專利名稱：一種基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，特別是涉及一種體外內(nèi)毒素吸附介質(zhì)的制備及其使用方法。
背景技術(shù)：
內(nèi)毒素(Endotoxin)是革蘭氏陰性菌在生長(zhǎng)、分裂時(shí)釋放或死亡時(shí)裂解出來的細(xì)胞壁外膜上的特有結(jié)構(gòu)。由于革蘭氏陰性菌非常頑固，在水中只需極少的養(yǎng)分即可存活，因而內(nèi)毒素廣泛存在于飲用水、食品、生物醫(yī)藥制劑中及接觸水溶液的器壁上；在高等生物體內(nèi)，胃腸道下端的革蘭氏陰性菌屬是生物體內(nèi)毒素的主要來源，細(xì)菌死亡后釋放的內(nèi)毒素會(huì)進(jìn)入血液循環(huán)而引起一系列病理變化。醫(yī)院臨床在使用藥品注射劑時(shí)若含細(xì)菌內(nèi)毒素大于lEU/mL，則病人會(huì)產(chǎn)生寒戰(zhàn)、發(fā)熱、嘔吐、膚色灰白、休克甚至死亡等熱源反應(yīng)，因此國(guó)家藥典對(duì)注射品中細(xì)菌內(nèi)毒素指標(biāo)有著嚴(yán)格規(guī)定，其限度水平為每單位體重5EU。目前常用的去除內(nèi)毒素的方法有活性炭吸附、超濾、萃取、親和層析等，但前三種方法只適合于從相對(duì)較穩(wěn)定的小分子物質(zhì)中去除內(nèi)毒素，且有效成分損失較大；親和層析雖然選擇性較好，但是也存在著裝柱、預(yù)處理等耗時(shí)步驟，且處理量較小。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種內(nèi)毒素吸附介質(zhì)及其使用方法，該內(nèi)毒素吸附介質(zhì)不僅對(duì)于內(nèi)毒素具有較高的選擇性，并且使用方便，適于大量生物制品中內(nèi)毒素的去除。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)，其制備方法包括如下步驟(1)先將磁性材料分散在含乙酸溶液中，加入殼聚糖得到水相I，再將該水相I轉(zhuǎn)移至含有司盤80的液體石蠟中，以戊二醛為交聯(lián)劑，采用反相懸浮法制得磁性殼聚糖微球；所述的磁性物質(zhì)為四氧化三鐵或鐵；(2)將磁性殼聚糖微球分散到二甲基亞砜與氫氧化鈉的混合溶液中，再加入環(huán)氧氯丙烷活化，去離子水洗滌至中性，得到活化后產(chǎn)物；(3)將活化后產(chǎn)物置于內(nèi)毒素親和配基溶液中固載，即得到所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)；所述的內(nèi)毒素親和配基為組氨酸、精氨酸、多聚賴氨酸、多粘菌素B或四乙烯五胺。進(jìn)一步，本發(fā)明推薦步驟(1)具體按照如下進(jìn)行將磁性材料超聲分散到乙酸溶液中，加入殼聚糖后攪拌均勻得到水相I，水相I中殼聚糖的濃度為10 40g/L，乙酸濃度為10 50mL/L，磁性材料與殼聚糖的投料質(zhì)量比為0.2 1 1 ；然后將水相I加入到含有0. 1 2vol%司盤80的液體石蠟中，水相I與含有0. 1 2vol%司盤80的液體石蠟的混合體積比為1 1 5;混勻后加入戊二醛，所加入的戊二醛與殼聚糖氨基的摩爾比為 1 0.1 6，加畢調(diào)整溫度至25 50°C反應(yīng)1 3小時(shí)，然后調(diào)整體系pH至10 13，升溫至50 80°C，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，充分反應(yīng)后分離產(chǎn)物，經(jīng)洗滌、干燥得到磁性殼聚糖微球。更進(jìn)一步，上述步驟(1)中，較佳的殼聚糖濃度為30 40g/L;戊二醛與殼聚糖氨基的摩爾比優(yōu)選為1 1 2 ；PH調(diào)至10 13以后溫度升至70°C反應(yīng)2 3小時(shí)為宜。進(jìn)一步，本發(fā)明推薦所述的步驟( 具體按照如下進(jìn)行將磁性殼聚糖微球分散到二甲亞砜/氫氧化鈉混合溶液中，然后加入環(huán)氧氯丙烷在振蕩下于25 50°C進(jìn)行活化反應(yīng)，充分反應(yīng)后過濾、洗滌至中性、干燥得到所述的活化后產(chǎn)物；所述二甲亞砜/氫氧化鈉混合溶液由二甲亞砜與0. 1 2mol/L的氫氧化鈉水溶液按照體積比1 0. 25 5配制得到，所述環(huán)氧氯丙烷與二甲亞砜/氫氧化鈉混合溶液的投料體積比為1 50 100，磁性殼聚糖微球與環(huán)氧氯丙烷的投料質(zhì)量體積比為lg/Ι 10mL。更進(jìn)一步，上述步驟( 中，二甲亞砜/氫氧化鈉混合溶液中氫氧化鈉終濃度控制在0.5 lmol/L為宜。