專利名稱：一種海膽狀核-殼型Fe₃O₄@TiO₂磁性微球及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于無機(jī)材料和分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海膽狀核-殼型的Fe3O4SlTiO2M性微球及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提出的磁性微球，可作為一種親和探針對含復(fù)雜肽段生物樣品中痕量磷酸化肽實現(xiàn)高選擇性富集，并結(jié)合MALD1-T0F/MS對富集到的磷酸化多肽進(jìn)行分析和鑒定。該材料在蛋白組學(xué)等領(lǐng)域有良好的實用價值和應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)的磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要方式之一，在細(xì)胞中蛋白質(zhì)的磷酸化是一種普遍的現(xiàn)象，這些磷酸化的蛋白在細(xì)胞信號傳導(dǎo)，細(xì)胞分化和細(xì)胞生長等生命過程起著重要調(diào)節(jié)作用。因此對于磷酸化蛋白的結(jié)構(gòu)鑒定和磷酸化水平的分析對于解釋蛋白磷酸化如何調(diào)節(jié)生命過程具有十分重要的意義。近年來，生物質(zhì)譜已經(jīng)成為磷酸化蛋白結(jié)構(gòu)解析的有力工具。然而，由于磷酸化肽段豐度低且在質(zhì)譜分析中的離子化效率相對較差，樣品中非磷酸化肽段信號嚴(yán)重干擾了磷酸化肽段的檢測。因此，在質(zhì)譜分析之前對磷酸化肽段進(jìn)行選擇性富集是非常必要的。目前，在磷酸化多肽富集領(lǐng)域最為典型的兩種技術(shù)是固定金屬親和色譜和金屬氧化物柱色譜。人們將不同的金屬離子，比如鈦，鋯，鐵，鎳等固定于不同的柱基質(zhì)上，尤其于近年來和整體柱填料結(jié)合解決了大部分磷酸化多肽富集問題。但是該法除了樹脂固有“孔洞效應(yīng)”造成富集到的磷酸化多肽無法被檢測外，一般由于金屬離子通過螯合技術(shù)鍵合在樹脂表層，作用力 薄弱，在反復(fù)使用過程中容易造成金屬離子流失，富集能力下降。此外，整體柱型固定離子親和色譜多借助液相色譜泵來促使樣品溶液，淋洗液和洗脫液通過親和基質(zhì)，使得整個預(yù)處理過程十分繁瑣。金屬氧化物表現(xiàn)出的高親和性能和穩(wěn)定性越來越贏得人們的青睞。一度人們熱衷于制備各種氧化物的微球，像氧化鋯，氧化鈦，氧化鐵以及一些氧化物的復(fù)合粒子。不過這些氧化物微球多采用裝填成柱子或者直接離心分離的方法用于磷酸化肽段的分離富集。但是，裝柱多涉及平衡，上樣，淋洗，洗脫及脫鹽等處理過程，使用相對復(fù)雜繁瑣；使用高速離心可能高質(zhì)量的非磷酸化肽段和磷酸化肽段共沉淀下來而造成部分低含量磷酸化多肽漏檢。近年來,磁性納米粒子以高比表面積，易表面修飾和快速的外磁場響應(yīng)，易回收等優(yōu)越性能已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于核磁成像，催化，傳感，疾病治療，富集等領(lǐng)域。逐步的人們將磁性粒子與磷酸化多肽的親和基團(tuán)，諸如金屬離子和金屬氧化物相結(jié)合，形成獨特的核-殼型復(fù)合材料，應(yīng)用于磷酸化多肽選擇性富集領(lǐng)域，尤為突出的是，磁性材料經(jīng)過富集后可以直接點靶進(jìn)行MALDI分析，無需洗脫，因此大大簡化了整個樣品預(yù)處理過程。但是，現(xiàn)有的金屬氧化物磁性材料比表面積偏小，表層親和位點不足，造成磷酸化肽段富集效果不是太理想。