制殼體的壁或透明材料例如玻璃的窗，其以密封方式附著到裝置。光學(xué)檢測器還可置于裝置內(nèi)部并且從外部不可見。
額外組件本發(fā)明的裝置還可包括例如用于樣品引入、移動、分析和儲存的額外元件。例如，本發(fā)明的裝置可包括接受樣品的儲存器并且還包括用于接受取樣器具(例如拭子、移液器或注射器針頭)的樣品室中的容器。這種容器的實例包括裝置中的間隔(septa)和開口。在取樣工具已將樣品引入后可關(guān)閉任何開口，或者取樣工具可通過間隔或墊圈密封到裝置。本發(fā)明的裝置還可包括一個或多個光學(xué)傳感器，例如如圖5所示。傳感器可用于確定特定量流體例如血液或含有光學(xué)可檢測試劑的流體何時流經(jīng)裝置。其它類型的傳感器例如電極或溫度傳感器也可用于此目的。
本發(fā)明的裝置還可包括植入裝置中或安置在裝置附近的加熱元件例如電阻加熱元件以控制溫度。溫度傳感器例如熱敏電阻或熱電偶可用于監(jiān)測溫度和/或提供恒溫器控制。本發(fā)明的裝置還可包括用于分析的元件，包括光學(xué)元件，例如濾波器、鏡片和光源(例如LED)以及電極,例如用于電導(dǎo)率(conductivity)、伏安法、電流測定法。還將理解的是，可將本發(fā)明的裝置制成本文所述那些元件的變型。裝置還可包括與多個獨立通道連接的兩個或更多個獨立入口，例如以測定在同一裝置上的兩個或更多個樣品或者同一樣品的兩個或更多個等分試樣。裝置還可同時或連續(xù)采用多于一種類型的分析；例如樣品可通過光學(xué)或電學(xué)測定。在這樣的結(jié)構(gòu)中，裝置可包括用于每一方法的多種分析試劑，或者一種或多種分析方法可依賴于樣品的固有性質(zhì)。裝置可包括不同類型的儲存器；例如單個裝置可采用粘附到通道壁的試劑和儲存于用閥密封的室中的分析試劑。裝置可包括任何數(shù)量的用于樣品分開的通道，并且每一通道可采用相同或不同分析方法和/或分析試劑。系統(tǒng)本發(fā)明還包括用于分析和/或致動所述裝置的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括用于例如通過插入與裝置配合的容器。取決于所用的裝置類型，系統(tǒng)可包括流體儲存器和用于遞送和移動試劑和/或樣品通過該裝置的泵。替代地或者此外，系統(tǒng)包括用于裝置上的閥致動器。對于破裂閥，此類致動器可施加足夠的機械壓力以使閥上的密封破裂。夾閥還可通過施加到夾點(pinch point)的機械壓力而致動。其它閥方案為本領(lǐng)域公知。裝置中含有流體的閥的壓縮也可用于泵送裝置中的流體，避免需要單獨的閥。系統(tǒng)還包括檢測器，通常是光學(xué)成像儀。若使用光學(xué)成像儀，則通常配置用于熒光檢測，然而其他光度測定的檢測是可能的，例如吸光度、磷光、濁度分析法和化學(xué)發(fā)光。成像儀可包括光源，例如發(fā)光二級管(LED)、激光或?qū)拵г蠢缁」饣虬谉霟?，其適合用于被檢測的光學(xué)信號。示例性光源使用三種LED;例如用于熒光素或Alexa 488的藍(lán)色(457nm)；例如用于Tamra或Alexa 532的綠色(525nm);以及例如用于Cy5或Alexa 647的紅色(640nm)。具有高輸出的LED可得自Luminus Devices, Inc (Billerica,MA)。成像儀還包括物鏡。示例性的物鏡特性是20 X放大倍數(shù)、0. 45數(shù)值孔徑(NA)和I. 25mm視野(FOV)。更優(yōu)選地，IOX放大倍數(shù)、0.45NA物鏡(Nikon Inc,Melville,NY)可與成像鏡片使用，其提供17. 5X的總放大倍數(shù)和2. 5mm F0V。成像儀還可包括光敏組件例如光電二極管、電荷耦合器件(CXD)陣列或光電倍增管(PMT)。放大倍數(shù)17. 5 X的光學(xué)系統(tǒng)可與格式為4872X3248像素的7. 4微米像素CXD照相機(DVC，Austin，TX)組合以對2. 5mm FOV成像。還可采用如本領(lǐng)域熟知的光學(xué)纖維和鏡片。特別合適的熒光團和濾波器示于表2。表2
