專利名稱：用于提取、濃縮和檢測分子物類的使用表面張力閥的低資源處理器的制作方法
用于提取、濃縮和檢測分子物類的使用表面張力閥的低資源處理器相關申請的交叉引用本申請要求于2010年7月16日提交的美國臨時專利申請序列號61/365，170的優(yōu)先權，其通過引用整體以并入本文。
背景技術：
1.發(fā)明領域本發(fā)明一般性地涉及診斷和檢測的領域。更特別地，本發(fā)明涉及用于評價分子相互作用的低資源處理器(1W resource processor)。具體地,本發(fā)明涉及包含被表面張力閥所分隔之多個室的裝置用于處理其上連接有篩選試劑之微珠中的用途。所述裝置允許測定各種環(huán)境和生物學樣品的內(nèi)容物。另外，可評價特異性相互作用，例如DNA-DNA相互作用、DNA-蛋白質(zhì)相互作用或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、離子-蛋白質(zhì)相互作用、酶-底物相互作用。2.相關領域討論最近的研究集中于開發(fā)用于低資源背景的基于核酸的檢測(Niemz等，2011)?；诤怂岬臋z測系統(tǒng)(如定量PCR(qPCR))因其靈敏度、特異性和相對快速的回應時間(time-to-answer)而成為特別有吸引力的用于檢測病原體的技術。PCR的有效性依賴于核酸模板的質(zhì)和量(Beuselinck等,2005)以及干擾物質(zhì)的缺乏(Radstrom等,2004)。例如，臨床樣品中存在的碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或其他未鑒定的干擾物質(zhì)都已經(jīng)顯示出抑制PCR并產(chǎn)生假陰性(Monteiro等，1997 ;Wilson，1997 ;Coiras等，2003)。除了多種干擾物質(zhì)之外，患者樣品還包含核酸酶，其直接減少存在的核酸靶標數(shù)目(Wilson，1997)。為了使假陰性最小化并且使基于核酸之診斷的效率最大化，在測試之前提取核酸并濃縮至不含干擾物質(zhì)的緩沖液中。一種傳統(tǒng)的實驗室方法使用苯酚-氯仿混合物(Chomczynski和Sacchi, 1987)。該方法高度有效,但是在今天并不常用，因為它耗費時間并且需要使用有毒的有機化學品。幾種固相提取試劑盒是可商購的，用以從患者樣品中純化DNA或RNA。這些試劑盒中有許多依賴于在乙醇和離液劑(chaotropic agent)(如硫氰酸胍(GuSCN))存在下核酸選擇性結合二氧化娃涂層表面(Avison, 2007 ;Yamada等，1990)。GuSCN還使蛋白質(zhì)污染物變性，包括可存在于樣品中的核酸酶(Chirgwin等，1979 ;MacDonald等，1987)。這些試劑盒對于低資源用途來說成本效率低，并且經(jīng)常需要使用專業(yè)的實驗室設備(例如機器人或離心機)和受過培訓的技術人員(在低資源背景中不可得)。另外，許多試劑盒涉及多個步驟，增加了樣品和操作者二者污染的機會。微流體是一種用于低資源的基于核酸之診斷的有前途的方式。最近，將微流體技術擴展以用于樣品制備已經(jīng)受到越來越多的關注(Niemz等,2011 ;Price等,2009)。這些裝置中有許多適用于與下游核酸擴增和檢測技術結合(Chen等，2010 ;Hagan等，2011)。但是，可用于核酸結合之固相的小表面積和可流過通道的有限樣品體積限制了回收核酸的總質(zhì)量(Niemz等，2011)，因此不利地影響了檢測限。
例如，尤其是隨著基于核酸的技術在低資源背景中變得越來越重要(Huggett等，2009)，用于診斷TB的跨腎(transrenaDDNA分析成為常規(guī)診斷方法(例如唾液顯微鏡法)的具有吸引力的替代方法?；颊吣驑拥腜CR分析因上述相同原因中的一些而無效。認為主要原因之一是尿樣中所含的鹽的高度變化。但是，尿液收集是完全非侵入性的。這在有限資源和技術人員的缺乏可能使得樣品收集困難的高疾病負荷背景下特別有利(Umansky和Tomei, 2006 ;Green等，2009)。另外，尿液收集提供了比其他侵入性更大的方法(例如唾液收集)大得多的樣品體積。雖然跨腎DNA以相對低的濃度(健康對象中為 6至50ng/mL (Bryzgunova等,2006))存在,但是能夠收集和測試大的體積確保了有充足的材料可用于進行精確診斷。最后，經(jīng)純化的跨腎DNA的分析可以是多重性的以同時檢測多種病原體的存在。例如，TB與HIV的共感染是撒哈拉以南非洲的常見問題(Green等，2009)。設計成診斷TB和HIV 二者的多重檢測測定對于該背景是理想的。尤其是隨著基于核酸之技術在低資源背景中變得越來越重要，用于診斷結核病的跨腎DNA分析的概念正成為常規(guī)診斷方法的具有吸引力的替代方法。因為死亡中的人細胞和微生物被分解，小核酸片段可到達血流中，隨后經(jīng)過腎進入尿液中(Botezatu等，2000)。用于分枝桿菌屬(mycobacterial)DNA的跨腎DNA片段的分析已證明它是診斷結核病的有前途的技術并且相對于常規(guī)唾液顯微鏡法提供了多個優(yōu)點(Aceti等，1999 ；Cannas等，2008 ;Gopinath和Singh，2009)。尿液收集是完全非侵入性的。這在有限資源和缺少技術人員可使得樣品收集困難的高疾病負荷環(huán)境中特別有利(Umansky和Tomei, 2006 ；Green等，2009)。另外，尿液收集提供了比唾液收集大得多的樣品體積。雖然跨腎DNA以相對低的濃度(健康對象中為 6至50ng/mL(Bryzgunova等,2006))存在,但是能夠收集和測試大體積確保了有充足的材料可用于進行精確診斷。最后，分枝桿菌屬特異性DNA序列的分析固有地比顯微鏡診斷更敏感(Huggett等,2009)。在沒有合適方法的情況下，唾液顯微鏡法仍然是目前診斷結核病的世界性標準。遺憾的是，唾液樣品收集可潛在地產(chǎn)生感染性氣溶膠，這在受過訓練的人員不可得的低資源背景中特別成問題(Cannas等，2008)。顯微鏡診斷耗費時間并且具有有限的靈敏度(Green等，2009)。但是，因為在進行任何基于核酸的診斷測試之前，在低資源背景中從尿液中純化DNA的方法不可用，所以這仍然是優(yōu)選的方法。類似的問題涉及測試其他分子物類(species)，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和碳水化合物。一般而言，“實際”樣品中包含的干擾物質(zhì)的存在使得任何目的分子物類的檢測更加困難。因此，期望快速的非侵入性的診斷技術，尤其在低資源背景中。

發(fā)明內(nèi)容