本發(fā)明推薦所述的步驟(3)具體按照如下進(jìn)行將活化后產(chǎn)物置于0.1 0. 5mol/L內(nèi)毒素親和配基溶液中，調(diào)節(jié)pH至10 12，于20 50°C振蕩反應(yīng)過夜，反應(yīng)完畢后過濾、洗滌至中性、干燥即得所述的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)。更進(jìn)一步，活化后產(chǎn)物與0. 1 0. 5mol/L內(nèi)毒素親和配基溶液的質(zhì)量體積比為 0. 1 lg/10mL。本發(fā)明還提供了所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)的使用方法，所述使用方法具體為取內(nèi)毒素吸附介質(zhì)用脫氧膽酸鈉水溶液(優(yōu)選質(zhì)量濃度0.5 1.0%的脫氧膽酸鈉水溶液)洗滌，再用無熱原水充分洗滌，干燥后分散到含有內(nèi)毒素的待處理溶液中，充分振蕩或攪拌，然后外加磁場(chǎng)，取出上清液即為處理后溶液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)不但對(duì)于內(nèi)毒素具有較高的選擇性，而且由于引入了磁性物質(zhì)，吸附時(shí)也不需要裝柱處理，待吸附平衡后外加磁場(chǎng)即可將吸附介質(zhì)與樣品分離，操作簡(jiǎn)便，可用于大量生物制品中內(nèi)毒素的去除。
四

圖1為實(shí)施例1所得吸附介質(zhì)的掃描電鏡圖；圖2為實(shí)施例1所得吸附介質(zhì)的粒徑分布圖；圖3為實(shí)施例1所得吸附介質(zhì)的磁滯回歸線圖； 圖4為實(shí)施例1磁性殼聚糖微球-組氨酸(MCM-His)吸附動(dòng)力學(xué)曲線；圖5為實(shí)施例1與實(shí)施例2所得不同內(nèi)毒素吸附介質(zhì)的吸附效果圖。
五具體實(shí)施例方式下面以具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此實(shí)施例1 殼聚糖-組氨酸內(nèi)毒素吸附介質(zhì)(MCM-His)的制備(1)將1. 5g四氧化三鐵超聲分散在IOOmL體積分?jǐn)?shù)為2%的乙酸溶液中，加入3g 殼聚糖(奧興公司生產(chǎn)，分子量30萬，脫乙酰度95%，即氨基密度為5833ymol/g)使其完全溶解后分散到IOOmL含有ImL司盤80的液體石蠟中，攪拌30min后滴加3mL體積分?jǐn)?shù)為 25%的戊二醛溶液，40°C反應(yīng)池，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH溶液調(diào)整pH至12左右，同時(shí)升溫至70°C，繼續(xù)攪拌反應(yīng)2h，產(chǎn)物經(jīng)石油醚和熱乙醇洗滌后真空干燥，即得磁性殼聚糖微球(MCM)，采用酸堿滴定法測(cè)定其氨基密度取微球50mg分散至20ml 10mmol/L的鹽酸溶液中，振蕩反應(yīng)lh，外加磁場(chǎng)吸住微球，取清液15ml用lOmmol/L氫氧化鈉溶液滴定，計(jì)算后結(jié)果見表1。(2)將步驟(1)所得磁性殼聚糖微球1. Og分散到20mL 二甲亞砜與氫氧化鈉的混合溶液(體積比1 1，氫氧化鈉濃度為lrnol/L)中，加入3mL環(huán)氧氯丙烷，40°C振蕩反應(yīng) 4h后用去離子水洗滌至中性、干燥。(3)將步驟⑵所得產(chǎn)物0. 5g轉(zhuǎn)移至IOmL 0. lmol/L組氨酸溶液中，用0. 5M氫氧化鈉溶液將PH調(diào)整至11左右，40°C水浴振蕩過夜，用去離子水洗滌至中性后干燥保存即得磁性殼聚糖-組氨酸內(nèi)毒素吸附介質(zhì)(MCM-His)，其氨基密度見表1，其掃描電鏡圖、粒徑分布圖、磁滯回歸線圖分別如圖1、圖2、圖3所示。實(shí)施例2 殼聚糖-四乙烯五胺內(nèi)毒素吸附介質(zhì)(MCM-TEPA)的制備(1)將2. Og四氧化三鐵超聲分散在IOOmL體積分?jǐn)?shù)為5%的乙酸溶液中，加入4g 殼聚糖(奧興公司生產(chǎn)，分子量30萬，脫乙酰度95%，即氨基密度為5833ymol/g)使其完全溶解后分散到200mL含有3mL司盤80的液體石蠟中，攪拌30min后滴加4mL體積分?jǐn)?shù)為 25%的戊二醛溶液，40°C反應(yīng)lh，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的NaOH溶液調(diào)整pH至12左右，同時(shí)升溫至70°C，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3h，產(chǎn)物經(jīng)石油醚和熱乙醇洗滌后真空干燥，即得磁性殼聚糖微球。