專利名稱：一種柵藻藻株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物和生物能源領(lǐng)域，涉及一種柵藻藻株及其用途。
背景技術(shù)：
隨著石油、天然氣、煤炭等化石燃料的大量使用，全球二氧化碳濃度急劇升高，導(dǎo)致氣候變暖、酸雨區(qū)域面積增大、極端天氣現(xiàn)象頻發(fā)。環(huán)境污染等問(wèn)題日益嚴(yán)重。并且隨著化石燃料的持續(xù)消耗，能源儲(chǔ)備也急劇減少。因此尋求一種綠色的可持續(xù)發(fā)展的新能源成為各國(guó)科學(xué)家研究的熱點(diǎn)。在清潔可再生能源中，以能源微藻生產(chǎn)生物柴油的研究受到人們廣泛的關(guān)注。生物柴油性質(zhì)與化石柴油接近，是最具發(fā)展?jié)摿Φ拇笞谝后w生物燃料之一。微藻光合作用效率高，生長(zhǎng)過(guò)程中吸收大 量的CO2,能有效地減少CO2的排放。有些微藻能夠利用廢棄物流中的組成成分，將其轉(zhuǎn)化成自身的生物物質(zhì)，故能有效地用于工業(yè)廢水、廢棄物質(zhì)的處理。柵藻是淡水中常見(jiàn)的浮游藻類，極喜在營(yíng)養(yǎng)豐富的靜水中繁殖。其中許多種類對(duì)有機(jī)污染物具有較強(qiáng)的耐性。柵藻在水體自凈和污水凈化中有一定作用，是有機(jī)污水氧化塘生物相中的優(yōu)勢(shì)種類。它可與細(xì)菌同時(shí)附著在水中有機(jī)物碎片和其他水生植物體上，形成膠質(zhì)層，吸附有機(jī)物。柵藻進(jìn)行光合作用時(shí)，一方面產(chǎn)生氧氣供細(xì)菌分解有機(jī)質(zhì)的需要，另一方面還可直接利用有機(jī)質(zhì)作為碳源和氮源，使水中有機(jī)物迅速降解，從而凈化水體。柵藻細(xì)胞內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)和維生素，柵藻繁殖快，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，可作為人工大量培養(yǎng)的材料。部分柵藻細(xì)胞內(nèi)能夠積累大量脂肪酸，通過(guò)人工操作，可轉(zhuǎn)化為生物柴油。申請(qǐng)?zhí)枮?00780020794.6的專利中分離到一株新的小球藻，并能應(yīng)用領(lǐng)域到多個(gè)領(lǐng)域,包括環(huán)境或工業(yè)生產(chǎn)中廢棄二氧化碳的處理、生物能源的生產(chǎn)和廢水處理。申請(qǐng)?zhí)枮?01010111834的專利中利用自分離柵藻在處理城市污水，并且耦合生產(chǎn)生產(chǎn)柴油的裝置能用于生產(chǎn)生物柴油的微藻原料。盡管如此，尚需要新的藻株，其溫度適應(yīng)范圍廣，在冬季、夏季均能夠進(jìn)行室外養(yǎng)殖；生長(zhǎng)速度快且易于收集；并且含有一定量的高附加值產(chǎn)物，可以應(yīng)用到飼料或食品行業(yè)，應(yīng)用范圍更加廣泛。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，得到了一種柵藻藻株，并且本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，該柵藻藻株能夠在較寬的溫度范圍(例如9-43°C)內(nèi)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度快且易于收集，并且能夠有效產(chǎn)生脂肪酸、類胡蘿卜素等物質(zhì)，具有在污水處理、生物柴油生產(chǎn)、以及飼料或食品行業(yè)等應(yīng)用的潛力。由此提供了下述發(fā)明:本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種柵藻藻株ENN2201A (Desmodesmus sp.),其保藏編號(hào)為CGMCC N0.5150，保藏日期為2011年8月17日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。所述的柵藻藻株ENN220IA(Desmodesmus sp.),其核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。