專利名稱：用于核酸定量分析的反應(yīng)器的制作方法
用于核酸定量分析的反應(yīng)器
背景技術(shù)：
在生物分析和新出現(xiàn)的基因組學(xué)領(lǐng)域中目前使用的重要技術(shù)是DNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。由于這種有力工具，可以從否則無法檢測量的DNA開始且產(chǎn)生用于后續(xù)分析的大量材料。PCR使用重復(fù)系列的步驟以產(chǎn)生位于兩個(gè)起始(“引物”)序列之間的多核苷酸序列拷貝。從模板、兩個(gè)引物序列(通常長度約15-30個(gè)核苷酸)、PCR緩沖液、游離脫氧核苷三磷酸(dNTPs)和熱穩(wěn)定的DNA聚合酶(通常為來自棲熱水生菌(TXe/SM/51 aquaticus_~)熱TAQ聚合酶)開始，將這些組分混合，并且加熱以分離雙鏈DNA。后續(xù)冷卻步驟允許引物對于含有待擴(kuò)增序列的單鏈DNA分子上的互補(bǔ)序列退火。靶序列的復(fù)制通過DNA聚合酶完成，這產(chǎn)生與模板互補(bǔ)的DNA鏈。這個(gè)過程的重復(fù)加倍目的序列的拷貝數(shù)，并且多重循環(huán)指數(shù)增加拷貝數(shù)。因?yàn)镻CR要求在較高和較低溫度之間的重復(fù)循環(huán)，所以PCR裝置必須由能夠經(jīng)得住此類溫度變化的材料制造。材料必須是在高溫機(jī)械和化學(xué)穩(wěn)定的，并且能夠經(jīng)得住反復(fù)的溫度變化而無機(jī)械降解。此外，材料必須與PCR反應(yīng)自身相容，并且不抑制聚合酶或結(jié)合DNA。常規(guī)PCR —般在管、微板和毛細(xì)管中進(jìn)行，所有這些可以方便地密封。然而，這些管、微板和毛細(xì)管的幾何學(xué)致使其不適合于漸消波檢測法(evanescent wave detectionmethod)。當(dāng)使用漸消波檢測法時(shí)，存在增加信噪比的兩種常見策略。一種方法增加實(shí)際雜交信號。另一種方法減少本底信號。存在可以用于增加實(shí)際雜交信號的多種技術(shù)方案。一種已知方案利用更靈敏的熒光標(biāo)記。另一種已知方案通過修飾暴露條件如緩沖液組成和溫度、或使用具有高信噪比的檢測器來增加雜交效率。然而，這些技術(shù)方案不能完全解決問題或引起其他有疑問的結(jié)果。作為例子，使用更靈敏的熒光標(biāo)記還可以增加本底噪聲。此外，改變暴露條件可以減少擴(kuò)增效率，并且高品質(zhì)檢測器一般是成本高得驚人的。與漸消波傳感中的高本底信號有關(guān)的某些原因和方案已在幾個(gè)技術(shù)文件中加以討論。作為例子，M. Yoshida 等人 1993 Meas. Sci. Technol. 4 1077-1079 描述了至更長的激發(fā)波長過程的轉(zhuǎn)變，以便將靈敏度增加比常規(guī)系統(tǒng)中獲得那種高的數(shù)量級。此外，基底的小平面可以精細(xì)拋光以便減少在光學(xué)基底表面上的散射。WO 2008/092291 Al還描述了多層反射或吸收涂層可以如何涂覆在基底底部上的粘附區(qū)域上，以阻止通過粘合劑引起的任何散射。上述方案僅能夠消除在反應(yīng)緩沖液內(nèi)生成的某些不需要的熒光本底信號，在所述反應(yīng)緩沖液中存在高濃度熒光分子。其余不需要的熒光本底信號一般來自四個(gè)不同方面。一個(gè)方面是檢測器的固有噪聲。這個(gè)方面非常難以消除。第二個(gè)方面來自在蓋板和反應(yīng)緩沖液之間的界面。該界面引起在熒光標(biāo)記的DNA分子和蓋板表面之間的非特異性結(jié)合。已作出通過多種表面修飾法減少非特異性結(jié)合的嘗試，這增加蓋板表面的惰性特征(例如通過預(yù)雜交)。參見通過Alan R. Kimmel, BrianOliver 的 Methods in Enzymology: DNA Microarrays,第 410 卷，第 157 頁。第三個(gè)方面涉及反應(yīng)緩沖液內(nèi)，在其中存在激發(fā)光的散射，從而使得激發(fā)光以不同方向傳送進(jìn)入反應(yīng)緩沖液內(nèi)。散射的激發(fā)光在蓋板和反應(yīng)之間的界面上未獲得完全反射，而是引起反應(yīng)緩沖液內(nèi)的熒光分子的激發(fā)/發(fā)射。WO 2008/092291 Al描述了通過拋光或使用多層反射或吸收涂層來修飾蓋板，以阻止散射。附圖簡述
本發(fā)明的實(shí)施方案可以通過參考舉例說明此類實(shí)施方案的下述說明書和附圖得到最佳理解。在附圖中
圖I舉例說明了能夠漸消波檢測微陣列的PCR過程中熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的藥筒(cartridge)視圖。
圖2舉例說明了能夠漸消波檢測微陣列的PCR過程中熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的藥筒側(cè)視圖。圖3舉例說明了能夠漸消波檢測微陣列的PCR過程中熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的另一個(gè)藥筒視圖。圖4舉例說明了能夠漸消波檢測微陣列的PCR過程中熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的另一個(gè)藥筒側(cè)視圖。圖5舉例說明了基于漸消波檢測操作的示例微陣列閱讀器的斷面視圖。圖6舉例說明了通過CXD檢測器捕獲的圖像，所述CXD檢測器舉例說明了兩個(gè)不同蓋板的完全熒光本底，其中一個(gè)蓋板由K9玻璃形成,并且另一個(gè)蓋板由石英制成。圖7顯不了具有明顯本底缺陷的石央樣品的(XD圖像。圖8顯示了完全的表面處理/DNA探針固定/預(yù)雜交/擴(kuò)增和檢測過程。圖9顯示了擴(kuò)增循環(huán)數(shù)目32的示例最終檢測結(jié)果，其起因于執(zhí)行圖8中舉例說明的過程。

圖10顯示了由于執(zhí)行圖8中舉例說明的過程在石英和K9玻璃之間的信噪比比較。定義
