專利名稱：改善色譜介質(zhì)性能的接枝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于接枝聚合物延伸劑(polymer extender)的改善方法。本發(fā)明還涉及將聚合物延伸劑接枝在用于蛋白質(zhì)分離的多孔基材上的方法上的改進(jìn)，其產(chǎn)生具有提高的蛋白質(zhì)結(jié)合容量和樹脂選擇性的多孔基材，以及涉及試劑盒及其制造和使用的相關(guān)方法。
背景技術(shù)：
從活生物體制得的治療性蛋白質(zhì)在現(xiàn)代健康中起著越來越重要的作用。這些蛋白質(zhì)提供許多優(yōu)于傳統(tǒng)藥物的益處，包括對疾病靶點的特異性和功效的提高。哺乳動物的免疫系統(tǒng)利用各種蛋白質(zhì)，IgA, IgD, IgE, IgG和IgM以控制和消除疾病威脅。遺傳和蛋白質(zhì)工程的到來已使許多“設(shè)計的”或重組的蛋白質(zhì)療法得以發(fā)展。這些療法可基于單一的蛋白質(zhì)、化學(xué)改性的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或蛋白質(zhì)復(fù)合物。這些治療性蛋白質(zhì)的一個子類單克隆抗體(MAbs)在保健和診斷中已有廣泛應(yīng)用。色譜分離廣泛地用于這些生物藥品的制造。隨著工業(yè)的成熟，使用新型/先進(jìn)技術(shù)和方法以增強(qiáng)分離將提供生物療法生產(chǎn)商向更多病患以較低成本提供這些醫(yī)藥的能力。用以提純蛋白質(zhì)的常規(guī)色譜方法包括親和、生物親和、離子交換、反相、疏水性相互作用、親水性相互作用、尺寸排阻和混合模式(上述種類的組合)等。這些類型的色譜方法的應(yīng)用和效率取決于各自與流動液相相互作用的溶質(zhì)分子和色譜系統(tǒng)的固定相(色譜介質(zhì))之間的表面-表面相互作用的選擇性。各種各樣的固定相色譜載體材料是可商購的。從雜質(zhì)中成功分離出產(chǎn)物的關(guān)鍵往往在于固定相、基質(zhì)和配體性質(zhì)(配體類型、配體密度、孔結(jié)構(gòu)、配體分布、材料組成)的正確組合、以及流動相或溶液的性質(zhì)(緩沖液類型、pH和電導(dǎo)率)?；|(zhì)和配體的特定設(shè)計產(chǎn)生可具有多個關(guān)鍵性質(zhì)的色譜介質(zhì)，所述關(guān)鍵性質(zhì)包括蛋白質(zhì)結(jié)合容量或通量、選擇性、床滲透性和化學(xué)穩(wěn)定性。提純方法包括結(jié)合產(chǎn)物為主(結(jié)合和洗脫)、結(jié)合雜質(zhì)為主(流通)和上述的組合(所謂的弱分區(qū)等)。在這些技術(shù)的設(shè)計中，關(guān)鍵的是控制以上教導(dǎo)的色譜介質(zhì)的性質(zhì)，以能夠并確保穩(wěn)定的分離得到提純蛋白質(zhì)產(chǎn)物。蛋白質(zhì)分離可在各種多孔基材或基質(zhì)上實現(xiàn)。用于樹脂和珠粒(bead)結(jié)構(gòu)的常規(guī)材料包括多糖(瓊脂糖、纖維素)、合成聚合物(聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯和聚丙烯酰胺)和陶瓷例如二氧化硅、氧化鋯和可控的多孔玻璃。這些材料通過通常約為200 A-3000 A的“擴(kuò)散孔”吸附蛋白質(zhì)，所述擴(kuò)散孔遠(yuǎn)小于通常約為>5 μ m的“對流孔”，其控制床滲透性，并由填充床中的珠粒間的空間形成。膜和整體式材料也常用于色譜，特別是流通應(yīng)用。常規(guī)的膜組成包括合成聚合物，例如聚偏氟乙烯、聚乙烯、聚醚砜、尼龍和多糖例如纖維素。已從聚苯乙烯、多糖和許多其它合成性聚合物中開發(fā)整體式材料(monoliths)。膜和整體式色譜不同于珠粒的是這些材料在相同的控制膜和整體式材料的滲透性的“對流孔”中吸附蛋白質(zhì)。常規(guī)的膜和整體式對流孔的大小為約0.6 μ m-約10 μ m。在這些基材中加入配體可通過各種熟知的技術(shù)實現(xiàn)。使用配體“觸手”或“延伸劑”以改善蛋白質(zhì)的結(jié)合容量并改變樹脂的選擇性包括例如通過接枝將配體置于與基質(zhì)偶聯(lián)的聚合物鏈上，并從基質(zhì)表面延伸出來。配體延伸劑通常產(chǎn)生更高的結(jié)合容量，因為延伸劑提高配體可利用性，其中目標(biāo)分子結(jié)合超過在表面上的單層吸附。例如，在Jansen等人的"Absorption of Proteins on Porous andNon-Porous Poly(ethyleneimine)and Tentacle-Type Anion Exchangers，，(Journal of Chromatography, vol.522, 1990, 77-93)中教導(dǎo)了用作離子交換劑的表面改性的多孔二氧化硅材料的制備，通過援引將其公開并入本文。已開發(fā)了用于接枝聚合物延伸劑的兩種標(biāo)準(zhǔn)方法以在多孔基材，例如在用于蛋白質(zhì)分離等的色譜等中使用的那些多孔基材上產(chǎn)生表面延伸劑:1)通過表面基團(tuán)從載體接
枝單體(“從......接枝單體”)和2)通過活性基團(tuán)將預(yù)形成的聚合物接枝至載體上(“將
