專利名稱：一種生物可降解聚合物微囊的制備方法
一種生物可降解聚合物微囊的制備方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及高分子微球、微囊材料的成型加工及作為新型藥物制劑材料的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
微囊是指從亞微米到毫米尺度的小型膠囊。功能材料與殼層材料是構(gòu)成微囊的兩個(gè)基本元素。微囊的制備，指的是通過一定的方法使功能材料被包裹或分散在殼層材料中， 從而制備顆粒狀復(fù)合物的過程。微囊是一種重要的商品形式。通過對(duì)物質(zhì)進(jìn)行包埋可以達(dá)到許多目的，如可以改善囊芯材料的化學(xué)或物理穩(wěn)定性，屏蔽囊芯的氣味、顏色和毒性，還可以實(shí)現(xiàn)囊芯物質(zhì)的控制釋放和靶向釋放。合成聚合物材料，由于便于成型加工，便于性能改造，是發(fā)展最快的一類微囊材料。
在傳統(tǒng)的聚合物領(lǐng)域中，微囊或中空微球能夠通過聚合物和致孔劑的相分離來制備。在致孔過程中，溶劑常被稱為致孔劑，通常選擇油溶性小分子。聚合物與溶劑的相分離能夠發(fā)生在聚合物鏈增長(zhǎng)過程中，由于聚合物分子量的增長(zhǎng)或分子間的交聯(lián)，大分子逐漸從小分子溶劑中沉淀出來，形成固態(tài)高分子。也能夠發(fā)生在高分子溶液體系中，由于環(huán)境條件改變，如溫度的變化、良溶劑的去除或不良溶劑的添加，造成溶劑對(duì)高分子的溶解能力下降，使高分子沉淀成固相。但是，這種方法只能包埋有限的幾種有機(jī)溶劑或溶于有機(jī)溶劑的物質(zhì)，難以形成通用的包埋方法。
對(duì)于生物活性物質(zhì)的包埋，更為常用的方法是水包油包水(W/0/W)復(fù)乳包埋法， 它能夠提供生物友好的內(nèi)水相環(huán)境，避免了被包埋組分同疏水溶劑的接觸，有利于生物分子構(gòu)象的穩(wěn)定和活性保持。再結(jié)合油相固化技術(shù)，能夠制備出以復(fù)乳液滴為模板的固體微膠囊，從而滿足長(zhǎng)期穩(wěn)定包埋的需要。可選擇的油相固化技術(shù)有懸浮聚合法和溶劑去除法。 前者油相中包含可聚合小分子單體，通過原位聚合實(shí)現(xiàn)油相固化；后者油相為高分子有機(jī)相溶液，通過溶劑的揮發(fā)或萃取實(shí)現(xiàn)油相固化。
復(fù)乳與溶劑去除法相結(jié)合是目前研究的重點(diǎn)，該方法便于采用生物降解的高分子為殼層材料，適用于載藥微囊的開發(fā)。而其中關(guān)注度最高的是聚乳酸類高分子，近十年，和復(fù)乳化技術(shù)相關(guān)的文獻(xiàn)中近半數(shù)涉及聚乳酸類殼層材料。在體液環(huán)境中，聚乳酸膠囊能夠在一定時(shí)間內(nèi)完全降解，釋放出內(nèi)部載藥，是一種理想的載藥材料。例如CN 1935127A提供一種以改性聚乳酸材料為囊材的微球制備方法，采用改性聚乳酸材料為囊材，對(duì)于囊芯物是水溶性或不能被溶劑溶解但表面是親水性的物質(zhì)或藥物的微球制備，先將囊芯物溶解或分散在水中，將改性聚乳酸材料溶解在其能與水相混溶的溶劑中，然后將囊芯物的水溶液加入改性聚乳酸材料的溶液中，或?qū)⒏男跃廴樗岵牧系娜芤杭尤肽倚疚锏乃芤褐?，或?qū)⑦@兩種溶液同時(shí)加入用于溶解改性聚乳酸材料的溶劑中，或?qū)⑺鼈兊幕旌先芤杭尤肴芙飧男跃廴樗岵牧系娜軇┲?，攪拌得微球溶液，然后過濾得微球。方法中不使用表面活性劑和分散劑，制備過程簡(jiǎn)單，粒徑可達(dá)到納米級(jí)，且粒徑可控，包裹率高，可很大程度上維持囊芯物的活性，微球具有緩釋功能。
相對(duì)于相分離的包埋方法，復(fù)乳法更適用于大量生物活性分子的包埋，但由于乳化的過程中伴隨著機(jī)械攪拌或超聲乳化，產(chǎn)生的剪切力會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)類藥物的活性產(chǎn)生不利影響；靠近油水界面的藥物會(huì)與油相的有機(jī)溶劑接觸，造成藥物活性的降低，甚至失活。此外由于復(fù)乳液是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，內(nèi)水相會(huì)在固化前與外水相融合，使得原本在內(nèi)水相的藥物泄漏到外水相中，降低藥物包埋率。
2005 ip, Im 等(Im, S. H. ， U. Y. Jeong, and Y. N. Xia, Polymer hollow particles with controllable holes in their surfaces.Nature Materials,2005.4 (9) p. 671-675)提出了一種先將聚合物微球加工成單眼微球，再封口的納米微囊制備方法。該方法首先制備納米尺度的聚苯乙烯膠乳顆粒，再使用甲苯溶脹聚苯乙烯納米顆粒，隨后使用液氮冷凍溶脹納米球，使納米球向界面收縮，形成中空結(jié)構(gòu)，最后緩慢升溫，使甲苯緩慢揮發(fā)，揮發(fā)過程中發(fā)生相分離形成單眼結(jié)構(gòu)。單眼球作為納米微囊的半成品，與囊芯材料進(jìn)行組裝，后升高溫度至殼層玻璃態(tài)溫度以上，通過退火處理(緩慢降溫)進(jìn)行封口，或通過有機(jī)溶劑對(duì)納米微球進(jìn)行溶脹，進(jìn)而達(dá)到封口的效果。馬光輝等(Ma，G.H.，et al. ,Uniform one-hole particles used as versatile micro-encapsulation. Chemistry Letters， 2008. 37(3) :p. 366-367)利用膜乳化技術(shù)，制備出了粒徑均一、孔徑可控微米尺度的聚苯乙烯單眼微球，并利用溶劑對(duì)微球溶脹，實(shí)現(xiàn)了微米尺度微球的封口，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)水溶性分子和磁流體的包埋。但由于聚苯乙烯生物相容性較差，限制了其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。