因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種處理樣品的方法，其包括(a)提供包含多個相繼的室的裝置，每一個所述室包含流體并且被表面張力閥隔開，其中第一反應室包含在其表面上有反應物的顆粒；(b)將樣品引入所述第一反應室中；(c)在足以允許所述反應物與所述樣品中的分析物反應的條件下孵育所述第一反應室；(d)將所述顆粒從所述第一反應室中運送到至少第二室中；以及(e)檢測所述分析物與所述反應物的相互作用。其他的室包括洗脫室和/或濃縮室。所述裝置可包含至少三個室，例如第一反應室、第一處理室和第一檢測室，其中所述第一處理室設置在所述第一反應室與所述第一作用室之間。所述方法還可進一步包括反轉所述顆粒的運送以將所述顆粒再引入到其已經(jīng)通過的室中。在一些實施方案中，在最終室中將靶標分子物類與所述珠分離。然后進一步分析這些靶標，例如RT-PCR或PCR反應。所述裝置可包含連續(xù)管和表面張力閥，所述閥將所述管分隔成所述多個室。所述管可由玻璃、聚合物或金屬制成。所述管可包含被聚合物包被的內(nèi)表面。所述顆粒可以是磁性顆粒、順磁性顆?；蛎芏扰c周圍流體不同的非磁性顆粒。運送可包括使磁場沿著所述管傳遞或使所述管經(jīng)受獨特的間歇磁場以實現(xiàn)所述顆粒的運動。運送可代之以包括向所述裝置施加離心力使得所述顆粒被運送通過所述多個室?；蛘撸墒褂玫兔芏攘黧w中包含的高密度珠(任選磁性的)的重力沉降，或使用由較高密度液體中包含的低密度顆粒產(chǎn)生的浮力來實施處理。所述分析物可以是蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸、重金屬、有機化合物、細菌、病毒或真菌細胞。蛋白質(zhì)是抗原、抗體或酶。所述反應物可以是抗體、抗原、螯合劑、月旨質(zhì)、碳水化合物、金屬、有機化合物、酶底物或核酸。檢測所述分析物與所述反應物的相互作用可包括FRET、比色測定、熒光測定、RT-PCR、光密度變化或折射率變化。引入可包括通過所述第一反應室的壁注射所述樣品。為了有助于引入，所述第一反應室的壁可包括有助于注射所述樣品的端口(port)。還可通過“毛細”作用加載樣品，其意指將流體轉移至一束小直徑毛細管中。所述樣品可以是生物學樣品，例如得自于患者的組織或流體樣品。所述樣品可以是環(huán)境樣品，例如土壤樣品、水樣品或植物樣品。所述顆粒的直徑可以是0.1至10微米，并且所述管的內(nèi)直徑可以是0.5至IO4微米。所述表面張力閥可包含非反應性氣體或具有低蒸汽壓或低表面張力的流體，例如非反應性氣體如空氣、二氧化碳、氮氣、氬氣、氦氣或六氟化硫，或者流體如礦物油、十二烷、1-十二烯、十三烷、油酸甲酯、乙酰苯、苯甲酸丙酯或1-甲基萘。另一個實施方案包括這樣的裝置，其包含多個相繼的室，每一個所述室包含流體并且被表面張力閥隔開。所述裝置可包含至少三個室，例如第一反應室、第一處理室和第一檢測室，其中所述第一處理室設置在所述第一反應室與所述第一作用室之間。其他室包括洗脫室和/或濃縮室。所述裝置可包含連續(xù)管和表面張力閥，所述表面張力閥將所述管分隔成所述多個室。所述管可由玻璃、聚合物或金屬制成，并且所述管的直徑可以是0.5至IO4微米。所述室可包含被聚合物包被的內(nèi)表面。所述表面張力閥可包含非反應性氣體或具有低蒸汽壓或低表面張力的流體，例如非反應性氣體如空氣、二氧化碳、氮氣、氬氣、氦氣或六氟化硫，或者流體如礦物油、十二烷、1-十二烯、十三烷、油酸甲酯、乙酰苯、苯甲酸丙酯或1-甲基萘。所述裝置可還包含含有表面反應物的顆粒。所述裝置還可包含磁場源。在又一個實施方案中，提供了一種處理樣品的方法，其包括(a)提供包含多個相繼的室的裝置，每一個所述室包含流體并且被表面張力閥隔開；(b)將包含表面反應物的顆粒引入所述第一反應室中，所述顆粒的表面包含結合至所述反應物的分析物；(C)將所述顆粒從所述第一反應室中運送到至少第二室中；以及(d)檢測所述分析物的存在。所述方法還可包括使所述顆粒與樣品混合以允許所述分析物結合至所述顆粒上的所述反應物。所述顆?？梢允谴判灶w粒、順磁性顆?；蛎芏扰c周圍流體不同的非磁性顆粒。運送可包括使磁場沿著所述管傳遞或使所述管經(jīng)受獨特的間歇磁場以實現(xiàn)所述顆粒的運動。運送可代之以包括向所述裝置施加離心力使得所述顆粒被運送通過所述多個室，或者通過密度驅動的運送，例如密度非常高的顆粒降落穿過密度較小的液體或者密度較小的易浮顆粒在密度較大的液體中上升。所述分析物可以是蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸、重金屬、有機化合物、細菌、病毒或真菌細胞。蛋白質(zhì)是抗原、抗體或酶。所述反應物可以是抗體、抗原、螯合劑、月旨質(zhì)、碳水化合物、金屬、有機化合物、酶底物或核酸。檢測所述分析物與所述反應物的相互作用可包括FRET、比色測定、熒光測定、RT-PCR、光密度變化或折射率變化。引入可包括通過所述第一反應室的壁注射所述樣品。為了有助于引入，所述第一反應室的壁可包含有助于注射所述樣品的端口。所述樣品可以是生物學樣品，例如得自于患者的組織或流體樣品。所述樣品可以是環(huán)境樣品，例如土壤樣品、水樣品或植物樣品。所述顆粒的直徑可以是0.1至10微米，并且所述管的內(nèi)直徑可以是0.5至IO4微米。所述裝置可包含至少三個室，例如第一反應室、第一處理室和第一檢測室，其中所述第一處理室設置在所述第一反應室與所述第一作用室之間。所述表面張力閥可包含非反應性氣體或具有低蒸汽壓或低表面張力的流體，例如非反應性氣體如空氣、二氧化碳、氮氣、氬氣、氦氣或六氟化硫，或者流體如礦物油、十二烷、1-十二烯、十三烷、油酸甲酯、乙酰苯、苯甲酸丙酯或1-甲基萘。還提供了這樣的試劑盒，其包含包括管的裝置，所述管包含多個相繼的室，每一個所述室包含流體并且被表面張力閥隔開。所述試劑盒還可包含設置在所述室的至少一個中的顆粒，或者還可包含設置在不同容器中的顆粒。在權利要求書和/或說明書中，當沒有數(shù)量詞修飾的名詞與術語“包含”或“包括”聯(lián)合使用時可意指“一個”，但是也意指“一個或更多個”、“至少一個”和“一個或多于一個”。術語“約”意指所述數(shù)目的正負5 %。根據(jù)以下詳細說明，本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)點將變得顯而易見。但是，應理解，雖然詳細說明和具體實施例指明了本發(fā)明的具體實施方案，但是其僅通過舉例說明給出，因為根據(jù)該詳細描述，在本發(fā)明精神和范圍內(nèi)的多種改變和修改對于本領域技術人員將變得顯而易見。當與以下描述和附圖一起考慮時，將更好地領會和理解本發(fā)明的這些和另一些實施方案。但是，應理解，雖然以下描述指明了本發(fā)明的多個實施方案及其許多具體細節(jié)，但是其僅通過舉例說明給出而并不是限制。在不偏離本發(fā)明精神的情況下，可在本發(fā)明范圍內(nèi)作出許多替換、修改、添加和/或重排，并且本發(fā)明包括所有的這些替換、修改、添加和/或重排。


附帶并構成本說明書一部分的附圖用于描述本發(fā)明的某些方面。通過參考附圖中闡明的示例性并因此非限制性的實施方案，本發(fā)明提供的本發(fā)明以及系統(tǒng)組件和操作的更清楚的概念將變得更清楚，在附圖中相同的附圖標記(如果它們在多于一種視圖中出現(xiàn))指相同元件。通過參照這些附圖中的一幅或更多幅并且與本文描述相結合，可更好地理解本發(fā)明。應注意，附圖中闡明的特征不一定是按比例繪制。
圖1—原型(prototype)提取法的設計，其示出固定在玻璃管中并被填充空氣的移液器頭隔開的三個處理溶液。RNA吸附到二氧化硅包被的磁珠上，使用外磁體牽引所述磁珠從左至右通過連續(xù)的處理室。處理之后，RNA在最后的水室中洗脫。圖2—磁環(huán)裝置“牽引通過(Pull-thr0Ugh)”實施方案。連續(xù)管提取盒的設計，其示出被表面張力閥隔開的各個處理溶液。外磁體用于牽引吸附于二氧化硅包被磁珠的RNA通過各處理溶液。處理之后，RNA在最后的水室中洗脫。圖3——基于致密珠沿提取盒向外的離心力運送的低資源處理器。圖4—自動化處理器設計。用于將磁性顆粒從一個處理溶液運送至下一個處理溶液的電磁設計的視圖。以線性排列圍繞閉合管布置的6個電磁體的系列。打開并關閉電磁體產(chǎn)生瞬時磁場，以牽引磁珠通過分隔連續(xù)處理溶液的表面張力界面。圖5——自動化處理器設計。線圈式處理器設計的俯視圖。裝滿流體的管包含四個表面張力閥，其將五個處理溶液隔 開。線圈在固定的磁體下旋轉，并且通過磁場使磁珠移動通過一系列處理溶液。圖6~低資源護理點(point-of-care)提取處理器，其舉例說明了表面張力閥(在這種情況下是液體/空氣界面)用于將液體處理步驟分隔開的用途。將生物學樣品注入到左室中(注射器)，然后使用外部環(huán)形磁體使二氧化硅包被磁珠從該室移動至第二室中。在該例中，捕猶的材料在右邊的最終室中釋放。圖7——提取盒加載設計。