因此，合成高比表面積的包覆金屬氧化物型的磁性材料，對于實現(xiàn)高效、快速磷酸化肽段的選擇性富集中有重要意義。一維納米棒具有較高的表面積/體積比，相對為球體而言能提供更對的活性位點。從一定意義上講，提高了相互作用的比表面積。本發(fā)明提供的海膽狀核一殼型的磁性微球集合了磁性材料快速外磁場響應(yīng)和金屬氧化物穩(wěn)定性的優(yōu)點，具有很高的比表面積，不但簡化了磷酸化多肽富集過程，提高了富集通量，而且這種合成方法更為新型磁性材料的合成提供了新思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種海膽狀核-殼型Fe3O4STiO2磁性微球及其制備方法和應(yīng)用?！N海膽狀核-殼型的Fe3O4SlTiO2磁性微球,于四氧化三鐵磁性微球表面包裹一層SiO2材料層，形成核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4SSiO2磁性微球材料，然后在核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4SSiO2磁性微球材料表面制備一層TiO2納米棒，形成海膽狀結(jié)構(gòu)；其中，四氧化三鐵磁性微球的粒徑為150-350nm，中間層氧化硅層的厚度為30_60nm，外層海膽狀TiO2納米棒的直徑50-100nm,長度 200-500nm。該發(fā)明所述的海膽狀核-殼型Fe3O4STiO2磁性微球的具體合成方法是:通過溶劑熱還原法合成四氧化三鐵超順磁微球，之后用正硅酸四乙酯通過溶膠凝膠法包覆一層二氧化硅，以酞酸丁酯為鈦源于表層沉積一層銳鈦礦納米晶，最后通過水熱生長法在磁球表層形成金紅石納米棒。具體合成方法如下:第一步用溶劑熱還原法合成Fe3O4磁性微球:以1-1.5gFeCl3.6H20為原料，用40-60mL乙二醇作分散劑，加入3-5g乙酸鈉和l_2g聚乙二醇，反應(yīng)溫度為200°C，反應(yīng)時間為6-12小時，得到Fe3O4磁性微球。第二步首先將Fe3O4磁性微球分別用水和乙醇反復(fù)超聲清洗以除去表層吸附雜質(zhì)，干燥后取20-50mg Fe3O4磁性微球重新分散在體積比1: 4的20-50 mL水/乙醇溶液中，再加入質(zhì)量濃度10%氨水3-6mL，在30-60°C攪拌條件下逐滴加入正硅酸乙酯200-500 μ L，反應(yīng)2-8小時；經(jīng)過水和乙醇分別清洗之后得到Fe3O4SSiO2M性微球。第三步在Fe3O4SSiO2微球表面沉積銳鈦礦晶種:將2)得到的Fe3O4SSiO2M性微球浸泡于10-20mL質(zhì)量濃度5-20%聚乙烯亞胺水溶液中，超聲處理表面10分鐘以上，然后靜置10-15小時。取出處理過的材料15-25 mg，經(jīng)過水清洗后重新懸浮在體積比1: 9的15-30mL水/乙醇溶液中，加入15 μ L質(zhì)量濃度0.02-0.05%稀鹽酸水溶液攪拌，以改變磁球表面的Z-電位為正，3-8 mL酞酸丁酯乙醇稀釋溶液在攪拌條件下逐滴加入，酞酸丁酯與乙醇的體積比1: 25-1: 40 ;之后在70-100°C之間回流1-3小時；經(jīng)過乙醇和水清洗若干次后，表層氧化鈦低聚物通過4 5 0-5 5 (TC高溫煅燒而形成銳鈦礦晶種；第四步生成具有海膽狀核-殼的Fe3O4STiO2磁性微球顆粒:步驟3)得到的材料2-10mg經(jīng)過超聲均一分散在30 mL質(zhì)量濃度10-20%鹽酸水溶液中，之后含磁球的懸浮液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在80-120°C之間高溫反應(yīng)6-12小時；反應(yīng)過后反應(yīng)釜自然冷卻到室溫，取出固體產(chǎn)物，固體產(chǎn)物用水和乙醇分別洗若干次后干燥。