如本文使用的，特定術(shù)語具有下述含義。在本說明書中使用的所有其他術(shù)語和短語具有其如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的普通含義。此類普通含義可以通過參考技術(shù)字典獲得，例如 Sax 和 Lewis StJHawley ^ s Condensed Chemical Dictionary % 11 版，Van NostrandReinhold, New York, N. Y. , 1987,和 The Merck Index,第 11 版，Merck & Co. , Rahway N. J.1989。如本文使用的，術(shù)語“和/或”意指這個(gè)術(shù)語與之相關(guān)的項(xiàng)目中的任何一個(gè)、項(xiàng)目的任何組合、或所有項(xiàng)目。如本文使用的，單數(shù)形式“一(a，an) ”和“該(the ) ”包括復(fù)數(shù)指代物，除非上下文另有明確說明。因此，例如，提及“制劑”包括多數(shù)此類制劑，從而使得化合物X的制劑包括化合物X的多個(gè)制劑。如本文使用的，術(shù)語“約”意指所指定值10%的變動(dòng)，例如約50%意味著從45%到55%的變動(dòng)。對于整數(shù)范圍，術(shù)語約可以包括大于和小于所述整數(shù)的一或兩個(gè)整數(shù)。
如本文使用的，術(shù)語“擴(kuò)增子”指聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的產(chǎn)物。擴(kuò)增子是已使用擴(kuò)增技術(shù)合成的DNA小片(例如具有兩種引物的雙鏈DNA)。擴(kuò)增子可以含有例如在5’末端由突光分子標(biāo)記的引物。如本文使用的，術(shù)語“陣列”和“微陣列”指元件(即實(shí)體)排列到材料或裝置內(nèi)。在另一種意義上，術(shù)語“陣列”指在基底上兩個(gè)或更多個(gè)測定區(qū)的整齊排列(例如行和列)。如本文使用的，術(shù)語“漸消”指隨著距離顯示出指數(shù)式衰變的近場駐波。如在光學(xué)中使用的，當(dāng)正弦波以大于臨界角的角度內(nèi)部反射離開界面時(shí)，形成漸消波，從而使得出現(xiàn)全內(nèi)反射。如本文使用的，術(shù)語“雜交”指互補(bǔ)核酸的配對。如本文使用的，術(shù)語“原動(dòng)力(motive force)”用于指用于誘導(dǎo)樣品沿著反應(yīng)器中的流動(dòng)路徑移動(dòng)的任何工具，并且包括跨越反應(yīng)器的任何部分應(yīng)用電位，跨越反應(yīng)器的任何部分應(yīng)用壓力差，或其任何組合。 如本文使用的，術(shù)語“核酸分子”指任何含有核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。如本文使用的，術(shù)語“光學(xué)檢測路徑”指檢測工具的配置或排列以形成路徑，由此電磁輻射能夠從外部來源傳送到用于接收輻射的工具，在其中輻射穿越反應(yīng)室。如本文使用的，術(shù)語“聚合酶鏈反應(yīng)”(PCR)指K. B. Mullis，美國專利號4，683，195,4, 683，202 和 4，965，188 的方法。如本文使用的，術(shù)語“反應(yīng)器”指可以在涉及流體的任何數(shù)目的化學(xué)過程中使用的裝置。有利的初級過程是使用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增DNA。任選地，DNA擴(kuò)增可以連同一個(gè)或多個(gè)其他類型的程序一起進(jìn)行。如本文使用的，術(shù)語“穩(wěn)定性”指材料經(jīng)得住損耗或移位且提供可靠性和可信性的能力。如本文使用的，術(shù)語“基底”指能夠支持結(jié)合的測定組分(例如測定區(qū)、細(xì)胞、測試化合物等)的材料。如本文使用的，術(shù)語“靶核酸”指對于待檢測的病原體固有的多核苷酸。多核苷酸是遺傳材料，包括例如DNA/RNA、線粒體DNA、rRNA、tRNA、mRNA、病毒RNA和質(zhì)粒DNA。如本文使用的，術(shù)語“水不可滲透的”指其中水將不經(jīng)過該材料的材料。發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了使用漸消波檢測技術(shù)用于靶核酸定量分析的反應(yīng)器及其使用方法。該反應(yīng)器包括具有腔的基底，排列在基底上的緩沖層；排列在緩沖層上的蓋板，以及入口和出口孔。該反應(yīng)器對于PCR加工是熱和化學(xué)穩(wěn)定的，且適合于漸消波檢測技術(shù)。在反應(yīng)器內(nèi)發(fā)生的PCR過程要求專門的溫度條件，例如高和低溫的循環(huán)周期。液體和反應(yīng)室的溫度變化通過加熱和冷卻系統(tǒng)調(diào)節(jié)。在高溫下，樣品液體膨脹且增加反應(yīng)室內(nèi)的壓力。相反，在低溫下，樣品液體收縮且減少反應(yīng)室內(nèi)的壓力。反應(yīng)室的任何變形會(huì)引起覆蓋層和基底之間的不完全粘附且導(dǎo)致滲漏。在PCR擴(kuò)增的情況下，即使小量的很少滲漏也可以導(dǎo)致假陽性。為了阻止這種滲漏，使用緩沖層。對于靶核酸的實(shí)時(shí)定量分析，利用漸消波檢測技術(shù)的幾種方法已得到公開，包括例如在Xu (美國專利申請公開號2006/0088844)和于2007年11月5日提交的名稱為“AQUANTITATIVE METHOD FOR OLIGONUCLEOTIDE MICROARRAY” 的 PCT 專利申請序列號 PCT/CN2007/003124中所述的技術(shù)。在描述靶核酸的實(shí)時(shí)定量分析的這些方法中，使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增樣品中的靶核酸。通過將靶核酸置于含有核苷酸腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和鳥嘌呤(G)(統(tǒng)稱為dNTPs)、DNA聚合酶和引物的緩沖液中開始PCR。引物是短鏈DNA，其序列互補(bǔ)于靶核酸的特定區(qū)域。引物起始靶核酸的復(fù)制。引物可以是在5’末端用熒光分子熒光標(biāo)記的，或dNTPs是熒光標(biāo)記的。這類PCR過程具有三個(gè)主要步驟變性、退火和延伸。