聚合物接枝至......”)。

用于將延伸劑與樹脂偶聯(lián)的一種已有方法是通過從基質(zhì)表面接枝聚合物鏈，然后使用金屬/氧化產(chǎn)生的自由基引發(fā)單體聚合，這通常產(chǎn)生大于50%的蛋白質(zhì)結(jié)合容量的增加(參見例如Muller的美國專利5，453，186)。已開發(fā)多種其它方法，包括使用葡聚糖接枝至基質(zhì)表面(參見例如Berg的美國專利6，428，707);使用高度支化的聚合物接枝(參見例如Amersham Bioscience的WO 2004/003542)和使用疏水聚合物接枝(參見例如GEHealthcare Bio-Sciences的TO 2005/098415)。將這些美國專利和公開的國際專利申請公開的內(nèi)容援引并入本文。例如，相對于簡單的表面結(jié)合的配體，在WO 05/098415中所教導(dǎo)的將疏水聚合物接枝至基質(zhì)樹脂改變了樹脂的蛋白質(zhì)選擇性。這些改變中的每一種都通過“從表面接枝單體”(引發(fā)自由基聚合)或“將聚合物接枝至表面”(預(yù)形成的聚合物的附著)向基質(zhì)表面加入聚合物鏈。使用自由基聚合反應(yīng)從多孔材料接枝單體是熟知的技術(shù)。通常，可由多孔表面材料或由溶液中的引發(fā)劑引發(fā)反應(yīng)。通過暴露于反應(yīng)性環(huán)境例如輻射、金屬氧化和吸附的引發(fā)物而在表面上產(chǎn)生自由基，從而可實現(xiàn)由表面引發(fā)自由基聚合(參見例如“Polymer Surfaces”，F(xiàn)abioGarbassi, John Wiley-Sons Inc., New York, 1998) 但是，這些“從...接枝單體”方法需要非?？煽氐娜芤簵l件和/或特殊設(shè)備，這使得它們的實施復(fù)雜且耗時。當(dāng)由溶液引發(fā)反應(yīng)時，需要在接枝之前將表面反應(yīng)性基團(tuán)附著至表面以能夠在新形成的聚合物和多孔材料的表面之間形成永久性的連接。通常，表面反應(yīng)性基團(tuán)能夠與溶液中的單體(例如相似類型的單體，例如錨固所形成的丙烯酸酯聚合物的附著的丙烯酸酯)進(jìn)一步聚合。但是，由于降解性鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合受到限制，優(yōu)選不使用烯丙基單體例如烯丙基縮水甘油醚(AGE)(參見例如“Principles of Polymerization”，GeorgeOdian, John Wiley-Sons Inc., New York, 1991),將其公開內(nèi)容援引并入本文。但是，已知使用烯丙基官能團(tuán)作為表面反應(yīng)性基團(tuán)。例如，烯丙基表面反應(yīng)性基團(tuán)可用以改性可用于形成孔徑>lmm并產(chǎn)生有效對流(>200mL/min)的多孔結(jié)構(gòu)(所謂的“jelly rolls”)的纖維素纖維或二氧化硅(參見例如Hou的美國專利4，663，163和4，724，207)，將這些美國專利的公開內(nèi)容援引并入本文。
或者，可將丙烯酰胺聚合并附著至瓊脂糖基質(zhì)(例如15重量％的瓊脂糖)，由此有效降低進(jìn)入基質(zhì)的蛋白質(zhì)擴(kuò)散，使得具有附著于其上的聚合丙烯酰胺的瓊脂糖基質(zhì)可用于HPLC應(yīng)用(HPLC應(yīng)用使用非多孔性珠粒以使分析物的分辨率最大)(參見例如Hjerten的美國專利5，135，650)，將其公開內(nèi)容援引并入本文。但是，Hou或Hjerten都沒有教導(dǎo)將偶聯(lián)至具有擴(kuò)散孔的多孔色譜載體表面上的丙烯酰胺或單體聚合，其中所述多孔載體保持其理想的蛋白質(zhì)吸附性質(zhì)。當(dāng)接枝熱響應(yīng)性聚合物時，殘余的甲基丙烯酸酯基團(tuán)可補(bǔ)充額外的乙烯基或烯丙基基團(tuán)以改善含LCST聚合物(較低的臨界溶液溫度)的接枝產(chǎn)率(參見例如Peters的美國專利5，929，214)，將其公開內(nèi)容援引并入本文。但是，這些改性在具有對流孔(>1 μ m)的載體上實現(xiàn)，其中目的是用溫度變化和接枝的LCST聚合物“門控”對流。為了達(dá)到在微米孔徑的孔中的流動降低，接枝的鏈必須具有較大的長度和密度以“填充”或“堵塞”該孔徑的孔。如Hjerten的美國專利5，135，650 (將其公開內(nèi)容援引并入本文)中所教導(dǎo)的，該接枝方法基本上填充或堵塞孔。LCST聚合物用于疏水作用色譜(HIC)，并且因為LCST聚合物證實了結(jié)合性質(zhì)對溫度強(qiáng)的依賴性，它們在多孔色譜中的總體實際應(yīng)用有限。為了通過使延伸劑的鏈長最小化而產(chǎn)生表面改性，已采用使用表面反應(yīng)性基團(tuán)和易進(jìn)行降解性鏈轉(zhuǎn)移的單體的策略。烯丙基表面反應(yīng)性基團(tuán)和烯丙基單體的組合對于使延伸劑的鏈長最小化是有利的。向多孔材料表面上加入聚合物延伸劑提供了改善的蛋白質(zhì)結(jié)合容量和樹脂選擇性上的理想變化。但是，由于蛋白質(zhì)分離變得要求更高，更為關(guān)鍵的是開發(fā)新技術(shù)和方法以產(chǎn)生新型聚合物結(jié)構(gòu)。因此，將希望開發(fā)改善的蛋白質(zhì)結(jié)合容量并對用于蛋白質(zhì)分離的多孔基材的樹脂選擇性進(jìn)行改變。

