專利名稱：一種胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法。
背景技術(shù)：
生物破乳劑是生物表面活性劑的一種，是一類能夠使乳狀液油水分離的新型破乳劑。與傳統(tǒng)化學(xué)破乳劑相比，生物破乳劑具有高效低毒、可生物降解、在極端條件下發(fā)揮活性等優(yōu)點，在原油開采、含油土壤修復(fù)等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用前景。(CairnS，W.L. ,Cooper, D. G. , Zajic, J. Ε. , Wood, J. Μ. , Kosaric, N. , 1982. Characterization of Nocardia amarae as a Potent Biological Coalescing Agent of Water-Oil Emulsions. Appl. Environ. Microbiol.，43，362-366.)目前發(fā)現(xiàn)的生物破乳劑多緊密結(jié)合于破乳菌株表面，難于提取因而不利于破乳活性物質(zhì)的性質(zhì)研究。因此，針對產(chǎn)胞壁結(jié)合型生物破乳劑的菌株，需要簡捷、方便、高效的提取手段來得到其破乳活性物質(zhì)，以便于對其進(jìn)行純化鑒定，進(jìn)一步揭示生物破乳菌破乳機(jī)理，從而指導(dǎo)生物破乳菌的培養(yǎng)和大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用。目前大量應(yīng)用于提取微生物胞壁結(jié)合物的方法是有機(jī)溶劑提取(Frmzetti， Α.，Bestetti，G.，Caredda，P.，La Colla，P.，Tamburini, Ε. , 2008. Surface-active compounds and their role in the access to hydrocarbons in Gordonia strains. FEMS Microbiol. Ecol.，63，M8-M8.)，另外水提取法被廣泛應(yīng)用于植物提取(Geuenich， S. ， Goffinet, C. ， Venzke, S. ， Nolkemper, S. ， Baumann, I. ， Plinkert, P. ， Reichling, J.，Keppler, 0. , 2008. Aqueous extracts from peppermint，sage and lemon balm leaves display potent anti—HIV—l activity by increasing the virion density. Retrovirology,5,27.)，該法也可以借鑒用于微生物胞壁物質(zhì)提取。但是這些方法應(yīng)用于產(chǎn)胞壁結(jié)合型生物破乳劑的破乳菌時，普遍存在提取過程復(fù)雜、效率不高、提取產(chǎn)物破乳活性不好、提取不完全等問題。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中提取效率低，提取不完全，提取產(chǎn)物破乳活性不好等問題，本發(fā)明的目的是提供一種胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，該方法工藝簡單、提取效率高，且能較大程度上保留提取物的功能活性。本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供了一種胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，該方法包括以下步驟將產(chǎn)胞壁結(jié)合型生物破乳劑的破乳菌菌體干粉與堿液混合攪拌，經(jīng)離心、中和、濃縮、透析除鹽和冷凍干燥，得到胞壁結(jié)合型生物破乳劑。所述的產(chǎn)胞壁結(jié)合型生物破乳劑的破乳菌選自產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes sp.)、諾卡氏菌(Nocardia sp.)、棒狀桿菌(Corynebacterium sp.)、紅球菌(Rhodococcus sp.)或微球菌(Micrococcus sp.)等菌種。
所述的產(chǎn)胞壁結(jié)合型生物破乳劑的破乳菌菌體干粉和堿液的料液比為5 1 25 lg/L。所述的堿液是濃度為0. 05-0. 15mol/L的NaOH溶液。所述的攪拌是在溫度為25-45°C，轉(zhuǎn)速為500-1000rpm的條件下，水浴磁力攪拌 2-12h。所述的離心其轉(zhuǎn)速為10000-12000rpm，溫度4_15°C，時間10_20min。所述的中和是用6mol/L鹽酸將離心后上清液pH值調(diào)至6. 8_72。所述的濃縮是在溫度45-55°C的條件下，將中和后清液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5_15mL。所述的透析除鹽包括以下步驟將濃縮后液體使用IOODa透析袋浸泡在蒸餾水中脫鹽，漲袋后用聚乙二醇(PEG12000)濃縮脫水，如此反復(fù)，直至透析袋外部蒸餾水的鹽度