$ 1111 ^ 石出±，Yin· (Yin, W. and Μ. Ζ. Yates,Encapsulation and sustained release from biodegradable microcapsules made by emulsification/freeze drying and spray/freeze drying. Journal of Colloid and Interface Science, 2009. 336(1) p. 155-161)利用噴霧法首先制備出0/W單乳液，并迅速置于低溫環(huán)境中冷凍干燥，在降溫的過程中，單乳液中的聚合物發(fā)生相分離，而在干燥過程中，單乳液中的有機(jī)溶劑被去除， 從而形成多孔的PLA微球；并通過二氯甲烷以及壓縮二氧化碳，進(jìn)行后續(xù)處理，實(shí)現(xiàn)了多孔微球的封口。實(shí)驗(yàn)中選用生物可降解材料作為殼層材料，但制備出的球形不好，且孔徑分布不均勻。Kim 等(Kim, H. K. , H. J. Chung, and T.G.Park, Biodegradable polymeric microspheres with " open/closed" pores for sustained release of human growth hormone. Journal of Controlled Release, 2006. 112(2) :p. 167-174)同樣利用相分離制孔技術(shù)，以單乳液為模板，利用表面活性劑Pluronic F127作為致孔劑制備出不同孔徑的 PLGA多孔微球，在裝載重組人生長(zhǎng)激素后，對(duì)其進(jìn)行了溶劑封口處理，缺點(diǎn)是制備工藝復(fù)雜，藥物的包埋率較低。
本發(fā)明提出一種完全不同于上述報(bào)道的方法，即首先使用復(fù)乳法制備生物可降解開孔微球，并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)造了一種新的微囊化方式，以期待獲得更高的囊芯材料裝載量和生物活性。首先通過復(fù)乳模板法制備中空開孔微球，復(fù)乳模板在固化過程中內(nèi)外水相融合形成內(nèi)外貫穿的孔道；并將開孔微球浸泡在含有囊芯材料的溶液中，當(dāng)被包埋物質(zhì)擴(kuò)散到微球內(nèi)部，并達(dá)到平衡時(shí)，可選用溶劑溶脹、升溫退火、照射三種不同方式對(duì)微球表面進(jìn)行處理，使其軟化收縮，從而達(dá)到封口的效果。相比傳統(tǒng)的復(fù)乳包埋方法，該方法的包埋過程中無機(jī)械攪拌或超聲破碎，過程更加溫和，避免生物活性物質(zhì)受損。包埋后溶液中剩余的囊芯材料可回收利用。相比較之前報(bào)道的先成球后封口的方法，本發(fā)明首次提出用復(fù)乳模板法制備開孔微球，該方法使用水相制孔，確保了生物兼容性，更加環(huán)境友好。達(dá)到了與之5前報(bào)道相同的粒徑、孔徑水平，且內(nèi)腔容積更大，更有利于囊芯材料的裝載。本發(fā)明選用生物可降解的聚乳酸類作為殼層材料，其中包括PLA，PLGA，PELA。通過調(diào)節(jié)制備工藝可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微球粒徑和孔徑的控制，適用于包埋多種尺度的囊芯材料。本發(fā)明在開發(fā)的過程中考慮了放大的需求，乳化和固化都是常規(guī)的生產(chǎn)方式，適合大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的之一在于提供一種新型的生物可降解材料微囊的制備方法。首先制備出具有貫穿孔結(jié)構(gòu)的開孔微球，該微球具有多腔的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和多孔的殼層，通過復(fù)乳演變和復(fù)乳固化兩個(gè)動(dòng)態(tài)過程的控制，可精確控制開孔球的開孔結(jié)構(gòu)與開孔數(shù)量。開孔球表面孔徑范圍為0.1-999 μ m。該開孔微球生物兼容性好，內(nèi)腔容積大，腔室之間彼此相互連接，且制備過程易于放大。隨后將開孔球浸入到囊芯材料的溶液中，囊芯材料通過擴(kuò)散進(jìn)入微球內(nèi)部，可選用溶劑溶脹法、照射法和升溫退火法三種對(duì)開孔微球進(jìn)行封口，從而實(shí)現(xiàn)先成球、后包埋生物活性物質(zhì)的目的。制備的微膠囊粒徑控制在 1-1000 μ m;本發(fā)明驗(yàn)證了該微膠囊的應(yīng)用，其中包括裝載小分子、生物大分子、納米材料和微米材料。
所述生物可降解材料微囊的制備方法，主要包括開孔微球的制備、囊芯材料的裝填，以及開孔微球的封口。所述方法具體包括以下步驟
(1)配制油相，所述油相為聚合物膜材溶液，其中溶劑為有機(jī)溶劑；配制內(nèi)水相溶液和外水相溶液，外水相添加表面活性劑；
(2)將內(nèi)水相分散到油相當(dāng)中，形成油包水初乳液；再將初乳液分散到外水相中， 形成水包油包水復(fù)乳液；
(3)利用溶劑去除法，使油相固化，得到具有內(nèi)外貫穿孔道的開孔微球；