在變性步驟中，將混合物加熱至約94°C (Centrigrade),在這個(gè)點(diǎn)上祀DNA分離成單鏈。將混合物快速冷卻。當(dāng)溫度下降至約60°C時(shí)，退火步驟發(fā)生，其中熒光標(biāo)記的引物與其在靶核酸上的互補(bǔ)序列雜交或 結(jié)合。延伸步驟可以在約60°C執(zhí)行或可以升高至72-78°C范圍。在這個(gè)步驟中，DNA聚合酶使用在溶液中的dNTPs以延伸熒光標(biāo)記的退火的引物，且形成稱為擴(kuò)增子的DNA新鏈。將混合物短暫再加熱回到約94°C，以將新產(chǎn)生的雙螺旋鏈分離成核酸單鏈，其開始PCR過程的另一個(gè)循環(huán)，對于PCR過程的每個(gè)循環(huán)，原始靶核酸的拷貝數(shù)大致加倍。PCR緩沖液可以另外含有熒光標(biāo)記的引物，即具有附著至其的熒光染料分子的引物，從而使得在每個(gè)PCR循環(huán)完成后，產(chǎn)生的擴(kuò)增子是熒光標(biāo)記的。使用稱為靶核酸探針的DNA的探針鏈定位靶核酸的擴(kuò)增子。靶核酸探針具有與靶核酸相同的互補(bǔ)的核苷酸序列。靶核酸探針以已知二維模式與基底表面栓系，其中基底表面形成含有PCR成分的反應(yīng)池的部分。PCR緩沖液還可以包括涂覆試劑或表面活性劑，以通過修飾反應(yīng)器的內(nèi)表面來阻止非特異性結(jié)合。此類涂覆試劑的例子包括聚氧化乙烯三嵌段共聚物、具有范圍為約200-約8000的分子量的聚乙二醇(PEG)、天然聚合物例如牛血清白蛋白(BSA)或提供所需表面特征的任何其他部分，特別是減少生物分子例如蛋白質(zhì)和核酸的吸附的那些。一般經(jīng)由任何合適的方法將含有待擴(kuò)增樣品以及合適緩沖液和試劑的溶液引入反應(yīng)器內(nèi)。樣品的引入可以使用任何方便的工具實(shí)現(xiàn)，包括電動(dòng)注射、水力注射、自發(fā)流體移位等。采用的特定工具在極大程度上取決于通道的配置以及引入精確體積樣品的必要性。在PCR過程的退火和延伸期過程中，靶擴(kuò)增子與其相應(yīng)靶核酸探針雜交。雜交的熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子用合適波長的光的漸消波照明，以激活熒光標(biāo)記的引物或熒光標(biāo)記的dNTPs的熒光染料分子。這個(gè)漸消波在經(jīng)由靶核酸探針與之栓系的基底表面進(jìn)入反應(yīng)池后在功率中指數(shù)衰變，具有約300 nm的有效穿透范圍。這意味著漸消波穿透足夠深入反應(yīng)池內(nèi)，以激活與那些靶核酸探針雜交的熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子，但它不激活在反應(yīng)池的主體中在溶液中熒光標(biāo)記的分子(例如熒光標(biāo)記的引物或熒光標(biāo)記的dNTPs)。通過監(jiān)控在基底表面上的不同位置的熒光強(qiáng)度，可以測定相應(yīng)靶核酸的擴(kuò)增子的目前豐度。以類似于實(shí)時(shí)PCR計(jì)算的方式，結(jié)果用于獲得原始樣品中特定靶的豐度的定量測量。反應(yīng)器
在一個(gè)實(shí)施方案中，圖I示意性舉例說明了可以用于進(jìn)行化學(xué)過程例如PCR的反應(yīng)器。該裝置一般在11處表示，包含具有平面表面15且含有腔17的基底13。顯示了排列在基底13的平面表面15上的緩沖層19。顯示了排列在緩沖層19的頂面23上的蓋板21。在裝置使用前，將蓋板21的下側(cè)25與基底13的平面表面15上的緩沖層19的頂面23對齊且靠其放置(參見例如圖2)。與緩沖層19組合的蓋板21和腔17形成反應(yīng)室，在其中進(jìn)行所需化學(xué)過程。將流體例如待分析的樣品、分析試劑、反應(yīng)物等從外部來源通過入口孔27引入反應(yīng)室內(nèi)。出口孔29使得流體從反應(yīng)室到外部容器而經(jīng)過。相應(yīng)地，通過將蓋板21與在基底13上的緩沖層19對齊而關(guān)閉反應(yīng)器，形成密封。在某些實(shí)施方案中，緩沖層19不是固化的。在其他實(shí)施方案中，緩沖層19是固化的。這個(gè)密封導(dǎo)致形成反應(yīng)室，流體可以通過入口孔27引入其內(nèi)且通過出口孔29去除。具有合適大小、硬度和化學(xué)抗性的一組塞子(例如橡膠)可以用于密封反應(yīng)室的入口孔27和出口孔29。在另一個(gè)實(shí)施方案中，圖3示意性舉例說明了可以用于進(jìn)行化學(xué)過程例如PCR的反應(yīng)器。該裝置一般在11處表示，包含具有平面表面15且含有腔17的基底13。顯示了排列在基底13的平面表面15上的緩沖層19。顯示了排列在緩沖層19的頂面23上的蓋板21。 在裝置使用前，將蓋板21的下側(cè)25與基底13的平面表面15上的緩沖層19的頂面23對齊且靠其放置(參見例如圖4)。與緩沖層19組合的蓋板21和腔17形成反應(yīng)室，在其中進(jìn)行所需化學(xué)過程。將流體例如待分析的樣品、分析試劑、反應(yīng)物等從外部來源通過入口孔27引入反應(yīng)室內(nèi)。出口孔29使得流體從反應(yīng)室到外部容器而經(jīng)過。相應(yīng)地，通過將蓋板21與在基底13上的緩沖層19對齊而關(guān)閉反應(yīng)器，形成密封。在某些實(shí)施方案中，緩沖層19不是固化的。在其他實(shí)施方案中，緩沖層19是固化的。這個(gè)密封導(dǎo)致形成反應(yīng)室，流體可以通過入口孔27引入其內(nèi)且通過出口孔29去除。具有合適大小、硬度和化學(xué)抗性的一組塞子(例如橡膠)可以用于密封反應(yīng)室的入口孔27和出口孔29?；缀蜕w板