TTAGCCATGCATGTCTAAGTATAAACTGCTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATAGTTTATTTGGTGGTACCTTCTTACTCGGAATAACCGTAAGAAATTTAGAGCTAATACGTGCGTAAATCCCGACTTCTGGAAGGGACGTATATATTAGATAAAAGGCCGACCGGGCTCTGCCCGACCCGCGGTGAATCATGATATCTTCACGAAGCGCATGGCCTTGTGCCGGCGCTGTTCCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGAGGCCTACCATGGTGGTAACGGGTGACGGAGGATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCTGATACGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATACCGGGCATTTCATGTCTGGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTA ATTCCAGCTCCA ATAGCGTATATTTA AGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCGGGTGGGTTTCAGCGGTCCGCCTATGGTGAGTACTGCTGTGGCCTTCCTTACTGTCGGGGACCTGCTTCTGGGCTTCATTGTCCGGGACAGGGATTCGGCATGGTTACTTTGAGTAAATTGGAGTGTTCAAAGCAGGCTTACGCCGTGAACATTTTAGCATGGAATAACATGATAGGACTCTGCCCTATTCTGTTGGCCTGTAGGAGTGGAGTAATGATTAAGAGGAACAGTCGGGGGCATTCGTATTTCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGAAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTGGGGGCTCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTCAACCATAAACGATGCCGACTAGGGATTGGCGGACGTTTTTGCATGACTCCGTCAGCACCTTGAGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGGAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGGTTGTCTTGTCAGGTTGATTCCGGTAACGAACGAGACCTCAGCCTTTAAATAGTCACTGTCGCTTTTTGCGGCTGGCTTTTGACTTCTTAGAGGGACAGTTGGCGTTTAGTCAACGGAAGTATGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGATGCATTCAACAAGCCTATCCCTAGCCGAAAGGCTCGGGTAATCTTTGAAACTGCATCGTGATGGGGATAGATTATTGCAATTATTAGTCTTCAACGAGGAATGCCTAGTAAGCGCAATTCATCAGATTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGGGTGTGCTGGTGAAGTGTTCGGATTGGCAATTATCGGTGGCAACACCGTCGATTGCCGAGAAGTTCATTAAACCCTCCCACCTAGAGAAGGAGAAGTCG (SEQ ID NO:3)所述的柵藻藻株ENN220IA (Desmodesmus sp.),其核苷酸序列包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
TGGGTTGGAAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTGAATATGCAAACCACAACACGCACTCTTTATTTGTGTTCGACGTTAGGTCAACACGCGCAAGCGTGTGGCCTACTAACCTACACACCATTGACCAACCATTTATCAAACCAAACTCTGAAGCTTTGGCTGCCGTTAACCGGCAGTTCTAACAAAGAACAACTCTCAACAACGGATATCTTGGCTCTCGCAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAACCATCGAATCTTTGAACGCATATTGCGCTCGACTCCTCGGAGAA