(4)將開孔微球的懸濁液加入到囊芯材料溶液當(dāng)中，充分混合，得到已裝填具有囊芯材料的開孔微球；
(5)開孔微球的封口，得到聚合物微囊。
優(yōu)選地，步驟(1)中所述聚合物膜材為聚乳酸、聚(乳酸-羥基乙酸)、單甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物中的1種或至少2種的組合，所述組合典型但非窮盡的實(shí)例有聚乳酸、聚(乳酸-羥基乙酸)的組合，聚(乳酸-羥基乙酸)、單甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物的組合，聚乳酸、單甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物的組合，聚乳酸、聚(乳酸-羥基乙酸)、單甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物的組合等。
優(yōu)選地，步驟(1)中所述有機(jī)溶劑為揮發(fā)性且不與水互溶的有機(jī)溶劑，例如正丁醇、甲乙酮、乙醚、氯仿、四氯甲烷、甲苯等，包括揮發(fā)性且可部分溶于水的有機(jī)溶劑，例如乙酸乙酯、苯酚等，進(jìn)一步優(yōu)選為不與水互溶的醇、酮、酯、醚、烷基苯、鹵代烷烴、鹵代芳烴中的1種或至少2種的組合，所述組合典型但非窮盡的實(shí)例有醇、酮的組合，醇、酮、酯、醚的組合，酯、烷基苯、鹵代烷烴的組合，酯、烷基苯、鹵代烷烴、鹵代芳烴的組合等，特別優(yōu)選為醇、酯、烷基苯、氯代烷烴、氯代芳烴中的1種或至少2種的組合。
步驟(1)中所述內(nèi)水相為常規(guī)內(nèi)水相，例如無機(jī)鹽的水溶液、水等。
步驟(1)中所述外水相為包含表面活性劑的常規(guī)水相，例如溶解有無機(jī)鹽、表面活性劑的水溶液等。
優(yōu)選地，步驟(3)中所述溶劑去除法為溶劑萃取法，也可以是靜置使溶劑揮發(fā)，或攪拌使溶劑揮發(fā)或其他去除溶劑的方法。
步驟(3)中所述固化過程中，內(nèi)水相與外水相融合，形成貫穿孔。
步驟(3)所述的具有內(nèi)外貫穿孔道的開孔微球，為單孔或多孔結(jié)構(gòu)。
步驟(5)所制備的聚合物微囊，為單一內(nèi)腔或多腔室結(jié)構(gòu)。
優(yōu)選地，步驟(3)中，使油相固化后，除去殘留的表面活性劑，特別優(yōu)選通過過篩或離心洗滌除去殘留的表面活性劑。
優(yōu)選地，步驟中所述囊芯材料溶液包括囊芯材料懸濁液和囊芯材料溶液。
步驟中所述開孔微球懸濁液溶劑為可分散但不溶解微球的溶劑。
優(yōu)選地，步驟(4)中所述混合溫度為40°C以下，進(jìn)一步優(yōu)選為30°C以下，特別優(yōu)選為室溫。
優(yōu)選地，步驟(4)中所述混合時(shí)間為15小時(shí)以上，進(jìn)一步優(yōu)選為20小時(shí)以上，更優(yōu)選為M小時(shí)以上，特別優(yōu)選為M小時(shí)。
優(yōu)選地，步驟(5)所述開孔微球的封口工藝，包括以下三種方法
(i)溶劑溶脹法；
(ii)照射法；
(iii)升溫退火法。
所屬領(lǐng)域技術(shù)人員也可根據(jù)其掌握的專業(yè)知識(shí)/新技術(shù)對(duì)開孔微球進(jìn)行封口。
優(yōu)選地，方法(i)中所述溶劑溶脹法具體為將有機(jī)溶劑添加到含有表面活性劑的水溶液中，并使其均勻分散于水相中，將已裝填具有囊芯材料的開孔微球加入，充分混合，轉(zhuǎn)移到水溶液中固化，得到封口后的微囊
優(yōu)選地，方法(i)中所述有機(jī)溶劑為揮發(fā)性且不與水互溶的有機(jī)溶劑，例如正丁醇、甲乙酮、乙醚、氯仿、四氯甲烷、甲苯等，包括揮發(fā)性且可部分溶于水的有機(jī)溶劑，例如乙酸乙酯、苯酚等，進(jìn)一步優(yōu)選為不與水互溶的醇、酮、酯、醚、烷基苯、鹵代烷烴、鹵代芳烴中的1種或至少2種的組合，所述組合典型但非窮盡的實(shí)例有醇、酮的組合，醇、酮、酯、醚的組合，酯、烷基苯、鹵代烷烴的組合，酯、烷基苯、鹵代烷烴、鹵代芳烴的組合等，特別優(yōu)選為醇、酯、烷基苯、氯代烷烴、氯代芳烴中的1種或至少2種的組合。
優(yōu)選地，方法(i)中采用超聲、均質(zhì)或機(jī)械攪拌的方法使有機(jī)溶劑均勻分散于水相中，特別優(yōu)選采用超聲方法，例如采用超聲細(xì)胞破碎儀。
優(yōu)選地，方法(i)中所述混合方式為持續(xù)攪拌、超聲或震蕩，保持微球的懸浮狀態(tài)，特別優(yōu)選置于垂直混合器上混合。
優(yōu)選地，方法(i)中固化后，洗滌，得到封口后的微囊，特別優(yōu)選采用過篩洗滌。
優(yōu)選地，方法(i)中所述固化可在靜置或攪拌狀態(tài)下進(jìn)行。
優(yōu)選地，方法(ii)所述照射法具體為將載有囊芯材料的開孔微球加入到含有表面活性劑的水溶液中，充分混合，采用紫外線或可見光或紅外線光源照射微球懸濁液，一段時(shí)間后，降溫，得到封□后的微囊。
優(yōu)選地，方法(ii)中所述混合方式為持續(xù)攪拌、超聲或震蕩，保持微球的懸浮狀態(tài)，特別優(yōu)選采用滾軸式混合器。
優(yōu)選地，方法(ii)中所述照射為紅外線照射。
方法(ii)中，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可通過調(diào)節(jié)光源與樣品距離、控制光強(qiáng)度使微球懸濁液獲得合適的照射到的光強(qiáng)。
優(yōu)選地，方法(iii)中所述升溫退火法具體為將載有囊芯材料的開孔微球加入到含有表面活性劑的水溶液中，混合并升溫至微球的玻璃化溫度以上，一段時(shí)間后，緩慢降溫，洗去表面活性劑，得到封口后的微囊。