(2)將步驟(1)所得磁性殼聚糖微球0. 5g分散到IOmL 二甲亞砜與氫氧化鈉的混合溶液(體積比1 1，氫氧化鈉濃度為lrnol/L)中，加入3mL環(huán)氧氯丙烷，40°C振蕩反應(yīng) 4h后用去離子水洗滌至中性、干燥。(3)將步驟⑵所得產(chǎn)物0. 5g轉(zhuǎn)移至IOmL 0. 2mol/L四乙烯五胺溶液中，用0. 5M 氫氧化鈉溶液將PH調(diào)整至11左右，40°C水浴振蕩過夜，用去離子水洗滌至中性后干燥保存即得磁性殼聚糖-四乙烯五胺內(nèi)毒素吸附介質(zhì)(MCM-TEPA)，其氨基密度見表1。表1不同吸附介質(zhì)的氨基密度
吸附介質(zhì)MCMMCM-HisMCM-TEPA氨基密度(μιηο /g)867.71240.11344.2實(shí)施例3 吸附介質(zhì)的使用分別取磁性殼聚糖微球(實(shí)施例1制得的MCM)、磁性殼聚糖微球-組氨酸(實(shí)施例1制得的MCM-His)及磁性殼聚糖微球-四乙烯五胺(實(shí)施例2制得的MCM-TEPA) 50mg 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %脫氧膽酸鈉水溶液洗滌抽濾或磁場(chǎng)分離三次，再用無熱原水洗滌三次，干燥后分散到2mL含有內(nèi)毒素的溶液(自來水)中，振蕩吸附30min，用磁鐵吸住吸附介質(zhì)，取出上清液測(cè)定內(nèi)毒素含量。內(nèi)毒素含量測(cè)定采用鱟試劑顯色基質(zhì)法，磁性殼聚糖微球-組氨酸(MCM-His)對(duì)內(nèi)毒素的吸附動(dòng)力學(xué)曲線如圖4所示，不同吸附介質(zhì)的吸附效果如圖5所示，從圖4可以看出該吸附介質(zhì)的吸附平衡時(shí)間較短，在IOmin之內(nèi)，可以高效快速的對(duì)樣品進(jìn)行去內(nèi)毒素處理。從圖5可以看出，磁性殼聚糖微球(MCM)本身對(duì)內(nèi)毒素也存在一定吸附作用，因?yàn)殡m然戊二醛與殼聚糖交聯(lián)反應(yīng)發(fā)生在醛基與氨基，但不可能完全，再加上微球本身的凝膠孔都會(huì)對(duì)內(nèi)毒素產(chǎn)生一定的吸附作用。經(jīng)過組氨酸和四乙烯五胺固載后吸附介質(zhì)的吸附容量得到了提升，其中以四乙烯五胺為配基的吸附介質(zhì)(MCM-TEPA)的吸附容量提高到了 554.lEU/go
權(quán)利要求
1.一種基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)，其特征在于所述的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)的制備方法包括如下步驟(1)先將磁性材料分散在乙酸溶液中，加入殼聚糖配成水相I，再將該水相I轉(zhuǎn)移至含有司盤80的液體石蠟中，以戊二醛為交聯(lián)劑，采用反相懸浮法制得磁性殼聚糖微球；所述的磁性物質(zhì)為四氧化三鐵或鐵；(2)將磁性殼聚糖微球分散到二甲基亞砜與氫氧化鈉的混合溶液中，再加入環(huán)氧氯丙烷活化，去離子水洗滌至中性，得到活化后產(chǎn)物；(3)將活化后產(chǎn)物置于內(nèi)毒素親和配基溶液中固載，即得到所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)；所述的內(nèi)毒素親和配基為組氨酸、精氨酸、多聚賴氨酸、多粘菌素B 或四乙烯五胺。
2.如權(quán)利要求1所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)，其特征在于所述的步驟(1)具體按照如下進(jìn)行將磁性材料超聲分散到乙酸溶液中，加入殼聚糖后攪拌均勻得到水相I，水相I中殼聚糖的濃度為10 40g/L，乙酸濃度為10 50mL/L，磁性材料與殼聚糖的投料質(zhì)量比為0.2 1 1 ；然后將水相I加入到含有0. 1 2Vol%司盤80的液體石蠟中，水相I與含有0. 1 2Vol%司盤80的液體石蠟的混合體積比為1 1 5 ；混勻后加入戊二醛，所加入的戊二醛與殼聚糖氨基的摩爾比為1 0.1 6，加畢調(diào)整溫度至 25 50°C反應(yīng)1 3小時(shí)，然后調(diào)整體系pH至10 13，同時(shí)升溫至50 80°C，繼續(xù)攪拌反應(yīng)1 3小時(shí)，充分反應(yīng)后分離產(chǎn)物，經(jīng)洗滌、干燥得到磁性殼聚糖微球。