發(fā)明內(nèi)容
為了以上對于可用于蛋白質(zhì)分離、具有改善的蛋白質(zhì)結(jié)合容量和樹脂選擇性的新多孔基材的需求、以及在具有擴(kuò)散孔的多孔基質(zhì)上接枝聚合物延伸劑的問題，已開發(fā)一種用于將聚合物延伸劑接枝在具有擴(kuò)散孔的多孔基材上的新方法。因此，根據(jù)本發(fā)明，已開發(fā)了一種用于將聚合物延伸劑偶聯(lián)在具有擴(kuò)散孔的多孔基材上的新接枝方法，其產(chǎn)生具有改善的蛋白質(zhì)結(jié)合容量和/或結(jié)合選擇性的基材，而不堵塞或填充多孔基材的擴(kuò)散孔。本發(fā)明至少部分地提供用于將聚合物延伸劑接枝在具有擴(kuò)散孔和與基材的表面偶聯(lián)的表面反應(yīng)性不飽和基團(tuán)的多孔基材上的新方法，其包括自由基接枝至易進(jìn)行降解性鏈轉(zhuǎn)移的表面反應(yīng)性基團(tuán)。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明至少部分地基于將聚合物延伸劑接枝在具有擴(kuò)散孔并用于蛋白質(zhì)分離等的多孔珠粒上的新方法，其產(chǎn)生具有改善的蛋白質(zhì)結(jié)合容量和理想的樹脂選擇性的珠粒。在又一個實施方案中，本發(fā)明至少部分地基于將聚合物延伸劑接枝在多孔聚合物色譜珠粒、多孔瓊脂糖色譜珠粒和多孔陶瓷色譜珠粒上。根據(jù)又一個實施方案，本發(fā)明至少部分基于將聚合物延伸劑接枝在具有孔徑大于O)約100A且小于(〈)約Iy的擴(kuò)散孔的多孔基材上。
根據(jù)又一個實施方案，本發(fā)明至少部分地基于將聚合物延伸劑接枝在具有擴(kuò)散孔和表面反應(yīng)性官能團(tuán)的多孔基材上的新方法，其包括以下步驟:a)提供多孔色譜珠粒，其具有擴(kuò)散孔以及與其偶聯(lián)的表面反應(yīng)性官能團(tuán)；b)提供包含接枝單體或接枝單體混合物的溶液、以及可溶性自由基聚合引發(fā)劑；c)使所述色譜珠粒與所述溶液接觸；d)在所述溶液中加入所述自由基聚合引發(fā)劑，由此在所述珠粒上的表面反應(yīng)性官能團(tuán)和所述接枝單體或接枝單體混合物之間引發(fā)自由基聚合反應(yīng)，以形成與所述珠粒偶聯(lián)的聚合物鏈延伸劑；e)洗滌所述珠粒以去除任何過量未反應(yīng)的接枝單體、接枝單體混合物或未附著的聚合物鏈，得到蛋白質(zhì)結(jié)合容量大于100g/L的多孔基材；和f)將配體與附著在色譜珠粒表面上的聚合物鏈偶聯(lián)。根據(jù)又一個實施方案，本發(fā)明至少部分地基于將聚合物延伸劑接枝在具有擴(kuò)散孔的多孔基材上的新方法，其中所述接枝單體或接枝單體混合物包括甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、丙烯酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、[3-(甲基丙烯?；被?丙基]三甲基氯化銨、2-丙烯酰氨基-乙醇酸、衣康酸或乙基乙烯基酮、甲基丙烯酸縮水甘油酯、N, N- 二甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥丙酯、N-苯基丙烯酰胺、羥丙基丙烯酰胺及它們的組合。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明至少部分地基于將聚合物延伸劑接枝在多孔基材上的新方法，其中與聚合物鏈延伸劑偶聯(lián)的配體包括強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)、磺丙基、磺酸基、陰離子交換基團(tuán)、三甲基氯化銨基團(tuán)、弱陽離子交換基團(tuán)、羧酸基、弱陰離子交換基團(tuán)、N，N-二乙基氨基、DEAE基團(tuán)、疏水作用基團(tuán)、苯基、丁基和丙基、以及親和基團(tuán)、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G和蛋白質(zhì)L及它們的組合。在一些其它實施方案中，本發(fā)明至少部分地基于將聚合物延伸劑接枝在多孔基材上的新方法，其中將表面反應(yīng)性官能團(tuán)與多孔基材表面偶聯(lián)的連接劑包括甲基丙烯酸酯、酰胺、丙烯酰胺、環(huán)氧化物、胺、丁二醇二縮水甘油醚、環(huán)氧氯丙烷、聚乙二醇二縮水甘油醚、乙二醇二縮水甘油醚、氯乙酸烯丙酯、氯丙烯、烯丙基(氯)二甲基硅烷、烯丙基縮水甘油醚、溴丙烯、甲基丙烯酸烯丙酯及它們的組合。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明至少部分地基于將聚合物延伸劑接枝在具有擴(kuò)散孔和表面反應(yīng)性不飽和官能團(tuán)的多孔基材上的新方法，其中所述不飽和官能團(tuán)是烯丙基。在其它實施方案中，本發(fā)明至少部分地提供使用自由基聚合引發(fā)劑將聚合物延伸劑接枝在多孔基材上的新方法，所述自由基聚合引發(fā)劑包括過硫酸銨、過硫酸鉀、偶氮雙(4-氰基戊酸)、Irgacure 2959、2，2'-偶氮雙(2-脒基-丙烷)鹽酸鹽及它們的組合。本發(fā)明的另一目的是提供涉及形成和使用用于將聚合物延伸劑接枝在具有擴(kuò)散孔的用于蛋白質(zhì)分離的多孔基材上的新方法的試劑盒和方法，其產(chǎn)生改善的蛋白質(zhì)結(jié)合容量和理想的樹脂選擇性。本發(fā)明的其它特征和益處將在以下的詳述和權(quán)利要求中給出。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是，不背離它的精神和范圍的情況下可對本發(fā)明進(jìn)行許多修改和變化。應(yīng)理解以上的概述和以下的詳述、權(quán)利要求以及附圖