優(yōu)選地，方法(iii)中所述混合方式為持續(xù)攪拌、超聲或震蕩，保持微球的懸浮狀態(tài)，特別優(yōu)選采用滾軸式混合器。
優(yōu)選地，方法(iii)中所述升溫采用控溫箱或微波加熱方式。
保持生物活性是微囊制劑的難題，傳統(tǒng)的W/0/W包埋技術(shù)都是將生物活性物質(zhì)溶解于內(nèi)水相，通過超聲破碎、均質(zhì)乳化、機(jī)械攪拌等方案使內(nèi)水相分散到油相中，在此過程中，被包埋藥物，如蛋白質(zhì)等，會(huì)受到機(jī)械剪切的破壞，活性降低；此外，復(fù)乳體系中存在大量的油水界面，蛋白質(zhì)與有機(jī)溶劑接觸，使其構(gòu)象發(fā)生變化，活性喪失；由于復(fù)乳液不穩(wěn)定性，內(nèi)外水相融合也會(huì)造成包埋率的降低。
本發(fā)明提出了一種制備生物可降解的微囊的方法，首先使用生物可降解材料制備開孔微球，再將其分散于囊芯材料的水溶液中，由于該發(fā)明制備的微球孔道內(nèi)外貫穿，水溶液會(huì)通過孔道灌滿整個(gè)微球的空腔。隨后利用溶劑溶脹法、照射法或升溫退火法，實(shí)現(xiàn)對(duì)微球表面大孔的密封，形成微囊，此時(shí)生物活性物質(zhì)被包埋在微囊內(nèi)腔中。
本發(fā)明所用的殼層材料有多種選擇，包括不同分子量的聚乳酸類材料，其中的聚 (乳酸-羥基乙酸)、單甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物可以是不同單體比例的聚合物。
在本發(fā)明中，若油相采用的有機(jī)溶劑溶于水，則在油相與外水相混合前，需在外水相中加入所述油相的有機(jī)溶劑，并使其飽和，以保證油相中的溶劑不會(huì)溶于外水相中，避免油相在乳化過程中出現(xiàn)固化。
本發(fā)明的目的之一還在于提供一種生物可降解材料微囊。
所述生物可降解材料微囊直徑為1-1000微米，膠囊殼層材料為生物可降解材料， 為單一內(nèi)腔或多腔室結(jié)構(gòu)，由本發(fā)明所述方法制備。
本發(fā)明的目的之一還在于提供一種所述生物可降解材料微囊的用途。所述生物可降解材料微囊可用于包埋小分子、生物大分子物質(zhì)，還可以裝載納米、微米級(jí)尺寸的顆粒， 如圖7、11、18、22所示。
本發(fā)明中利用溶劑溶脹法封口適用于包埋能耐受微量有機(jī)溶劑的生物材料。當(dāng)所包埋物對(duì)有機(jī)溶劑較為敏感時(shí)，可利用照射法或升溫退火法；特別是照射法，能在較低的溶液溫度下實(shí)現(xiàn)封口。
本發(fā)明中開孔微球的結(jié)構(gòu)，可通過復(fù)乳演變、固化過程兩個(gè)動(dòng)態(tài)過程來調(diào)控，也可通過調(diào)整制備配方來選擇合適的殼層材料。
本發(fā)明中所述互溶指兩種液體能以任何比例互相溶解的現(xiàn)象，因此所述“不與水互溶的有機(jī)溶劑”，包括可部分溶于水的有機(jī)溶劑。
本發(fā)明中采用的制備方法，只涉及工業(yè)生產(chǎn)中的常規(guī)制備，便于工藝放大與應(yīng)用推廣。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所述生物可降解聚合物微囊的制備方法，具有以下優(yōu)占.^ \\\ ·
(1)相比傳統(tǒng)的復(fù)乳包埋方法，該方法的包埋過程中無機(jī)械攪拌或超聲破碎，過程更加溫和，避免生物活性物質(zhì)受損。
(2)包埋后溶液中剩余的囊芯材料可回收利用。
(3)相比較之前報(bào)道的先成球后封口的方法，本發(fā)明首次提出用復(fù)乳模板法制備開孔微球，該方法使用水相制孔，確保了生物兼容性，更加環(huán)境友好。達(dá)到了與之前報(bào)道相同的粒徑、孔徑水平，且內(nèi)腔容積更大，更有利于囊芯材料的裝載。
(4)本發(fā)明選用生物可降解的聚乳酸類作為殼層材料，通過調(diào)節(jié)制備工藝可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微球粒徑和孔徑的控制，適用于包埋多種尺度的囊芯材料。
(5)本發(fā)明在開發(fā)的過程中考慮了放大的需求，乳化和固化都是常規(guī)的生產(chǎn)方式， 適合大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1是開孔微球制備及封口工藝示意圖2是實(shí)施例1制備的PELA開孔微球的電子顯微鏡照片；
圖3是實(shí)施例1制備的PELA開孔微球的光學(xué)顯微鏡照片；
圖4是實(shí)施例1利用溶劑溶脹法封口后的PELA微囊電子顯微鏡照片；
圖5是實(shí)施例2制備的PELA開孔微球的電子顯微鏡照片；
圖6是實(shí)施例2制備的PELA開孔微球的光學(xué)顯微鏡照片；
圖7是實(shí)施例2PELA微囊包埋小分子染料AF488的激光共聚焦及光學(xué)顯微鏡照片；
圖8是實(shí)施例2利用升溫退火法封口后的PELA微囊電子顯微鏡照片；
圖9是實(shí)施例3制備的PELA開孔微球的電子顯微鏡照片；
圖10是實(shí)施例3制備的PELA開孔微球的光學(xué)顯微鏡照片；
圖11是實(shí)施例3PELA微囊包埋生物大分子AF488-BSA的激光共聚焦及光學(xué)顯微鏡照片；
圖12是實(shí)施例3利用紅外照射法封口后的PELA微囊電子顯微鏡照片；
圖13是實(shí)施例4制備的PLA開孔微球的電子顯微鏡照片；
圖14是實(shí)施例4制備的PLA開孔微球的光學(xué)顯微鏡照片；
圖15是實(shí)施例4利用紅外照射法封口后的PLA微囊電子顯微鏡照片；