用于形成實(shí)施方案中的基底和蓋板的材料就對于特定應(yīng)用希望的物理和化學(xué)特征而言進(jìn)行選擇。在使用的反應(yīng)條件下(例如就pH、電場等而言)，就它們與之接觸的任何試劑而言，基底和蓋板應(yīng)是化學(xué)惰性和物理穩(wěn)定的。因?yàn)镻CR涉及相對高的溫度，所以重要的是所有材料在使用的溫度范圍內(nèi)是化學(xué)和物理穩(wěn)定的。對于與光學(xué)檢測工具的使用，使用的材料應(yīng)是光學(xué)透明的，一般對于約150 nm - 800 nm范圍中的波長是透明的。例如，在某些實(shí)施方案中，基底包括平面(即2維)玻璃、金屬、復(fù)合物、塑料、二氧化硅或其他生物相容或生物學(xué)非活性的組合物。可以采用許多基底。基底可以是生物學(xué)、非生物學(xué)、有機(jī)、無機(jī)的或這些中的任何的組合，作為粒子、繩、沉淀物、凝膠、片、管道、球體、器皿、毛細(xì)管、墊、切片、薄膜、板、載玻片等存在。基底可以具有任何方便的形狀，例如盤、正方形、球體、圓圈等?；滓话闶潜馄降牡梢圆扇《喾N可替代的表面配置。例如，基底可以含有在其上發(fā)生合成的升高或壓低的區(qū)域?；准捌浔砻婵梢孕纬稍谄渖线M(jìn)行本文描述的反應(yīng)的剛性載體?；准捌浔砻孢€選擇為提供合適的吸光特征。例如，基底可以是聚合Langmuir Blodgett薄膜、玻璃、官能化玻璃、Si、Ge、GaAs> GaP> Si02、SiN4、改性硅或廣泛多樣的凝膠或聚合物中的任何一種，例如(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯((poly)vinylidenedifluoride)、聚苯乙烯、聚碳酸酯或其組合。用于形成本反應(yīng)器的合適材料包括但不限于聚合材料、陶瓷(包括氧化鋁等)、玻璃、石英、金屬、復(fù)合物及其層壓體(laminate)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，基底是玻璃。在其他實(shí)施方案中，基底是聚合材料。聚合材料一般是有機(jī)聚合物，其為同聚物或共聚物，天然存在或合成的，交聯(lián)或未交聯(lián)的。特定目的聚合物包括但不限于聚烯烴例如聚丙烯、聚酰亞胺、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、聚醚、聚氨基甲酸酯、多氟烴、聚苯乙烯、聚(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)(ABS)、丙烯酸酯和丙烯酸聚合物例如聚甲基丙烯酸甲酯、以及其他取代和未取代的聚烯烴，及其共聚物?；缀蜕w板還可以由“復(fù)合物”制造，即由不相似材料組成的組合物。復(fù)合物可以是嵌段復(fù)合物，例如A-B-A嵌段復(fù)合物、A-B-C嵌段復(fù)合物等?？商娲?，復(fù)合物可以是材料的異質(zhì)組合，即其中材料不同于分開相，或不相似材料的同質(zhì)組合。如本文使用的，術(shù)語“復(fù)合物”用于包括“層壓體”復(fù)合物。如本文使用的，術(shù)語“層壓體”指由等同或不同材料的幾個(gè)不同粘結(jié)層形成的復(fù)合材料。其他復(fù)合物基底包括聚合物層壓體，聚合物-金屬層壓體，例如由銅涂覆的聚合物，金屬包陶瓷(ceramic-in-metal)、或金屬包聚合物(polymer-in-metal)復(fù)合物。
基底和蓋板的表面可以進(jìn)行化學(xué)修飾，以提供希望的化學(xué)或物理性質(zhì)，例如減少分子部分與反應(yīng)室內(nèi)壁的吸附，且減少電滲透流。例如，玻璃、聚合或陶瓷基底和/或蓋板的表面可以由電中性分子種類、兩性離子基團(tuán)、親水或疏水寡聚物或聚合物涂覆或官能化以含有電中性分子種類、兩性離子基團(tuán)、親水或疏水寡聚物或聚合物等。對于具有反應(yīng)位點(diǎn)或官能團(tuán)例如羧基、羥基、氨基和鹵烷基(例如聚乙烯醇、聚羥基苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈等)的聚酰亞胺、聚酰胺和聚烯烴，或?qū)τ诳梢赃@樣修飾以便含有此類反應(yīng)位點(diǎn)或官能團(tuán)的聚合物，可以將基團(tuán)化學(xué)結(jié)合至可以提供多種希望的表面性質(zhì)的表面。經(jīng)修飾的基底是這樣官能化的聚酰亞胺，以便含有表面結(jié)合的水溶性聚合物例如聚氧化乙烯(PE0)，其趨于減少不需要的吸附且使DNA擴(kuò)增和涉及雜交技術(shù)的其他方法中的非特異性結(jié)合降到最低。使用表面活性劑(例如聚氧化乙烯三嵌段共聚物例如在商品名稱“Pluronic”下可獲得的那些、聚氧乙烯脫水山梨糖醇或“TWEEN”)、天然聚合物(例如牛血清白蛋白或“BSA”)、或提供所需表面特征特別是減少生物分子或核酸或蛋白質(zhì)的吸附的其他部分，還可以有利地修飾基底表面。還應(yīng)強(qiáng)調(diào)單個(gè)基底的不同區(qū)域可以具有化學(xué)上不同的表面。例如，反應(yīng)室可以具有例如由聚氧化乙烯等涂覆或官能化的一個(gè)內(nèi)表面，而反應(yīng)室的另一個(gè)內(nèi)表面可以是未涂覆或官能化的。以這種方式，存在于相同基底中的不同組分和特征可以用于進(jìn)行不同化學(xué)或生物化學(xué)過程，或在單一化學(xué)或生物化學(xué)過程內(nèi)的不同步驟?；卓梢允蔷哂写笥诩s0. I W/mK、或大于約0. 5 W/mK或大于約I W/mK的導(dǎo)熱系數(shù)的導(dǎo)熱材料。這允許在快速加熱和冷卻循環(huán)過程中的快速熱轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方案中，基底是具有大于約I W/mK的導(dǎo)熱系數(shù)的導(dǎo)熱聚丙烯。導(dǎo)熱聚丙烯一般包括充當(dāng)加熱元件的材料。合適的導(dǎo)熱材料可以包括例如鐵、鎳、鈷、鉻；碳鋼纖維、磁性不銹鋼纖維、鎳?yán)w維、鐵磁體涂覆的導(dǎo)電纖維、鐵磁體涂覆的非導(dǎo)電纖維及其合金。在一個(gè)實(shí)施方案中，將基底加熱以升高反應(yīng)器的溫度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將基底冷卻以降低反應(yīng)器的溫度。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，將基底加熱且隨后冷卻以調(diào)節(jié)反應(yīng)器的溫度。在一個(gè)實(shí)施方案中，蓋板是玻璃。現(xiàn)有技術(shù)無一提及與可以用于波導(dǎo)的不同材料(即蓋板21)相關(guān)的本底效應(yīng)。