將患者樣品引入提取盒一端中的方法。(I)使所述提取盒的端部降低從而進入患者樣品中，毛細作用將患者樣品吸取進入所述盒的一端，(2)此時所述患者樣品與在管內(nèi)表面上干燥的磁珠相互作用。然后使用外磁體將所述珠運送通過表面張力閥和管上部中包含的處理溶液。圖8——使用低資源牽引通過RNA提取裝置的RSV RNA提取(右側柱)與可商購試劑盒相當。使用五種方法從儲存的7RSV+(黑色柱)和7RSV-(灰色柱)小兒鼻腔沖洗樣品中提取RSV RNA的比較。使用磁力驅動的牽引通過設計提取的提取效率與三種可商購試劑盒中的兩種類似。平均值土S.D >，N = 7。圖9—使用連續(xù)管提取盒(籲)或RNeasv試劑盒(〇)從摻入已知暈RSV RNA的HEp-2細胞裂解物中提取之后可通過RT-PCR檢測的RNA檢測限(平均值±S.d，n = 3)。當對不包含RNA拷貝的樣品進行提取時，用提取盒檢測到197±8.5個RNA拷貝而用RNeasy試劑盒檢測到202±9.5個拷貝。示出連續(xù)管提取盒的檢測限(虛線)。通過計算必須添加到RSV陰性細胞裂解物中以在提取后可通過RT-RNA檢測的靶標RNA的最小量來確定提取盒檢測限。比較該值與關于RNeasy試劑盒計算的檢測限。向20 μ L未感染HEp_2細胞裂解物摻入 5 μ L 包含 0,5X IO3,5X IO4UX IO5,5X IO5UX IO6 和 5X IO6 拷貝 RSV N 基因RNA標準品的TE緩沖液中的RNA并通過2.6節(jié)所述的兩種方法提取。提取后，通過RT-PCR對RNA進行定量。檢測限定義為針對不含RNA的對照提取獲得的平均值之上的3個標準差(3s.d.)。圖10——DNA提取。使用提取盒(左側柱)和DNeasv試劑盒(右側柱)從200 μ L合成尿中回收結核病革巴標IS6110DNA的百分比的比較，(平均值土s.d., η = 3)。圖11—使用空氣閥的蛋白質(zhì)提取。從磷酸鹽緩沖鹽水和血漿中提取富組氨酸蛋白，平均值 +/-s.d., N = 3。
圖12-用商品化離心式柱(spin column)和牽引通過設計提取拒疾蛋白質(zhì)的
比較。這是在每種方法的理想條件下兩種方法的簡單比較。商品化試劑盒使用試劑盒中存在的標準試劑進行。％回收指兩種方法第一次洗脫中收集的蛋白質(zhì)的量(對于我們是洗脫室，對于離心式試劑盒是離心下來的第一次洗脫液)(平均值土 s.d., η = 3)。優(yōu)選實施方案如上所討論的，使用檢測分析物的簡單快速測定的主要障礙是患者樣品中包含的污染物的存在，這阻斷了這些方法的有效性。例如，已顯示了臨床樣品中存在的高濃度碳水化合物可抑制PCR的結果。除了包含抑制基于核酸之檢測的污染物之外，患者樣品還包含DNase和RNase，其使樣品中存在的核酸靶標數(shù)目隨時間減少?？缮藤彾喾N核酸提取試劑盒用于實驗室背景。但是，它們需要實驗室設備，例如離心機和移液器。總體目標是開發(fā)自足式低資源裝置以從樣品中提取分子(如核酸或蛋白質(zhì))并且在洗脫緩沖液中濃縮靶標，從而可用于多種下游應用而不需要復雜或昂貴的技術。本發(fā)明人開發(fā)了適用于在低資源背景中操作的替代性核酸提取盒。這種自足式提取盒預加載有被空氣間隔(稱為“表面張力閥”)隔開的處理溶液。在RNA提取研究中，使RSV感染細胞裂解，并且在GuSCN和乙醇存在下使病毒RNA選擇性吸附至二氧化硅包被磁珠。將各個處理溶液預加載到單個連續(xù)長度的Tygon管中，通過表面張力彼此隔開并固定在其位置。通過以下過程實現(xiàn)干擾物質(zhì)的移除:RNA選擇性吸附至二氧化硅包被磁珠，然后使用外部施加的磁場牽引所述磁珠通過每個處理溶液。RNA在最終溶液中從磁珠表面洗脫。該報道描述了該方法的一般特征并且比較了其與基于實驗室的商業(yè)化試劑盒的性能。因此，本發(fā)明提供了與低成本生物分子隔離(isolation)、分析和檢測技術有關的問題的獨特解決方案，其中通過將反應物設置在可容易地操作通過儀器或系統(tǒng)的多個“區(qū)”的顆粒上使所述反應物“可移動”。不同的區(qū)將多個溶液隔開，包括反應區(qū)和處理區(qū)。本發(fā)明的一個重要方面是使用表面張力閥使不同區(qū)隔離開，同時允許運送所述顆粒通過每個區(qū)。出乎意料地，盡管有相當大的表面張力，所述顆粒也可通過這些空氣閥，并且在沒有將液體從一個室轉移至另一個室的情況下也可如此。因此，本發(fā)明可解決目前限制生物分子隔離、分離和檢測技術應用的許多問題并且還產(chǎn)生了應用的新領域。以下更詳細地描述了本發(fā)明的這些和另一些方面。A.裝置—般而言，裝置將具有以下組件。第一，連續(xù)管將為產(chǎn)生多個室提供基礎。所述室本質(zhì)上是通過使用表面張力閥維持彼此隔開的液體袋(liquid pocket)，所述表面張力閥是散布在液體袋之間的流體或氣體物質(zhì)。所述裝置還可包含預先設置在其中的顆粒以用于檢測弓I入到所述裝置中的分析物。最后，所述裝置可不設置有液體袋，取而代之地是可在隔開的容器(即，試劑盒)中含有液體和流體/氣體組分，以在實施時使用或分布進/定制所述裝置。以下將更詳細地討論所述裝置的單個元件。1.管設計該裝置的核心是建立一系列沿管排列的溶液，每個溶液與下一個溶液通過表面張力閥隔開。只有直徑足夠小的管允許流體和閥的穩(wěn)定布置。直徑大于約4mm的管將不支持穩(wěn)定閥的形成。因此，該組件的重要物理性質(zhì)是其直徑。所述管可由多種不同材料(包括玻璃、聚合物或金屬)制成。所述管應由在以下進一步討論的允許表面張力閥形成的聚合物制成，或內(nèi)部包被所述聚合物。還期望具有低表面能量的管，這意味著其不結合蛋白質(zhì)并且還是疏水性的。所述管材料的這些性質(zhì)影響排列溶液的穩(wěn)定性，并因此影響可使用的管的直徑。較低的表面能量一般需要較小直徑的管來允許穩(wěn)定的閥形成。對于玻璃、硅烷化玻璃、聚苯乙烯、特氟龍(Teflon)和一些類型的氟化乙烯聚丙烯Tygon管的典型表面能量值在10-50、10-30、15-30、20-30、5mN/m的范圍內(nèi)，包括 10,15,18.5、20、25、30、35、40、45 和 50mN/m?！N具體類型的管是Tygon管,這是多種撓性管(flexible tubing)的商標名。Tygon是Saint-Gobain Corporation的注冊商標。Tygon管用于多個市場,包括食品和飲料、化學處理、工業(yè)、實驗室、醫(yī)療、藥品和半導體處理。有許多透明的撓性Tygon管的配方。不同配方之間的耐化學性和物理性質(zhì)不同，但是所述管一般對幾乎任何的化學侵蝕都有耐性。Tygon的幾種配方是批準的VI類并且可用于手術方法或藥品處理。醫(yī)用形式包括以下:Tygon醫(yī)用/手術管S-50-HL——于最新的IS010993標準和FDA指南表征生物相容性。該材料無毒性、無溶血性并且無熱原性。該配方用于微創(chuàng)裝置、透析設備，用于旁路(bypass)方法和化療藥物遞送。Tygon醫(yī)用管S-54-HL在1964年引入用于醫(yī)學應用。該材料可用于用于靜脈或動脈內(nèi)灌注或其他手術用途的導管。使用熱成型和驟燃技術可將Tygon S-54-HL制造成套管或保護套產(chǎn)品。制藥Tygon包括:Tygon LFL(長彎曲壽命(Long Flex Life))泵管是具有廣譜耐化學性的無毒性透明管。其經(jīng)常用于產(chǎn)物過濾和發(fā)酵以及表面活性劑遞送。Tygon2275高純度管是不含增塑劑的材料，其經(jīng)常用于無菌填充和分配系統(tǒng)和診斷設備。該配方還被認為具有低吸收/吸附特性，這使流體改變的風險最小。Tygon22751.B.高純度壓力管不含增塑劑并且用帶子加固以與升高的工作壓力使用。Tygon chemfluor FEP是非蛋白質(zhì)結合的管,其不包含添加劑或增塑劑。