GAGCATGTCTGCCTCAGCGTCGGTTTACACCCTCACCCCTCTTCCTTAACAGGAGGCGCCTGTCGTGCTTGCTTAAGCCGGCAGCAGGGGTGGATCTGGCTCTCCCAATCGGATTCACTCTGGTTGGGTTGGCTGAAGCACAGAGGCTTAAACTGGGACCCAATTCGGGCTCAACTGGATAGGTAGCAACACCCTCGGGTGCCTACACGAAGTTGTGTCTGAGGACCTGGTTAGGAGCCAAGCAGGAAACGCGTCTCTGGCGCGTACTCTGTATTCGACCTGAGCTCAGGCAAGGCTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGGAGGAACCCCTTTT (SEQ ID NO:6) 本發(fā)明人在德陽(yáng)市中江縣凱江河取水樣，加入1/3體積的BGll培養(yǎng)基，在25°C、光照強(qiáng)度為40ymOl/m2.s的條件下培養(yǎng)5天左右，取該水樣于顯微鏡下觀察，判斷水樣中存在的主要物種。調(diào)整細(xì)胞濃度約為1000個(gè)/ml，取100 μ I水樣涂布于BGll培養(yǎng)基的固體瓊脂板上，在25°C、光照強(qiáng)度為40 μ mol/m2.s左右的條件下培養(yǎng)10天左右，即可看到單藻落長(zhǎng)出，用接種環(huán)或無(wú)菌牙簽挑取單藻落接種于BGll培養(yǎng)基中培養(yǎng)。重復(fù)此過(guò)程，直到獲得純培養(yǎng)的藻株，本發(fā)明中對(duì)其編號(hào)稱為“ENN2201A”。實(shí)施例1中給出了具體的分離篩選過(guò)程。實(shí)施例2中從形態(tài)水平和分子水平上對(duì)得到的藻株進(jìn)行了分類鑒定，并進(jìn)行了分析和比對(duì)。根據(jù)形態(tài)鑒定和分子鑒定的結(jié)果，確定ENN2201A為柵藻科(Scenedesmaceae),鏈帶藻屬(Desmodesmus)。本發(fā)明的另一方面涉及所述的柵藻藻株的培養(yǎng)方法，其包括如下的(1)-(4)中的任一項(xiàng)或多項(xiàng):(I) 所述培養(yǎng)基為淡水藻培養(yǎng)基，例如BG11、BBM、CT、SE、HB111、HB 119、或MA;(2)培養(yǎng)溫度為9_43°C ;優(yōu)選為15_40°C ;更優(yōu)選為25_30°C ；(3) pH 為 7-9 ；(4)光照為 200-1500 μ mol/m2/s。關(guān)于培養(yǎng)溫度，最佳的培養(yǎng)溫度為25_30°C，在等于高于9°C，但是小于15°C時(shí)也能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度會(huì)受一定的影響。高于40°C并小于43°C，持續(xù)2-4h下能生長(zhǎng)，見(jiàn)實(shí)施例8，但是生長(zhǎng)速度會(huì)受影響。本發(fā)明的柵藻藻株(ENN2201A)應(yīng)用范圍廣泛，包括但不限于污水處理、生物柴油生產(chǎn)、以及飼料或食品行業(yè)等等。本發(fā)明的另一方面涉及所述的柵藻藻株在處理或凈化污水中的用途；具體地，所述污水為工業(yè)廢水或城市生活污水,所述廢氣為工業(yè)廢氣。實(shí)施例8的數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的柵藻藻株能夠有效地凈化污水特別是工業(yè)廢水，例如化工廢水。本發(fā)明的再一方面涉及所述的柵藻藻株在制備生物柴油和/或油脂中的用途。術(shù)語(yǔ)“生物柴油”包括但不限于:由動(dòng)植物油脂或其廢油或者由藻類油脂制備的脂肪酸甲酯和/或脂肪酸乙酯；或者由動(dòng)植物油脂或其廢油或者由藻類油脂制備的脂肪酸單燒基酷。實(shí)施例4的數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的柵藻藻株能夠有效地生成脂肪酸。本發(fā)明的再一方面涉及所述的柵藻藻株在制備飼料中的用途；具體地，所述飼料為水產(chǎn)品飼料、畜禽飼料、或?qū)櫸镲暳纤鲲暳峡梢匀炕虿糠钟杀景l(fā)明的柵藻藻株構(gòu)成。本發(fā)明的柵藻藻株可以單獨(dú)作為飼料，也可以作為添加劑制備飼料。