)

可通過將電極并入裝置中使用非光學(xué)方法例如電化學(xué)方法。隨后電極連接至系統(tǒng)中的電路。這樣的測量實例包括電流測定法、循環(huán)伏安法或電導(dǎo)率。尿樣本中病原體的電化學(xué)分析已通過聯(lián)合使用塑料基底上的金電極與DNA捕獲和分析探針而實現(xiàn)(Liao等Journal of Clin Microbiol 2006 ;44 :561-570)。血液和其它樣品中特定寡核苷酸的分析已用涂有自裝配烷硫醇單層的金電極上的氧化還原標(biāo)記的DNA莖-環(huán)探針的交流伏安法而實現(xiàn)(Lubin 等 Anal. Chem. 2006 ;785671_5677)。還可使用磁檢測或放射性檢測。例如磁弛豫測量可用于分析病原體例如鳥分支桿菌副結(jié)核種(Mycobacterium avium spp. Paratuberculosis),其基于磁納米顆粒的聚集(Nano Lett. ,2007 ； :380-383)。系統(tǒng)還可包括用于裝置溫度控制的加熱和冷卻系統(tǒng)，例如從20_80°C。加熱和冷卻可通過元件實現(xiàn)，所述元件為裝置的一部分或當(dāng)插入系統(tǒng)時與裝置接觸。加熱和冷卻可通過珀耳帖元件、電阻加熱元件、散熱裝置、冷卻扇或加熱/冷卻的循環(huán)流體而實現(xiàn)。加熱和冷卻還可通過當(dāng)插入系統(tǒng)時的裝置周圍加熱或冷卻空氣流而實現(xiàn)。系統(tǒng)還可包括用于分析例如檢測和/或計數(shù)裝置的膜上的細(xì)胞、顆?；蚍治鑫?例如與顆粒結(jié)合的分析物)的軟件?；陬伾⑿螤?、大小、亮度或第二形態(tài)(secondarymorphology)(例如成簇)，軟件還可用于區(qū)分不同類型的細(xì)胞、顆?；蚍治鑫?例如與顆粒結(jié)合的分析物)。這樣的軟件可購自許多銷售商例如Metamorph(MDS)和Image Pro (MediaCybernetics)或可使用數(shù)學(xué)軟件例如MATLAB(Mathworks)創(chuàng)建。軟件的性質(zhì)還取決于所用的分析方法。可提供其它組件。例如可包括條形碼閱讀器用于掃描裝置上的鑒定鑒定標(biāo)簽和與樣品相關(guān)的患者標(biāo)識符。這樣的條形碼閱讀器可構(gòu)建入系統(tǒng)中或可以是通過導(dǎo)線(cable)或無線連接連接至系統(tǒng)的外部手提類型。打印機可用于生成打印的讀出結(jié)果，其可并入患者圖表或病歷。系統(tǒng)還可包括用于連接至設(shè)備中主機(例如醫(yī)院信息系統(tǒng))的硬件和軟件。系統(tǒng)的元件可一起安裝在單個單元中或者可為分開的組件。此外，盡管將用于分析、流體移動和溫度所需的元件描述為系統(tǒng)的一部分，但與裝置配合至系統(tǒng)相反的是，所述元件可集成至裝置、系統(tǒng)或介于兩者之間，如本文所描述。示例性系統(tǒng)框圖示于圖15。方法本發(fā)明的裝置用于分析各種樣品中細(xì)胞、顆粒和其它分析物(例如與顆粒結(jié)合的分析物)。用于本發(fā)明的步驟通常包括使樣品(其可經(jīng)預(yù)處理)通過裝置，使得細(xì)胞、顆粒和其它分析物沉積于膜上。如本文所述，使細(xì)胞、顆粒和其它分析物(例如與顆粒結(jié)合的分析物)與分析試劑接觸并且成像或另外進行分析。還可采用洗滌步驟以去除可干擾精確測量的任何分析試劑。在一些方法中，將細(xì)胞裂解以釋放其內(nèi)容物。