FEP代表氟化乙烯丙烯。蠕動式應用包括以下:Tygon R-3603實驗室管常用于大學實驗室。其經(jīng)常用于孵箱、通風櫥并且作為用于本生燈(Bunsen burner)的橡膠管的替代品。該材料以真空大小生產(chǎn)并且在室溫下可禁受住完全真空。Tygon R-1000超軟管用于一般的實驗室應用。其是最軟的Tygon配方，并且硬度計硬度ShoreA為40 (ASTM方法D2240-02)。因為該材料的硬度低，所以其常用于低扭矩蠕動泵。Tygon LFL (長彎曲壽命)泵管、Tygon3350、Tygon S-50-HL 醫(yī)用 / 手術管、Tygon2275高純度管和Tygon2001管也用于蠕動泵應用。其他類型的管包括以下。硅氧烷管(LPS)是最常用的蠕動泵管。它具有最長的使用壽命和對于水溶劑的良好化學相容性?？墒褂脻裱h(huán)對硅氧烷管進行單次的高壓滅菌。乙烯管(LPV)是可用蠕動泵管中每英尺成本最低的。它一般只對大多數(shù)水性溶劑具有相當?shù)南嗳菪远鴮τ袡C溶劑不具有良好耐性。它在蠕動泵中僅具有硅酮管使用壽命的約三分之一。乙烯管不應進行高壓處理或者暴露于80°C以上的溫度。含氟彈性體管(LPF)既是化學惰性最強的也是壽命最短的蠕動泵管。它甚至可在有限的時間內(nèi)禁受住鹵化溶劑。其在蠕動泵中的使用壽命僅是娃氧燒管的約二十分之一。與娃氧燒管一樣，可使用濕循環(huán)對含氟彈性體管進行單次高壓滅菌處理。Teflon (特氟龍)管(HPT)是我們制造的所有管中惰性最大的。它可禁受住幾乎任何用于現(xiàn)代實驗室的溶劑，從蒸餾水到二氯甲烷。其優(yōu)良的熱特性允許其重復地進行高壓處理。高壓處理之后，特氟龍管應直至其冷卻才用于流體運送。聚乙烯管(HPP)是特氟龍管的廉價替代品。與特氟龍管一樣，聚乙烯可操作的壓力顯著高于其他撓性管中的任何一種。聚乙烯不具有特氟龍的熱穩(wěn)定性，所以它不應進行高壓滅菌處理；但是它可用環(huán)氧乙烷進行滅菌處理。2.室本發(fā)明人設計了裝備有氣體/流體閥的處理室，所述閥允許顆粒進出所述室而基本上不損失液體，并且保留每個區(qū)室的完整性。在一個具體實施方案中，所述處理室被配置成具有低至納升的容積。反應、處理、雜交和分析步驟可在一系列隔開的室中進行。一般而言，所述室含水性液體，所述液體包含多種化學和生物物類，如鹽、染料、標記和其他化學物類。圖1至4闡明了所述室布置的實例及其彼此之間的關系。參照圖1，示出使用者沿著與包含空氣之塑料移液器頭相連的管的區(qū)段牽引立方體磁體。立方體磁體的移動將磁性顆粒運送通過溶液/空氣界面。在插圖中，箭頭示出珠進入分隔兩種液體溶液的空氣。參照圖2，手動使環(huán)形磁體沿管移動，從而運送磁性顆粒。在該插圖中，箭頭示出珠試圖通過空氣表面張力閥。參照圖3，示出使用者通過手產(chǎn)生的離心力驅使高密度顆粒在管中降落。在插圖中，箭頭示出珠試圖通過空氣表面張力閥。參照圖4，沿著管設置一連串的c形夾電磁體。通過使電磁體順序激活，磁性顆粒被沿著管的長度運送。在插圖中，箭頭示出珠試圖通過水/空氣表面張力閥。反應室。一種類型的室是反應室。在反應室中，分析物與顆粒表面上的反應物相關聯(lián)。在將顆粒引入裝置之前使其與樣品混合的一個實施方案中，這種反應室是不必要的。一般而言，反應室將提供顆粒上的反應物與分析物可相互作用的合適條件。所述反應室可任選地包含抑制非特異性相互作用或一旦實現(xiàn)則穩(wěn)定相互作用的物質(zhì)。處理室。多種不同類型的處理室可用于本發(fā)明。方便時還可具有一連串的處理室。在顆粒流動可反向的意義上來說，處理室也可重復利用，使得給定的室的使用多于一次。本發(fā)明也可利用其中包含不同溶液的多個處理室。一個示例性處理室是預處理室。經(jīng)常的情況是，以這種方式“預處理”反應物、樣品或顆粒，從而確保接著發(fā)生的與靶標的反應具有高保真度，即，使非特異性結合最小。預處理中的經(jīng)典實例是“阻斷”反應。通過用非特異性蛋白質(zhì)(如BSA)預處理底物來抑制非特異性蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。類似地，通過將探針與已知與所述探針缺少同源性的“隨機” DNA孵育可減少非特異性DNA反應。在這種情況下，預處理室之后將是反應室。評價生物分子反應時的另一個重要步驟是從反應物中除去非特異性結合分子。雖然實現(xiàn)與預處理相同的目標，但是清洗是發(fā)生在將反應物暴露于靶標之后。通常，清洗溶液包含與用于靶標溶液的緩沖液類似的緩沖液，但是缺少靶標自身。偶爾期望改變清洗溶液的化學特性，例如通過改變鹽濃度或pH。清洗室將在反應室之后?？砂硗獾氖?，在最終的提取過程中將目標物類釋放到所述室中。該室的功能是提供許多提取過程的洗脫步驟。該室還可有效地作為濃縮室起作用，因為如果其體積與原始樣品體積相比足夠小，則分子靶標的數(shù)目將高于初始樣品中，從而有效濃縮該物種。在一些實施方案中，可期望遞歸地放大與靶標分析物結合至反應物的信號，或者產(chǎn)生用于反應的更多靶標。實現(xiàn)這個有多種機制。但是，共同特征是在反應室之前或之后需要一個或更多個室，從而實現(xiàn)導致放大的必需步驟。最后，為了增加過程的效率，可通過提取和再引入或者通過運送機制反轉(例如，離心力、密度或磁性)從處理室下游回收顆粒并且返回至上游反應室或處理室。通過重復反應和/或處理步驟可增加信號以及結合和檢測的特異性。因此，圖1至4示出線性排列的室的實施方案。管也可以是撓性的并且如圖5所示，另一個實施方案可以是扁平的線圈式設計，其示出管排列成線圈，所述線圈緩慢旋轉以將磁性顆粒從一個室牽弓I至下一個。3.表面張力閥本發(fā)明的一個重要方面是使用表面張力閥將管分隔成離散的室。這些表面張力閥使得處理流體與可移動底物之組成上具有靈活性。本質(zhì)上，所述表面張力閥是簡單的非反應性氣體或液體，其通過與構成多個室的流體產(chǎn)生穩(wěn)定界面將裝置的多個區(qū)段隔開。所述氣體或液體的重要方面包括低蒸汽壓或低表面張力，其被定義為蒸汽壓顯著小于IkPa并且表面張力在2至lOOmN/m之間，包括對于空氣/水約72，對于水/礦物油約50，對于芐醇/水約3.3 (值來自于有機溶劑手冊)(Lide，1995)(通過引用并入)。適當氣體的實例包括空氣、二氧化碳、氮氣、氦氣、氬氣或六氟化硫。液體包括礦物油、十二烷、1-十二烯、十三烷、油酸甲酯、乙酰苯、苯甲酸丙酯或1-甲基萘。另外，添加某些材料可改變表面張力界面，例如Tween '可降低表面張力。如圖1至5所闡明的，有多種方法可實現(xiàn)顆粒運送通過表面張力閥。例如，外部永磁體、外部可移動電磁體、通過管繞一端運動而施加的離心力、和密度驅動(即，在重力下重顆粒下降或者在密度較小的流體中易浮顆粒向上運動)。4.顆粒用于本發(fā)明的顆粒將優(yōu)先結合一類分子或選擇的目的靶標、易受通過外力(例如磁體或密度差)的運送影響與小尺寸的功能性結合起來以增加反應效率。所述顆粒可以由多種材料(如金屬、陶瓷、玻璃或聚合物)合成。特別地，對于采用磁場的實施方案，所述顆粒是磁性或順磁性顆粒。在采用離心力的實施方案中，所述顆粒的密度應> I?？缮藤忣w粒包括由SIGMA-ALDRICH提供的那些并且包括聚苯乙烯、聚苯乙烯單分散體、磁體、三聚氰胺樹脂、羧酸酯改性的三聚氰胺樹脂、聚甲基丙烯酸酯和二氧化硅(包括包被有以上物質(zhì)中任何一種的珠)。可以以多種方法實現(xiàn)將顆粒/樣品引入盒中。圖6闡明了通過Tygon管的壁注射樣品?？稍谧⑸淝笆诡w粒與樣品混合，或者顆?？梢呀?jīng)存在于懸液中或干燥于管的第一區(qū)段中。圖7闡明了通過毛細作用加載顆粒/樣品的第二實施方案。在該實施方案中，小直徑管中存在的毛細力導致樣品被吸入盒的第一區(qū)段中?？