僅是示例性和解釋性的，并且旨在提供本發(fā)明教導(dǎo)的各種實施方案的解釋。本文教導(dǎo)的具體實施方案僅以實施例的方式提供，并且不以任何方式表示是限制性的。
具體實施方式
出于本說明書和所附權(quán)利要求的目的，除非另有說明，所有表示成分量、材料百分比或比例、反應(yīng)條件和其它在本說明書和權(quán)利要求中使用的數(shù)值應(yīng)理解為在所有情況下由術(shù)語“約”修飾。因此，除非相反地指出，在以下的說明書和所附權(quán)利要求中闡述的數(shù)值參數(shù)是約值，其可根據(jù)希望通過本發(fā)明得到的理想性質(zhì)而變化。至少，并且不為了限制權(quán)利要求范圍的等同原則的使用，各數(shù)值參數(shù)應(yīng)至少根據(jù)所給出的有效數(shù)，并通過采用常規(guī)的舍入技術(shù)進(jìn)行詮釋。盡管闡述本發(fā)明的寬范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是約值，但是在具體實施例中闡述的數(shù)值盡可能精確地給出。然后，任何數(shù)值固有地包括由于它們各自的測試中的標(biāo)準(zhǔn)偏差必然導(dǎo)致的一定誤差。此外，本文教導(dǎo)的所有范圍應(yīng)理解為包括所有歸入其中的子范圍。例如，范圍“1-10”包括最小值I和最大值10之間(且包括該值)的任何子范圍，也就是說，最小值等于或大于I且最大值等于或小于10的所有子范圍，例如5.5-10。在更詳細(xì)地描述本發(fā)明之前，將定義一些術(shù)語。這些術(shù)語的使用不限制本發(fā)明范圍，而僅起到便于本發(fā)明說明的作用。本文使用的單數(shù)形式“一個/種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代，除非另有清楚的說明。當(dāng)增長的自由基非常具有反應(yīng)性時發(fā)生“降解性鏈轉(zhuǎn)移”，但具有單體的鏈轉(zhuǎn)移產(chǎn)物不具有反應(yīng)性(形成穩(wěn)定的自由基)(參見“Principles of Polymerization”，GeorgeOdian, John Wiley-Sons Inc., New York, 1991),將其公開內(nèi)容援引并入本文。該鏈轉(zhuǎn)移導(dǎo)致大幅下降的聚合速率和聚合物分子量。當(dāng)希望低分子量的表面改性時，這在接枝中是有利的(參見例如Ihre的美國專利7，048, 858和7，060, 187)。但是，當(dāng)使用更具反應(yīng)性的單體時，表面反應(yīng)性基團(tuán)變?yōu)樵恍纬删酆衔飼r在“將聚合物接枝至……”方法中的更長的延伸劑或觸手的鏈終止錨固物。這些原位產(chǎn)生的延伸劑提供改善的結(jié)合容量和改進(jìn)的選擇性。所述方法是有利的，因為它可用于廣泛的單體，例如丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯和廣泛的基材或基質(zhì)(例如聚合物珠粒、瓊脂糖珠粒和陶瓷珠粒)。本文中可使用的其它“多孔基材”或“基質(zhì)”包括但不限于任何具有擴(kuò)散孔和烯丙基表面反應(yīng)性基團(tuán)的材料。本文中可使用的用于多孔基材或基質(zhì)的優(yōu)選材料包括包含甲基丙烯酸烯丙酯等的多糖、合成聚合物、瓊脂糖、纖維素、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯，以及上述的混合物。最優(yōu)選的材料包括用烯丙基表面反應(yīng)性基團(tuán)改性的瓊脂糖、包含烯丙基表面反應(yīng)性基團(tuán)的聚丙烯酸甲酯材料、用烯丙基表面反應(yīng)性基團(tuán)改性的聚丙烯酸甲酯材料和加入甲基丙烯酸烯丙基甲基酯的聚甲基丙烯酸酯材料。本文中可使用的“官能團(tuán)”的實例包括但不限于離子交換基團(tuán)、生物親和基團(tuán)、疏水基團(tuán)、親硫作用基團(tuán)、螯合物或螯合基團(tuán)、與目標(biāo)化合物具有所謂的相互作用的基團(tuán)、氫鍵基團(tuán)和親水基團(tuán)。本文中可使用的“配體”的實例包括但不限于離子交換基團(tuán)、疏水作用基團(tuán)、親水作用基團(tuán)、親硫作用基團(tuán)、金屬親和基團(tuán)、親和基團(tuán)、生物親和基團(tuán)和混合模式基團(tuán)(上述的組合)。