可以直接使用藻體，即藻粉，添加到飼料中，也可以破壁后加入。飼料的制備方法可以參考，例如:周安國(guó)主編，飼料手冊(cè)，農(nóng)業(yè)出版社，.2002;齊廣海等編著，飼料配制技術(shù)手冊(cè)，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000;韓長(zhǎng)日、吳偉雄，飼料添加劑制造技術(shù)，科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社2011-02，等等。本發(fā)明的再一方面涉及所述的柵藻藻株在制備類胡蘿卜素中的用途；具體地，所述類胡蘿卜素選自玉米黃質(zhì)、角黃素、以及胡蘿卜素中的任一種或多種。實(shí)施例7的數(shù)據(jù)顯示，本發(fā)明的柵藻藻株能夠有效地生成類胡蘿卜素。本發(fā)明還提供了如下的方法。本發(fā)明的再一方面涉及一種處理或凈化污水或廢氣的方法，包括使用本發(fā)明的柵藻藻株的步驟；具體地，所述污水為工業(yè)廢水或城市生活污水，所述廢氣為工業(yè)廢氣。本發(fā)明的再一方面涉及一種制備生物柴油和/或油脂的方法，包括使用本發(fā)明的柵藻藻株的步驟。本發(fā)明的再一方面涉及一種制備飼料的方法，包括使用本發(fā)明所述的柵藻藻株的步驟。本發(fā)明的再一方面涉及一種制備類胡蘿卜素的方法，包括使用本發(fā)明的柵藻藻株的步驟；具體地，所述類胡蘿卜素選自玉米黃質(zhì)、角黃素、以及β_胡蘿卜素中的任一種或多種。發(fā)明的有益效果I)本藻種適溫范圍廣，在低溫下養(yǎng)殖也有較好的性能，能有效增加全年養(yǎng)殖天數(shù)。2)本藻種沉降性 能良好，能有效降低藻體收集的成本，具有較高的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前
旦
-5^ O3)本藻種生長(zhǎng)速度快，含油及類胡蘿卜素，具有多方面的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用效果。


圖1:ΕΝΝ2201Α顯微鏡下形態(tài)。圖A和B中的線段代表10微米。圖2:ΕΝΝ2201Α 藻 18S 序列 Blast 結(jié)果。圖3:ENN2201A 進(jìn)化樹分析(18S)。圖4:ENN2201A 藻 ITS 序列 Blast 結(jié)果。圖5:ENN2201A 進(jìn)化樹分析(ITS)。圖6:ENN2201A在三角瓶中生長(zhǎng)結(jié)果。圖7:ENN2201A、1號(hào)藻株、2號(hào)藻株的脂肪酸含量和干重的評(píng)價(jià)結(jié)果。圖8:ENN2201A在低溫環(huán)境下生長(zhǎng)結(jié)果。生長(zhǎng)速率計(jì)算公式:v = (ml_m2) /
藻液干重，t:培養(yǎng)時(shí)間。注:接種時(shí)，三個(gè)藻株初始濃度分別為1: 0.914、2: 0.812、1.288，差距不是很大，不會(huì)對(duì)后續(xù)生長(zhǎng)有特別重大的影響。圖9:將處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ENN2201A藻種接種于50X3X50cm的板式反應(yīng)器中，以BGll培養(yǎng)基培養(yǎng)。并且，以相同條件接種兩株生長(zhǎng)較快的柵藻藻株進(jìn)行比較。圖10:ENN2201A生長(zhǎng)16天時(shí)類胡蘿卜素中各物質(zhì)含量。占干重比例:左為玉米黃質(zhì)、中為角黃素、右為胡蘿卜素。圖11:ΕΝΝ2201Α在自來(lái)水及廢水中的生長(zhǎng)情況。生物材料保藏說(shuō)明:
柵藻藻株ENN2201A(建議的分類命名為Desmodesmus sp.)，其于2011年8月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCCN0.5150，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下面的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1:篩選產(chǎn)油柵藻藻株在德陽(yáng)市中江縣凱江河取水樣，加入1/3體積的BGlI培養(yǎng)基，在25°C、光照強(qiáng)度為40 μ mol/m2.s的條件下培養(yǎng)5天左右，取該水樣于顯微鏡下觀察，判斷水樣中存在的主要物種。