專利名稱：一種用于富集循環(huán)腫瘤細胞的納米磁性免疫微球制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學領(lǐng)域，具體涉及一種富集循環(huán)腫瘤細胞的納米磁性免疫微球的制備及其使用方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)腫瘤細胞微轉(zhuǎn)移的途徑，在血液或淋巴管中循環(huán)的腫瘤細胞稱為循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)，由若干循環(huán)腫瘤細胞聚集形成的細胞團塊被稱為循環(huán)腫瘤微栓(circulating tumor microemboli，CTM)。CTM是腫瘤細胞的“集體遷移”行為，因其能夠抵抗細胞凋亡、保持細胞增殖能力而具有更高的轉(zhuǎn)移潛能。由于循環(huán)腫瘤細胞在血液或淋巴液中含量非常少以及缺乏有效的特異性標志物，有關(guān)CTC的研究進展比較緩慢。 現(xiàn)有的分離、檢測技術(shù)方法各有利弊，至今尚未有一個統(tǒng)一的實驗方案和標準。CTC在外周血中的含量極少，每IOml血液中可能僅含少數(shù)幾個CTC或CTM，而IOml 血液則含有大約1億個白細胞和500億個紅細胞。因此，只有首先對臨床血樣中的CTC進行富集，然后才能進行檢測和生物學性質(zhì)與基因分析?，F(xiàn)有的富集CTC的方法通常有三種1)梯度密度離心法即依據(jù)細胞沉降系數(shù)不同而進行分離。2)過濾法8μπι孔徑的聚碳酸酯膜可使較小的淋巴細胞和中性粒細胞通過，而較大的腫瘤細胞則被阻滯在膜上。該方法不僅操作簡單，而且比較敏感，可避免煩瑣的多步驟分離造成的稀少細胞的破壞和丟失。3)免疫磁性分離法這是目前最為常用的CTC富集方法。針對上皮細胞抗原EpCAM、BerEP4、CK或器官特異性標志物(如mammoglobul in、 PSA、CEA和HER-2)的抗體通常被用來分離CTC，富集效率可達1 X IO4 2X IO5倍。為了進一步降低血細胞含量，提高富集效率，可以將陰性分選與陽性分選相結(jié)合。陰性分選采用的標志物通常是白細胞表達的⑶45或巨噬細胞、血小板表達的⑶61。另外，為了提高CTC 富集的特異性，最近的研究傾向于將物理分離方法和免疫磁性分離方法相結(jié)合。如先用 Ficoll-Hypaque離心分離，接著進行免疫磁性陽性、陰性分選，最后在熒光染色的基礎(chǔ)上用顯微操作技術(shù)收集高效富集的前列腺腫瘤細胞。免疫磁性分離法效率高，且在整個過中可避免細胞溶解，使目的細胞的計數(shù)成為可能。目前檢測血液中腫瘤細胞的存在可以成為癌癥早期診斷或在腫瘤活檢中幫助鑒別腫瘤是否浸潤的有力手段。腫瘤細胞微轉(zhuǎn)移的常用檢測方法包括RT-PCR技術(shù)、流式細胞技術(shù)(flow cytometry, FCM)和免疫細胞化學法(ICC)等等。RT-PCR法雖然敏感性較高， 但具有較高的假陽性率。FCM檢測方法價格昂貴而且操作起來費時費力，不能提供有關(guān)腫瘤細胞形態(tài)方面的信息，還需用腫瘤細胞特異抗體進行ICC染色，難以作為常規(guī)檢測方法應(yīng)用于臨床。ICC法具有較高的特異性，但撿出率很低。目前，免疫納米磁性微球的誕生為腫瘤細胞生物診斷提供了先進的分離手段，它具有高特異性、高濃縮性、高分離率，且不影響細胞活性等特點，國外有報道可提高分離率IO3-IO4倍(Martin et al. 1998)。

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的旨在針對循環(huán)腫瘤細胞檢測中樣品中腫瘤細胞濃度極低，不利于檢測的問題，提供一種用于循環(huán)腫瘤細胞富集的納米磁性免疫微球及其使用方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公布了一種新的納米磁性免疫微球，它以納米碳包純鐵磁性微球為內(nèi)核，連接上皮細胞特異性抗體，與循環(huán)腫瘤細胞通過抗原-抗體反應(yīng)結(jié)合在一起，對外周血中存在的腫瘤細胞進行快速富集，與免疫細胞化學方法(ICC)相結(jié)合，對患者外周血腫瘤細胞進行檢測。使檢測靈敏性提高到在5X IO7個細胞中可檢測到一個腫瘤細胞。便于發(fā)現(xiàn)早期患者隱性微轉(zhuǎn)移、監(jiān)測術(shù)后患者腫瘤復發(fā)與轉(zhuǎn)移、評估患者預后以及制定治療方案。如上所述的納米磁性微球，其特征是具有超順磁性的碳包純鐵(FeOC)納米磁性微球；如上所述的納米磁性微球，其特征是碳包純鐵可以位于磁性微球的內(nèi)部的任何地方；如上所述的納米磁性微球，其特征是磁性微球內(nèi)部可以有一個或者多個碳包純鐵顆粒。