本文中可使用的一些優(yōu)選的配體包括但不限于強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)，例如磺丙基、磺酸基；強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)，例如三甲基氯化銨基團(tuán)；弱陽離子交換基團(tuán)，例如羧酸基；弱陰離子交換基團(tuán)，例如N，N- 二乙基氨基或DEAE基團(tuán)；疏水作用基團(tuán)，例如苯基、丁基、丙基和己基；以及未和基團(tuán)，例如蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)G和蛋白質(zhì)L。本文中可使用的“自由基聚合引發(fā)劑”的實例包括但不限于過硫酸銨、過硫酸鉀、偶氮雙(4-氰基戍酸)、Irgacure ⑩ 2959 (Ciba-Geigy, Hawthorn, N.Y.)、2，2 '-偶氮雙(2-脒基-丙烷)鹽酸鹽等。接枝反應(yīng)可使用本領(lǐng)域已知的方法引發(fā)，優(yōu)選熱引發(fā)(加熱)或UV輻射。本文中可使用的“表面反應(yīng)性不飽和基團(tuán)或官能團(tuán)”的實例包括但不限于烯丙基。優(yōu)選的表面反應(yīng)性不飽和官能團(tuán)包括具有式R-O-CH2-CH=CH2的烯丙基，其中R是多孔基材表面或該表面和烯丙基之間的連接基。本文中可使用的“連接物”的實例包括但不限于包含在自由基聚合反應(yīng)中進(jìn)行高水平的降解性鏈轉(zhuǎn)移的基團(tuán)的分子。本文中可使用的連接物還包括對堿性溶液具有顯著穩(wěn)定性的分子或官能團(tuán)，例如包含醚鍵、甲基丙烯酸酯、酰胺、丙烯酰胺、環(huán)氧化物、胺等的化合物。使用本領(lǐng)域已知的方法可將優(yōu)選的連接物例如丁二醇二縮水甘油醚、環(huán)氧氯丙烷、聚乙二醇二縮水甘油醚、乙二醇二縮水甘油醚進(jìn)一步用含烯丙基的基團(tuán)例如烯丙基縮水甘油醚改性。優(yōu)選的連接物包括氯乙酸烯丙酯、氯丙烯、烯丙基(氯)二甲基硅烷、烯丙基縮水甘油醚、溴丙烯和甲基丙烯酸烯丙酯。最優(yōu)選的連接物包括烯丙基縮水甘油醚、溴丙烯和甲基丙烯酸烯丙酯。本文中可使用的“接枝單體”或“接枝單體混合物”的實例包括但不限于甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯和丙烯酰胺。最優(yōu)選的接枝單體包括但不限于丙烯酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-烷丙磺酸、[3-(甲基丙烯?；被?丙基]三甲基氯化銨、2-丙烯酰氨基-乙醇酸、衣康酸或乙基乙烯基酮、甲基丙烯酸縮水甘油酯、N, N- 二甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥丙酯、N-苯基丙烯酰胺、羥丙基丙烯酰胺及它們的組合。在常規(guī)的接枝方法中，或者殘余的不飽和物保持進(jìn)一步聚合的反應(yīng)性，或者表面引發(fā)需要謹(jǐn)慎控制的條件。例如，丙烯酸酯官能團(tuán)與表面的附著使得生長的聚合物鏈與表面反應(yīng)，然后繼續(xù)生長，使得延伸劑與表面附著的位置基本上是無序的。例如，在鏈生長的任意時間點，在表面基團(tuán)上聚合鏈可反應(yīng)并繼續(xù)生長，由此沿延伸劑無序地接入表面反應(yīng)性基團(tuán)。在表面引發(fā)的情況中，例如羥基的金屬氧化，必須控制溶液條件以保持金屬的活性氧化狀態(tài)，并避免終止表面活化反應(yīng)。在本文教導(dǎo)的接枝方法中克服了這兩個缺陷。在較不嚴(yán)格的條件下，在溶液中模擬聚合物延伸劑的聚合，并且與多孔基材的附著更可能終止，由于表面反應(yīng)性基團(tuán)的降解性鏈轉(zhuǎn)移起著抑制劑的作用，終止聚合物鏈的生長。(參見“Principles ofPolymerization，，，George Odian, John Wiley-Sons Inc., New York, 1991),將其公開內(nèi)容援引并入本文。與進(jìn)行降解性鏈轉(zhuǎn)移的烯丙基表面反應(yīng)性基團(tuán)接枝對于整體式材料、纖維素纖維和二氧化硅顆粒是已知的。但是，已知對整體式材料、纖維素纖維和二氧化硅顆粒的改性在對流孔(>1μπι)上實現(xiàn)，所述對流孔遠(yuǎn)大于在基于珠粒的技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的擴(kuò)散孔。對纖維素和二氧化硅顆粒改性，然后構(gòu)成具有大對流孔的多孔結(jié)構(gòu)。在多孔結(jié)構(gòu)形成之前使用延伸劑的材料改性不是有利的，并且也不易用于基于珠粒的技術(shù)，因為希望僅在內(nèi)部結(jié)構(gòu)/表面積的表面上(配體可與目標(biāo)分子相互作用)具有延伸劑。通過由這些改性顆粒形成多孔結(jié)構(gòu)而對顆粒(例如纖維素和二氧化硅)改性產(chǎn)生堵塞的對流孔和延伸劑的無規(guī)分布，由此提供有限的且大幅下降的配體與目標(biāo)分子的相互作用。另外，接枝的延伸劑加入到本體多孔結(jié)構(gòu)上(即在珠粒形成之前接枝延伸劑)可折衷或改變材料的機(jī)械性質(zhì)和孔的形態(tài)。整體式材料的改性產(chǎn)生微米孔徑的孔中的孔限制(降低流速)。這些觀察到的孔限制表明具有聚合物延伸劑改性的整體式材料完全填充或堵塞所提供的較小的擴(kuò)散性整體式材料的孔。