靶生物分子例如DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和它們的復(fù)合物可隨后捕獲在裝置中提供的顆粒例如珠上。樣品中的分析物還可在引入裝置中之前，結(jié)合至顆粒。顆粒通常用結(jié)合部分例如抗體或針對核酸的序列特異性探針(其經(jīng)設(shè)計用于捕獲靶分析物)表面功能化。這樣的顆粒是本領(lǐng)域熟知的，例如膠乳珠、二氧化硅珠和順磁珠。捕獲步驟之后，顆?；旌衔锿ㄟ^裝置并沉積在膜上。分析可如細(xì)胞的情況一樣進行。例如顆粒可以是熒光的。 在Luminex xMAP系統(tǒng)中，具有不同結(jié)合部分的顆粒可發(fā)出與熒光不同的顏色。這樣的顆粒隨后可經(jīng)混合并通過發(fā)射顏色區(qū)分。這允許在同一測定中分析多個分析物。用報告熒光團標(biāo)記的結(jié)合部分可用于分析例如檢測和定量分析物。若顆粒是熒光的，則報告熒光團與顆粒的顏色不同。方法還可用于分析任何類型的細(xì)胞。例如方法可用于鑒定以下來源的生物體培養(yǎng)物、環(huán)境樣品例如空氣、水、土壤或工業(yè)樣品或生物樣品例如血液、血漿、血清、支氣管肺泡灌洗液、氣管內(nèi)吸出物、痰、尿、腦脊液(CSF)和淋巴。方法可用于分析植物細(xì)胞、動物細(xì)胞、細(xì)菌、真菌(例如酵母菌)和原生生物，例如以鑒定特定生物體種類或其它分類例如細(xì)菌的、真菌的或原生生物。示例性的用途用于鑒定感染性生物體，例如血液培養(yǎng)物中酵母或細(xì)菌種類，和用于檢測和鑒定導(dǎo)管相關(guān)血流感染(CR-BSI)。例如酵母分析可用于鑒定白假絲酵母(C. albicans)、平滑假絲酵母(C. glabrata)、克魯斯假絲酵母(C. krusei)、近平滑假絲酵母(C. parapsilosis)和熱帶假絲酵母(C. tropicali)。該方法還可用于區(qū)分金黃色葡萄球菌(S. aureus)對比凝固酶-陰性葡萄球菌(CNS);糞腸球菌(E. faecalis)對比其它腸球菌；大腸桿菌(E. coli)和肺炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae) (EK)對比銅綠假單胞菌(P. aeruginosa);白假絲酵母對比其它假絲酵母屬(Candida);以及血液培養(yǎng)物或CR-BSI中的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性生物體(任選)。本發(fā)明的方法還可用于測定來自患者的細(xì)胞，例如用于診斷疾病狀態(tài)。這樣的細(xì)胞包括癌細(xì)胞、紅細(xì)胞和白細(xì)胞、祖細(xì)胞、干細(xì)胞、胎兒細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和血小板。微粒細(xì)胞器例如細(xì)胞核、葉綠體、線粒體還可在與其它用于分離的顆粒結(jié)合或不結(jié)合的情況下進行分析。優(yōu)選分析試劑是標(biāo)記的核酸結(jié)合探針，例如WO 2005/121373所描述的PNA FISH探針(該專利通過引用結(jié)合到本文中)，DNA和LNA探針。探針可用多種可檢測標(biāo)簽標(biāo)記，包括熒光團、酶(例如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)、電化學(xué)活性標(biāo)記、磁顆粒、生物素和半抗原。其它分析試劑包括標(biāo)記的抗體、適體和細(xì)胞內(nèi)染料。還可使用用于免疫測定的試齊U，例如ELISA所用的抗體-酶綴合物。試劑可儲存在儲存器中的裝置上，例如通道中的密封室或經(jīng)干燥或膠化位置。對于沉積在通道上的試劑，幾何形狀和基質(zhì)決定溶解試劑必需的時間。圖10A顯示幾何形狀對溶解的影響。