折射指數(shù)一般是當(dāng)選擇材料用于光學(xué)波導(dǎo)材料時(shí)需要考慮的唯一重要因素。此外，關(guān)于可以用于漸消波傳感中的不同材料的熒光吸收/發(fā)射特征，一般給予很少的考慮。蓋板21可以通過激光切割、注模、拋光等進(jìn)行制造。作為測定特定材料的熒光吸收/發(fā)射特征的部分，蓋板21可以在激光掃描過程中使用，其中同時(shí)檢測發(fā)射熒光本底信號。檢測可以使用在圖5中所示的系統(tǒng)中運(yùn)行的程序來完成，其中發(fā)生移動(dòng)和成像設(shè)置但不運(yùn)行實(shí)際反應(yīng)(參見例如，實(shí)施例2)。檢測到的圖像顯示有關(guān)所選材料的熒光本底。這種方法證實(shí)當(dāng)與其他材料如光學(xué)玻璃K9相比較時(shí)，由石英制成的蓋板21生成顯著更少的熒光本底信號。此外，與DNA探針固定過程組合的進(jìn)一步的表面修飾(在下文實(shí)施例3中討論的)證實(shí)，當(dāng)與其他材料如光學(xué)玻璃K9相比較時(shí)，由石英制成的蓋板生成高得多的信噪比。緩沖層在反應(yīng)器中，在基底和蓋板之間使用緩沖層。緩沖層應(yīng)具有對于基底和蓋板的良好粘附。緩沖層還應(yīng)無法被樣品中使用的液體滲透。緩沖層應(yīng)能夠經(jīng)得住在4°C直到95°C之間的反復(fù)循環(huán)達(dá)延長時(shí)間段(例如1-2小時(shí))。緩沖層還應(yīng)不干擾PCR過程和檢測系統(tǒng)?？梢允褂枚喾N緩沖層，盡管所選的任何緩沖層都應(yīng)能夠經(jīng)得住在位于反應(yīng)室中的任何樣品材料的加工過程中生成的力，例如在樣品材料的分布過程中發(fā)展的力，在樣品材料的熱加工過程中發(fā)展的力等。當(dāng)例如加工涉及熱循環(huán)時(shí)，這些力可以很大。在一個(gè)實(shí)施方案中，與樣品加工裝置結(jié)合使用的緩沖層應(yīng)顯示出低熒光，且與該過程和待與PCR結(jié)合使用的材料相容。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖層可以顯示出密封劑和/或粘附性質(zhì)。此類緩沖層可以更順應(yīng)樣品加工裝置的高體積生產(chǎn)，因?yàn)樗鼈円话悴簧婕霸谌垠w粘結(jié)中使用的高溫粘結(jié)過程，它們也不存在液體粘合劑、溶劑粘結(jié)、超聲粘結(jié)等使用中固有的處理問題。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖層可以包括確保緩沖層的性質(zhì)不受水不利影響的材料。例如，緩沖層不應(yīng)喪失粘附，喪失內(nèi)聚力，軟化，膨脹或響應(yīng)在樣品裝載和加工過程中暴露于水而變得不透明。此外，緩沖層不應(yīng)含有在樣品加工過程中可以提取到水內(nèi)的任何組分，從而可能損害裝置性能。此外，緩沖層可以是單一材料或兩種或更多種材料的組合或摻和物。緩沖層可以起因于例如溶劑涂覆、絲網(wǎng)印刷、輥筒印刷、熔體擠出涂覆、熔體噴射、條紋涂覆(stripecoating)或?qū)訅哼^程。緩沖層可以具有廣泛多樣的厚度，只要它符合顯示出上述特征和性質(zhì)。為了達(dá)到最大限度粘結(jié)保真度和需要時(shí)充當(dāng)鈍化層，緩沖層應(yīng)是連續(xù)的且不含針孔或多孔性。本領(lǐng)域已知的任何粘合劑組合物可以作為緩沖層應(yīng)用。合適的粘合劑組合物在例如 “Adhesion and Bonding,” Encyclopedia of Polymer Science and Engineering,第I卷，第476-546頁，Interscience Publishers,第二版，1985中描述。在一個(gè)實(shí)施方案中，粘合劑組合物是水不可滲透的。合適的水不可滲透的粘合劑包括例如基于天然橡膠膠乳的粘合劑、基于合成橡膠的粘合劑、基于硅的粘合劑和熱熔性粘合劑。許多其他粘合劑也可以用于本發(fā)明的目的，具體選擇取決于待彼此結(jié)合的兩個(gè)表面的特征、在其下完成粘結(jié)的環(huán)境和所得到的產(chǎn)物的預(yù)期用途。粘合劑的詳盡討論可以在llmann’ s Encyclopediaof Industrial Chemistry,VCH Verlagsgesellschaft GmbH,Germany, 1985,第Al卷,在第221-267 頁和 Encyclopedia of Chemical Technology,第四版，John Wiley & Sons, NYC,1991，第I卷，在第445-466頁找到。還可以使用可固化粘合劑。然而，還可以使用接觸、壓敏、橡膠基、乳液、熱熔、天然產(chǎn)物、聚氨基甲酸酯、丙烯酸、環(huán)氧樹脂、酚和聚酰亞胺粘合劑。合適類別的密封劑組合物還可以包括例如聚氨基甲酸酯、聚異丁烯、丁基橡膠、彈性體、環(huán)氧樹脂、天然和合成橡膠、硅酮、聚硫化物、丙烯酸酯及其組合。密封劑組合物可以包括極性和/或反應(yīng)基團(tuán)(例如硅烷、氨基甲酸酯、酯、巰基及其組合)，以提供與靶基底(例如玻璃和塑料)足夠的共價(jià)和/或極性(例如氫)粘結(jié)。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖層可以由疏水材料組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，緩沖層可以由硅酮材料組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用娃密封劑。娃酮密封劑一般包括娃酮聚合物、一種或多種填充劑、交聯(lián)組分例如反應(yīng)硅烷和催化劑的混合物。硅酮聚合物具有硅氧烷主鏈且包括懸垂烷基、烷氧基或乙酰氧基。此類基團(tuán)水解為硅烷醇基團(tuán)，其通過縮合形成更大的鏈。硅酮密封劑可以借助于填縫槍、抹刀或其他合適方法應(yīng)用，并且通過暴露于濕空氣中固化。硅酮 密封劑具有低收縮特征，并且可以在廣泛溫度范圍上應(yīng)用且使用。由于其溫和固化條件，室溫硫化(RTV)硅酮橡膠密封劑是特別有用的。