如上引用的Hjerten教導(dǎo)了具有被聚合的聚丙烯酸酯接枝而完全堵塞的孔的瓊脂糖基質(zhì)，使得孔中的蛋白質(zhì)擴(kuò)散被消除，使得能夠?qū)⒃摬牧嫌糜诜嵌嗫仔灾榱５膽?yīng)用，例如分析型HPLC。在如本文教導(dǎo)的本發(fā)明的方法中，改進(jìn)結(jié)合容量的表面反應(yīng)性基團(tuán)密度、弓I發(fā)劑濃度和單體濃度的組合可改變選擇性，并產(chǎn)生新型的分離樹脂。實施例實施例1A.使用表面反應(yīng)性基團(tuán)和陽離子交換延伸劑改性多糖樹脂根據(jù)Porath 和 Fornstedt, " Group Fractionation of Plasma Proteins onDipolar 1n Exchangers " , (Journal of Chromatography, vol.51, 1970, pp.479-489)(將其公開內(nèi)容援引并入本文)的教導(dǎo)，使用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)瓊脂糖珠粒(SephaiOse 4B)(GE Healthcare, Piscataway N.J.)。然后根據(jù)以下方法用表面反應(yīng)性基團(tuán)烯丙基縮水甘油醚(AGE)對珠粒改性:在罐中，將IOmL的珠粒加至18g的8M NaOH、4g的AGE、3g的Na2SO4中，然后在50°C下攪拌過夜。然后用500mL的Mill1-Q㊣水洗滌珠粒，并過濾成濕餅。在塑料袋中將濕餅加至包含2.4g的2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、17.3g的Mill1-Q 水、0.2g的N，N- 二甲基丙烯酰胺和0.12g的Irgacure 2959 (CIBA)的20mL溶液中。將塑料袋放置在兩個聚乙烯板之間。然后將聚乙烯夾層板用帶捆扎在將組裝件輸送通過具有"H"燈泡的Fusion Systems UV曝光實驗裝置的輸送裝置上。曝光時間由組裝件移動通過UV單元的速度控制。在該實施例中，組裝件以每分鐘15英尺移動通過UV室。使組裝件靜置5分鐘，然后去除袋子，過濾珠粒，并用500mL的Mill1-Q⑧水洗滌。根據(jù)表I中所示的實施例6中的方法測試平衡蛋白質(zhì)結(jié)合容量。實施例1B.不使用表面反應(yīng)性基團(tuán)和陽離子交換延伸劑的情況下改性多糖樹脂根據(jù)Porath 和 Fornstedt, " Group Fractionation of Plasma Proteins onDipolar 1n Exchangers " , (Journal of Chromatography, vol.51, 1970, pp.479-489)的教導(dǎo)，使用環(huán)氧氯丙燒交聯(lián)瓊脂糖珠粒(Sepharose 4B) (GE Healthcare, PiscatawayN.J.)。然后用500mL的Mill1-Q⑧水冼滌珠粒，并過濾成濕餅。在塑料袋中將濕餅加至包含2.4g的2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、17.3g的Mill1-Q 水、0.2g的N，N- 二甲基丙烯酰胺和0.12g的Irgacure 2959 (CIBA)的20mL溶液中。將塑料袋放置在兩個聚乙烯板之間。然后將聚乙烯夾層板用帶捆扎在將組裝件輸送通過具有"H"燈泡的FusionSystems UV曝光實驗裝置的輸送裝置上。曝光時間由組裝件移動通過UV單元的速度控制。在該實施例中，組裝件以每分鐘15英尺移動通過UV室。使組裝件靜置5分鐘，然后去除袋子,過濾珠粒,并用500mL的Mill1-Q 7jC洗滌。根據(jù)表I中所示的實施例6中的方法測試平衡蛋白質(zhì)結(jié)合容量。實施例1C.使用表面反應(yīng)性基團(tuán)和陰離子交換延伸劑改性多糖樹脂根據(jù)Porath 和 Fornstedt, " Group Fractionation of Plasma Proteins onDipolar 1n Exchangers " , (Journal of Chromatography, vol.51, 1970, pp.479-489)的教導(dǎo)，使用環(huán)氧氯丙燒交聯(lián)瓊脂糖珠粒(Sepharose 4B) (GE Healthcare, PiscatawayN.J.)。然后根據(jù)以下方法用表面反應(yīng)性基團(tuán)烯丙基縮水甘油醚(AGE)對珠粒改性:在罐中，將IOmL的珠粒加至18g的lMNa0H、12g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50°C下攪拌過夜。然后用500mL的Mill1-Q 水洗滌珠粒，并過濾成濕餅。將濕餅加至包含6g的75%(3_丙烯酰氨基丙基)三甲基氯化銨溶液、13.6g的Mill1-Q 水和0.2g的過硫酸銨的溶液中。將混合物在65°C下攪拌17小時。然后用500mL的Mill1-Q 水冼滌珠粒。根據(jù)表I中所示的實施例6中的方法測試平衡蛋白質(zhì)結(jié)合容量。實施例1D.