專利名稱：色譜系統(tǒng)中的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于確定色譜柱結(jié)合能力(binding capacity)的方法、色譜系統(tǒng)以及用于控制色譜系統(tǒng)的方法。
背景技術(shù)：
溶質(zhì)的色譜柱的結(jié)合能力是工藝色譜中非常重要的因素。該結(jié)合能力直接影響色譜步驟的生產(chǎn)力和成本。該結(jié)合能力從動(dòng)態(tài)/穿透能力方面定義或作為最大結(jié)合能力來(lái)定義。該動(dòng)態(tài)能力取決于溶液流過(guò)色譜介質(zhì)填充柱的條件，例如定義為柱體積和進(jìn)料流率之間的比率的停留時(shí)間。如果停留時(shí)間無(wú)限長(zhǎng)，則最大結(jié)合能力代表柱的穿透能力。初始穿透能力定義為在流出物中首次檢測(cè)到溶質(zhì)時(shí)的點(diǎn)處由柱占據(jù)的結(jié)合溶質(zhì)的量。穿透能力還可定義為給定的穿透百分比處的能力，其中百分比代表在流出物中存在的來(lái)自柱的結(jié)合溶質(zhì)的量，其采用進(jìn)料中存在的溶質(zhì)的百分比表達(dá)。根據(jù)該定義，最大結(jié)合能力將等于100% 穿透(即不再有溶質(zhì)能結(jié)合到柱的點(diǎn)處)的穿透能力。因此，為了確定最大能力，在不同的穿透水平測(cè)量穿透能力，其中這些水平由在樣品加載期間在流出物中測(cè)量的來(lái)自柱的溶質(zhì)的濃度水平來(lái)定義。通常，通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)通過(guò)置于流出物線的檢測(cè)器的流中的信號(hào)來(lái)確定這些濃度。這些濃度(信號(hào))對(duì)時(shí)間(或體積或加載質(zhì)量)的標(biāo)繪圖稱作穿透曲線。色譜上穿透的位置和它的形狀與有多少溶質(zhì)能夠在柱上結(jié)合以及溶質(zhì)有多快將所有吸附位飽和有關(guān)。還示出有在任何給定時(shí)間還有多少溶質(zhì)可以結(jié)合到柱。在雜質(zhì)存在的情況下溶質(zhì)的穿透結(jié)合能力是當(dāng)發(fā)展純化規(guī)程時(shí)優(yōu)化的最關(guān)鍵參數(shù)之一。因?yàn)殡s質(zhì)大部分情況下具有與溶質(zhì)相似的吸光性質(zhì)，結(jié)合穿透能力的確定是繁瑣和費(fèi)力的工作。在典型的試驗(yàn)中，來(lái)自的柱的流出物采用連續(xù)小部分收集，其隨后使用例如HPLC等高分辨率技術(shù)對(duì)溶質(zhì)進(jìn)行分析。從而對(duì)色譜柱的結(jié)合能力的確定是相當(dāng)復(fù)雜的，并且進(jìn)料溶液濃度在進(jìn)料施加到色譜柱上的期間隨機(jī)變化的情況下，無(wú)法測(cè)量實(shí)際的穿透能力。如果想在最佳工藝條件下操作柱，測(cè)量實(shí)際穿透能力是非常重要的。例如，可以示出，在某些條件下當(dāng)感興趣的溶質(zhì)達(dá)到它在柱流出物中的濃度的某一值時(shí)，例如它初始濃度的10%，獲得捕獲色譜步驟的最大生產(chǎn)力。如果穿透能力根據(jù)上文描述的方法確定，如果進(jìn)料濃度或工藝條件(其包括流率和 /或色譜介質(zhì)性質(zhì))采用不可預(yù)測(cè)的方式隨時(shí)間變化，則無(wú)法在確切的10%的穿透時(shí)終止柱的加載。此外，在變化的工藝條件下，確定在不同穿透水平處的穿透能力在連續(xù)色譜的情況下是非常重要的。在連續(xù)色譜中，若干相同的柱采用允許柱串聯(lián)和/或并聯(lián)操作的設(shè)置而連接，其取決于方法要求。從而，原則上所有柱可以同時(shí)運(yùn)行，只是方法步驟稍微改變。程序可以重復(fù)，使得每個(gè)柱在工藝中加載、洗脫和再生若干次。與“常規(guī)的”色譜相比，其中單個(gè)色譜循環(huán)基于若干連貫步驟，例如加載、清洗、洗脫和再生，在基于多個(gè)相同柱的連續(xù)色譜中，所有這些步驟同時(shí)發(fā)生只是每個(gè)發(fā)生在不同的柱上。連續(xù)色譜操作導(dǎo)致更好地利用色譜樹(shù)脂、減少的處理時(shí)間并且降低的緩沖需求，所有這些有益于工藝經(jīng)濟(jì)。連續(xù)色譜有時(shí)表示為模擬移動(dòng)床(SMB)色譜。模擬移動(dòng)床色譜是周期逆流工藝的一個(gè)示例，因?yàn)闃?gòu)成系統(tǒng)的所有色譜柱在與樣品流相反的方向上周期地同時(shí)移動(dòng)。柱的明顯的移動(dòng)通過(guò)使到柱的進(jìn)入流和從柱的輸出流適當(dāng)?shù)刂囟ㄏ蚨鴮?shí)現(xiàn)。Bishop 等人(〃 Simulated Moving Bed technology in Biopharmaceutical Processing(生物制藥加工中的模擬移動(dòng)床技術(shù))“，Bischops，Μ.和Pennings，Μ.， Recovery Biological Products XI, (2003)Banff,Alberta,Canada)公開(kāi)了基于模擬移動(dòng)床(SMB)技術(shù)的連續(xù)色譜法，其已經(jīng)成功地用于具有蛋白A親和樹(shù)脂的IgG的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的純化。