圖16是實(shí)施例5制備的PELA開孔微球的電子顯微鏡照片；
圖17是實(shí)施例5制備的PELA開孔微球的光學(xué)顯微鏡照片；
圖18是實(shí)施例5PELA微囊包埋500nm熒光納米顆粒的激光共聚焦及光學(xué)顯微鏡照片；
圖19是實(shí)施例5利用溶劑溶脹法封口后的PELA微囊電子顯微鏡照片；
圖20是實(shí)施例6制備的PELA開孔微球的電子顯微鏡照片；
圖21是實(shí)施例6制備的PELA開孔微球的光學(xué)顯微鏡照片；
圖22是實(shí)施例6PELA微囊包埋2 μ m熒光顆粒的激光共聚焦及光學(xué)顯微鏡照片；
圖23是實(shí)施例6利用紅外照射法封口后的PELA微囊電子顯微鏡照片；
圖M是實(shí)施例7制備的PLGA開孔微球的電子顯微鏡照片；
圖25是實(shí)施例7制備的PLGA開孔微球的光學(xué)顯微鏡照片；
圖沈是實(shí)施例7利用紅外照射法封口后的PLGA微囊電子顯微鏡照片。
具體實(shí)施方式
為便于理解本發(fā)明，本發(fā)明列舉實(shí)施例如下。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。
實(shí)施例1
稱取200mg PELA置于試管中，加入2ml乙酸乙酯將其溶解，制成油相；配制1. 0% NaCl (w/v)水溶液，作為內(nèi)水相；配制2. 5% PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，再加入過量乙酸乙酯，搖勻，制成飽和溶液，靜置，待分層后取下清液，加入NaCl，使飽和溶液中NaCl 濃度為0. 5% (w/v)，將其作為外水相。取800μ 1內(nèi)水相加入到油相中，14000rpm均質(zhì)乳化 25s，形成初乳液；將初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均質(zhì)乳化60s，形成復(fù)乳液。
將復(fù)乳液裝入反應(yīng)瓶中，垂直混合IOmin后取下，倒入IOml去離子水中，200rpm磁力攪拌3min，進(jìn)行預(yù)固化；再將預(yù)固化產(chǎn)物倒入400ml去離子水中，500rpm磁力攪拌％iin。 所得開孔微球粒徑為1-900 μ m,過篩洗三次得到最終產(chǎn)物，平均粒徑為80 μ m，如圖2、3所7J\ ο
將開孔微球的懸濁液加入到重組人生長(zhǎng)激素水溶液中，并置于垂直混合器上，在室溫下充分混合Mh。
配制0.05% PVA (w/v)水溶液30ml，加入15ml乙酸乙酯，在200V超聲強(qiáng)度下超聲破碎乳化2min ；每超聲IOs,間隔3s。
將500 μ 1裝載有重組人生長(zhǎng)激素的開孔微球懸濁液，加入到7ml反應(yīng)瓶中，其中懸濁液濃度為IO5個(gè)/ml開孔微球；隨后加滿上述乙酸乙酯乳液，置于混合速度為40rpm的垂直混合器上。整個(gè)封口過程在室溫下進(jìn)行，20min后取下反應(yīng)瓶，倒入IOml水中固化，固化時(shí)攪拌速度為200rpm，攪拌時(shí)間為!Bmin ；最后洗去表面活性劑，得到封口后的微囊，如圖 4所示。
實(shí)施例2
稱取200mg PELA置于試管中，加入2ml乙酸乙酯將其溶解，制成油相；配制1. 5% NaCl (w/v)水溶液，作為內(nèi)水相。配制1.0% PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入過量乙酸乙酯，搖勻，制成飽和溶液，靜置，待分層后取下清液，加入NaCl，使飽和溶液中NaCl濃度為0.5% (w/v)，將其作為外水相。取600 μ 1內(nèi)水相加入到油相中，14000rpm均質(zhì)乳化 25s，形成初乳液；將初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均質(zhì)乳化60s，形成復(fù)乳液。
將復(fù)乳液裝入反應(yīng)瓶中，垂直混合20min后取下，倒入IOml去離子水中，200rpm磁力攪拌3min，進(jìn)行預(yù)固化；再將預(yù)固化產(chǎn)物倒入400ml去離子水中，500rpm磁力攪拌％iin。 所得開孔微球粒徑為10-1000 μ m,過篩洗三次得到最終產(chǎn)物，平均粒徑為40 μ m，如圖5、6 所示。
將開孔微球的懸濁液加入到水溶性熒光染料AF488當(dāng)中，并置于垂直混合器上， 在室溫下充分混合Mh。
將500 μ 1裝載有水溶性熒光染料AF488的開孔微球懸濁液，加入到7ml反應(yīng)瓶中，其中懸濁液濃度為IO5個(gè)/ml開孔微球，加滿0. 05% PVA(w/v)水溶液，置于混合速度為70rpm滾軸式混合器上，并將混合器放入44°C恒溫箱中，15min后取下樣品，置于IOml水中固化，固化時(shí)攪拌速度為200rpm，攪拌時(shí)間為;3min ；最后洗去表面活性劑，得到封口后的微囊，如圖7、8所示。
實(shí)施例3
稱取200mg PELA置于試管中，加入2ml乙酸乙酯將其溶解，制成油相；配制2. 5% NaCl (w/v)水溶液，作為內(nèi)水相。配制1.0%PVA(W/V)水溶液并置于分液漏斗中，加入過量乙酸乙酯，搖勻，制成飽和溶液，靜置，待分層后取下清液，加入NaCl，使飽和溶液中NaCl濃度為1.0% (w/v)，將其作為外水相。取600μ1內(nèi)水相加入到油相中，14000rpm均質(zhì)乳化 25s，形成初乳液；將初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均質(zhì)乳化60s，形成復(fù)乳液。