如上所述的納米磁性微球，其特征是磁性微球的基質(zhì)可以為殼聚糖、聚苯乙烯、氧化硅、殼聚糖、或者任何其他可以用于做磁性微球基質(zhì)的材料。如上所述的納米磁性微球，其特征粒徑在10nm-50nm之間的磁性顆粒，它可以是任何形狀，優(yōu)選球形；如上所述的磁性免疫微球，其特征是該磁性微球可以通過共價偶聯(lián)、疏水作用力或者是分子間作用力與抗體偶聯(lián)在一起。如上所述的納米磁性免疫微球，其特征是不僅適用于腫瘤細胞的分離，還適用于分離其它細胞或分子。如上所述的特異性抗體，其特征是能與循環(huán)腫瘤細胞表面蛋白(抗原)特異性結(jié)合的抗體，它可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還公布了一種用納米磁性免疫微球富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，其特征是納米磁性免疫微球捕獲腫瘤細胞，在磁場作用力下將與磁性免疫微球結(jié)合樣品分離，實現(xiàn)對外周血或體液中各種類型腫瘤細胞的富集。再對磁性免疫微球-腫瘤細胞復合物進行洗滌，去除殘留的細胞及細其它雜質(zhì)，最后得到高濃度的腫瘤細胞-磁性微球復合物。如上所述的富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，其特征是免疫磁性微球可以通過磁性微球表面固定的抗體與腫瘤細胞表面相應(yīng)抗原反應(yīng)，形成磁性微球-抗體-抗原復合物，從而實現(xiàn)免疫磁性微球捕獲腫瘤細胞。還可以通過如下方式進行，生物素化的抗體與循環(huán)腫瘤細胞表面相應(yīng)抗原反應(yīng)，形成生物素-抗體-腫瘤細胞復合物，再加入表面固定有親和素的磁性微球，磁性微球表面的親和素與生物素反應(yīng)，形成磁性微球-親和素-生物素-抗體-循環(huán)腫瘤細胞復合物，從而實現(xiàn)免疫磁性微球?qū)ρh(huán)腫瘤細胞的捕獲。本發(fā)明所公開的納米磁性免疫微球具有磁響應(yīng)性強，粒徑小，易于操作等特點。
具體實施例方式盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實例進行說明，但是不能認為是對本發(fā)明專利的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對本發(fā)明進行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣屬本發(fā)明的保護范圍。實施例1納米磁性微球的制備將IOOmg海藻酸鈉液溶于細1純水中，加入anl 5% !^OC磁流體溶液，42°C使之充分混勻溶解后，超聲15min，用10% Na2CO3調(diào)節(jié)混合液的pH為10左右，升溫至60°C。超聲和高速攪拌的條件下，將混合液逐滴加入到溫度為60°C的90ml AOT/正庚烷油相中，形成透明的灰黑色反相微乳體系。在超聲和攪拌的條件下將30%的4.5ml CaCl2溶液加入到微乳體系中，進行磁分離后，分別用丙酮、乙醇和蒸餾水洗滌，然后離心分選，真空冷凍干燥后保存。實施例2磁性微球-抗體偶聯(lián)物的制備取Img制備好的磁性微球，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，用0. 01mol/L PBS PH7. 0的定容到細1，加入水溶性EDC 5mg和7. 5mg suflo-NHS,充分混勻，室溫反應(yīng)15min，然后加入50mg的6-氨基己酸，室溫旋轉(zhuǎn)攪拌3h后，加入500 μ 1 (40 μ g/ml) EpCAM單克隆抗體(BD Wiarmingen，美國)，輕輕攪拌6h，以0. 2M甘氨酸溶液(含0. 2% BSA) Iml封閉，磁分離洗滌，加入儲存液4°C保存。透射電鏡觀察微球呈球形，有很好的分散性，粒徑分布于45-89nm之間，平均粒徑為56nm。利用Bradford檢測法測定納米免疫磁性微球中蛋白質(zhì)含量，每毫克免疫磁性微球可連接108. 6μ g抗體。利用免疫熒光染色，流式細胞儀檢測顯示97. 9%的納米免疫磁性微球表面連接有EpCAM抗體。實施例3乳腺癌腫瘤細胞富集與檢測每份樣品中加入納米免疫磁性微球適量，混勻后室溫旋轉(zhuǎn)攪拌30min，磁分離器分離，用PBS或生理鹽水洗滌磁性微球若干次，去除雜質(zhì)，最后將磁性微球重懸于適當?shù)囊后w中，得到濃縮的、純的循環(huán)腫瘤細胞。