盡管實(shí)際上由SMB提供的多柱和多段連續(xù)方法極大地提高工藝效率，但至今SMB 系統(tǒng)尚未用于cGMP生物制藥生產(chǎn)，這主要因?yàn)閺挠布筒僮鲀蓚€(gè)角度的系統(tǒng)的復(fù)雜性。操作的角度是特別感興趣的，因?yàn)檫B續(xù)法是更復(fù)雜的并且需要許多操作(步驟)在非常精確的預(yù)定時(shí)間點(diǎn)同時(shí)發(fā)生。與批量色譜相比之下，考慮工藝變化性的安全因素的實(shí)現(xiàn)不建議用于連續(xù)工藝，這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)限定，它們?cè)诩僭O(shè)僅在到系統(tǒng)的輸入沒(méi)有變化的情況下才能成立的穩(wěn)定態(tài)下操作。Heeter 等人(Heeter，G. A. and Liapis, Α. I. , J. Chrom A,711(1995))已經(jīng)提出基于三柱周期逆流色譜(3C-PCC)原理的方法作為典型的四段SMB系統(tǒng)的備選。最近， Lacki 等人(“Protein A Counter-Current Chromatography for Continuous Antibody Purification(用于連續(xù)抗體純化的蛋白A逆流色譜)“，Lacki, K. M.和Bryntesson, L. M.，ACS (2004) Anaheim, CA USA)描述這樣的3C-PCC系統(tǒng)用于對(duì)MabklectTM親和樹(shù)月旨的IgG吸附。該3C-PCC系統(tǒng)需要比典型的四段SMB系統(tǒng)更簡(jiǎn)單的硬件和更容易的操作，其直接降低與資本設(shè)備和系統(tǒng)維護(hù)關(guān)聯(lián)的成本。事實(shí)上，模擬移動(dòng)床技術(shù)已經(jīng)在各種其他領(lǐng)域中使用了幾十年。例如，美國(guó) 3, 291, 726 (Universal Oil Products)早在1966年描述用于石油化工業(yè)的連續(xù)模擬逆流吸附工藝。在歷史上，可靠的連續(xù)工藝的必不可少的因素是1)使用的柱的質(zhì)量，并且更具體地，柱之間的相似性或甚至同一性，幻恒定進(jìn)料成分，和幻硬件可靠性，更具體地，由泵輸送的恒定流率。如果柱是不相同的，典型地用于設(shè)計(jì)連續(xù)色譜工藝的理論計(jì)算將不正確， 并且將變得難以設(shè)計(jì)高效和健全的連續(xù)色譜工藝。如果進(jìn)料濃度和流率采用意想不到的方式隨時(shí)間變化，相同的論點(diǎn)適用。因此，為了放大考慮，在系統(tǒng)中具有相同的柱和可靠的泵是必不可少的。然而，用色譜介質(zhì)封裝柱以便獲得可重復(fù)結(jié)果是非常復(fù)雜的。甚至板的數(shù)量或其他封裝性質(zhì)中的小的差異可以對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生巨大影響。此外，由于色譜樹(shù)脂的能力在樹(shù)脂壽命/使用期間典型地變化，為新的樹(shù)脂選擇的工藝條件將不能適用于已經(jīng)使用若干次的樹(shù)脂。如果進(jìn)料濃度還將改變，設(shè)計(jì)將一直在最佳狀態(tài)操作的高效連續(xù)色譜工藝將甚至是更復(fù)雜的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于確定和監(jiān)測(cè)色譜柱的結(jié)合能力的可靠的和動(dòng)態(tài)方法。這通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1的方法并且通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求10的色譜系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。因此進(jìn)料信號(hào)和流出物信號(hào)可以用于連續(xù)確定色譜柱的結(jié)合能力。本發(fā)明的另外的目的是提供用于控制色譜系統(tǒng)的可靠的和動(dòng)態(tài)方法。這采用根據(jù)權(quán)利要求20的方法實(shí)現(xiàn)。因此色譜系統(tǒng)可以基于實(shí)時(shí)測(cè)量色譜柱的
6結(jié)合能力而動(dòng)態(tài)控制。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，色譜系統(tǒng)是周期逆流系統(tǒng)。本發(fā)明的另外的合適的實(shí)施例在從屬的權(quán)利要求中限定。


圖1示意地示出根據(jù)本發(fā)明的色譜系統(tǒng)，其包括一個(gè)色譜柱和兩個(gè)檢測(cè)器。圖2是示出來(lái)自圖1中的兩個(gè)檢測(cè)器的信號(hào)的圖。圖3示意地示出根據(jù)本發(fā)明的三柱周期逆流(3C-PCC)系統(tǒng)，其包括四個(gè)檢測(cè)器。圖^、b和c示意地示出圖3的三個(gè)閥。圖5示意地示出根據(jù)本發(fā)明的四柱周期逆流(4C-PCC)系統(tǒng)。圖6是示出從圖5中示出的4C-PCC系統(tǒng)中的五個(gè)檢測(cè)器中檢測(cè)的信號(hào)的圖。