如該圖所示，平整表面(菱形)上的沉積比孔(正方形、三角形)中沉積導(dǎo)致更快釋放?？椎膶挾扰c深度的比率也影響釋放速率，其中較窄較深的孔(三角形)導(dǎo)致釋放較慢。圖10B顯示基質(zhì)對溶解的影響。蔗糖(正方形)和無基質(zhì)(菱形)比葡聚糖硫酸酯基質(zhì)(三角形)導(dǎo)致釋放更快。圖10C-D顯示以下不同基質(zhì)對溶解速率的影響360kDa聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(正方形)、葡聚糖硫酸酯(DS)(三角形)和甘露糖(正方形)。PVP比甘露糖或葡聚糖硫酸酯的釋放快。額外的基質(zhì)材料包括聚乙烯醇和聚乙二醇。光學(xué)檢測可為單色的或多色的?？捎玫臒晒鈭F集合包括FITC(或Alexa 488)/Tamra/Cy5(或 Alexa 647)、FITC/Texas 紅色/Cy5 和 Alexa 405/FITC/Texas 紅色。原則上，三色的使用允許我們編碼裝置每一通道中的7個實體(entity)。這樣的實例示于圖11A-11F。圖IlA顯示對于4道裝置的道分配。I道包括用于金黃色葡萄球菌和對照生物體(C. 0.)的綠色標(biāo)記(FITC)試劑；用于CNS和C. 0.的紅色標(biāo)記試劑(Tamra);以及用于革蘭氏陽性(G+)和泛真菌(pan fungal)的紫色標(biāo)記試劑(Cy5)。2道包括用于糞腸球菌和C.O.的綠色標(biāo)記試劑；用于其它腸球菌(OE)和C.O.的紅色標(biāo)記試劑；以及用于革蘭氏陽性(G+)和泛真菌的紫色標(biāo)記試劑。3道包括用于 大腸桿菌+肺炎克雷伯氏菌(EK)和C. 0.的綠色標(biāo)記試劑；用于銅綠假單胞菌(P. aer)和C. 0.的紅色標(biāo)記試劑；以及用于革蘭氏陰性(G-)和泛真菌的紫色標(biāo)記試劑。4道包括用于白假絲酵母和C.O.的綠色標(biāo)記試劑；用于其它假絲酵母屬種(0假絲酵母)和C.O.的紅色標(biāo)記試劑；以及用于全體細(xì)菌(Bac Uni)和泛真菌的紫色標(biāo)記試劑。圖IlB顯示包括金黃色葡萄球菌的樣品的結(jié)果。在該測定中，在I道中，金黃色葡萄球菌細(xì)胞將被染成綠色和紫色，并且C.O.將被染成綠色、紅色和紫色；在2道中，金黃色葡萄球菌細(xì)胞將被染成紫色，并且C. 0.將被染成綠色、紅色和紫色；在3道中，金黃色葡萄球菌將不會被染色，而C. 0.將被染成綠色和紅色；在4道中，金黃色葡萄球菌將被染成紫色，并且C.O.將被染成綠色、紅色和紫色。結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌存在于樣品中而不含酵母菌或其它細(xì)菌于樣品中。圖IlC顯示包括銅綠假單胞菌樣品的結(jié)果。在該測定中，在I道和2道中，銅綠假單胞菌將不會被染色,而C. 0.將被染成綠色、紅色和紫色；在3道中，銅綠假單胞菌將被染成紅色和紫色，并且C. 0.將被染成紅色和綠色；在4道中，銅綠假單胞菌將被染成紫色，并且C.O.將被染成綠色、紅色和紫色。結(jié)果顯示銅綠假單胞菌存在于樣品中，而酵母菌或其它細(xì)菌不存在于樣品中。圖IlD顯示包括棒狀桿菌樣品的結(jié)果。在該測定中，在I道、2道和4道中，棒狀桿菌將被染成紫色，并且C.O.將被染成綠色、紅色和紫色；在3道中，棒狀桿菌將不會被染色，而C. 0.將被染成綠色和紅色。結(jié)果顯示未鑒定的革蘭氏陽性細(xì)菌存在于樣品中，并且對該生物體計數(shù)。圖IlE顯示包括白假絲酵母樣品的結(jié)果。在該測定中，在I道和2道中，白假絲酵母將被染成紫色，并且C.O.將被染成綠色、紅色和紫色；在3道中，白假絲酵母將被染成紫色，并且C. 0.將被染成綠色和紅色；在4道中，白假絲酵母將被染成綠色和紫色，并且C.O.將被染成綠色、紅色和紫色。結(jié)果顯示白假絲酵母存在于樣品中，而細(xì)菌或其它酵母菌不存在于樣品中。