調(diào)整細(xì)胞濃度約為1000個(gè)/ml，取100 μ I水樣涂布于BGll培養(yǎng)基的固體瓊脂板上，在25°C、光照強(qiáng)度為40 μ mol/m2.s左右的條件下培養(yǎng)10天左右，即可看到單藻落長(zhǎng)出，用接種環(huán)或無(wú)菌牙簽挑取單藻落接種于BGll培養(yǎng)基中培養(yǎng)。重復(fù)此過(guò)程，直到獲得純培養(yǎng)的藻株。將生長(zhǎng)出的純系藻液分別在三角瓶、柱式反應(yīng)器中培養(yǎng)，定期測(cè)定干重和油脂含量，從中挑選生長(zhǎng)速度快、油脂含量高的藻株。通過(guò)此方法，獲得一藻株命名為ENN2201A。本發(fā)明所用的BGll培養(yǎng)基均如下面的表I所示。表1:BG11培養(yǎng)基配方
權(quán)利要求
1.一種柵藻藻株ENN2201A(Desmodesmus sp.)，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.5150，保藏日期為2011年8月17日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柵藻藻株ENN220IA(Desmodesmus sp.),其核苷酸序列包括SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的柵藻藻株ENN220IA(Desmodesmus sp.),其核苷酸序列包括SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求1所述的柵藻藻株的培養(yǎng)方法，其包括如下的(1)-(4)中的至少一項(xiàng): (1)所述培養(yǎng)基為淡水藻培養(yǎng)基，例如BG11、BBM、CT、SE、HB111、HB 119、或MA; (2)培養(yǎng)溫度為9-43°C;優(yōu)選為15-40°C ;更優(yōu)選為25_30°C ； (3)pH 為 7-9 ；(4)光照為200-1500 μ mol/m2/s。
5.權(quán)利要求1所述的柵藻藻株在處理或凈化污水和/或廢氣中的用途；具體地，所述污水為工業(yè)廢水或城市生活污水,所述廢氣為工業(yè)廢氣。
6.權(quán)利要求1所述的柵藻藻株在制備生物柴油和/或油脂中的用途。
7.權(quán)利要求1所述的柵藻藻株在制備飼料中的用途；具體地，所述飼料為水產(chǎn)品飼料、畜禽飼料、或?qū)櫸镲暳稀?br> 8.權(quán)利要求1所述的柵藻藻株在制備類胡蘿卜素中的用途；具體地，所述類胡蘿卜素選自玉米黃質(zhì)、角黃素、以及胡蘿卜素中的至少一種。
9.一種處理或凈化污水或廢氣的方法，包括使用權(quán)利要求1所述的柵藻藻株的步驟；具體地，所述污水為工業(yè)廢水或城市生活污水，所述廢氣為工業(yè)廢氣。
10.一種制備生物柴油和/或油脂的方法，包括使用權(quán)利要求1所述的柵藻藻株的步驟。
11.一種制備飼料的方法，包括使用權(quán)利要求1所述的柵藻藻株的步驟。
12.—種制備類胡蘿卜素的方法，包括使用權(quán)利要求1所述的柵藻藻株的步驟；具體地，所述類胡蘿卜素選自玉米黃質(zhì)、角黃素、以及胡蘿卜素中的任一種或多種。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物和生物能源領(lǐng)域，涉及一種柵藻藻株及其用途。具體地，本發(fā)明涉及一種柵藻藻株ENN2201A(Desmodesmus sp.)，其保藏編號(hào)為CGMCC No.5150，保藏日期為2011年8月17日，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。本發(fā)明的柵藻藻株能夠在較大的溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)速度快且易于收集，并且能夠有效產(chǎn)生脂肪酸、類胡蘿卜素等物質(zhì)，具有在污水處理、生物柴油生產(chǎn)、以及飼料或食品行業(yè)等應(yīng)用的潛力。
文檔編號(hào)B01D53/84GK103184156SQ201110448718
公開日2013年7月3日 申請(qǐng)日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者鄧平, 羅少敬, 陳傳紅, 吳洪, 馬建源 申請(qǐng)人:新奧科技發(fā)展有限公司