稍陬w粒沿第一區(qū)段管吸取或干燥之前使顆粒與樣品混合，在這種情況下，當所述顆粒與超前流體相接觸時釋放。如上所述在接下來的室之間進行顆粒的運送。5.試劑盒根據(jù)本發(fā)明，提供了包括上述裝置的試劑盒。一般而言，試劑盒包括用于多種試劑(如顆粒、反應物和檢測試劑)——作為液體或凍干固體的單獨的小瓶或容器。在后一種情況下，可包括的合適溶劑例如水、乙醇、多種緩沖溶液等。所述試劑也可以在裝置中以即用形式(即，與在裝置中已經(jīng)建立的室和表面張力閥一起)提供。所述裝置、顆粒、反應物和/或試劑可設置在固定于吹模或注模塑料中的小瓶或容器中或者設置在扁平循環(huán)盒內(nèi)的線圈式管中。B.反應物和靶標本發(fā)明的另一個重要方面是設置在顆粒表面上的反應物和這些反應物與之相互作用的靶標。對于反應物，材料以任何具體類型的方式相互作用不是必要的。相反地，預想了允許反應物與靶標分析物結合的任何物理相互作用，例如共價、非共價、靜電、水靜力(hydrostatic)或離子。例如，通過用二氧化硅包被顆粒，可將核酸(DNA和RNA，取決于溶液)吸附至顆粒以排除掉其他生物分子。還預想了與金屬(尤其是重金屬)配位的分子作為反應物。尤其考慮了鎳和鈷。簡單地基于化合物與反應物的相對相互作用，也可使用非特異性結合將更一般類別的化合物分開。如上所述，所述反應物可以是多種生物分子中的任何一種，包括核酸(DNA、RNA)、蛋白質(zhì)。另一些反應物包括氨基酸和有機小分子。對于兩個核酸，結合相互作用一般通過雜交表征，通過同源堿基配對實現(xiàn)。對于一個或更多個蛋白質(zhì)分子，相互作用一般是形成蛋白質(zhì)-配體復合物，這依賴于組分分子的互補結構和電荷，例如抗體-抗原相互作用和酶-底物相互作用。以下描述了適用于本發(fā)明的多種類型的分子。1.核酸 術語“核酸”為本領域所公知。本文使用的“核酸” 一般指DNA、RNA或其衍生物或類似物的分子，包括合成分子。核酸還定義為包含一連串天然嘌呤或嘧啶堿基的分子。術語“核酸”涵蓋了術語“寡核苷酸”和“多核苷酸”，其各自是術語“核酸”的亞類。術語“寡核苷酸”指長度在約3與約100個核堿基之間的分子。術語“多核苷酸”指長度大于約100個核堿基的至少一個分子。這些定義一般指單鏈和雙鏈分子兩者，后者彼此之間基本上或完全互補。核酸甚至可涵蓋三鏈分子。本文使用的單鏈核酸可由前綴“ss”指示，雙鏈核酸由前綴“ds”指示，而三鏈核酸由前綴“ ts ”表示。(b) DNADNA定義為包含腺嘌呤“A”、鳥嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”和胞嘧啶“C”的核酸。單鏈和雙鏈兩種DNA分子可用于本發(fā)明。DNA可包含編碼序列或非編碼序列、和基因組序列或cDNA、與目的靶標同源的合成鏈。DNA “陣列”一表示一組選擇的探針的DNA集合。(c) RNARNA定義為含A、G、尿嘧啶“U”或C的核酸。單鏈和雙鏈兩種RNA分子可用于本發(fā)明。因為其不穩(wěn)定的性質(zhì)，必須采取另外的步驟以維持包含RNA之樣品的完整性。尤其是，RNAse的普遍存在需要使用RNAse抑制劑，如DEPC。2.蛋白質(zhì)在另一個實施方案中，所述探針可以是蛋白質(zhì)化合物。雖然有各種各樣的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用；但是，蛋白質(zhì)也結合核酸、金屬和其他非蛋白質(zhì)化合物(例如，脂質(zhì)、激素、遞質(zhì))。以下列出了可用作靶標或探針的蛋白質(zhì)的一些實例。(a)抗體抗體可用作用于未知分子的探針，或者它們可以是用于與已知探針反應的靶標。所述抗體的來源可以是多克隆或單克隆的。用于制備抗體的方法為本領域技術人員所公知，在此不需討論。使用標準技術可將抗體固定于絲狀支持物。明顯地，鑒定與某些靶標分子結合的抗體是可通過本發(fā)明實現(xiàn)的重要目的。但是，本發(fā)明還允許篩選樣品中抗體的存在。例如，顆?？砂喾N細菌和病毒抗原，其可通過鑒定受影響對象中的相關抗體有助于診斷傳染病。(b)酶酶是有助于修飾各種各樣的化合物的蛋白質(zhì)，所述化合物包括核酸、其他蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖、類固醇和許多其他的化合物?？紤]的具體測定類型包括鑒定酶抑制劑，所述抑制劑結合所述酶但并不被所述酶處理?；蛘?，鑒定通過酶結合的化合物可有助于設計通過酶處理的前藥。(C)受體受體是通過結合其同源配體部分而有助于信號轉導過程的分子。一旦結合，受體就會進行另一些功能(酶促、細胞內(nèi)轉位、細胞滲透)，從而影響信號傳導。使用本發(fā)明可實現(xiàn)對阻斷受體功能或模擬天然配體的分子的鑒定。(d) DNA結合蛋白另一類重要的蛋白質(zhì)是DNA結合蛋白。這些蛋白質(zhì)包括聚合酶、解旋酶、連接酶和轉錄因子。可評價具有不同DNA序列特異性程度的蛋白質(zhì)結合不同DNA序列的能力。相反地，一旦可鑒定出對DNA序列具有特異性的未知結合蛋白，就提供所述序列作為探針。3.小分子和其他靶標可檢查各種各樣的“小分子”與給定反應物相互作用的能力。這些文庫包含非蛋白質(zhì)和非核酸分子?；蛘?，可圍繞特定“藥物核心(pharmacore) ”來構建文庫,所述藥物核心被認為提供特定藥物發(fā)揮功能所必需的基本結構特征。另外，使用本發(fā)明裝置和方法可測定化合物，例如脂質(zhì)、碳水化合物、金屬和毒素。4.標記在多個實施方案中，可期望標記顆粒、反應物或靶標分子。標記的實例包括順磁性離子、放射性同位素、化學發(fā)光化合物、熒光團、生色團、NMR可檢測物質(zhì)和X射線成像化合物。順磁性離子包括鉻(III)、錳(II)、鐵(III)、鐵(II)、鈷(II)、鎳(II)、銅(II)、釹(III)、釤(III)、鐿(III)、釓(III)、釩(II)、鋱(III)、鏑(III)、欽(III)和 / 或鉺(III)，并且特別優(yōu)選釓。用于其他環(huán)境(例如X射線成像)的離子包括但不限于鑭(III)、金
(III)、鉛(II)，以及尤其是鉍(III)。
放射性同位素包括砹21V4碳、51鉻、36氯、57鈷、58鈷、銅fV52Eiu鎵6V氫、碘123、碘I'碘I'銦111、59鐵、32磷、鍊i'錸硒、35硫、得■和/或釔90。在某些實施方案中常
優(yōu)選1251，并且因為其低能量和長范圍檢測的適用性，經(jīng)常也優(yōu)選锝99m和/或銦m?？紤]使用的熒光標記中包括Alexa350、Alexa430、AMCA、BODIPY 630/650、B0DIPY650/665、BODIPY-FL、B0DIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、Cascade Blue、Cy3、Cy5，6-FAM、異硫氰酸熒光素、HEX、6-J0E、俄勒R綠(Oregon Green)488、俄勒R綠500、俄勒岡綠 514、Pacific Blue、REG、羅丹明綠、羅丹明紅、Renographin、R0X、TAMRA, TET、四甲基羅丹明和/或德克薩斯紅。也可使用在與生色底物接觸后將產(chǎn)生有色產(chǎn)物的酶(酶標簽)。合適的酶的實例包括脲酶、堿性磷酸酶、(辣根)過氧化氫酶或葡萄糖氧化酶。優(yōu)選的二級結合配體是生物素和/或親和素和鏈霉親和素化合物。這些標記的使用為本領域所公知并且例如在美國專利 3，817，837,3, 850，752,3, 939，350,3, 996，345,4, 277，437,4, 275，149 和 4，366，241 中有所描述，其各自通過引用并入本文。C.定義
`