使用表面反應(yīng)性基團(tuán)和陽離子交換延伸劑改性多糖樹脂，在低離子強(qiáng)度下具有最佳的結(jié)合根據(jù)Porath 和 Fornstedt, " Group Fractionation of Plasma Proteins onDipolar 1n Exchangers " , (Journal of Chromatography, vol.51, 1970, pp.479-489)的教導(dǎo)，使用環(huán)氧氯丙燒交聯(lián)瓊脂糖珠粒(Sepharose 4B) (GE Healthcare, PiscatawayN.J.)。然后根據(jù)以下方法用表面反應(yīng)性基團(tuán)烯丙基縮水甘油醚(AGE)對珠粒改性:在罐中，將IOmL的珠粒加至18g的lMNa0H、2.4g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50°C下攪拌過夜。然后用500mL的MiII1-Q 水洗滌珠粒，并過濾成濕餅。在罐中將濕餅加至包含Ig的2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、18.8g的Mill1-Q 水、0.15g的N，N- 二甲基丙烯酰胺和0.08g的過硫酸銨的20mL溶液中。將罐攪拌，并在65°C下加熱I小時。然后過濾珠粒并用500mL的Mill1-Q 水洗滌。根據(jù)表I中所示的實施例6中的方法測試平衡蛋白質(zhì)結(jié)合容量。實施例1E.使用表面反應(yīng)性基團(tuán)和陽離子交換延伸劑改性多糖樹脂，在高離子強(qiáng)度下具有最佳的結(jié)合根據(jù)Porath 和 Fornstedt, " Group Fractionation of Plasma Proteins onDipolar 1n Exchangers " , (Journal of Chromatography, vol.51, 1970, pp.479-489)的教導(dǎo)，使用環(huán)氧氯丙燒交聯(lián)瓊脂糖珠粒(Sepharose 4B) (GE Healthcare, PiscatawayN.J.)。然后根據(jù)以下方法用表面反應(yīng)性基團(tuán)烯丙基縮水甘油醚(AGE)對珠粒改性:在罐中，將IOmL的珠粒加至18g的lMNa0H、12g的AGE、3g的Na2SO4，然后在50°C下攪拌過夜。然后用500mL的MiII1-Q低水洗滌珠粒，并過濾成濕餅。在罐中將濕餅加至包含2g的2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、17.8g的Mill1-Q 水、0.2g的N，N- 二甲基丙烯酰胺和0.08g的過硫酸銨的20mL溶液中。將罐攪拌，并在65°C下加熱I小時。然后過濾珠粒并用500mL的Mill1-Q 水洗滌。根據(jù)表I中所示的實施例6中的方法測試平衡蛋白質(zhì)結(jié)合容量。表1.用于瓊脂糖珠粒的平衡結(jié)合容量
權(quán)利要求
1.改性具有擴(kuò)散孔和表面反應(yīng)性不飽和官能團(tuán)的多孔基材的方法，所述方法包括: a)提供多孔基材，所述多孔基材具有擴(kuò)散孔以及與該基材的表面附著的表面反應(yīng)性不飽和官能團(tuán)； b)提供包含接枝單體或接枝單體混合物的溶液以及可溶性自由基聚合引發(fā)劑； c)使所述基材與所述溶液接觸；和 d)在所述溶液中加入所述自由基聚合引發(fā)劑，由此在所述基材的表面上的表面反應(yīng)性不飽和官能團(tuán)和所述接枝單體或接枝單體混合物之間引發(fā)自由基聚合，以形成與所述基材偶聯(lián)的聚合物鏈。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述基材選自多孔聚合物珠粒、多孔瓊脂糖珠粒和多孔陶瓷珠粒。
3.權(quán)利要求1的方法，所述方法在步驟(d)之后還包括: e)洗滌所述基材以去除任何過量未反應(yīng)的接枝單體、接枝單體混合物或未附著的聚合物鏈，得到蛋白質(zhì)結(jié)合容量大于100g/L的多孔基材。
4.權(quán)利要求3的方法，所述方法在步驟(e)之后還包括: f)將配體與附著在所述多孔基材表面上的聚合物鏈偶聯(lián)。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述自由基聚合引發(fā)劑選自過硫酸銨、過硫酸鉀、偶氮雙(4-氰基戊酸)、IrgacUre 2959、2，2'-偶氮雙(2-脒基-丙烷)鹽酸鹽及它們的組合。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述不飽和官能團(tuán)由烯丙基構(gòu)成。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述烯丙基由式R-O-CH2-CH=CH2構(gòu)成，其中R是多孔基材表面或所述表面和烯丙基之間的連接基。
8.權(quán)利要求1的方法，其中約20-約400μ mol/mL的表面反應(yīng)性基團(tuán)具有式R-O-CH2-CH=CH2，其中R是多孔基材表面或所述表面和烯丙基之間的連接基。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述接枝單體或接枝單體混合物選自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺、丙烯酸、2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙烷磺酸、[3-(甲基丙烯?；被?丙基]三甲基氯化銨、2-丙烯酰氨基-乙醇酸、衣康酸或乙基乙烯基酮、甲基丙烯酸縮水甘油酯、N, N- 二甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥丙酯、N-苯基丙烯酰胺、羥丙基丙烯酰胺及它們的組合。