實施例3鏈霉親和素免疫磁性微球的制備取Img制備好的磁性微球，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，用0. 01mol/L PBS PH7. 0的定容到細1，加入水溶性EDC 5mg和7. 5mg suflo-NHS，充分混勻，室溫反應(yīng)15min，然后加入50mg的6-氨基己酸，室溫旋轉(zhuǎn)攪拌池后，加入500 μ 1 (40 μ g/ml)鏈霉親和素，輕輕攪拌他，以0. 2M甘氨酸溶液(含0. 2% BSA) Iml封閉，磁分離，洗滌，加入儲存液4°C保存。實施例4腫瘤細胞的富集往樣品中加入生物素化的抗腫瘤細胞表面抗原的抗體，混勻，靜置30min，加入適量鏈霉親和素磁性微球，渦旋混勻，室溫孵育15min，中間多次混勻，磁分離器分離，用PBS 或生理鹽水洗滌磁性微球若干次，去除雜質(zhì)，最后將磁性微球重懸于適當?shù)囊后w中，得到濃縮的、純的循環(huán)腫瘤細胞。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明公布了一種新的納米磁性免疫微球，它以納米磁性微球為內(nèi)核，連接上皮細胞特異性抗體，與循環(huán)腫瘤細胞通過抗原-抗體反應(yīng)結(jié)合在一起，對外周血中存在的腫瘤細胞進行快速富集。
2.如權(quán)利1所述的納米磁性微球，其特征是具有超順磁性的碳包純鐵(FeOC)納米磁性微球。
3.如權(quán)利1所述的納米磁性微球，其特征是活性碳包裹納米純鐵。
4.如權(quán)利1所述的納米免疫磁性微球，其特征是免疫微球內(nèi)部可以有一個或者多個納米碳包純鐵微球。
5.如權(quán)利1所述的納米磁性微球，其特征是磁性微球的基質(zhì)可以為殼聚糖、聚苯乙烯、 氧化硅、殼聚糖、或者任何其他可以用于做磁性微球基質(zhì)的材料。
6.如權(quán)利1所述的納米磁性微球，其特征粒徑在10nm-50nm之間的納米磁性顆粒，它可以是任何形狀，優(yōu)選球形。
7.如權(quán)利1所述的納米磁性微球，其特征是該磁性微球可以通過共價偶聯(lián)、疏水作用力或者是分子間作用力與抗體偶聯(lián)在一起。
8.如權(quán)利1所述的納米磁性免疫微球，其特征是不僅適用于循環(huán)腫瘤細胞的分離，還適用于其它細胞或分子的分離。
9.如權(quán)利1所述的特異性抗體，其特征是能與循環(huán)腫瘤細胞表面蛋白(抗原)特異性結(jié)合的抗體，它可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。
10.本發(fā)明還公布了一種用納米磁性免疫微球富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，其特征是免疫磁性微球捕獲腫瘤細胞，在磁場作用力下將與磁性免疫微球結(jié)合樣品分離，實現(xiàn)對外周血或體液中各種類型腫瘤細胞的富集。再對磁性免疫微球-腫瘤細胞復合物進行洗滌，去除殘留的細胞及細其它雜質(zhì)，最后得到高濃度的腫瘤細胞-磁性微球復合物。
11.如權(quán)利9所述的富集循環(huán)腫瘤細胞的方法，其特征是磁性免疫微球可以通過磁性免疫微球表面固定的抗體與腫瘤細胞表面相應(yīng)抗原反應(yīng)，形成磁性微球-抗體-抗原復合物，從而實現(xiàn)磁性免疫微球捕獲腫瘤細胞。還可以通過如下方式進行，生物素化的抗體與循環(huán)腫瘤細胞表面相應(yīng)抗原反應(yīng)，形成生物素-抗體-腫瘤細胞復合物，再加入表面固定有親和素的磁性微球，磁性微球表面的親和素與生物素反應(yīng)，形成磁性微球-親和素-生物素-抗體-循環(huán)腫瘤細胞復合物，從而實現(xiàn)磁性免疫微球?qū)ρh(huán)腫瘤細胞的捕獲。
全文摘要
本發(fā)明屬生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種富集循環(huán)腫瘤細胞的納米磁性免疫微球及其使用方法。以納米碳包純鐵磁性微球(Fe@C)為內(nèi)核，連接腫瘤細胞抗體，制備可富集循環(huán)腫瘤細胞的納米磁性免疫微球。用此磁性微球富集循環(huán)腫瘤細胞，可以有效以提高循環(huán)腫瘤細胞檢測的靈敏性。該免疫磁性微球具有磁反應(yīng)性強、易于操作等特點，可以應(yīng)用于循環(huán)腫瘤細胞的快速富集。
文檔編號B01J20/28GK102527353SQ20111043361
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月21日
發(fā)明者周漢新, 李富榮, 齊暉 申請人:深圳市老年醫(yī)學研究所