< 10mg/Lo所述的冷凍干燥是在_50°C下冷凍干燥Mh。本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點和有益效果1.本發(fā)明相對于其它提取方法，微生物破乳活性物質(zhì)的提取率較高，提取率最高可達(dá)40%以上。2.本發(fā)明對破乳活性物質(zhì)提取較完全，殘余菌體無破乳活性。3.本發(fā)明提取的產(chǎn)物破乳效果好，提取產(chǎn)物投加量為1000mg/L時，破乳最高可達(dá) 90%。4.本發(fā)明采用堿液提取，工藝簡單高效，成本較低。5.本發(fā)明采用透析袋除鹽，工藝簡單有效。6.本發(fā)明的方法破乳活性物質(zhì)提取完全，有利于生物破乳劑的純化鑒定和生物破乳菌破乳機(jī)理進(jìn)一步揭示，并能為生物破乳菌的培養(yǎng)和大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明適用于胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取，特別適用于專利200710046963. 5 中所述的一株產(chǎn)胞壁結(jié)合型生物破乳劑的破乳菌高效生物破乳菌產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp. S-XJ-I (說明書第1頁第觀行)，以下將以此菌株為實施對象進(jìn)行描述。高效生物破乳菌產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp. S-XJ-1取自克拉瑪依油田某站采油井井口 Im處長期受石油污染的土壤，于-4°C保存在斜面培養(yǎng)基上。將保藏菌種活化后接種至IOOmL肉湯培養(yǎng)基富集培養(yǎng)72h，再將IOmL培養(yǎng)液接入IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d。培養(yǎng)后將菌株的全培養(yǎng)液在IOOOOrpm高速離心10分鐘，獲得濕菌，使用正己烷洗提離心三次，-50°C冷凍干燥24h得到菌體干粉，為本發(fā)明原料。高效生物破乳菌產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp. S-XJ-I所用的肉湯培養(yǎng)基(IL)組成為牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 25g，pH = 7. 0。發(fā)酵培養(yǎng)基(IL)組成為=NH4NO3 4. Og, K2HPO4 4. 0g, KH2PO4 6. 0g，MgSO4 · 7Η20 0. 2g，微量元素溶液 lmL，NaCl 25g。碳源為液體石蠟 4% (V/V)。其中微量元素溶液(IL)包含 CaCl2 ·2Η20 lOOOmg，F(xiàn)eSO4 ·7Η20 1000mg,EDTA 1400mg。用6mol/L HCl和6mol/L NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH = 9. 0。培養(yǎng)基使用前， 使用高壓蒸氣滅菌，滅菌條件為=IXlO5I3a滅菌20min。培養(yǎng)條件為35°C，130rpm。(陸麗君，黃翔峰，劉佳，等.一株高效生物表面活性劑產(chǎn)生菌的篩選鑒定及其性質(zhì)研究.工業(yè)微生物，2008，38 (5) :34-39.)本發(fā)明中模型乳狀液配制方法如下用煤油和水配制油包水型(W/0)模型乳狀液，在250mL高腳燒杯中，加入80mL溶有1. 526g Span80和0. 074g Tween80的煤油溶液， 然后加入120mL蒸餾水，用高速攪拌乳化機(jī)攪拌3. 5min,轉(zhuǎn)速lOOOOrpm。破乳試驗用于驗證提取物破乳活性。(黃翔峰，尚家佳，陸麗君，等.PH對破乳菌Alcaligenes sp. S-XJ-I破乳性能的影響.微生物學(xué)通報，2010，37 (11) :1575-1580.)實施例11.將培養(yǎng)得到的生物破乳菌產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp. S-XJ-I菌體干粉0. 5g和 50mL 0. Imol/LNaOH溶液加入錐形瓶中(菌體干粉和堿液的料液比為10 lg/L)，在35°C， 轉(zhuǎn)速900rpm的條件下水浴磁力攪拌10h。2.對所得混合液進(jìn)行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000rpm，溫度15°C，時間lOmin，上清液備用，殘余菌體冷凍干燥。3.用6mol/L鹽酸將上清液pH調(diào)至6. 8-7. 2，在50°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約10mL。 蒸發(fā)后液體使用IOODa透析袋浸泡在蒸餾水中脫鹽，漲袋后用PEG12000濃縮脫水，如此反復(fù)，直至透析袋外部蒸餾水的鹽度< 10mg/L。收集除鹽后清液，在_50°C下冷凍干燥Mh，得到提取的破乳活性物質(zhì)固體，提取率43. 6%。4.稱取一定量所得破乳物質(zhì)，加水溶解配成10g/L溶液，pH調(diào)節(jié)至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳狀液，劇烈震蕩120下，放入35°C水浴鍋48h，其破乳率可達(dá) 90%。殘菌進(jìn)行相同破乳試驗驗證失去破乳活性。實施例21.將培養(yǎng)得到的生物破乳菌產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp. S-XJ-I菌體干粉0. 5g和 50mL 0. Imol/LNaOH溶液加入錐形瓶中(菌體干粉和堿液的料液比為10 lg/L)，在35°C， 轉(zhuǎn)速900rpm的條件下水浴磁力攪拌4h。2.對所得混合液進(jìn)行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000rpm，溫度15°C，時間lOmin，上