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點:該材料是以氧化鈦為主體的材料，中間的磁核能提供足夠的磁場響應(yīng)，同時避免了以往以磁核為主材料氧化層薄、比表面積小的缺點。由于納米棒的各向異性生長，對于混合體系中磷酸化多肽的捕獲十分有利。該材料在磷酸化多肽富集過程中展現(xiàn)了很高的選擇性和富集能力，在蛋白組學(xué)領(lǐng)域具有良好的實用前景和應(yīng)用價值。
本發(fā)明的產(chǎn)品能高效、處理過程簡單地對痕量磷酸化肽段進(jìn)行特異性捕獲。


圖1是實施例1制備過程中不同階段的透射電鏡圖。(a)溶劑熱法合成的四氧化三鐵微球。(b) Fe3O4SSiOjS殼結(jié)構(gòu)微球。(c)在Fe3O4SSiO2表面沉積一層銳鈦礦晶種。(d)海膽狀核-殼型Fe3O4STiO2微球。兩個插圖分別是納米棒的局部放大圖和選區(qū)電子能量衍射圖。從圖中可以觀測到材料具有較好的分散性和均一的包覆性，銳鈦礦晶種在Fe3O4SSiO2表面良好的分散，水熱生長之后，由高度晶化的納米粒子組成金紅石型的納米棒。圖2是實施例1納米棒生長前后磁性材料的掃描電鏡圖。(a)沉積銳鈦礦晶種的Fe3O4SSiO2微球。(b)海膽狀核-殼型Fe3O4STiO2微球。由圖可知，材料經(jīng)過水熱生長之后，銳鈦礦晶種長成納米棒，在材料表面具有較好的生長取向。圖3是實施例1納米棒生長前后磁性材料的X射線衍射圖。(a)沉積銳鈦礦晶種的Fe3O4SSiO2微球。(b)海膽狀核-殼型Fe3O4STiO2微球。前后對比圖可以得知，在水熱生長過程中，銳鈦礦型納米粒子轉(zhuǎn)變成金紅石型的納米棒。圖4是實施例2用該海膽狀核-殼型的材料處理a -casein胰蛋白酶解混合多肽溶液前后的MALD1-TOF/MS圖。處理前溶液的濃度是4 X liTmol/L。比較處理前的(a)圖和處理后的(b)圖可知該材料具有很強(qiáng)的選擇性。圖5是實施例3用海膽狀核-殼型的材料處理更低濃度的a -casein胰蛋白酶解混合多肽溶液的MALD1-T0F/MS圖。處理前溶液的濃度是2 X 10_9mOl/L.處理前后的對比可以得知該材料具有優(yōu)良的富集能力。
具體實施例方式通過具體實例對本發(fā)明海膽狀核-殼型的磁性材料用于多肽混合溶液中磷酸化多肽的選擇性富集過程進(jìn)行細(xì)致闡述.
實施例1.海膽狀核-殼型的Fe3O4STiO2磁性材料合成。整個合成反應(yīng)分成四步:第一步，用溶劑熱還原法合成Fe3O4超順磁性微球:1.35gFeCl3.6H20加入到40mL乙二醇中，攪拌至溶液澄清。加3.6g乙酸鈉和Ig聚乙二醇(4000-6000)，充分?jǐn)嚢柚寥芤壕鶆?。將溶液轉(zhuǎn)移至50mL反應(yīng)釜，升高溫度至200°C，反應(yīng)8小時。待自然冷卻之后用水和乙醇超聲清洗若干次。最后產(chǎn)物在60°C條件下干燥備用。第二步，采用溶膠凝膠法合成具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4S SiO2磁性微球:首先對由步驟一制得的Fe3O4磁性微球30mg在超聲條件下重新分散在40mL I: 4水/乙醇溶液中，再加入5mL10%氨水。在40°C條件下攪拌10分鐘，逐滴加入正硅酸乙酯300 μ L，經(jīng)過反應(yīng)3小時，磁性材料用磁場收集，經(jīng)過水和乙醇清洗之后得到Fe3O4SSiO2磁性微球。第三步，在Fe3O4SlSiO2微球表面沉積銳鈦礦晶種。步驟二得到的Fe3O4S SiO2磁性微球用IOmL 10%聚乙烯亞胺超聲處理表面30min，靜置過夜。