將復(fù)乳液裝入反應(yīng)瓶中，垂直混合aiiin后取下，倒入IOml去離子水中，200rpm磁力攪拌3min，進(jìn)行預(yù)固化；再將預(yù)固化產(chǎn)物倒入400ml去離子水中，500rpm磁力攪拌％iin。 所得開孔微球粒徑為20-800 μ m,過篩洗三次得到最終產(chǎn)物，平均粒徑為60 μ m，如圖9、10 所示。
將開孔微球的懸濁液加入到經(jīng)AF488標(biāo)記的BSA溶液當(dāng)中，在室溫下置于垂直混合器上充分混合24h所示。
將500 μ 1裝載有經(jīng)AF488標(biāo)記的BSA的開孔微球懸濁液，加入到7ml反應(yīng)瓶中， 其中懸濁液濃度為IO5個(gè)/ml開孔微球，加滿0. 05% PVA(w/v)水溶液，置于混合速度為 70rpm滾軸式混合器上，上方放置紅外燈，調(diào)節(jié)紅外燈與樣品距離，使照射到樣品的光強(qiáng)為 110ymol/m2/S，lh后取下樣品，自然冷卻至室溫。最后洗去表面活性劑，得到封口后的微囊，如圖11、12所示。
實(shí)施例4
稱取IOOmg PLA置于試管中，加入aiil乙酸乙酯將其溶解，制成油相；配制1.0% NaCl (w/v)水溶液，作為內(nèi)水相。配制1.0% PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入過量乙酸乙酯，搖勻，制成飽和溶液，靜置，待分層后取下清液，加入NaCl，使飽和溶液中NaCl濃度為1.0% (w/v)，將其作為外水相。取800μ1內(nèi)水相加入到油相中，14000rpm均質(zhì)乳化 25s，形成初乳液；將初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均質(zhì)乳化60s，形成復(fù)乳液。
將復(fù)乳液裝入反應(yīng)瓶中，垂直混合ailin后取下，倒入IOml去離子水中，200rpm磁力攪拌3min，進(jìn)行預(yù)固化；再將預(yù)固化產(chǎn)物倒入400ml去離子水中，500rpm磁力攪拌％iin。 所得開孔微球粒徑為30-1000 μ m，過篩洗三次得到最終產(chǎn)物，平均粒徑為70 μ m，如圖13、 14所示。
將500 μ 1開孔微球懸濁液，加入到7ml反應(yīng)瓶中，其中懸濁液濃度為IO5個(gè)/ml開孔微球，加滿0. 05 % PVA (w/v)水溶液，置于混合速度為70rpm滾軸式混合器上，上方放置紅外燈，調(diào)節(jié)紅外燈與樣品距離，使照射到樣品的光強(qiáng)為130ymOl/m2/s，lh后取下樣品，自然冷卻至室溫。最后洗去表面活性劑，得到封口后的微囊，如圖15所示。
實(shí)施例5
稱取50mg PELA置于試管中，加入aiil乙酸乙酯將其溶解，制成油相；配制1.0% NaCl (w/v)水溶液，作為內(nèi)水相。配制1.0% PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入過量乙酸乙酯，搖勻，制成飽和溶液，靜置，待分層后取下清液，加入NaCl，使飽和溶液中NaCl濃度為0. (w/v)，將其作為外水相。取700 μ 1內(nèi)水相加入到油相中，14000rpm均質(zhì)乳化25s，形成初乳液；將初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均質(zhì)乳化60s，形成復(fù)乳液。
將復(fù)乳液裝入反應(yīng)瓶中，垂直混合IOOmin后取下，倒入410ml去離子水中，500rpm 磁力攪拌細(xì)in，進(jìn)行固化。所得開孔微球粒徑為1-900 μ m，過篩洗三次得到最終產(chǎn)物，平均粒徑為80 μ m，如圖16、17所示。
將開孔微球的懸濁液加入500nm熒光納米顆粒懸濁液當(dāng)中，并置于垂直混合器上，在室溫下充分混合Mh。
配制0.05% PVA (w/v)水溶液30ml，加入15ml乙酸乙酯，在200V超聲強(qiáng)度下超聲破碎乳化2min ；每超聲IOs,間隔3s。
將500 μ 1裝載有500nm熒光納米顆粒的開孔微球懸濁液，加入到7ml反應(yīng)瓶中，其中懸濁液濃度為IO5個(gè)/ml開孔微球；隨后加滿上述乙酸乙酯乳液，置于混合速度為 40rpm的垂直混合器上。整個(gè)封口過程在室溫下進(jìn)行，35min后取下反應(yīng)瓶，倒入IOml水中固化，固化時(shí)攪拌速度為200rpm，攪拌時(shí)間為^iin ；最后洗去表面活性劑，得到封口后的微囊，如圖18、19所示。
實(shí)施例6
稱取200mg PELA置于試管中，加入2ml乙酸乙酯將其溶解，制成油相；配制2. 5% NaCl (w/v)水溶液，作為內(nèi)水相。配制3.5%PVA(W/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入過量乙酸乙酯，搖勻，制成飽和溶液，靜置，待分層后取下清液，加入NaCl，使飽和溶液中NaCl濃度為1.0% (w/v)，將其作為外水相。取500μ1內(nèi)水相加入到油相中，14000rpm均質(zhì)乳化 25s，形成初乳液；將初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均質(zhì)乳化60s，形成復(fù)乳液。
將復(fù)乳液裝入反應(yīng)瓶中，垂直混合證后取下，倒入IOml去離子水中，200rpm磁力攪拌:3min，進(jìn)行預(yù)固化；再將預(yù)固化產(chǎn)物倒入400ml去離子水中，500rpm磁力攪拌％iin。所得開孔微球粒徑為10-600 μ m,過篩洗三次得到最終產(chǎn)物，平均粒徑為50 μ m，如圖20、21所7J\ ο