圖IlF顯示包括新生隱球菌(Cryptococcus neoforman)樣品的結(jié)果。在該測定中，在I道和2道中，新生隱球菌將被染成紫色，并且C. 0.將被染成綠色、紅色和紫色；在3道中，新生隱球菌將被染成紫色，并且C.O.將被染成綠色和紅色；在4道中，新生隱球菌將被染成紫色，并且C.O.將被染成綠色、紅色和紫色。結(jié)果顯示酵母菌而非細(xì)菌存在于樣品中，并且可對酵母菌計數(shù)。圖12A-12I顯示使用圖1A-1C裝置的方法示意圖。在步驟(a)中，例如經(jīng)吸量管人工加入樣品例如lOOyL-lmL。隨后在步驟(b)中，將裝置連接至系統(tǒng)并且將液體例如600 iiL/min雜交緩沖液泵送經(jīng)過裝置，例如達(dá)3分鐘。在步驟(c)中，繼續(xù)液體的泵送；例如流速降至20 u L/min,并且將裝置加熱至55°C。在步驟(d) - (f)中，繼續(xù)液體的泵送，導(dǎo)致沉積于多個通道的每一個中的分析試劑(例如PNA FISH試劑)釋放(如伸長的橢圓形所示)。這些步驟可進行例如超過27分鐘。在步驟(g)-(h)中，繼續(xù)液體的泵送例如300 ii L/min達(dá)5分鐘，導(dǎo)致從分析物中洗掉未結(jié)合的試劑。隨后對染色的細(xì)胞或顆粒成像，例如在< 350C (步驟(i))下。這些事件的順序圖像示于圖13。示例性方法步驟在實施例中描述。這些步驟可用于本發(fā)明的任何方法。樣品制備
在遞送至裝置前，樣品可經(jīng)或可不經(jīng)預(yù)處理。樣品可經(jīng)處理以消除背景細(xì)胞或以溶解樣品的粘性組分。樣品可經(jīng)預(yù)處理以從源基質(zhì)分離目標(biāo)細(xì)胞或樣品可經(jīng)處理以穩(wěn)定目標(biāo)細(xì)胞或富集目標(biāo)細(xì)胞。例如血液樣品可用抗凝血劑處理或可經(jīng)處理以選擇性裂解血液細(xì)胞。樣品還可經(jīng)過濾以去除非-細(xì)胞碎片。樣品還可經(jīng)稀釋以降低粘度。額外的樣品處理方法包括透化和固定。在分析之前，樣品處理可在或可不在裝置上進行。用于血液樣品的示例性裂解方法涉及將樣品與9份0. 7%吐溫-20、0. OlM磷酸鈉緩沖液和來自蜂蜜曲霉(Aspergillus melleus)的蛋白酶(Amano/Sigma)接觸，并且在37°C加熱I小時。溶液還可按I : I使用，在37°C加熱30分鐘。裂解緩沖液的額外成分可包括脂肪酶、膽固醇酯酶、雙鏈DNA酶、0. IM磷酸鈉緩沖液，以及不同或另外的去污劑(例如皂苷和Triton-X)。在如CR-BSI實例中所述的裝置中進行裂解可能是有利的。內(nèi)部對照本發(fā)明的方法還可使用內(nèi)部對照細(xì)胞或顆粒，例如其可在裂解階段加入至樣品中。對照生物體的實例包括Prototheca wickerhami i (藻類的一種)、椰氏副球菌(Paracoccus yeeii)(革蘭氏陰性)和球形芽抱桿菌屬(Bacillus sphaericus)(革蘭氏陽性桿菌)。這些方法在每道中將使用針對對照生物體的探針；對照生物體還可與存在的其它探針反應(yīng)(例如BacUni或G+，若生物體是革蘭氏陽性菌)。對照生物體的形態(tài)可用作附加的標(biāo)識符。內(nèi)部對照的使用得以確定該方法是否恰如其分的起作用并且可用于說明裝置中樣品的不均等分開。實施例I-酵母菌分析設(shè)計假絲酵母物種板(Candida Speciation Panel)以分析血流感染中5個最普遍的假絲酵母種白假絲酵母、平滑假絲酵母、克魯斯假絲酵母、近平滑假絲酵母和熱帶假絲酵母。它還包含通用酵母菌探針、其用于確定樣品是否為酵母。假絲酵母物種板使用基于甲醇的PNA FISH測定，這可參見WO 2005/121373。整個測定是在本發(fā)明的裝置中自動運行的。