10.權(quán)利要求1的方法，其中所述多孔基材上的擴(kuò)散孔的孔徑為> 約100A且〈約1 μ。
11.使用表面聚合物鏈延伸劑改性具有擴(kuò)散孔的多孔色譜珠粒的方法，所述方法包括: a)提供多孔色譜珠粒，所述多孔色譜珠粒具有擴(kuò)散孔、表面以及與所述表面偶聯(lián)的表面反應(yīng)性不飽和官能團(tuán)； b)提供包含接枝單體或接枝單體混合物的溶液以及可溶性自由基聚合引發(fā)劑； c)使所述色譜珠粒與所述溶液接觸；和 d)在所述溶液中加入所述自由基聚合引發(fā)劑，由此在所述珠粒上的表面反應(yīng)性不飽和官能團(tuán)和所述接枝單體或接枝單體混合物之間引發(fā)自由基聚合，以形成與所述珠粒偶聯(lián)的聚合物鏈延伸劑； e)洗滌所述珠粒以去除任何過量未反應(yīng)的接枝單體、接枝單體混合物或未附著的聚合物鏈，得到蛋白質(zhì)結(jié)合容量大于100g/L的多孔色譜珠粒；和 f)將配體與附著在所述色譜珠粒表面上的聚合物鏈偶聯(lián)。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述多孔色譜珠粒選自聚合物珠粒、瓊脂糖珠粒和陶瓷珠粒。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述自由基聚合引發(fā)劑選自過硫酸銨、過硫酸鉀、偶氮雙(4-氰基戊酸)、Irgacure 2959、2，2'-偶氮雙(2-脒基-丙烷)鹽酸鹽及它們的組合。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述不飽和官能團(tuán)由烯丙基構(gòu)成。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述烯丙基由式R-O-CH2-CH=CH2構(gòu)成，其中R是多孔基材表面或所述表面和烯丙基之間的連接基。
16.權(quán)利要求11的方法，其中約20-約400ymol/mL的表面反應(yīng)性基團(tuán)具有式R-O-CH2-CH=CH2，其中R是多孔色譜珠粒或所述珠粒表面和烯丙基之間的連接基。
17.權(quán)利要求11的方法，其中所述接枝單體或接枝單體混合物選自甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯、丙烯酰胺及它們的組合。
18.權(quán)利要求11的方法，其中所述多孔色譜珠粒上的擴(kuò)散孔的孔徑為> 約100 A且〈約I μ。
19.權(quán)利要求11的方法，其中所述配體選自強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)、磺丙基、磺酸、陰離子交換基團(tuán)、三甲基氯化銨、弱陽離子交換基團(tuán)、羧酸、弱陰離子交換基團(tuán)、N，N-二乙基氨基、DEAE、疏水作用基團(tuán)、苯基、丁基和丙基、以及未和基團(tuán)、蛋白質(zhì)Α、蛋白質(zhì)G和蛋白質(zhì)L。
20.權(quán)利要求7、8、15和16中任一項的方法，其中所述連接基選自甲基丙烯酸酯、酰胺、丙烯酰胺、環(huán)氧化物、胺、丁二醇二縮水甘油醚、環(huán)氧氯丙烷、聚乙二醇二縮水甘油醚、乙二醇二縮水甘油醚、氯乙酸烯丙酯、氯丙烯、烯丙基(氯)二甲基硅烷、烯丙基縮水甘油醚、溴丙烯、甲基丙烯酸烯丙酯及它們的組合。
21.權(quán)利要求4的方法，其中所述配體選自強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)、磺丙基、磺酸、陰離子交換基團(tuán)、三甲基氯化銨、弱陽離子交換基團(tuán)、羧酸、弱陰離子交換基團(tuán)、N，N-二乙基氨基、DEAE、疏水作用基團(tuán)、苯基、丁基和丙基、以及未和基團(tuán)、蛋白質(zhì)Α、蛋白質(zhì)G和蛋白質(zhì)L。
全文摘要
本發(fā)明涉及將聚合物延伸劑接枝在具有擴(kuò)散孔的多孔基材例如是用于蛋白質(zhì)分離中的那些上的改進(jìn)方法，而不填充所述基材的擴(kuò)散孔，并且不限制通過其的擴(kuò)散。通過改變接枝條件和/或單體組成，所得到的具有接枝在其上的聚合物延伸劑的多孔基材具有提高的蛋白質(zhì)結(jié)合容量和樹脂選擇性，從而增強(qiáng)了基材的蛋白質(zhì)分離效率。接枝的聚合物延伸劑提供在較高電導(dǎo)率下具有顯著結(jié)合容量的基材。本發(fā)明還涉及使用并將聚合物延伸劑接枝在具有擴(kuò)散孔的多孔樹脂基材上的試劑盒和方法。
文檔編號B01J20/28GK103108693SQ201080068116
公開日2013年5月15日 申請日期2010年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月29日
發(fā)明者N·索伊斯, J·烏瑪納, Y·張 申請人:Emd密理博公司