具體實(shí)施例方式為了克服關(guān)于現(xiàn)有技術(shù)論述的困難，由本發(fā)明提供基于類似反饋的控制原理的實(shí)時(shí)控制算法。因此，用于評(píng)估不同的柱在任何給定工藝時(shí)刻的狀態(tài)的方法是特別感興趣的。 例如，了解色譜柱在特定的穿透水平時(shí)的結(jié)合能力將允許人們?cè)u(píng)估柱是否仍能夠結(jié)合溶質(zhì)以及在柱達(dá)到全飽和之前仍能夠結(jié)合多少溶質(zhì)。相似地，從工藝成品率角度來(lái)看，了解是否已經(jīng)到達(dá)初始穿透能力是最感興趣的，因?yàn)榇藭r(shí)將在來(lái)自柱的流出物的流中發(fā)現(xiàn)溶質(zhì)，并且如果沒(méi)有采取適當(dāng)行動(dòng)，溶質(zhì)將直接浪費(fèi)或?qū)⑴c其他未結(jié)合組分一起被收集。圖1示意地示出根據(jù)本發(fā)明的簡(jiǎn)單色譜系統(tǒng)的一部分。該色譜系統(tǒng)包括一個(gè)色譜柱1。它進(jìn)一步包括連接到色譜柱1的入口端5的進(jìn)料線3。要傳遞通過(guò)柱1的樣品可以通過(guò)該進(jìn)料線3添加。系統(tǒng)進(jìn)一步包括連接到相反端(即色譜柱1的出口端7)的流出物線9。已經(jīng)經(jīng)過(guò)色譜柱1的樣品可以通過(guò)流出物線9。色譜系統(tǒng)根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步包括沿著進(jìn)料線3的某處安置的第一檢測(cè)器11。該第一檢測(cè)器11適應(yīng)于檢測(cè)進(jìn)料信號(hào)，其代表進(jìn)入進(jìn)料線的進(jìn)料材料(樣品)的成分。此外，色譜系統(tǒng)包括第二檢測(cè)器13，其沿著流出物線 9的某處安置并且適應(yīng)于檢測(cè)代表通過(guò)流出物線9從柱1流出的樣品的成分的流出物信號(hào)。 該第一和該第二檢測(cè)器11、13合適地是相同類型的檢測(cè)器并且在一個(gè)實(shí)施例中，其是UV檢測(cè)器，即測(cè)量樣品的UV吸光度。其他可能類型的檢測(cè)器測(cè)量pH、電導(dǎo)率、光散射、熒光、IR 或可見(jiàn)光。如果系統(tǒng)中的不同的檢測(cè)器不是相同類型的檢測(cè)器，當(dāng)根據(jù)本發(fā)明用于進(jìn)一步計(jì)算時(shí)，需要使檢測(cè)到的信號(hào)相關(guān)。此外，根據(jù)本發(fā)明，第一和第二檢測(cè)器11、13都連接到確定單元15。所述單元分析在第一和第二檢測(cè)器11、13中檢測(cè)的信號(hào)，以便確定色譜柱的結(jié)合能力。來(lái)自第一和第二檢測(cè)器11、13的可能的信號(hào)在圖2中示出，在圖中示出隨時(shí)間的信號(hào)強(qiáng)度。進(jìn)料信號(hào)表示為21并且是來(lái)自第一檢測(cè)器11的信號(hào)。它大致上是直線，因?yàn)檫M(jìn)料樣品在該情況下并且在該時(shí)間窗口期間是成分恒定的。流出物信號(hào)表示為23并且是來(lái)自第二檢測(cè)器13的信號(hào)。 樣品的一部分一經(jīng)過(guò)柱1并且進(jìn)入流出物線9 (其中安置第二檢測(cè)器1 的通道，該流出物信號(hào)23就在點(diǎn)a從零開(kāi)始上升。信號(hào)然后將上升直到點(diǎn)b，此處它穩(wěn)定進(jìn)入平穩(wěn)期25。當(dāng)進(jìn)料中的所有未結(jié)合組分已經(jīng)經(jīng)過(guò)柱時(shí)，該平穩(wěn)期25出現(xiàn)。在平穩(wěn)期25之后當(dāng)信號(hào)23開(kāi)始再次上升時(shí)進(jìn)一步限定穿透點(diǎn)C。這是由于柱1中的色譜介質(zhì)開(kāi)始達(dá)到飽和并且原本應(yīng)該已經(jīng)結(jié)合在柱中的樣品部分中的一些開(kāi)始穿透柱這一事實(shí)。當(dāng)信號(hào)23接近信號(hào)21時(shí)進(jìn)一步限定穿透點(diǎn)d。該點(diǎn)限定作為飽和點(diǎn)并且代表樣品的結(jié)合組分幾乎完全將色譜介質(zhì)飽和的時(shí)刻。根據(jù)本發(fā)明，在任何給定時(shí)間點(diǎn)計(jì)算Δ信號(hào)(Deltasignal)，其定義成從在減少了規(guī)定時(shí)間延遲的給定時(shí)間與給定時(shí)間之間測(cè)量的信號(hào)減去在給定時(shí)間測(cè)量的流出物信號(hào)23所選取的進(jìn)料信號(hào)21。進(jìn)料信號(hào)21對(duì)進(jìn)料的未結(jié)合和結(jié)合組分兩者的特征(在一個(gè)實(shí)施例中，UV吸光度)進(jìn)行測(cè)量。該時(shí)間延遲定義為樣品中的未結(jié)合化合物從進(jìn)料檢測(cè)器 11(圖1)移動(dòng)到流出物檢測(cè)器13(圖1)的時(shí)間。該時(shí)間延遲可以應(yīng)用停留時(shí)間分布理論測(cè)量，或它可以通過(guò)從信號(hào)23達(dá)到平穩(wěn)期25時(shí)的時(shí)間中扣除信號(hào)21首次到達(dá)最高平穩(wěn)期 e時(shí)的時(shí)間而測(cè)量。這在圖2中圖示為箭頭四。一個(gè)具體時(shí)間點(diǎn)處的Δ信號(hào)在圖2中圖示為箭頭觀。如指示的，如果時(shí)間延遲被補(bǔ)償，該箭頭觀可以傾斜。根據(jù)本發(fā)明，計(jì)算最大Δ信號(hào)(DeltaSignalmaX)27，其定義成進(jìn)料信號(hào)21減去流出物信號(hào)23在平穩(wěn)期25時(shí)的信號(hào)水平。該最大△信號(hào)27然后可以用于限定對(duì)于例如穿透點(diǎn)和飽和點(diǎn)的合適的水平。