將開孔微球的懸濁液加入到2 μ m熒光顆粒懸濁液當(dāng)中，并置于垂直混合器上，在室溫下充分混合Mh。
將500 μ 1裝載有2 μ m熒光顆粒的開孔微球懸濁液，加入到7ml反應(yīng)瓶中，其中懸濁液濃度為IO5個(gè)/ml開孔微球，加滿0. 05% PVA (w/v)水溶液，置于混合速度為70rpm滾軸式混合器上，上方放置紅外燈，調(diào)節(jié)紅外燈與樣品距離，使照射到樣品的光強(qiáng)為130 μ mol/ m2/s，lh后取下樣品，自然冷卻至室溫。最后洗去表面活性劑，得到封口后的微囊，如圖22、 23所示。
實(shí)施例7
稱取200mg PELA置于試管中，加入2ml乙酸乙酯將其溶解，制成油相；配制2. 5% NaCl (w/v)水溶液，作為內(nèi)水相。配制1. 5% PVA(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入過量乙酸乙酯，搖勻，制成飽和溶液，靜置，待分層后取下清液，加入NaCl，使飽和溶液中NaCl濃度為1.0% (w/v)，將其作為外水相。取500μ1內(nèi)水相加入到油相中，14000rpm均質(zhì)乳化 25s，形成初乳液；將初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均質(zhì)乳化60s，形成復(fù)乳液。
將復(fù)乳液裝入反應(yīng)瓶中，垂直混合證后取下，倒入IOml去離子水中，200rpm磁力攪拌:3min，進(jìn)行預(yù)固化；再將預(yù)固化產(chǎn)物倒入400ml去離子水中，500rpm磁力攪拌％iin。所得開孔微球粒徑為10-600 μ m,過篩洗三次得到最終產(chǎn)物，平均粒徑為50 μ m，如圖M、25所1不。
將500 μ 1開孔微球懸濁液，加入到7ml反應(yīng)瓶中，其中懸濁液濃度為IO5個(gè)/ml開孔微球，加滿0. 05 % PVA (w/v)水溶液，置于混合速度為70rpm滾軸式混合器上，上方放置紅外燈，調(diào)節(jié)紅外燈與樣品距離，使照射到樣品的光強(qiáng)為140ymOl/m2/s，lh后取下樣品，自然冷卻至室溫。最后洗去表面活性劑，得到封口后的微囊，如圖沈所示。
實(shí)施例8
稱取200mg PLGA置于試管中，加入5ml氯仿將其溶解，制成油相；配制2. 5 % KCl (w/v)水溶液，作為內(nèi)水相。配制1.5%十二烷基硫酸鈉(w/v)水溶液并置于分液漏斗中，加入過量氯仿，搖勻，制成飽和溶液，靜置，待分層后取下清液，加入KCl，使飽和溶液中 KCl濃度為1. 0% (w/v)，將其作為外水相。取500 μ 1內(nèi)水相加入到油相中，14000rpm均質(zhì)乳化25s，形成初乳液；將初乳液倒入15ml外水相中，4000rpm均質(zhì)乳化60s，形成復(fù)乳液。
將復(fù)乳液裝入反應(yīng)瓶中，垂直混合證后取下，倒入IOml去離子水中，200rpm磁力攪拌:3min，進(jìn)行預(yù)固化；再將預(yù)固化產(chǎn)物倒入400ml去離子水中，500rpm磁力攪拌％iin。所得開孔微球粒徑為10-500 μ m,過篩洗三次得到最終產(chǎn)物，平均粒徑為70 μ m。
將開孔微球的懸濁液加入到經(jīng)AF488標(biāo)記的BSA溶液當(dāng)中，在40°C下置于超聲振蕩下充分混合1 所示。
將500 μ 1開孔微球懸濁液，加入到7ml反應(yīng)瓶中，其中懸濁液濃度為IO5個(gè)/ml開孔微球，加滿0.05%十二烷基硫酸鈉(w/v)水溶液，置于混合速度為70rpm滾軸式混合器上，采用控溫箱加熱到微球玻璃化溫度以上，保持2小時(shí)，自然冷卻至室溫。最后洗去表面活性劑，得到封口后的微囊。
申請(qǐng)人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程， 但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)工藝設(shè)備和工藝流程才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)， 對(duì)本發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種生物可降解材料微囊的制備方法，包括以下步驟(1)配制油相，所述油相為聚合物膜材溶液，其中溶劑為有機(jī)溶劑；配制內(nèi)水相溶液和外水相溶液，外水相添加表面活性劑；(2)將內(nèi)水相分散到油相當(dāng)中，形成油包水初乳液；再將初乳液分散到外水相中，形成水包油包水復(fù)乳液；(3)利用溶劑去除法，使油相固化，得到具有內(nèi)外貫穿孔道的開孔微球；(4)將開孔微球的懸濁液加入到囊芯材料溶液當(dāng)中，充分混合，得到已裝填具有囊芯材料的開孔微球；(5)開孔微球的封口，得到聚合物微囊。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中所述聚合物膜材優(yōu)選為聚乳酸、 聚(乳酸-羥基乙酸)、單甲氧基聚乙二醇聚乳酸共聚物中的1種或至少2種的組合；優(yōu)選地，步驟(1)中所述有機(jī)溶劑為揮發(fā)性且不與水互溶的有機(jī)溶劑，例如正丁醇、 甲乙酮、乙醚、氯仿、四氯甲烷、甲苯等，包括揮發(fā)性且可部分溶于水的有機(jī)溶劑，例如乙酸乙酯、苯酚等，進(jìn)一步優(yōu)選為不與水互溶的醇、酮、酯、醚、烷基苯、鹵代烷烴、鹵代芳烴中的1 種或至少2種的組合，特別優(yōu)選為醇、酯、烷基苯、氯代烷烴、氯代芳烴中的1種或至少2種的組合。