本文使用的未經(jīng)數(shù)量詞修飾時定義為一個或多于一個。本文使用的術語多個定義為兩個或多于兩個。本文使用的術語另一個定義為至少第二個或更多個。 本文使用的術語包括和/或具有定義為包含(即，開放式語言)。本文使用的術語偶聯(lián)定義為連接，但并不一定是直接連接。本文使用的術語約定義為至少接近給定值(例如，優(yōu)選在給定值的10%內(nèi)，更優(yōu)選I %內(nèi)，最優(yōu)選0.1 %內(nèi))。本文使用的術語基本上定義為至少接近給定的狀態(tài)(例如，優(yōu)選在給定狀態(tài)的10%內(nèi)，更優(yōu)選1%內(nèi)，最優(yōu)選0.1%內(nèi))。本文使用的短語“其中可衍生的任何整數(shù)”定義為本說明書中列舉的相應數(shù)字之間的整數(shù)，并且短語其中可衍生的任何范圍定義為這些相應數(shù)字內(nèi)的任何范圍。
D.實施例包括以下實施例以證明本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。本領域技術人員應理解，以下實施例中公開的技術是由本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在本發(fā)明實踐中運行良好的技術，并因此可被認為構成了其優(yōu)選實施方式。但是，本領域技術人員應理解，根據(jù)本公開內(nèi)容，在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可對公開的具體實施方案作出許多改變并仍然獲得相同或類似的結果O實施例1RSV RNA提取圖6示出該想法的一個實施方案，其闡明了用于從小兒鼻腔洗出樣品中提取病毒RNA的一種設計。通過Tygon管將經(jīng)溶解的鼻腔洗出樣品注射到左側的第一室中并在該室中存在的胍鹽緩沖液中與二氧化硅包被磁珠混合。樣品RNA結合至二氧化硅表面。預加載的處理溶液通過閥的表面張力固定在其位置。外磁體拖動磁珠并牽引其通過每一個處理溶液。出乎意料地，當珠到達液體-空氣界面時，它們通過所述界面而不帶走溶液。類似地進入下一個溶液直至整個顆粒群通過所有的處理步驟。處理除去樣品污染物，并且RNA濃縮在最終室中的50 μ I水中并用于下游RT-PCR處理，以檢測呼吸道合胞體病毒(RSV)的存在。圖8示出使用磁力牽引通過(magnetic pull-through)的設計和幾種商業(yè)化試劑盒進行RSV RNA提取的比較。使用連續(xù)管提取盒從TE緩沖液和HEp-2細胞裂解物中進行RNA提取。圖1的初始原型設計被進一步簡化為圖2所示的連續(xù)管設計。在該設計中，在 61cm長的Tygon管(1.6mm內(nèi)徑)內(nèi)預加載8個處理溶液。這些溶液是促離液清洗緩沖液(300 μ L的4M鹽酸胍，25mM檸檬酸鈉，pH7.0)、含RNA沉淀緩沖液的兩個區(qū)段(300 μ L的80%乙醇，5mM磷酸鉀，pH8.5)、含水清洗液的三個區(qū)段(100 μ L分子級水)和RNA洗脫液(50 μ L分子級水)。選擇50 μ L洗脫液體積使得RT-PCR輸入與其他提取方法(如RNeasy試劑盒)相當。每個溶液通過 2mm長的空氣間隙與彼此隔開。制備了三種類型的提取測試樣品:5yL的TE緩沖液中RSV N基因標準RNA (濃度為I X IO6拷貝/ μ L)、摻入5 μ L RNA標準物的20 μ LHEp-2細胞裂解物(2 X IO3個細胞/ μ L)或20 μ L經(jīng)RSV感染的HEp-2細胞裂解物。通過使其5次通過25號針來使得細胞裂解物樣品均勻。在提取之前，將樣品添加到230 μ L RNA-二氧化硅結合緩沖液(230 μ L2M硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，pH7.0, 50%乙醇)和20 μ L直徑Iym的二氧化娃包被磁珠(3 X IO6顆粒/ μ L) (Bioneer Inc., Alameda, CA)中，并且在室溫下在旋轉混合器上放置5分鐘?；旌现?，將每種樣品加載到管內(nèi)，并蓋上管蓋。通過外磁體在第一室中收集顆粒并使用直徑 5cm的釹環(huán)磁體(Emovendo LLC, Petersburg, WV)以 4mm/秒牽引所述顆粒通過表面張力閥和每個相繼的室，如圖2所述。在再收集之前，通過來回快速移動磁體使顆粒分散在促離液清洗液和RNA沉淀溶液中。在水清洗溶液中，顆?？梢砸?8mm/秒移動以使清洗期 間通過洗脫的RNA損失最小。最后,顆粒分散于最終的洗脫室中并在室溫下孵育5分鐘后除去。雖然其在原型設計中使用，但是在該最終設計中不進行65°C的RNA洗脫，這是因為它在大多數(shù)低資源背景下不能實行。收集最終室的內(nèi)容物用于RT-PCR分析。每步RNA提取都在 15分鐘內(nèi)完成。圖9舉例說明了該設計操作特征的實例。使用連續(xù)管提取盒(.)或RNeasy試劑盒(〇)，在摻入已知量RSV RNA的HEp-2細胞裂解物中提取之后，可通過RT-PCR檢測的RNA的檢測限(平均值土s.d，n = 3)。當提取不含RNA拷貝的樣品時，用提取盒檢測到197±8.5個RNA拷貝，用RNeasy試劑盒檢測到202±9.5個拷貝。示出了連續(xù)管提取盒的檢測限(虛線)。通過計算必須添加到RSV陰性細胞裂解物中以在提取后可通過RT-RNA檢測的靶標RNA的最小量來確定提取盒檢測限。將該值與關于RNeasy試劑盒所計算的檢測限進行比較。向20 μ L未感染HEp-2細胞裂解物中摻入包含0、5X 103、5X 104、1X 105、5 X ΙΟ5、I X IO6和5 X IO6拷貝RSV N基因RNA標準物的TE緩沖液中的5 μ L RNA并通過兩種方法提取。提取后，通過RT-PCR對RNA進行定量。檢測限定義為對于不含RNA的對照提取中獲得的平均值之上的三個標準差(3s.d.)。 實施例2——跨腎DNA提取在該實施例中，在內(nèi)徑為1.6mm的 45cm長的Tygon管內(nèi)預加載四個處理溶液。這些溶液是促離液清洗緩沖液(300 μ L的4M鹽酸胍，25mM檸檬酸鈉，pH7.0)、含DNA沉淀緩沖液的兩個區(qū)段(300 μ L的80%乙醇，5mM磷酸鉀，pH8.5)和DNA洗脫液(50 μ L分子級水)。這些溶液可被 2mm長的空氣間隙彼此隔開。通過整合DNA技術(Coralville, 1wa)合成來自結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis) IS6110序列的140喊基DNA序列，并且將5 X IO7個拷貝慘入200 μ L合成尿中，所述合成尿由0.65 二水氯化鈣、0.65氯化鎂、4.6氯化鈉、2.3硫酸鈉、0.65 二水檸檬酸鈉、2.8磷酸氫二鉀、1.6氯化鉀、1.0氯化銨、25尿素和1.1肌酸肝(單位為g/L)構成(Miro-Casas等，2001)。將摻入DNA的合成尿樣品與200 μ L DNA- 二氧化硅結合緩沖液(4Μ 鹽酸狐，25mM 朽1 樣酸鈉，ρΗ7.0)和 20 μ L (0.8mg) Invitrogen Dynabeads MYONE 娃燒珠(Carlsbad,California)混合并在室溫下潤旋混合5分鐘?；旌虾螅瑢悠芳虞d到管內(nèi)，并蓋上管蓋。通過外磁體在第一室中收集顆粒并使用直徑 5cm的釹環(huán)磁體(Emovendo LLC,Petersburg, WV)以 4mm/秒牽引所述顆粒通過空氣閥和每個相繼的室。在再收集之前,通過來回快速移動磁體使顆粒分散在促離液清洗液和DNA沉淀溶液中。最后，顆粒完全分散于DNA洗脫室中并被除去，收集最終室的內(nèi)容物用于PCR分析。每步DNA提取都在 9分鐘內(nèi)完成。比較其提取效率與根據(jù)制造商說明書使用Qiagen DNeasy試劑盒提取的DNA。