穿透點(diǎn)c可以合適地定義成最大△信號(hào)的某一預(yù)定百分比， 例如在跨度1-10%中的某處或更合適地在1-3%的跨度中的某處，并且飽和點(diǎn)d可以合適地定義成最大Δ信號(hào)的某一預(yù)定百分比，例如在跨度60-90%中的某處或更合適地在跨度 70-80%中的某處。確定穿透點(diǎn)和飽和點(diǎn)的該方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是這可以實(shí)時(shí)自動(dòng)完成并且這由于進(jìn)料信號(hào)被自動(dòng)補(bǔ)償而不依賴進(jìn)料濃度。在本發(fā)明的另外的方面，結(jié)合能力(例如穿透點(diǎn)和飽和點(diǎn))的這些確定用于自動(dòng)控制不同的色譜工藝步驟的起動(dòng)和停止，即當(dāng)已經(jīng)達(dá)到某一穿透點(diǎn)或飽和點(diǎn)水平時(shí)，控制系統(tǒng)可以控制色譜系統(tǒng)進(jìn)入下一個(gè)工藝步驟，例如使柱流出物重定向到不同的收集點(diǎn)，或停止加載步驟并且啟動(dòng)柱清洗步驟。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，在所謂的周期逆流(PCC)系統(tǒng)中，色譜系統(tǒng)包括超過(guò)一個(gè)色譜柱。在該周期逆流系統(tǒng)中，進(jìn)料大部分時(shí)間被傳遞通過(guò)串聯(lián)連接的至少兩個(gè)柱。該串聯(lián)通常稱作加載段，并且在該加載段中添加柱和從該加載段去除柱分別基于串聯(lián)的最后一個(gè)和第一個(gè)柱的預(yù)定穿透點(diǎn)和飽和點(diǎn)。在圖3中示意地示出根據(jù)本發(fā)明的包括三個(gè)柱的這樣的系統(tǒng)。本發(fā)明的益處在該示例中甚至更明確，這是因?yàn)镻CC系統(tǒng)中的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題是為了能夠獲得高效系統(tǒng)操作而需要在系統(tǒng)中使用的柱盡可能相同并且進(jìn)料成分和流率應(yīng)該恒定，或至少它們隨工藝時(shí)間的變化用先驗(yàn)應(yīng)該得知。利用本發(fā)明，可以通過(guò)根據(jù)確定的穿透點(diǎn)和飽和點(diǎn)調(diào)整不同的柱應(yīng)該在加載段中多久以及應(yīng)該在加載段中哪個(gè)位置而補(bǔ)償柱結(jié)合能力和/或流率中的任何差異。在圖3中示出進(jìn)料泵31經(jīng)由第一檢測(cè)器33連接到第一閥塊35。緩沖泵37還連接到該第一閥塊35。該第一閥塊35經(jīng)由第一 T型閥41進(jìn)一步連接到第一柱39的入口。 該第一柱39的出口端通過(guò)第二檢測(cè)器45連接到第二 T型閥43。該第一閥塊35經(jīng)由第二閥塊49進(jìn)一步連接到第二柱47的入口。該第二柱47的出口端經(jīng)由第三檢測(cè)器53連接到第三閥塊51。此外，第三T型閥55連接在該第二 T型閥43和該第三閥塊51之間。該第三 T型閥55還連接到第四T型閥57，其還連接到第一 T型閥41和第二閥塊49。因此來(lái)自第一柱39的流出物可以通過(guò)T型閥43、55、57和閥塊49被引導(dǎo)到第二柱47的入口。此外，第一閥塊35經(jīng)由第五T型閥61連接到第三柱59的入口。第三柱59的出口端經(jīng)由第四檢測(cè)器65連接到第六T型閥63。此外，第七T型閥67連接在第三閥塊51和該第六T型閥 63之間。該第七T型閥67還連接到第八T型閥69，其還連接到第二閥塊49和第五T型閥 61。因此，來(lái)自第二柱47的流出物可以被引導(dǎo)到第三柱59的入口。來(lái)自第三柱59的流出物可以通過(guò)閥63、67、51、55、57和41引導(dǎo)到第一柱39的入口。第一閥塊35的結(jié)構(gòu)在圖乜中示意地示出，第二閥塊49的結(jié)構(gòu)在圖4b中示意地示出并且第三閥塊51的結(jié)構(gòu)在圖如中示意地示出。在這些圖中，每組四個(gè)盒子代表T型閥(3通閥)。此外，根據(jù)本發(fā)明，第一、 第二、第三和第四檢測(cè)器33、45、53和65全部連接到確定單元71。該確定單元適應(yīng)于使用來(lái)自檢測(cè)器的檢測(cè)信號(hào)來(lái)確定對(duì)于三個(gè)不同的柱的穿透點(diǎn)和飽和點(diǎn)。該確定單元71和所有的閥塊以及T型閥和泵進(jìn)一步連接到控制單元73(所有連接未在圖中示出)，其適應(yīng)于從何時(shí)從加載段去除柱或添加柱進(jìn)入加載段、何時(shí)改變流率、何時(shí)起動(dòng)新的清洗步驟等方面控制色譜系統(tǒng)。檢測(cè)器33、45、53、65在一個(gè)實(shí)施例中是UV檢測(cè)器?？梢杂糜诒景l(fā)明的檢測(cè)器的其他示例已經(jīng)在前面論述。