裝置包含具有6種不同酵母探針的6個通道。將樣品加入裝置中，在此處進行雜交和洗滌。在雜交和洗滌步驟期間，有持續(xù)的流，其允許樣品流向膜。一旦完成測定，觀察膜的陽性酵母細(xì)胞。方法如下I.將酵母種(來自新鮮YM平板)接種到Y(jié)M液體培養(yǎng)基并且生長約4-6小時。2. 4-6小時后，取IOOii L液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物，稀釋到ImL甲醇-雜交緩沖液中并且以600 ii L/min加入到圖I的裝置中。3.在55 °C以300 ii L/min的流速使探針/雜交溶液流經(jīng)裝置達(dá)5分鐘，隨后在55 °C將流速降至20 u L/min,達(dá)25分鐘。4.在55°C以300 u L/min的流速使洗滌溶液流經(jīng)裝置達(dá)20分鐘。5.讓裝置冷卻，隨后使用20 X物鏡用FITC或雙光帶濾波器觀察熒光。試劑
雜交緩沖液包含甲醇(50%)、0. IM 氯化鈉、0. 025M Tris-HCL(pH 9. 0),0. 1%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5%酵母提取液溶液和DEPC水(補至100% )。洗滌緩沖液包含0. 025M氯化鈉、0. 005M Tris-HCl (pH 9. 0),0. I % Triton X-100,0. 05% (v/v) ProClin 300和DEPC水(補至100% )。表3提供所用探針。表3.
權(quán)利要求
1.ー種裝置，其包括 具有與多個通道流體連通的流體入ロ的殼體，其中所述多個通道的每ー個與容納用于分析細(xì)胞、顆?；蚺c所述顆粒結(jié)合的分析物的試劑的儲存器流體連通； ー個或多個基本上平面的多孔膜，所述細(xì)胞或顆粒不通過所述膜；和 ー個或多個出口，其中遠(yuǎn)離所述入口流動的液體在所述多個通道之間被分開且經(jīng)所述一個或多個膜流向所述出口； 并且其中所述儲存器安置在所述ー個或多個膜的上游。
2.權(quán)利要求I的裝置，其中所述分析試劑結(jié)合至與所述顆粒結(jié)合的靶分析物。
3.權(quán)利要求I的裝置，還包括至少ー個用于所述顆粒的儲存器，其中所述儲存器安置在所述入口和所述ー個或多個膜中的一個之間，并且其中用于所述顆粒的所述儲存器與所述多個通道的至少ー個流體連通。
4.權(quán)利要求I的裝置，其中所述殼體包括ー個部分，通過所述部分可在所述ー個或多個膜中之一上進行所述細(xì)胞或顆粒的光學(xué)分析。
5.權(quán)利要求I的裝置，還包括鄰近所述ー個或多個膜中之一或在其上安置的用于所述細(xì)胞或顆粒電分析的電極。
6.權(quán)利要求I的裝置，還包括用于所述細(xì)胞或顆粒磁弛豫分析的與所述ー個或多個膜中之ー鄰近的磁共振檢測器。
7.權(quán)利要求I的裝置，還包括安置在所述ー個或多個膜中之一和所述出口之間的廢料儲存器。
8.權(quán)利要求I的裝置，還包括容納液體試劑的儲存器，其安置在所述入口和所述ー個或多個膜中之一之間且通過閥與所述多個通道分開。
9.權(quán)利要求I的裝置，還包括用于容納樣品的儲存器，其安置在所述入口和所述ー個或多個膜中之一之間且與所述多個通道流體連通。
10.權(quán)利要求9的裝置，還包括通過閥與所述樣品儲存器分開的容納液體試劑的儲存器。
11.權(quán)利要求I的裝置，還包括溫度傳感器和/或加熱或冷卻元件。
12.權(quán)利要求I的裝置，還包括安置在所述入口和所述ー個或多個膜中之一之間的被動混合器或主動混合器元件。
13.權(quán)利要求I的裝置，其中所述多個通道的每ー個具有基本相同的流體抗性。
14.權(quán)利要求I的裝置，其中，對于所述多個通道的至少ー個，將所述儲存器安置在所述通道內(nèi)。