合適的室溫硫化(RTV)硅酮橡膠密封劑包括例如單組分 RTV 橡膠(KE3475, Shin-Etsu Chemical Co. , Ltd.,日本)和單組分(one-part)濕固化 RTV (SE 9120, Dow Corning Corporation, Midland, MI, USA)0除了濕固化硅密封劑材料，還可以使用輻射可固化的硅密封劑。合適的紫外輻射可固化硅酮密封劑組合物一般包含(i )含輻射敏感官能團(tuán)的有機(jī)聚硅氧烷和(ii)光敏引發(fā)劑。輻射敏感官能團(tuán)的例子包括丙烯酰、甲基丙烯酰、巰基、環(huán)氧和烯基醚基團(tuán)。光敏引發(fā)劑的類型取決于有機(jī)聚硅氧烷中的輻射敏感基團(tuán)的性質(zhì)。光敏引發(fā)劑的例子可以包括二芳基碘鎗鹽、锍鹽、苯乙酮、二苯甲酮和苯偶姻及其衍生物。特別有用類型的不飽和有機(jī)硅化合物具有附著至硅的至少一個(gè)脂肪族不飽和有機(jī)基團(tuán)/分子。脂肪族不飽和有機(jī)硅化合物包括硅烷、聚硅烷、硅氧烷、硅氮烷，以及含有通過亞甲基或聚亞甲基或亞苯基連接在一起的硅原子的單體或聚合材料。緩沖層還可以選自硅酮材料類，其基于硅酮聚合物和粘性樹脂的組合，如例如“Silicone Pressure Sensitive Adhesives,，， Handbook of Pressure SensitiveAdhesive Technology,第3版,第508-517頁中描述的。已知娃酮壓敏粘合劑的疏水性、其經(jīng)得住高溫的能力及其與多種不同表面粘結(jié)的能力。某些合適的組合物可以在PCT專利申請公開號WO 00/68336中描述。其他合適的組合物可以基于硅酮-聚脲基壓敏粘合劑家族。此類組合物在美國專利號5，461，134 ;美國專利號6，007，914 ；PCT專利申請公開號WO 96/35458 ；PCT專利申請公開號WO 96/34028 ；和PCT專利申請公開號WO 96/34029中描述。此類壓敏粘合劑基于硅酮-聚脲聚合物和粘性試劑的組合。粘性試劑可以根據(jù)需要選自功能(反應(yīng))和無功能增粘劑種類內(nèi)。一種或多種粘性試劑的水平可以根據(jù)需要改變，以便對粘合劑組合物賦予所需粘性。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，壓敏粘合劑組合物可以是粘性聚二有機(jī)硅氧烷寡脲鏈段共聚物，包括(a)軟聚二有機(jī)硅氧烷單元、硬聚異氰酸酯殘基單元，其中聚異氰酸酯殘基是聚異氰酸酯減去-NCO基團(tuán)，任選地，軟和/或硬有機(jī)聚胺單元，其中異氰酸酯單元和胺單元的殘基通過脲鍵連接；和(b) —種或多種粘性試劑(例如硅酸酯樹脂等)。
在某些實(shí)施方案中，屏障層可以是例如單側(cè)或雙側(cè)水不可滲透的粘合帶。在其他實(shí)施方案中，屏障層可以是例如用水不可滲透的粘合劑在一側(cè)或兩側(cè)上涂覆的墊圈。在其他實(shí)施方案中，屏障層可以是例如水不可滲透的層壓體材料。制造
基底可以使用任何方便的方法進(jìn)行制造，包括但不限于微模塑和鑄型技術(shù)、浮雕法、表面微加工和體微加工。后面一種技術(shù)涉及通過直接蝕刻到整體材料內(nèi)的顯微結(jié)構(gòu)形成，一般使用濕化學(xué)蝕刻或反應(yīng)離子蝕刻。表面微加工涉及從沉積在基底表面上的薄膜制造。盡管前述討論已使用DNA作為核酸，但將本文公開的方法應(yīng)用于其他核酸，包括RNA序列或RNA和DNA序列的組合，對于本領(lǐng)域合理技術(shù)人員是顯而易見的。應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的特定描述已簡化以僅舉例說明與本發(fā)明明確理解有關(guān)的那些元件和限制，同時(shí)為了清楚的目的消除其他元件。在考慮本發(fā)明的說明書后，本領(lǐng)域普通技 術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到其他元件和/或限制可以是希望的，以便實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。然而，因?yàn)榇祟惼渌?或限制可以由普通技術(shù)人員在考慮本發(fā)明的說明書后容易地確定，并且不是本發(fā)明完全理解必需的，所以此類元件和限制的討論在本文中不提供。參考圖5，根據(jù)某些實(shí)施方案，顯示了基于漸消波檢測的微陣列閱讀器100的斷面視圖(還參見WO 2008/092291 Al)。線性位移臺(tái)124可以支持線形輸出光源102，例如激光。光源102的波長可以選擇為在激活熒光標(biāo)記的范圍中。光源102可以在接觸基底112前通過圓柱透鏡104 (束成形元件)再成形。例如接觸可以包括進(jìn)入基底112。例如圓柱透鏡104可以是衍射光學(xué)元件或漫射光學(xué)元件。光源102、圓柱透鏡104和線性位移臺(tái)124可以組成線掃描激發(fā)系統(tǒng)?；?12可以是光學(xué)基底，例如玻璃或聚合物?；?12可以是非常薄的，以減少熱容量且符合快速溫度控制的需求。例如基底112可以是約I mm -約3 mm厚?；?12可以由激發(fā)波長下的低自發(fā)熒光材料制造。線掃描激發(fā)系統(tǒng)可以支持均勻強(qiáng)度。例如可以應(yīng)用具有均勻度校正的均勻線掃描，以克服用于點(diǎn)掃描的更低速度。為了獲得彈性和方便的偶聯(lián)，例如可以應(yīng)用直接偶聯(lián)。例如可以通過反饋控制調(diào)整激發(fā)的位置變動(dòng)。例如同步化回路可以通過線掃描激發(fā)系統(tǒng)用于同步化取樣。基底112可以接觸反應(yīng)室116，封裝緩沖溶液122且組成實(shí)時(shí)PCR微陣列反應(yīng)系統(tǒng)。例如基底112的折射率可以高于緩沖溶液122。例如基底可以與反應(yīng)室116膠合。熒光標(biāo)記可以在成像傳感器106例如冷卻CXD照相機(jī)106中通過成像透鏡110成像。在基底112和圖像透鏡110之間的濾光片108可以用于阻斷激發(fā)光且通過熒光。與反應(yīng)室116接觸，在臺(tái)120上的加熱/冷卻元件118可以用于加熱、冷卻或穩(wěn)定反應(yīng)系統(tǒng)。例如元件118可以是TEC溫度控制板。任何光源強(qiáng)度的變動(dòng)可以通過檢測器114例如光電檢測器進(jìn)行監(jiān)控。