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，采用圖3的系統(tǒng)實(shí)行的色譜工藝包括(a)用第一檢測(cè)器33連續(xù)監(jiān)測(cè)進(jìn)料線中的信號(hào)并且連續(xù)監(jiān)測(cè)來(lái)自柱39、47、59的每個(gè)的流出物中的信號(hào)(用第二、第三和第四檢測(cè)器45、53、65)，以及計(jì)算在時(shí)間上往后偏移預(yù)定延遲時(shí)間的進(jìn)料信號(hào)和來(lái)自每個(gè)柱39、47、59的輸出流線中的流出物信號(hào)之間的差；(b)將包括至少一個(gè)目標(biāo)化合物的進(jìn)料傳過(guò)第一吸附劑(第一柱39中的色譜介質(zhì))，并且當(dāng)在進(jìn)料線和來(lái)自第一吸附劑的流出物之間測(cè)量的△信號(hào)(如上文關(guān)于圖2描述的定義)達(dá)到預(yù)定值Xl時(shí)將輸出流從第一吸附劑引導(dǎo)到第二吸附劑(第二柱47中的色譜介質(zhì))；(c)將進(jìn)料重定向到第二吸附劑，并且當(dāng)在進(jìn)料線和來(lái)自第一吸附劑的流出物之間測(cè)量的Δ信號(hào)達(dá)到預(yù)定值χ2時(shí)使清洗液傳過(guò)目標(biāo)化合物已經(jīng)與之結(jié)合的第一吸附劑；(d)當(dāng)在進(jìn)料線和來(lái)自第二吸附劑的流出物之間測(cè)量的Δ信號(hào)達(dá)到預(yù)定值xl時(shí)， 引導(dǎo)清洗液輸出流到第三吸附劑(第三柱59中的色譜介質(zhì))并且隨后將輸出流從第二吸附劑引導(dǎo)到第三吸附劑；(e)使第一吸附劑再生；(f)將進(jìn)料重定向到所述第三吸附劑，并且當(dāng)在進(jìn)料線和來(lái)自第二吸附劑的流出物之間測(cè)量的△信號(hào)達(dá)到預(yù)定值x2時(shí)使清洗液傳過(guò)目標(biāo)化合物已經(jīng)與之結(jié)合的第二吸附劑；(g)當(dāng)在進(jìn)料線和來(lái)自第三吸附劑的流出物之間測(cè)量的Δ信號(hào)達(dá)到預(yù)定值xl時(shí)， 引導(dǎo)清洗液輸出流到第一吸附劑，并且隨后將輸出流從第三吸附劑引導(dǎo)到第一吸附劑；(h)使第二吸附劑再生；(i)將進(jìn)料重定向到所述第一吸附劑，并且當(dāng)在進(jìn)料線和來(lái)自第三吸附劑的流出物之間測(cè)量的△信號(hào)達(dá)到預(yù)定值x2時(shí)使清洗液傳過(guò)目標(biāo)化合物已經(jīng)與之結(jié)合的第三吸附劑；(j)當(dāng)在進(jìn)料線和來(lái)自第一吸附劑的流出物之間測(cè)量的Δ信號(hào)達(dá)到預(yù)定值xl時(shí)， 引導(dǎo)清洗液輸出流到第二吸附劑，并且隨后將輸出流從第一吸附劑引導(dǎo)到第二吸附劑；
9
(k)使第三吸附劑再生；(1)重復(fù)步驟(b)-(k)；其中至少一個(gè)目標(biāo)化合物在步驟(d)、(g)和/或(j)中收集。Xl和x2的預(yù)定值分別代表穿透點(diǎn)和飽和點(diǎn)。當(dāng)操作逆流系統(tǒng)時(shí)本發(fā)明能夠使用不相同的柱，這是因?yàn)橹再|(zhì)中的任何差異可以通過(guò)基于對(duì)柱的每個(gè)測(cè)量的△信號(hào)和最大△信號(hào)自動(dòng)調(diào)整穿透和飽和切換點(diǎn)而補(bǔ)償。 這還能夠當(dāng)由于進(jìn)料濃度中的任何變化而發(fā)生進(jìn)料濃度的意想不到的變化時(shí)操作逆流系統(tǒng)，并且從而加載進(jìn)入每個(gè)柱的質(zhì)量的變化可以通過(guò)基于自動(dòng)補(bǔ)償進(jìn)料濃度變動(dòng)的Δ信號(hào)和最大△信號(hào)自動(dòng)調(diào)整穿透和飽和切換點(diǎn)而補(bǔ)償。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，包括超過(guò)2個(gè)色譜柱的色譜系統(tǒng)可以用于直接捕獲來(lái)自源于灌注細(xì)胞培養(yǎng)的進(jìn)料流的產(chǎn)物。對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員，眾所周知在這樣的流中的組分濃度將隨時(shí)間改變，并且在沒(méi)有自動(dòng)控制算法情況下，由于錯(cuò)誤地用先驗(yàn)指定的重定向點(diǎn)，色譜系統(tǒng)的操作不可能沒(méi)有明顯損耗產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)。示例提供本示例僅為了說(shuō)明目的，并且不應(yīng)該解釋為限制由附上的權(quán)利要求限定的本發(fā)明。該示例圖示使用根據(jù)本發(fā)明的具有AUVmax控制(即在該示例中檢測(cè)器是UV檢測(cè)器并且最大Δ信號(hào)稱作AUVmax)的四柱周期逆流(4C-PCC)系統(tǒng)在蛋白A色譜樹(shù)脂上從包含單克隆抗體(MAb)和牛血清白蛋白的混合物中提純MAb的連續(xù)主要捕獲步驟。 更具體地，四個(gè)相似的柱用蛋白A色譜樹(shù)脂MabklectTM(GE Healthcare Bio-Sciences, 瑞典，烏普薩拉)填充。這些柱連接到定制修改的人KTAexplorerTM (GE Healthcare Bio-Sciences，瑞典，烏普薩拉)色譜系統(tǒng)(圖5)，其配置為具有基于連續(xù)比較在四個(gè)柱的每個(gè)的前面和后面測(cè)量的UV信號(hào)的自動(dòng)控制功能的四柱周期逆流系統(tǒng)4C-PCC。該系統(tǒng)包括三個(gè)獨(dú)立的泵進(jìn)料泵101、第一緩沖泵103和第二緩沖泵105。該系統(tǒng)進(jìn)一步包括第一柱107、第二柱109、第三柱111和第四柱113。該系統(tǒng)進(jìn)一步包括5個(gè)UV檢測(cè)器安置在進(jìn)料線上的第一 UV檢測(cè)器115，安置在第一柱107后面的第二 UV檢測(cè)器117，安置在第二柱109后面的第三UV檢測(cè)器119，安置在第三柱111后面的第四UV檢測(cè)器121和安置在第四柱113后面的第五UV檢測(cè)器123。