處理過的材料經(jīng)過水清洗重新懸浮在20mL水/乙醇(I: 9v/v)溶液中，加入10 μ L稀鹽酸水溶液(I: 1000ν/ν)攪拌20min至體系均一。之后5mL體積比為1: 25酞酸丁酯乙醇稀釋溶液在常溫持續(xù)攪拌條件下逐滴加入。至滴加結(jié)束十分鐘后體系溫度升高至85°C回流1.5小時。重復(fù)酞酸丁酯乙醇加入反應(yīng)和回流步驟一次以使得表層氧化鈦低聚物達(dá)適宜量.反應(yīng)過后的磁性材料經(jīng)過乙醇和水超聲清洗，60°C干燥6小時。在氮氣保護(hù)條件下500°C高溫煅燒一小時而形成銳鈦礦晶種。最后，生成具有海膽狀核-殼的Fe3O4STiO2磁性微球顆粒:步驟三得到的材料約5mg經(jīng)過超聲均一分散在30mL 9.3%濃鹽酸的水溶液中，之后含磁球的懸浮液轉(zhuǎn)移至50mL反應(yīng)釜中，在110°C條件下高溫反應(yīng)11小時。反應(yīng)過后反應(yīng)釜自然冷卻到室溫，材料經(jīng)過外磁場控制，用水和乙醇洗若干次，60°C干燥。該種磁性材料比表面積大，具有快速的外部磁場響應(yīng),對生物樣品中痕量磷酸化多肽選擇性富集時處理簡單、特異性強(qiáng)。該材料在蛋白組學(xué)等領(lǐng)域有良好的實用價值和應(yīng)用前景。實施例2.選擇性富集復(fù)雜多肽混合液中的磷酸化多肽和基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜分析。(I) a -casein蛋白酶解液制備。a -casein溶解在pH = 8的碳酸氫銨緩沖溶液中形成lmg/ml的溶液，按重量分?jǐn)?shù)為2.5%比例加入胰蛋白酶，于37°C條件下進(jìn)行酶解18小時后終止，得到的多肽混合溶液用含50%乙腈的0.1 %三氟乙酸水溶液稀釋至濃度為4X 10 7mol/L。(2)磷酸化多肽的選擇性富集和MALD1-T0F/MS分析。5 μ L IOmg/mL的實施例1制備的海膽狀核-殼型Fe3O4SlTiO2微球水溶液加入到200 μ L濃度為4X10_7mol/L的a -casein胰蛋白酶解混合多肽溶液中，渦旋震蕩3分鐘進(jìn)行磷酸化多肽的捕獲。之后用磁場控制分離上清，所得的磁性材料用100 μ L含50%乙腈的0.1%三氟乙酸水溶液進(jìn)行非特異性吸收物質(zhì)的清洗，每次渦旋30秒之后去上清。最后磁性材料用IOyL 2%的氨水在渦旋振動條件下洗脫3分鐘。取洗脫液0.5 μ L點在MALD1-TOF/MS靶板上，待自然干燥之后在滴加0.5 μ L基質(zhì)溶液?；|(zhì)溶液組成是20mg/mL的2，5-DHB (溶于70%乙腈水溶液)和I %的磷酸溶液水溶液，體積比是1:1。然后用MALD1-TOF/MS進(jìn)行分析。分析的條件為，337nm的氮脈沖激光，加速電壓20kV，正離子模式，反射式T0F/MS檢測。結(jié)果如圖4所示，說明該海膽狀核-殼型磁性材料對磷酸化多肽具有很強(qiáng)的選擇性，鑒定結(jié)果見表I。表1.MALD1-TOF/MS中檢測到的磷酸化多肽列表
權(quán)利要求
1.一種海膽狀核-殼型的Fe3O4SlTiO2磁性微球,其特征在于:四氧化三鐵磁性微球表面包裹一層SiO2，形成核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4SSiO2-性微球，之后再在Fe3O4SSiO2-性微球材料表面制備一層金紅石型TiO2納米棒,形成海膽狀結(jié)構(gòu)；其中，四氧化三鐵磁性微球的粒徑為150-350nm，中間層氧化硅層的厚度為30_60nm，外層海膽狀TiO2納米棒的直徑50-100nm,長度 200-500nm。