清液備用，殘余菌體冷凍干燥。3.用6mol/L鹽酸將上清液pH調(diào)至6. 8-7. 2，在50°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約10mL。 蒸發(fā)后液體使用IOODa透析袋浸泡在蒸餾水中脫鹽，漲袋后用PEG12000濃縮脫水，如此反復(fù)，直至透析袋外部蒸餾水的鹽度< 10mg/L。收集除鹽后清液，在_50°C下冷凍干燥Mh，得到提取的破乳活性物質(zhì)固體，提取率38. 2%。4.稱取一定量所得破乳物質(zhì)，加水溶解配成10g/L溶液，pH調(diào)節(jié)至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳狀液，劇烈震蕩120下，放入35°C水浴鍋48h，其破乳率可達(dá) 88. 5%。殘菌進(jìn)行相同破乳試驗驗證失去破乳活性。實施例31.將培養(yǎng)得到的生物破乳菌產(chǎn)堿桿菌Alcaligenes sp. S-XJ-I菌體干粉0. 5g 和50ml 0.08mOl/LNa0H溶液加入錐形瓶中(菌體干粉和堿液的料液比為10 lg/L)，在 350C，轉(zhuǎn)速900rpm的條件下水浴磁力攪拌他。2.對所得混合液進(jìn)行離心分離，離心轉(zhuǎn)速為12000rpm，溫度15°C，時間lOmin，上
清液備用，殘余菌體冷凍干燥。
3.用6mol/L鹽酸將上清液pH調(diào)至6. 8-7. 2，在50°C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約10mL。 蒸發(fā)后液體使用IOODa透析袋浸泡在蒸餾水中脫鹽，漲袋后用PEG12000濃縮脫水，如此反復(fù)，直至透析袋外部蒸餾水的鹽度< 10mg/L。收集除鹽后清液，在_50°C下冷凍干燥Mh，得到提取的破乳活性物質(zhì)固體，提取率37. 2%。4.稱取一定量所得破乳物質(zhì)，加水溶解配成10g/L溶液，pH調(diào)節(jié)至中性，取2mL加入破乳管，再加入18mL模型乳狀液，劇烈震蕩120下，放入35°C水浴鍋48h，其破乳率可達(dá) 82. 5%。殘菌進(jìn)行相同破乳試驗驗證失去破乳活性。上述的對實施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和應(yīng)用本發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對這些實施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動。因此，本發(fā)明不限于這里的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，其特征在于該方法包括以下步驟將產(chǎn)胞壁結(jié)合型生物破乳劑的破乳菌菌體干粉與堿液混合攪拌，經(jīng)離心、中和、濃縮、透析除鹽和冷凍干燥，得到胞壁結(jié)合型生物破乳劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，其特征在于所述的產(chǎn)胞壁結(jié)合型生物破乳劑的破乳菌選自產(chǎn)堿桿菌、諾卡氏菌、棒狀桿菌、紅球菌或微球菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，其特征在于所述的產(chǎn)胞壁結(jié)合型生物破乳劑的破乳菌菌體干粉和堿液的料液比為5 1 25 lg/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，其特征在于所述的堿液是濃度為0. 05-0. 15mol/L的NaOH溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，其特征在于所述的攪拌是在溫度為25-45°C，轉(zhuǎn)速為500-1000rpm的條件下，水浴磁力攪拌2_12h。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，其特征在于所述的離心其轉(zhuǎn)速為 10000-12000rpm，溫度 4_15°C，時間 10_20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，其特征在于所述的中和是用6mol/L鹽酸將離心后上清液pH值調(diào)至6. 8-7. 2。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，其特征在于所述的濃縮是在溫度45-55°C的條件下，將中和后清液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至5-15mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，其特征在于所述的透析除鹽包括以下步驟將濃縮后液體使用IOODa透析袋浸泡在蒸餾水中脫鹽，漲袋后用聚乙二醇濃縮脫水，如此反復(fù)，直至透析袋外部蒸餾水的鹽度< 10mg/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，其特征在于所述的冷凍干燥是在-50°C下冷凍干燥Mh。
全文摘要
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種胞壁結(jié)合型生物破乳劑的提取方法，該方法包括以下步驟將產(chǎn)胞壁結(jié)合型生物破乳劑的破乳菌菌體干粉與堿液混合攪拌，經(jīng)離心、中和、濃縮、透析除鹽和冷凍干燥，得到胞壁結(jié)合型生物破乳劑。本發(fā)明的方法工藝簡單、提取效率高，且能較大程度上保留提取物的功能活性，有利于生物破乳劑的純化鑒定和生物破乳菌破乳機(jī)理進(jìn)一步揭示，并能為生物破乳菌的培養(yǎng)和大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。
文檔編號B01D17/04GK102350261SQ20111019664
公開日2012年2月15日 申請日期2011年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月14日
發(fā)明者倪曉靜, 劉佳, 張樹聰, 彭開銘, 徐竟成, 陸麗君, 黃翔峰 申請人:同濟(jì)大學(xué)