該系統(tǒng)進(jìn)一步包括若干旋轉(zhuǎn)閥和分流器 127。安置這些UV檢測(cè)器115、117、119、121、123使得進(jìn)料流和來(lái)自每個(gè)柱的流出物傳遞通過(guò)UV檢測(cè)器(圖5)。來(lái)自每個(gè)UV檢測(cè)器的吸光度使用UNICORN 軟件(GE Healthcare Bio-Sciences，瑞典，烏普薩拉)記錄。UNICORN 還用于控制所有的泵和閥。從蛋白A柱洗脫的MAb收集在單個(gè)池子中。下列單柱色譜循環(huán)用作用于采用連續(xù)方式操作4C-PCC洗脫的基礎(chǔ)1)用3個(gè)柱體積(CV)的緩沖液A來(lái)平衡柱；幻柱加載進(jìn)料；幻用4CV的緩沖液A清洗柱；4)用4CV的緩沖液B洗脫柱；5)用4CV的緩沖液C的柱CIP;以及，6)用3CV的緩沖液A使柱再生。所有步驟以0. 4mL/min的流率進(jìn)行。使用的溶液的成分在下面給出緩沖液A:PBS，pH7緩沖液B 0. IM檸檬酸鈉，pH = 3. 5
緩沖液C :50mM NaOH進(jìn)料溶解在緩沖液A中的 2. 00g/L MAb和;3mg/ml BSA (Sigma)包含進(jìn)料的幾百毫升的溶液連續(xù)饋送進(jìn)入上文描述的試驗(yàn)4C-PCC裝置中。進(jìn)料溶液的吸光度由安置在進(jìn)料線(圖5)上的第一 UV檢測(cè)器115連續(xù)測(cè)量。純化的MAb采用謹(jǐn)慎的方式通過(guò)將緩沖液B施加進(jìn)入飽和柱而從系統(tǒng)中洗脫。在洗脫步驟之前清洗飽和柱。在圖6中，在第一啟動(dòng)期間記錄進(jìn)料線和來(lái)自色譜柱107、109、111、113的每個(gè)的流出物中的信號(hào)，4C-PCC循環(huán)由以下組成1)將進(jìn)料加載進(jìn)入第一柱107 ；2)串聯(lián)連接第一和第二柱107、109 ;3)當(dāng)清洗第一柱107至第三柱111時(shí)將進(jìn)料引導(dǎo)到第二柱109 ;4)當(dāng)施加進(jìn)料時(shí)串聯(lián)連接第二和第三柱109、111 ；5)洗脫第一柱107 ；6)使第一柱107再生；7)當(dāng)清洗第二柱109至第四柱113時(shí)將進(jìn)料引導(dǎo)進(jìn)入第三柱111 ；8)當(dāng)連續(xù)施加進(jìn)料時(shí)串聯(lián)連接第三和第四柱111、113 ;9)洗脫第二柱109; 10)使第二柱109再生；11)當(dāng)清洗第三柱111 至第一柱107時(shí)將進(jìn)料引導(dǎo)進(jìn)入第四柱113 ；12)當(dāng)連續(xù)施加進(jìn)料時(shí)串聯(lián)連接第四和第一柱 113,107 ；13)洗脫第三柱111 ； 14)使第三柱111再生；15)當(dāng)清洗第四柱113至第二柱109 時(shí)將進(jìn)料引導(dǎo)進(jìn)入第一柱107 ； 16)當(dāng)連續(xù)施加進(jìn)料時(shí)串聯(lián)連接第一和第二柱107、109 ；17) 洗脫第四柱113 ；18)使第四柱113再生；19)再一次重復(fù)步驟3_18。在圖2中示出的重復(fù)UV圖樣在圖6中描繪，其中呈現(xiàn)在9個(gè)單柱加載期間(其代表兩個(gè)4C-PCC循環(huán))記錄的UV信號(hào)。表示的曲線201是源于圖5中的第一 UV檢測(cè)器115 的信號(hào)，即這是進(jìn)料信號(hào)。表示的曲線203是源于圖5中的第二 UV檢測(cè)器117的信號(hào)，即這是來(lái)自第一柱107的流出物信號(hào)。表示的曲線205是源于圖5中的第三UV檢測(cè)器119 的信號(hào)，即這是來(lái)自第二柱109的流出物信號(hào)。表示的曲線207是源于圖5中的第四UV檢測(cè)器121的信號(hào)，即這是來(lái)自第三柱111的流出物信號(hào)。表示的曲線209是源于圖5中的第五UV檢測(cè)器123的信號(hào)，即這是來(lái)自第四柱113的流出物信號(hào)。如在圖6中示出的，代表來(lái)自每個(gè)柱的流出物中MAb濃度的色譜根據(jù)本發(fā)明中描述的原理通過(guò)分別對(duì)在AUVmax 信號(hào)的χ = 3%和χ = 70%處檢測(cè)穿透點(diǎn)和飽和點(diǎn)所設(shè)置的AUV(即在該示例中檢測(cè)器是 UV檢測(cè)器并且Δ信號(hào)稱作Δ UV)判據(jù)而獲得，其中χ由以下給出
權(quán)利要求
1 一種用于確定色譜柱(1 ；39,47,59 ；107,109,111,113)的結(jié)合能力的方法，其包括-檢測(cè)進(jìn)料信號(hào)Ol ；201)，其代表向所述柱的入口提供的進(jìn)料材料的成分；-檢測(cè)流出物信號(hào)03 ；203，205，207，209)，其代表來(lái)自所述柱的流出物的成分；-使用所述進(jìn)料信號(hào)和所述流出物信號(hào)來(lái)確定所述柱的結(jié)合能力。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在色譜工藝期間連續(xù)確定所述柱(1；39，47， 59 ； 107，109，111，113)的所述結(jié)合能力。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其包括使用相同類型的檢測(cè)器(11，13;33，45，53， 65 ； 115，117，119，121，123)檢測(cè)所述進(jìn)料信號(hào)(21 ；201)和所述流出物信號(hào)(23 ；203，205， 207,209)。