15.權(quán)利要求I的裝置，還包括多個分析試劑的儲存器，其中每ー儲存器與所述多個通道中的至少ー個流體連通。
16.權(quán)利要求15的裝置，其中所述多個儲存器中的每ー個與所述多個通道的一個且僅ー個流體連通。
17.權(quán)利要求16的裝置，其中將每一所述儲存器安置在所述通道內(nèi)。
18.權(quán)利要求I的裝置，其中，對于所述多個通道的至少ー個，所述儲存器通過閥與所述通道分開。
19.權(quán)利要求I的裝置，其中分析試劑的所述儲存器與所述多個通道的每ー個流體連通，使得所述分析試劑遠(yuǎn)離所述入ロ的流動在所述多個通道之間被分開。
20.權(quán)利要求I的裝置，其中所述ー個或多個膜中之ー是基本上非熒光的。
21.權(quán)利要求I的裝置，其中所述ー個或多個膜中之ー對醇、酸或堿的降解有抗性。
22.權(quán)利要求I的裝置，還包括分析試劑的多個儲存器，其中所述多個通道的每ー個通過儲存器閥與所述試劑的儲存器之一分開，并且還包括多個通道閥，當(dāng)所述閥關(guān)閉時，防止所述通道和所述入ロ之間的流動。
23.權(quán)利要求22的裝置，還包括樣品室和液體試劑室，其中所述樣品室和所述液體試劑室通過閥分開并且安置在所述入口和所述多個通道之間。
24.權(quán)利要求I的裝置，其中所述儲存器是機械可變形室，并且壓縮所述室排出其內(nèi)容物。
25.權(quán)利要求I的裝置，其中所述出口允許氣體而非液體通過。
26.具有用干與前述權(quán)利要求中任ー項的裝置配合的容器的系統(tǒng)，其包括(i)用于將流體從所述裝置的所述入口泵向所述裝置的所述出口的致動器；(ii)配置為與所述裝置對接的溫度控制器，以控制所述裝置至少一部分的溫度；和(iii)配置為與用于分析所述膜上細(xì)胞、顆?；蚺c所述顆粒結(jié)合的分析物的所述裝置對接的檢測器。
27.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，還包括配置為與所述裝置對接的主動混合器元件，以混合所述入ロ和所述膜之間的兩種流體。
28.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，其中所述檢測器是光學(xué)檢測器、電檢測器、或磁弛豫或磁共振檢測器。
29.權(quán)利要求26的系統(tǒng)，還包括流體儲存器和泵，以將流體從所述儲存器遞送到所述裝置的所述入口。
30.分析樣品的方法，所述方法包括以下步驟 (i)將樣品引入裝置，所述裝置包括 具有與多個通道流體連通的流體入口的殼體，其中所述多個通道的每ー個與容納用于分析細(xì)胞、顆?；蚺c所述顆粒結(jié)合的分析物的試劑的儲存器流體連通； ー個或多個基本上平面的多孔膜，所述細(xì)胞或顆粒不通過所述膜；和 ー個或多個出口，其中遠(yuǎn)離所述入口流動的液體在所述多個通道之間被分開且經(jīng)所述一個或多個膜流向所述出口； 并且其中所述儲存器安置在所述ー個或多個膜的上游。
其中所述樣品包括所述細(xì)胞、顆?；蚺c所述顆粒結(jié)合的分析物； (ii)允許所述分析試劑與所述細(xì)胞、顆?；蚍治鑫锝佑|； (iii)捕獲所述膜上的所述細(xì)胞或顆粒；和 (iv)分析所述膜上的所述細(xì)胞或顆粒。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述分析試劑包括針對核酸的探針或抗體。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述探針包括PNA、DNA或LNA。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述細(xì)胞、顆?；蚺c所述顆粒結(jié)合的分析物還與結(jié)合所述探針或抗體的試劑接觸，從而導(dǎo)致信號放大。
34.權(quán)利要求30的方法，其中所述分析試劑經(jīng)標(biāo)記用于光學(xué)、電或磁檢測。