實(shí)施例下述實(shí)施例是上述本發(fā)明的舉例說明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)容易地認(rèn)識(shí)到實(shí)施例中描述的技術(shù)和試劑暗示其中可以實(shí)踐本發(fā)明的許多其他方法。實(shí)施例I這個(gè)實(shí)施例舉例說明使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過程和漸消波檢測技術(shù)用于核酸定量分析的微陣列反應(yīng)器的制造。反應(yīng)室由玻璃蓋板和導(dǎo)熱聚丙烯基底制成。玻璃蓋板的內(nèi)表面是化學(xué)修飾的，以減少熒光物質(zhì)和其他污染物的吸附。 靶核酸探針以已知二維模式與玻璃蓋板的內(nèi)表面栓系。玻璃蓋板也是透明的且適合于漸消波檢測技術(shù)。
具有內(nèi)部腔的導(dǎo)熱聚丙烯基底使用模塑法進(jìn)行制造。將入口和出口摻入基底內(nèi)。通過緩沖層將玻璃蓋板和聚丙烯基底裝配且密封在一起，以形成反應(yīng)器。在裝載樣品后，將入口和出口用橡皮塞密封。為了防止反應(yīng)器對于熱循環(huán)的液體滲漏，在基底和蓋板之間使用緩沖層?？晒袒尥鹉z(來自Shin-Etsu Chemical Co. ,Ltd.，日本的KE3475)用作緩沖層。這種娃酮橡膠是水不可滲透的且能夠經(jīng)得住4°C直到95°C的溫度。這種硅酮橡膠還將不干擾PCR過程或在固化后顯示出低熒光。為了防止對于玻璃蓋板、聚丙烯基底和固定的靶探針的損害，硅橡膠是室溫硫化(RTV )材料。將樣品和多種分析試劑和反應(yīng)物從外部來源通過入口孔引入反應(yīng)室內(nèi)。當(dāng)流體通過入口孔引入時(shí)，出口孔充當(dāng)氣孔。在加入樣品和多種分析試劑和反應(yīng)物后，具有合適大小、硬度和化學(xué)抗性的一組橡皮塞用于密封反應(yīng)室的入口孔和出口孔。當(dāng)使用反應(yīng)器用于核酸檢測時(shí)，將反應(yīng)器和內(nèi)部的試劑通過PCR溫度循環(huán)程序加熱且冷卻下來。例如，半導(dǎo)體冷卻器用于加熱/冷卻由導(dǎo)熱聚丙烯材料制成的基底。在PCR過程期間，室中的靶DNA指數(shù)擴(kuò)增，并且擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中的退火/延伸步驟與在玻璃蓋板的內(nèi)表面上栓系的靶探針雜交。玻璃蓋板適合于通過漸消波的熒光檢測。玻璃蓋板可以例如由其折射率高于反應(yīng)器內(nèi)的PCR/雜交緩沖液的折射率的K9光學(xué)玻璃制成。熒光分子例如CY5可以用于PCR引物標(biāo)記。CY5在649 nm處最大限度激發(fā)且在670 nm處最大限度發(fā)射。本發(fā)明已就多個(gè)具體實(shí)施方案和技術(shù)而言進(jìn)行描述。然而，應(yīng)當(dāng)理解可以作出許多變動(dòng)和修飾，同時(shí)仍在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。實(shí)施例2
由石英和K9玻璃制成的蓋板的熒光本底測試
由石英和K9玻璃制成的蓋板在具有相同制造過程的相同光學(xué)工廠中進(jìn)行制造，包括激光切割、粗磨光、在入射小平面和缺口檢測中的精細(xì)拋光。在由這兩個(gè)種類的材料制成的最終蓋板中達(dá)到相同光學(xué)級別。隨后將這兩種材料連同基底一起個(gè)別地置于微陣列閱讀器的檢測位置上，如WO 2008/092291 Al中所述。在635nm處的激發(fā)光束以具有給定入射角的側(cè)小平面打進(jìn)蓋板內(nèi)(參見例如圖5)。位移臺(tái)124按程序工作，以水平移動(dòng)，以確保入射光可以在蓋板和腔中的空氣之間的界面上以相同入射角掃描蓋板的整個(gè)表面。掃描過程以恒定速度進(jìn)行。軟件程序用于控制檢測器的暴露開始/終止時(shí)間。將檢測器與濾光片整合，以排除在635nm處的激發(fā)光，從而使得僅可以捕獲發(fā)射熒光。圖6顯示了通過CXD檢測器捕獲的圖像，所述CXD檢測器舉例說明了兩個(gè)不同蓋板的完全突光本底，其中一個(gè)蓋板由K9玻璃形成,并且另一個(gè)蓋板由石英制成。掃描時(shí)間對于每個(gè)蓋板是4秒,具有在Coolsnap (XD中的相同暴露時(shí)間。CXD的固有本底是約7 RLU,并且石英和K9材料的固有本底低于10且分別從20到40不等(包括CCD的固有本底)。因此，石英的固有本底低于3 (大多數(shù)石英載玻片本底接近于零)，而K9載玻片的固有本底從10到超過30不等。使用由低熒光本底差異形成的蓋板，石英將允許包括待篩除(即拒絕)的明顯本底缺陷的那些蓋板。參見例如圖7，其顯示了具有明顯本底缺陷的石英樣品的CXD圖像。實(shí)施例3
在實(shí)際檢測過程中石英和K9玻璃的信噪比比較
圖8顯示了完全的表面處理/DNA探針固定/預(yù)雜交/擴(kuò)增和檢測過程。通過通常用于檢測金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的兩種DNA寡核苷酸探針比較石英和K9的信噪比，所述金黃色葡萄球菌是通常以葡萄樣簇出現(xiàn)且引起癤子、敗血病和其他感染的
一類細(xì)菌。
探針I(yè) :5’ NH2- (CH2) 6 -TTTTTCCCCCTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCAC 3，。探針2:5’ NH2- (CH2)6 -TTTTTCCCCCTGTAAGTAACTGTGGACATCTTGACGG 3，。圖9顯示了擴(kuò)增循環(huán)數(shù)目32的示例最終檢測結(jié)果，其起因于執(zhí)行圖8中舉例說明的過程。如圖10上所示，石英的信噪比比K9玻璃的那種高得多。石英更高的信噪比幫助準(zhǔn)確識(shí)別起始雜交信號和Ct值。這個(gè)過程的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是分批間或分批內(nèi)蓋板的芯片品質(zhì)可以由選擇性檢查控制，因?yàn)榭梢院Y除且棄去具有相對大信噪比變動(dòng)的那些分批。
權(quán)利要求