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括-使用所述進(jìn)料信號(hào)Ol ；201)和所述流出物信號(hào)03 ；203，205，207，209)來(lái)確定Δ信號(hào)和最大Δ信號(hào)07)，Δ信號(hào)是所述進(jìn)料信號(hào)減去所述流出物信號(hào)，最大Δ信號(hào)(XT)是當(dāng)所述流出物信號(hào)由于大致全部未結(jié)合組分已經(jīng)經(jīng)過(guò)所述柱這一事實(shí)而顯示平穩(wěn)期05) 時(shí)所述進(jìn)料信號(hào)減去所述流出物信號(hào)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其包括當(dāng)確定所述△信號(hào)和所述最大△信號(hào)時(shí)補(bǔ)償時(shí)間延遲，所述時(shí)間延遲代表未結(jié)合組分經(jīng)過(guò)所述柱所花的時(shí)間。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其包括使用所述△信號(hào)來(lái)確定所述柱的穿透點(diǎn)(c) 和/或飽和點(diǎn)(d)，所述穿透點(diǎn)和飽和點(diǎn)計(jì)算為所述最大△信號(hào)(XT)的相應(yīng)的某一預(yù)定百分比。
7.如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其包括檢測(cè)來(lái)自周期逆流PCC系統(tǒng)中的每個(gè)色譜柱(39，47，59 ； 107，109，111，113)的流出物信號(hào)(203，205，207，209)，以及使用這些流出物信號(hào)連同所述進(jìn)料信號(hào)O01)以在所述色譜工藝期間連續(xù)確定所述PCC系統(tǒng)的不同色譜柱(39,47,59 ；107，109，111，113)的結(jié)合能力。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其包括檢測(cè)所述進(jìn)料材料和所述流出物中的 UV吸光度。
9.如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其包括檢測(cè)所述進(jìn)料材料和所述流出物中的 pH、電導(dǎo)率、光散射、熒光、IR或可見(jiàn)光。
10.一種色譜系統(tǒng)，其包括至少一個(gè)色譜柱(1;39，47，59;107，109，111，113)，其特征在于，它進(jìn)一步包括-第一檢測(cè)器(11 ；33 ；115)，其適應(yīng)于檢測(cè)代表向所述至少一個(gè)柱的入口提供的進(jìn)料材料成分的進(jìn)料信號(hào)Ol ；201)；-第二檢測(cè)器(13 ；45 ；117)，其適應(yīng)于檢測(cè)代表來(lái)自所述系統(tǒng)的第一柱(1 ；39 ； 107)的流出物成分的流出物信號(hào)03 ；203)；-確定單元(15 ；71)，其連接到所述檢測(cè)器并且適應(yīng)于基于所述進(jìn)料信號(hào)和所述流出物信號(hào)確定所述第一柱(1 ；39 ； 107)的結(jié)合能力。
11.如權(quán)利要求10所述的色譜系統(tǒng)，其特征在于，所述確定單元(15;71)適應(yīng)于在所述色譜工藝期間基于所述進(jìn)料信號(hào)和所述流出物信號(hào)連續(xù)確定所述至少一個(gè)柱(1 ；39, 47,59 ；107,109,111,113)的結(jié)合能力。
12.如權(quán)利要求10或11所述的色譜系統(tǒng)，其包括周期逆流系統(tǒng)中的至少兩個(gè)柱(39， 47,59 ；107，109，111，113)并且進(jìn)一步包括另外的檢測(cè)器(53,65 ；119，121，123)，一個(gè)在每個(gè)另外的柱07，59;109，111，113)的后面，每個(gè)另外的檢測(cè)器適應(yīng)于檢測(cè)代表來(lái)自每個(gè)另外的柱(47,59 ；109,111,113)的流出物的成分的流出物信號(hào)(205，207，209)，每個(gè)檢測(cè)器連接到所述確定單元(71)，所述確定單元適應(yīng)于在所述色譜工藝期間基于所述進(jìn)料信號(hào)和所述流出物信號(hào)連續(xù)確定每個(gè)色譜柱(39，47，59 ;107，109，111，113)的結(jié)合能力。
13.如權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的色譜系統(tǒng)，其中所有檢測(cè)器(11，13；33,45, 53, 65 ；115，117，119，121，123)是相同類型。
14.如權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的色譜系統(tǒng)，其中所述確定單元(15；71)適應(yīng)于使用所述進(jìn)料信號(hào)Ol ；201)和所述流出物信號(hào)03 ；203，205，207，209)來(lái)確定對(duì)于每個(gè)柱(1 ；39,47, 59 ；107，109，111，113)的Δ信號(hào)和最大Δ信號(hào)(27)，Δ信號(hào)是所述進(jìn)料信號(hào)減去所述流出物信號(hào)，最大△信號(hào)m是當(dāng)所述流出物信號(hào)由于大致全部未結(jié)合組分已經(jīng)經(jīng)過(guò)所述柱這一事實(shí)而顯示平穩(wěn)期0 時(shí)所述進(jìn)料信號(hào)減去所述流出物信號(hào)。