使用正向引物5’ -ACCAGCACCTAACCGGCTGTGG-3’ (SEQ ID NO:1)和反向引物 5’ -CATCGTGGAAGCGACCCGCCAG-3’ (SEQ ID NO:2)擴增 IS6110 序列的 129 堿基片段(Cannas 等，2008)。根據(jù)制造商說明書，在使用5 μ LDNA模板和Qiagen Quantitect SYBR green PCR試劑盒中以25 μ L的體積進行反應。使用Rotor-Gene Q熱循環(huán)儀(Qiagen, Germantown,MD)，熱循環(huán)由以下組成:94 °C 15分鐘以活化DNA聚合酶；40周期的94 °C 15s ;62°C 30秒和72°C30秒。使用熔解曲線分析確定產(chǎn)物特異性。收集數(shù)據(jù)，通過Rotor-Gene Q軟件(Qiagen, Germantown, MD)記錄Ct值,并使用標準曲線轉化為DNA拷貝數(shù)/ μ L。圖10舉例說明了使用該實施方案的結果。從摻入DNA的合成尿中提取的DNA的回收效率為27.15 ± 1.10%。這相當于DNA洗脫濃度為271，500± 11，020拷貝/μ L。使用DNeasy試劑盒提取的DNA的回收效率為68.6±3.48%。這相當于DNA洗脫濃度為686，000±34，780拷貝/ μ L?；厥招释ㄟ^所提取拷貝的總數(shù)目除以樣品中存在拷貝的初始數(shù)目并乘以100%來計算。實施例3——使用空氣/液體界面的蛋白質(zhì)隔離將一條Tygon ‘ 管切成9.5”長并且水平放置在實驗臺上之后，使用凝膠上樣移液器頭將 ο μ L緩沖液B (50mM磷酸鈉pH8.0, 300mM NaCl,500mM咪唑，0.05%吐溫20)插入管的右端并用MelTemp毛細管的圓頭端封閉該端(僅將1/8”玻璃插入TygOIl ‘管中)。用緩沖液A(50mM磷酸鈉pH8.0，300mM NaCl，500mM咪唑，0.05%吐溫20)填充ImL注射器。小心地從注射器圓筒和針中除去所有的空氣氣泡并分配緩沖液直至黑色的注射器帽靜止在ImL刻度線處。將注射器針從洗脫室左側的1/8”插入管的壁中并分配0.1mL緩沖液A。將注射器從以上清洗室左側的1/8”再次插入管的壁中并分配0.1mL緩沖液A。重復第三次以產(chǎn)生3個清洗室。將PCR管(已在圓頭切割以具有小圓孔)的切割端插入管的右手側，確保Tygon ^=在管底部完全密封并且在PCR管中沒有褶皺或折痕。使用注射器針，在管蓋中刺出小孔以充當釋放閥。將提取管保持豎直，將100 μ L樣品吸入到PCR管中，然后吸入100 μ L緩沖液C。確保樣品適當混合以完全溶解所有的細胞。為了得到包含溶解樣品的加載室，將IOyLlOOX稀釋的Dynabeads 添加至PCR管中。封閉蓋并用小片膠帶密封孔。將管放于烤架(如果需要使用膠帶貼到烤架上)并使管旋轉 ο分鐘以適當?shù)鼗旌蠘悠贰?0分鐘后，從烤架下移下管。使用環(huán)狀磁體在PCR管切割端將珠收集成團塊。牽引珠通過第一空氣閥并進入第一清洗室中。沿著室長度使用“來回”運動使珠分散I分鐘。在第一清洗室的末端收集珠的小球，然后牽引小球通過空氣閥進入第二清洗室。以類似方式牽弓I珠通過第二和第三清洗室，以確保珠在整個室中足夠分散。在第三清洗室中收集珠的小球，牽引小球進入洗脫室并使用“來回”運動使珠分散10分鐘。10分鐘后，牽引珠回到洗脫室左側的空氣室中。使用移液器從樣品加載室中移出200 μ L樣品并放入新的Eppendorf ‘管中。用刀片將珠團塊與洗脫室之間洗脫室左側的的空氣閥切開。用向上的MelTemp毛細管將提取管的切割端放進Eppendorf 管中。移除MelTemp管并將90 μ L緩沖液B移入至含洗脫室的Tygon ‘管中，以使得所述室被沖入新的Eppendorf 1管中。儲存樣品用于稍后的分析。圖11舉例說明了該實施例的提取百分比。從磷酸鹽緩沖鹽水和血漿中提取瘧疾蛋白質(zhì)靶標(富組氨酸蛋白)的效率分別為約55%和25%。實施例4——使用礦物油/水表面張力閥的蛋白質(zhì)隔離根據(jù)本發(fā)明的裝置用于隔離與瘧疾相關的替代靶標(標記有熒光化合物TAMRA的HRP-1 I)。使用BS3作為交聯(lián)劑使胺末端磁珠(硅烷化氧化鐵，12 μ mo I胺/mL，p = 2.5g/mL,直徑1-4 μ m, 25_35EMU/g)與經(jīng)賴氨酸修飾的NTA交聯(lián)。交聯(lián)后，顆粒使用NiCl2而帶有 Ni (II)。對于該裝置，每個室含100 μ L溶劑。每個室之間是 25至50 μ L輕質(zhì)礦物油作為閥。使用1/16(直徑)的Tygon管。室內(nèi)容物和反應如下:室I (樣品):樣品與Ni (II)NTA磁珠反應室2(清洗 I):0.1M 磷酸緩沖液(ρΗ8.0), 300mM NaCl，0.25% 吐溫 20室3(清洗 2):0.1M 磷酸緩沖液(ρΗ8.0), 300mM NaCl，0.25% 吐溫 20室4(洗脫):0.1M 磷酸緩沖液(ρΗ8.0), 300mM NaCl，0.25%吐溫 20,200mM 咪唑室5(洗脫后):0.1M 磷酸緩沖液(pH8.0)，300mM NaCl，0.25 % 吐溫 20，200mM 咪唑該裝置預先加載有被輕質(zhì)礦物油隔開的室2至5。盡可能多地避免空氣袋。將靶標(TAMRA HRP-1I，10 μ M 結合位點)和 BSA(熒光素 BSA，100 μ g/mL) 二者與 Ni (NTA)磁珠(100 μ M Ni(II)NTA)孵育10分鐘(100 μ L總體積)。孵育后，將混合物注射到第一室中。然后使用環(huán)狀磁體使磁珠轉移通過管。當珠到達室中時，通過來回快速移動磁體使所述珠擴散至整個室。然后，緩慢移動磁體穿過室，垂直于管振蕩以確保有效混合。該過程花費 I分鐘。然后通過磁體收集珠并轉移至后續(xù)的室。當提取完成時，收集室并使用熒光進行分析。牽引通過方法(BNT-1I)相同方法施加于初始室包含BNT-1I (I μ Μ)、BSA(40mg/mL)、100 μ M Ni (II)NTA 磁珠的裝置。圖12示出采用該實施例所述裝置和方法得到的代表性結果。在本公開內(nèi)容的教導下，不需過度實驗即可進行并使用本文公開的本發(fā)明的所有公開實施方案。本發(fā)明不受本文所述的理論聲明限制。雖然公開了本發(fā)明人考慮的實施本發(fā)明的最佳模式，但是本發(fā)明的實踐不限于此。因此，本領域技術人員將理解，除本文具體描述的之外，也可實踐本發(fā)明。另外，單個組件不一定形成所公開的形狀或組合成所公開的配置，而是可以以幾乎任何形狀提供和/或組合成幾乎任何配置。此外，單個組件不一定由所公開的材料制造，而是可由幾乎任何合適的材料制造。另外，可對構成本文所述方法的步驟或步驟順序做出改變。明顯的是，在不偏離基于本發(fā)明概念的精神和/或范圍的情況下可對本發(fā)明的特征做出多種替換、修改、添加和/或重排。認為由所附權利要求及其等同項限定的基于本發(fā)明概念的精神和/或范圍包括所有的這些替換、修改、添加和/或重排。除非在給定權利要求中使用短語“用于......的方法”和/或“用于......的步
驟”明確列出方法加功能(means-plus-function)的限定,否則所附權利要求不應解釋為包括這種限定。本發(fā)明的亞類實施方案由所附獨立權利要求及其等同項描述。本發(fā)明的具體實施方案由所附獨立權利要求及其等同項來區(qū)分。E.參考文獻在某種程度上以下參考文獻提供了示例性方法和補充本文所述那些的其他細節(jié)，其具體通過引用并入本文。U.S.Patent3，817，837U.S.Patent3，850，752U.S.Patent3，939，350U.S.Patent3，996，345U.S.Patent4，277，437U.S.Patent4，275，149U.S.Patent4，366，241Aceti et al.，Thorax.，54 (2):145-146,1999.