1.一種用于靶核酸定量分析的反應(yīng)器，其包含 具有第一個(gè)平面相對表面和第二個(gè)平面相對表面的基底，所述基底具有腔； 排列在所述基底的第一個(gè)平面表面上的緩沖層； 排列在所述緩沖層上的石英蓋板，所述蓋板與所述腔和緩沖層組合限定反應(yīng)室；和 其中所述靶核酸的定量分析使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過程和漸消波檢測技術(shù)。
2.權(quán)利要求I的反應(yīng)器，其中所述基底和所述緩沖層各自獨(dú)立地包含熱穩(wěn)定且對污染有抗性的化學(xué)惰性材料。
3.權(quán)利要求I的反應(yīng)器，其中所述基底是玻璃、金屬、陶瓷、復(fù)合物、聚合材料或其組合或?qū)訅后w。
4.權(quán)利要求3的反應(yīng)器，其中所述聚合材料是聚酰亞胺、聚碳酸酯、聚酯、聚酰胺、聚醚、聚氨基甲酸酯、多氟烴、聚苯乙烯、聚(丙烯腈-丁二烯-苯乙烯)、聚甲基丙烯酸甲酯、聚烯烴或其共聚物。
5.權(quán)利要求3的反應(yīng)器，其中所述基底是導(dǎo)熱聚丙烯。
6.權(quán)利要求I的反應(yīng)器，其中所述基底具有大于約IW/mK的導(dǎo)熱系數(shù)。
7.權(quán)利要求I的反應(yīng)器，其中所述緩沖層是水不可滲透的密封劑。
8.權(quán)利要求7的反應(yīng)器，其中所述水不可滲透的密封劑是室溫硫化硅酮橡膠。
9.權(quán)利要求I的反應(yīng)器，其進(jìn)一步包含通過所述基底與所述反應(yīng)室聯(lián)系的至少一個(gè)入口孔和至少一個(gè)出口孔，使得流體從外部來源進(jìn)入且通過所述反應(yīng)室而經(jīng)過，并且從而限定流體流動(dòng)路徑。
10.權(quán)利要求I的反應(yīng)器，其中所述蓋板的表面是用氨基-鹽水修飾的。
11.權(quán)利要求10的反應(yīng)器，其中所述蓋板的表面是用官能團(tuán)進(jìn)一步修飾的。
12.權(quán)利要求11的反應(yīng)器，其中所述官能團(tuán)是硫氰酸酯。
13.權(quán)利要求11的反應(yīng)器，其中所述蓋板的表面包括被封閉的未反應(yīng)的SCN基團(tuán)。
14.一種用于靶核酸定量分析的方法，其包括 將相當(dāng)于含有一種或多種祀核酸、一種或多種突光標(biāo)記的引物、一種或多種任選突光標(biāo)記的dNTPs、熱穩(wěn)定的核酸聚合酶和緩沖液的樣品流體引入反應(yīng)器，所述反應(yīng)器包括具有第一個(gè)平面相對表面和第二個(gè)平面相對表面的基底，所述基底具有腔； 排列在所述基底的第一個(gè)平面表面上的緩沖層； 排列在所述緩沖層上的石英蓋板，所述蓋板與所述腔和緩沖層組合限定反應(yīng)室；和通過所述基底與所述反應(yīng)室聯(lián)系的至少一個(gè)入口孔和至少一個(gè)出口孔，使得流體從外部來源進(jìn)入且通過所述反應(yīng)室而經(jīng)過，并且從而限定流體流動(dòng)路徑； 應(yīng)用原動(dòng)力以使所述樣品流體沿著所述流動(dòng)路徑移動(dòng)到所述反應(yīng)室內(nèi)； 密封所述至少一個(gè)入口孔和至少一個(gè)出口孔； 加熱所述反應(yīng)室中的所述樣品流體，以將一種或多種雙鏈靶核酸分離成單鏈靶核酸；將所述樣品冷卻以允許所述一種或多種熒光標(biāo)記的引物與所述單鏈靶核酸雜交和通過熱穩(wěn)定的核酸聚合酶的單鏈靶核酸復(fù)制；和反復(fù)加熱和冷卻以達(dá)到所需擴(kuò)增程度； 激活來自與一種或多種靶核酸雜交的一個(gè)或多個(gè)熒光標(biāo)記的擴(kuò)增子的一種或多種熒光應(yīng)答；和檢測所述一種或多種熒光應(yīng)答用于所述一種或多種靶核酸的定量分析，其中所述一種或多種熒光應(yīng)答的激活是通過使用預(yù)定波長的漸消波。
15.權(quán)利要求14的方法，其進(jìn)一步包括用氨基-鹽水修飾所述蓋板的表面。
16.權(quán)利要求15的方法，其進(jìn)一步包括用官能團(tuán)修飾所述蓋板的表面。
17.權(quán)利要求16的方法，其中用官能團(tuán)修飾所述蓋板的表面包括用硫氰酸酯修飾所述蓋板的表面。
18.權(quán)利要求16的方法，其進(jìn)一步包括封閉在所述蓋板的表面上未反應(yīng)的SCN基團(tuán)。
19.一種用于靶核酸定量分析的反應(yīng)器，其包含 具有第一個(gè)平面相對表面和第二個(gè)平面相對表面的基底，所述基底具有腔； 排列在所述基底的第一個(gè)平面表面上的緩沖層； 排列在所述緩沖層上的石英蓋板，所述蓋板與所述腔和緩沖層組合限定反應(yīng)室；其中所述蓋板的表面是用氨基-鹽水修飾且用官能團(tuán)[發(fā)明人-SCN是什么意思？ ] (SCN)進(jìn)一步修飾的，并且其中所述蓋板的表面包括被封閉的未反應(yīng)的SCN基團(tuán)；和 通過所述基底與所述反應(yīng)室聯(lián)系的至少一個(gè)入口孔和至少一個(gè)出口孔，使得流體從外部來源進(jìn)入且通過所述反應(yīng)室而經(jīng)過，并且從而限定流體流動(dòng)路徑； 其中所述靶核酸的定量分析使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)過程和漸消波檢測技術(shù)。
20.權(quán)利要求18的方法，其中所述基底是聚合材料并且所述緩沖層是水不可滲透的密封劑，并且所述蓋板是玻璃板，并且其中所述基底具有大于約I W/mK的導(dǎo)熱系數(shù)。
全文摘要
提供了使用漸消波檢測技術(shù)用于靶核酸定量分析的反應(yīng)器和用于靶核酸定量分析的方法。該反應(yīng)器包括具有腔的基底，排列在基底上的緩沖層；排列在緩沖層上的石英蓋板，以及入口和出口孔。該反應(yīng)器對于PCR加工是熱和化學(xué)穩(wěn)定的，且適合于漸消波檢測技術(shù)。
文檔編號B01L3/00GK102791882SQ201080065414
公開日2012年11月21日 申請日期2010年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月20日
發(fā)明者T.潘, X.劉, Z.孫 申請人:霍尼韋爾國際公司