15.如權(quán)利要求14所述的色譜系統(tǒng)，其中所述確定單元(15；71)進(jìn)一步適應(yīng)于當(dāng)確定所述△信號(hào)和所述最大△信號(hào)時(shí)補(bǔ)償時(shí)間延遲，所述時(shí)間延遲代表未結(jié)合組分經(jīng)過(guò)所述柱所花的時(shí)間。
16.如權(quán)利要求14或15所述的色譜系統(tǒng)，其中所述確定單元(15；71)進(jìn)一步適應(yīng)于使用所述△信號(hào)來(lái)確定所述柱的穿透點(diǎn)(c)和/或飽和點(diǎn)(d)，所述穿透點(diǎn)和飽和點(diǎn)計(jì)算為所述最大Δ信號(hào)(XT)的相應(yīng)的某一預(yù)定百分比。
17.如權(quán)利要求10-16中任一項(xiàng)所述的色譜系統(tǒng)，其進(jìn)一步包括控制單元(73)，控制單元(7 連接到所述確定單元(15 ；71)并且適應(yīng)于在所述色譜工藝期間連續(xù)監(jiān)測(cè)所述確定的結(jié)合能力并且依賴于所述確定的結(jié)合能力實(shí)時(shí)控制不同的色譜工藝步驟的起動(dòng)和停止。
18.如權(quán)利要求10-17中任一項(xiàng)所述的色譜系統(tǒng)，其中所述檢測(cè)器(11，13；33,45, 53, 65 ；115，117，119，121，123)是 UV 檢測(cè)器。
19.如權(quán)利要求10-17中任一項(xiàng)所述的色譜系統(tǒng)，其中所述檢測(cè)器(11，13；33,45, 53, 65 ；115，117，119，121，123)是pH、電導(dǎo)率、光散射、熒光、IR或可見(jiàn)光檢測(cè)器。
20.一種用于控制包括至少一個(gè)柱(1 ；39,47,59 ；107,109,111,113)的色譜系統(tǒng)的方法，其包括下列中的步驟-根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)確定所述至少一個(gè)色譜柱的結(jié)合能力；和-根據(jù)所確定的結(jié)合能力控制不同的色譜工藝步驟的起動(dòng)和停止。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于，在所述色譜工藝期間連續(xù)確定所述結(jié)合能力并且根據(jù)所確定的結(jié)合能力實(shí)時(shí)控制所述不同的色譜工藝步驟的所述起動(dòng)和停止。
22.一種用于控制包括至少兩個(gè)柱(39,47,59 ；107,109,111,113)的周期逆流色譜系統(tǒng)的方法，其包括下列中的步驟-檢測(cè)進(jìn)料信號(hào)001)，其代表向所述柱的入口提供的進(jìn)料材料的成分；-檢測(cè)流出物信號(hào)O03，205，207，209)，其代表來(lái)自所述系統(tǒng)中的每個(gè)柱的流出物的成分；-根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)確定每個(gè)色譜柱的結(jié)合能力；-依賴于所確定的結(jié)合能力控制到所述柱的進(jìn)料以及所述柱之間的進(jìn)料。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，在所述色譜工藝期間連續(xù)確定所述結(jié)合能力并且依賴于所確定的結(jié)合能力實(shí)時(shí)控制到所述柱的進(jìn)料以及所述柱之間的進(jìn)料。
24.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其包括依賴于所確定的結(jié)合能力控制對(duì)于所述進(jìn)料和緩沖泵(31,37 ；101,103,105)的流率。
25.如權(quán)利要求22-24中任一項(xiàng)所述的方法，其包括通過(guò)根據(jù)所確定的結(jié)合能力調(diào)整不同的柱應(yīng)該多久在加載段中以及在加載段中哪個(gè)位置而補(bǔ)償不同的柱性質(zhì)和/或流率中的任何差異。
全文摘要
用于確定色譜柱(1；39，47，59；107，109，111，113)的結(jié)合能力的方法，其包括-檢測(cè)進(jìn)料信號(hào)(21；201)，其代表向柱的入口提供的進(jìn)料材料的成分；-檢測(cè)流出物信號(hào)(23；203，205，207，209)，其代表來(lái)自柱的流出物的成分；-使用該進(jìn)料信號(hào)和該流出物信號(hào)來(lái)確定柱的結(jié)合能力。用于控制包括至少一個(gè)柱的色譜系統(tǒng)的方法，其包括下列中的步驟-根據(jù)上文確定至少一個(gè)色譜柱的結(jié)合能力；和-根據(jù)確定的結(jié)合能力控制不同的色譜工藝步驟的起動(dòng)和停止。
文檔編號(hào)B01D15/14GK102472731SQ201080029549
公開(kāi)日2012年5月23日 申請(qǐng)日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者E·埃斯特拉達(dá), H·斯科格拉爾, K·拉克基, P·班格特森 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司