3.如權(quán)利要求2所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)，其特征在于所述步驟(1)中，水相I中殼聚糖濃度為30 40g/L。
4.如權(quán)利要求2所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)，其特征在于所述步驟(1)中，戊二醛與殼聚糖氨基的摩爾比為1 1 2。
5.如權(quán)利要求2所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)，其特征在于所述步驟(1)中，調(diào)整體系PH調(diào)至10 13以后，升溫至70°C反應(yīng)2 3小時(shí)。
6.如權(quán)利要求1所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)，其特征在于所述的步驟( 具體按照如下進(jìn)行將磁性殼聚糖微球分散到二甲亞砜/氫氧化鈉混合溶液中，然后加入環(huán)氧氯丙烷在振蕩下于25 50°C進(jìn)行活化反應(yīng)，充分反應(yīng)后過濾、洗滌至中性、干燥得到所述的活化后產(chǎn)物；所述二甲亞砜/氫氧化鈉混合溶液由二甲亞砜與0. 1 2mol/L 的氫氧化鈉水溶液按照體積比1 0.25 5配制得到，所述環(huán)氧氯丙烷與二甲亞砜/氫氧化鈉混合溶液的投料體積比為1 50 100，磁性殼聚糖微球與環(huán)氧氯丙烷的投料質(zhì)量體積比為lg/1 IOmL0
7.如權(quán)利要求6所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)，其特征在于所述的步驟O)中，控制二甲亞砜/氫氧化鈉混合溶液中氫氧化鈉終濃度在0. 8 lmol/L。
8.如權(quán)利要求1所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)，其特征在于所述的步驟(3)具體按照如下進(jìn)行將活化后產(chǎn)物置于0. 1 0. 5mol/L內(nèi)毒素親和配基溶液中， 調(diào)節(jié)pH至10 12，于20 50°C振蕩反應(yīng)過夜，反應(yīng)完畢后過濾、洗滌至中性、干燥即得所述的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)。
9.如權(quán)利要求8所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)，其特征在于所述的步驟(3)中，所述活化后產(chǎn)物與0. 1 0. 5mol/L內(nèi)毒素親和配基溶液的質(zhì)量體積比為~0. 1 lg/10mL。
10.如權(quán)利要求1所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)的使用方法，具體按照如下方法進(jìn)行取內(nèi)毒素吸附介質(zhì)用脫氧膽酸鈉水溶液洗滌，再用無熱原水充分洗滌，干燥后分散到含有內(nèi)毒素的待處理溶液中，充分振蕩或攪拌，然后外加磁場(chǎng)吸住吸附介質(zhì)，取出上清液即為處理后溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)及其使用方法，所述的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)的制備方法包括如下步驟(1)先將磁性材料分散在乙酸溶液中，加入殼聚糖配成水相I，再將該水相I轉(zhuǎn)移至含有司盤80的液體石蠟中，以戊二醛為交聯(lián)劑，采用反相懸浮法制得磁性殼聚糖微球；(2)將磁性殼聚糖微球分散到二甲基亞砜與氫氧化鈉的混合溶液中，再加入環(huán)氧氯丙烷活化，去離子水洗滌至中性，得到活化后產(chǎn)物；(3)將活化后產(chǎn)物置于內(nèi)毒素親和配基溶液中固載，即得到所述的基于磁性殼聚糖微球的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)。本發(fā)明的內(nèi)毒素吸附介質(zhì)不但對(duì)于內(nèi)毒素具有較高的選擇性，而且操作簡(jiǎn)便，可用于大量生物制品中內(nèi)毒素的去除。
文檔編號(hào)B01J20/30GK102350309SQ201110182649
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月30日
發(fā)明者姜玉奇, 應(yīng)國(guó)清, 易喻, 來燦林, 梅建鳳, 王鴻, 陳建澍 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)