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權利要求
1.一種處理樣品的方法，其包括: (a)提供包含通過管相連接的多個相繼的室的裝置，每個所述相繼的室包含流體并且被基于氣體的表面張力閥隔開，其中第一反應室包含在其表面上具有反應物的顆粒； (b)將樣品引入所述第一反應室中； (C)在足以允許所述反應物與所述樣品中的分析物反應的條件下孵育所述第一反應室； (d)將所述顆粒從所述第一反應室通過設置于其間的管運送到至少第二室中；以及 (e)檢測所述分析物與所述反應物的相互作用。
2.權利要求1的方法，其中所述裝置包含至少三個室。
3.權利要求2的方法，其中所述裝置包含所述第一反應室、第一處理室和第一檢測室，其中所述第一處理室設置在所述第一反應室與所述第一作用室之間。
4.權利要求2的方法，其 還包括反轉所述顆粒的運送以將所述顆粒再引入其已經(jīng)通過的室中。
5.權利要求1的方法，其中所述裝置包括連續(xù)管和表面張力閥，所述表面張力閥將所述管分隔成所述多個室。
6.權利要求5的方法,其中所述管由玻璃、聚合物或金屬制成。
7.權利要求5的方法，其中所述管包含被聚合物包被的內(nèi)表面。
8.權利要求1的方法，其中所述顆粒是磁性顆粒、順磁性顆?；蛎芏?gt;I或< I的非磁性顆粒。
9.權利要求8的方法，其中運送包括使磁場沿著所述管傳遞或使所述管經(jīng)受獨特的間歇磁場以實現(xiàn)所述顆粒的運動。
10.權利要求1的方法，其中運送包括向所述裝置施加離心力或重力使得所述顆粒被運送通過所述多個室。
11.權利要求8的方法，其中通過密度驅動的運送來運送密度>I的所述非磁性顆粒。
12.權利要求1的方法，其中所述分析物是蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸、重金屬、有機化合物、細菌、病毒或真菌細胞。
13.權利要求12的方法，其中所述蛋白質(zhì)是抗原、抗體或酶。
14.權利要求1的方法，其中所述反應物是抗體、抗原、螯合劑、脂質(zhì)、碳水化合物、金屬、有機化合物、酶底物或核酸。
15.權利要求1的方法，其中檢測所述分析物與所述反應物的相互作用包括FRET、比色測定、熒光測定、RT-PCR、光密度變化或折射率變化。
16.權利要求1的方法，其中引入包括通過所述第一反應室的壁注射所述樣品。
17.權利要求1的方法，其中引入包括通過毛細作用使所述樣品移動到所述第一反應室中。
18.權利要求1的方法，其中所述樣品是生物學樣品。
19.權利要求17的方法，其中所述生物學樣品是得自于患者的組織或流體樣品。
20.權利要求1的方法，其中所述樣品是環(huán)境樣品。
21.權利要求20的方法，其中所述環(huán)境樣品是土壤樣品、水樣品或植物樣品。
22.權利要求1的方法，其中所述顆粒的直徑為0.1至10微米。
23.權利要求1的方法，其中所述管的直徑是0.5至IO4微米。
24.權利要求1的方法，其中所述基于氣體的表面張力閥包括具有低蒸汽壓和/或低表面張力的非反應性氣體。
25.權利要求24的方法,其中所述非反應性氣體是空氣、二氧化碳、氮氣、氬氣、氦氣或六氟化硫。
26.權利要求25的方法，其中所述非反應性氣體是空氣。
27.包含通過管相連接的多個相繼的室的裝置，每個所述室包含流體并且被基于氣體的表面張力閥隔開。
28.權利要求27的裝置，其中所述裝置包含三個室，所述三個室包括所述第一反應室、第一處理室和第一檢測室，其中所述第一處理室設置在所述第一反應室與所述第一作用室之間。
29.權利要求27的裝置，其中所述裝置包含連續(xù)管和表面張力閥，所述表面張力閥將所述管分隔成所述多個室。
30.權利要求29的裝置，其中所述管由玻璃、金屬或聚合物制成。
31.權利要求29的裝置，其中所述管包含被聚合物包被的內(nèi)表面。
32.權利要求30的裝置，其中所述第一反應室的壁包含有助于注射所述樣品或顆粒的端口。
33.權利要求29的裝置，其中所述管的直徑是0.5至IO4微米。
34.權利要求27的裝置，其中所述基于氣體的表面張力閥包括具有低蒸汽壓和/或低表面張力的非反應性氣體。
35.權利要求34的裝置，其中所述非反應性氣體是空氣、二氧化碳、氮氣、氬氣、氦氣或六氟化硫。
36.權利要求35的裝置，其中所述非反應性氣體是空氣。
37.權利要求27的裝置，其還包含含有表面反應物的顆粒。
38.權利要求27的裝置，其還包含磁場源。
39.處理樣品的方法，其包括: (a)提供包含通過管相連接的多個相繼的室的裝置，每個所述相繼的室包含流體并且被基于氣體的表面張力閥隔開； (b)將包含表面反應物的顆粒引入所述第一反應室中，所述顆粒表面包含結合至所述反應物的分析物； (C)將所述顆粒從所述第一反應室通過設置于其間的管運送到至少第二室中；以及 (d)檢測所述分析物的存在。
40.權利要求39的方法，其還包括使所述顆粒與樣品混合以允許所述分析物與所述顆粒上的所述反應物結合。
41.權利要求39的方法，其中所述顆粒是磁性顆粒、順磁性顆?；蛎芏?gt;I或< I的非磁性顆粒。
42.權利要求41的方法，其中運送包括使磁場沿著所述管傳遞或使所述管經(jīng)受獨特的間歇磁場以實現(xiàn)所述顆粒的運動。
43.權利要求41的方法，其中通過密度驅動的運送來運送密度>I的所述非磁性顆粒。
44.權利要求39的方法，其中運送包括向所述裝置施加離心力使得所述顆粒被運送通過所述多個室。
45.權利要求39的方法，其中所述分析物是蛋白質(zhì)、多肽、脂質(zhì)、碳水化合物、核酸、重金屬、有機化合物、細菌、病毒或真菌細胞。
46.權利要求45的方法，其中所述蛋白質(zhì)是抗原、抗體或酶。
47.權利要求39的方法，其中所述反應物是抗體、抗原、螯合劑、脂質(zhì)、碳水化合物、金屬、有機化合物、酶底物或核酸。
48.權利要求39的方法，其中檢測所述分析物與所述反應物的相互作用包括FRET、比色測定、熒光測定、RT-PCR、光密度變化或折射率變化。
49.權利要求39的方法，其中引入包括通過所述第一反應室的壁注射所述顆粒。
50.權利要求49的方法，其中引入包括通過毛細作用使所述樣品移動到所述第一反應室中。
51.權利要求40的方法，其中所述樣品是生物學樣品或環(huán)境樣品。
52.權利要求51的方法，其中所述生物學樣品是得自于患者的組織或流體樣品。
53.權利要求40的方法，其中所述樣品是環(huán)境樣品。
54.權利要求53的方法，其中所述環(huán)境樣品是土壤樣品、水樣品或植物樣品。
55.權利要求39的方法，其中所述裝置包含至少三個室。
56.權利要求55的方法，其中所述裝置包含所述第一反應室、第一處理室和第一檢測室，其中所述第一處理室設置在所述第一反應室與所述第一作用室之間。
57.權利要求55的方法，其還包括反轉所述顆粒的運送以將所述顆粒再引入其已經(jīng)通過的室中。
58.權利要求39的方法，其中所述基于氣體的表面張力閥包括具有低蒸汽壓和/或低表面張力的非反應性氣體。
59.權利要求58的方法，其中所述非反應性氣體是空氣、二氧化碳、氮氣、氬氣、氦氣或六氟化硫。
60.權利要求59的方法，其中所述非反應性氣體是空氣。
61.試劑盒，其包括包含管的裝置，所述管包含多個相繼的室，每一個所述室包含流體并且被基于氣體的表面張力閥隔開。
62.權利要求61的試劑盒，其還包括設置在所述室至少之一中的顆粒，或者還包括設置在不同容器中的顆粒。
全文摘要
本發(fā)明描述了使用用于處理樣品的低資源裝置來隔離、分離和檢測分子物類的系統(tǒng)和方法。方法包括根據(jù)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、DNA-DNA和其他化學相互作用來隔離、分離和檢測分子物類。
文檔編號B01L3/00GK103153467SQ201180044832
公開日2013年6月12日 申請日期2011年7月15日 優(yōu)先權日2010年7月16日
發(fā)明者里克·哈茲爾頓 申請人:范德比爾特大學