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述溶劑去除法優(yōu)選為溶劑萃取法，也可以是靜置使溶劑揮發(fā)，或攪拌使溶劑揮發(fā)或其他去除溶劑的方法；步驟(3)所述的具有內(nèi)外貫穿孔道的開孔微球，為單孔或多孔結(jié)構(gòu)；優(yōu)選地，步驟(3)中，使油相固化后，除去殘留的表面活性劑，特別優(yōu)選通過過篩或離心洗滌除去殘留的表面活性劑；步驟(5)所制備的聚合物微囊，為單一內(nèi)腔或多腔室結(jié)構(gòu)。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(4)中所述囊芯材料溶液優(yōu)選包括囊芯材料懸濁液和囊芯材料溶液；步驟(4)中所述開孔微球懸濁液溶劑為可分散但不溶解微球的溶劑；優(yōu)選地，步驟(4)中所述混合溫度為40°C以下，進(jìn)一步優(yōu)選為30°C以下，特別優(yōu)選為室優(yōu)選地，步驟中所述混合時(shí)間為15小時(shí)以上，進(jìn)一步優(yōu)選為20小時(shí)以上，更優(yōu)選為M小時(shí)以上，特別優(yōu)選為M小時(shí)。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟(5)所述開孔微球的封口工藝，包括以下三種方法(i)溶劑溶脹法； ( )照射法； (iii)升溫退火法。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，方法(i)中所述溶劑溶脹法為將有機(jī)溶劑添加到含有表面活性劑的水溶液中，并使其均勻分散于水相中，將已裝填具有囊芯材料的開孔微球加入，充分混合，轉(zhuǎn)移到水溶液中固化，得到封口后的微囊；優(yōu)選地，方法(i)中所述有機(jī)溶劑為揮發(fā)性且不與水互溶的有機(jī)溶劑，例如正丁醇、 甲乙酮、乙醚、氯仿、四氯甲烷、甲苯等，包括揮發(fā)性且可部分溶于水的有機(jī)溶劑，例如乙酸乙酯、苯酚等，進(jìn)一步優(yōu)選為不與水互溶的醇、酮、酯、醚、烷基苯、鹵代烷烴、鹵代芳烴中的1 種或至少2種的組合，特別優(yōu)選為醇、酯、烷基苯、氯代烷烴、氯代芳烴中的1種或至少2種的組合；優(yōu)選地，方法(i)中采用超聲、均質(zhì)或機(jī)械攪拌的方法使有機(jī)溶劑均勻分散于水相中， 特別優(yōu)選采用超聲方法，例如采用超聲細(xì)胞破碎儀。
7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，方法(i)中所述混合方式為持續(xù)攪拌、超聲或震蕩，保持微球的懸浮狀態(tài)，特別優(yōu)選置于垂直混合器上混合；優(yōu)選地，方法(i)中固化后，洗滌，得到封口后的微囊，特別優(yōu)選采用過篩洗滌；優(yōu)選地，方法(i)中所述固化可在靜置或攪拌狀態(tài)下進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，方法(ii)中所述照射法為將載有囊芯材料的開孔微球加入到含有表面活性劑的水溶液中，充分混合，采用紫外線或可見光或紅外線光源照射微球懸濁液，一段時(shí)間后，降溫，得到封口后的微囊；優(yōu)選地，方法(ii)中所述混合方式為持續(xù)攪拌、超聲或震蕩，保持微球的懸浮狀態(tài)，特別優(yōu)選采用滾軸式混合器；優(yōu)選地，方法(ii)中所述照射為紅外線照射；優(yōu)選地，方法(iii)中所述升溫退火法為將載有囊芯材料的開孔微球加入到含有表面活性劑的水溶液中，混合并升溫至微球的玻璃化溫度以上，一段時(shí)間后，緩慢降溫，洗去表面活性劑，得到封口后的微囊；優(yōu)選地，方法(iii)中所述混合方式為持續(xù)攪拌、超聲或震蕩，保持微球的懸浮狀態(tài)， 特別優(yōu)選采用滾軸式混合器；優(yōu)選地，方法(iii)中所述升溫采用控溫箱或微波加熱方式。
9.一種如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述方法制備的生物可降解材料微囊，其特征在于，所述生物可降解材料微囊直徑為1-1000微米，膠囊殼層材料為生物可降解材料，為單一內(nèi)腔或多腔室結(jié)構(gòu)。
10.一種如權(quán)利要求9所述的生物可降解材料微囊的用途，其特征在于，所述生物可降解材料微囊可用于包埋小分子、生物大分子物質(zhì)，還可以裝載納米、微米級(jí)尺寸的顆粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種生物可降解聚合物微囊的制備方法，主要包括開孔微球的制備、囊芯材料的裝填和開孔微球的封口。所述生物可降解材料微囊可用于包埋小分子、生物大分子物質(zhì)，還可以裝載納米、微米級(jí)尺寸的顆粒。相比傳統(tǒng)的復(fù)乳包埋方法，該方法更加溫和，避免生物活性物質(zhì)受損；包埋后溶液中剩余的囊芯材料可回收利用；更加環(huán)境友好，達(dá)到了與之前報(bào)道相同的粒徑、孔徑水平，且內(nèi)腔容積更大，更有利于囊芯材料的裝載；適合大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)B01J13/02GK102489230SQ201110401710
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者蘇志國(guó), 那向明, 馬光輝, 高飛 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院過程工程研究所