35.權(quán)利要求30的方法，其中所述分析試劑包括光學(xué)上可區(qū)分的并且與不同細(xì)胞、顆?；蚪Y(jié)合至所述顆粒的分析物結(jié)合的多種試劑。
36.權(quán)利要求30的方法，還包括，在步驟(i)之后且在步驟(iv)之前，用液體試劑處理所述樣品。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述裝置還包括被動混合器，其經(jīng)安置使得在流經(jīng)所述裝置的同時并且在接觸所述膜之前，所述液體試劑和所述樣品混合。
38.權(quán)利要求36的方法，其中所述處理步驟還包括用所述液體試劑主動混合所述樣品。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述裝置還包括樣品儲存器和通過閥與所述樣品儲存器分開的液體試劑儲存器，其中在步驟(i)中將所述樣品引入所述樣品儲存器，所述液體試劑儲存于所述液體試劑儲存器中，并且所述主動混合包括致動所述閥和將所述液體試劑轉(zhuǎn)移至所述樣品儲存器或?qū)⑺鰳悠忿D(zhuǎn)移至所述液體試劑儲存器。
40.權(quán)利要求36的方法，其中所述液體試劑包括稀釋劑、裂解緩沖液或包含與所述分析物的結(jié)合部分的所述顆粒。
41.權(quán)利要求40的方法，其中將所述樣品與包含結(jié)合部分的所述顆粒在如下條件下接觸其中所述樣品的所述分析物與所述顆粒結(jié)合，在步驟(iii)中其由所述膜捕獲。
42.權(quán)利要求30的方法，其中所述樣品與對照顆粒接觸，對照顆粒隨后在多個通道之間與所述樣品成比例地被分開，其中所述對照顆粒在步驟(iii)中由所述膜捕獲。
43.權(quán)利要求30的方法，其中所述裝置還包括容納分析試劑的多個儲存器，其中所述多個儲存器之一安置在所述多個通道的每ー個內(nèi)，并且在步驟(ii)中所述分析試劑通過相鄰液體的流動從所述儲存器釋放。
44.權(quán)利要求30的方法，其中所述裝置還包括容納分析試劑的多個儲存器，其中所述多個儲存器之一通過閥與所述多個通道的每ー個分開，并且步驟(ii)包括致動所述閥。
45.權(quán)利要求30的方法，其中所述細(xì)胞是微生物并且對其進行分析。
46.權(quán)利要求30的方法，其中分析所述細(xì)胞并且受試者由于疾病而產(chǎn)生所述細(xì)胞。
47.權(quán)利要求30的方法，其中所述樣品包括培養(yǎng)物、環(huán)境樣品或生物樣品。
48.包括權(quán)利要求1-25中任ー項的裝置和稀釋劑、裂解緩沖液、雜交緩沖液或?qū)φ疹w粒的試劑盒。
49.可檢測、鑒定和定量復(fù)雜生物樣品中低水平微生物的裝置。
全文摘要
總體而言，本發(fā)明特征為用于多孔膜上細(xì)胞、顆粒和其它分析物的分析的多重裝置、系統(tǒng)、方法和試劑盒。優(yōu)選裝置檢測、鑒定并定量復(fù)雜生物樣品例如血液中低水平的微生物。示例性的裝置包括具有與多個通道流體連通的流體入口的殼體，例如具有基本相同流體抗性的通道。所述多個通道的每一個與容納用于分析細(xì)胞、顆?；蚺c顆粒結(jié)合的分析物的儲存器流體連通；一個或多個基本上平面的多孔膜，所述細(xì)胞或顆粒不通過該膜；和一個或多個出口，其中遠(yuǎn)離所述入口流動的液體在所述多個通道之間被分開且經(jīng)一個或多個膜流向所述出口；并且其中將所述儲存器安置在所述一個或多個膜的上游。
文檔編號B01L3/00GK102802797SQ201080028730
公開日2012年11月28日 申請日期2010年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者M·富赫斯, H·斯滕德, M·梅爾策爾, J·謝潑德, R·黃 申請人:艾德萬德克斯公司