2.—種權(quán)利要求1所述海膽狀核-殼型的Fe3O4STiO2磁性微球的制備方法在于:1)用溶劑熱還原法合成Fe3O4磁性微球:以1-1.5gFeCl3.6H20為原料，用40_60mL乙二醇作分散劑，加入3-5g乙酸鈉和l_2g聚乙二醇，反應(yīng)溫度為200°C，反應(yīng)時間為6-12小時，得到Fe3O4磁性微球； 2)采用溶膠凝膠法合成具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4SSiO2微球:首先將Fe3O4磁性微球分別用水和乙醇反復(fù)超聲清洗以除去表層吸附雜質(zhì)，干燥后取20-50mg Fe3O4磁性微球重新分散在體積比1: 4的20-50mL水/乙醇溶液中，再加入質(zhì)量濃度10%氨水3_6mL，在30_60°C攪拌條件下逐滴加入正硅酸乙酯200-500 μ L，反應(yīng)2-8小時；經(jīng)過水和乙醇分別清洗之后得到Fe3O4SSiO2磁性微球； 3)在Fe3O4SJSiOJ^t表面沉積銳鈦礦晶種:將2)得到的Fe3O4SlSiO2磁性微球浸泡于10-20mL質(zhì)量濃度5-20 %聚乙烯亞胺水溶液中，超聲處理表面10分鐘以上，然后靜置10-15小時；取出處理過的材料15-25mg，經(jīng)過水清洗后重新懸浮在體積比1: 9的15_30mL水/乙醇溶液中，加入15 μ L質(zhì)量濃度0.02-0.05%稀鹽酸水溶液攪拌，以改變磁球表面的Z-電位為正，3-8mL酞酸丁酯乙醇稀釋溶液在攪拌條件下逐滴加入，酞酸丁酯與乙醇的體積比I: 25-1: 40 ;之后在70-100°C之間回流1-3小時；經(jīng)過乙醇和水清洗若干次后，表層氧化鈦低聚物通過450-550°C高溫煅燒而形成銳鈦礦晶種； 4)生成具有海膽狀核-殼的Fe3O4STiO2磁性微球顆粒:步驟3)得到的材料2-10mg經(jīng)過超聲均一分散在30mL質(zhì)量濃度10-20%鹽酸水溶液中，之后含磁球的懸浮液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，在80-120°C之間高溫反應(yīng)6`-12小時；反應(yīng)過后反應(yīng)釜自然冷卻到室溫，取出固體產(chǎn)物，固體產(chǎn)物用水和乙醇分別洗若干次后干燥，得產(chǎn)品。
3.—種權(quán)利要求1所述的海膽狀核-殼型的Fe3O4STiO2磁性微球作為磷酸化多肽的微吸附劑的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:直接將權(quán)利要求1所述磁性微球加入含有磷酸化肽的復(fù)合肽段混合物中震蕩，進(jìn)行痕量磷酸化多肽的分離富集。
全文摘要
本發(fā)明屬于無機(jī)材料和分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海膽狀核-殼型的磁性微球及其制備方法和在磷酸化多肽選擇性富集方面的應(yīng)用。該磁性微球是在Fe3O4磁性微球表面以溶膠凝膠法包覆一層SiO2材料，然后再沉積一層銳鈦礦晶核，最后通過水熱生長使得納米晶種在表面長成金紅石納米棒，形成具有海膽狀外形的磁性微球顆粒。該種磁性材料比表面積大，具有快速的外部磁場響應(yīng)，對生物樣品中痕量磷酸化多肽選擇性富集時處理簡單、特異性強(qiáng)。該材料在蛋白組學(xué)等領(lǐng)域有良好的實用價值和應(yīng)用前景。
文檔編號B01J20/30GK103157430SQ20111041039
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者許國旺, 李華, 石先哲, 單圓鴻 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所