專利名稱：親和色譜基質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及親和色譜法領(lǐng)域，且更具體涉及含有配體的分離基質(zhì)，所述配體含有一個(gè)或多個(gè)蛋白A結(jié)構(gòu)域(E、D、A、B、C)或蛋白Z，具有在至少一個(gè)單體中最接近C末端的脯氨酸殘基(C-terminal most proline residue)的氨基酸取代。本發(fā)明還涉及用具有增加能力(capacity)的優(yōu)勢(shì)的前述基質(zhì)分離目標(biāo)蛋白質(zhì)的方法。
_2]
背景技術(shù)：
免疫球蛋白為全球范圍內(nèi)生產(chǎn)或研發(fā)中最普遍的生物制藥產(chǎn)品。其特定治療市場(chǎng)的高度商業(yè)化需求和由此帶來的價(jià)值已導(dǎo)致制藥公司將重點(diǎn)放在將其各自的mAb生產(chǎn)過程的生產(chǎn)力最大化，同時(shí)控制相關(guān)的成本。大多數(shù)情況下使用親和色譜法作為這些免疫球蛋白分子(例如單克隆或多克隆抗體)純化中的關(guān)鍵步驟之一。特別有意義的一類親和試劑是能特異性結(jié)合免疫球蛋白分子的恒定部分的蛋白質(zhì)，這樣的相互作用不依賴于抗體的抗原結(jié)合特異性。這樣的試劑可廣泛用于從不同樣本中用親和色譜法回收免疫球蛋白，所述樣本例如但不限于血清或血漿制備物或得自細(xì)胞培養(yǎng)物的原料。這樣的蛋白質(zhì)的一個(gè)實(shí)例為葡萄球菌蛋白A，其含有能與不同物種的IgG免疫球蛋白的Fe和Fab部分相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域?；谄咸亚蚓鞍譇 (SpA)的試劑因?yàn)槠涓叨扔H和力和選擇性在生物技術(shù)領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了廣泛的用途，例如用于捕獲和純化抗體以及檢測(cè)的親和色譜法。目前，基于SpA的親和介質(zhì)可能是最廣泛使用的從不同樣本中分離單克隆抗體及其片段的親和介質(zhì)，所述樣本包括來自細(xì)胞培養(yǎng)物的工業(yè)原料。因此，各種包含蛋白A配體的基質(zhì)可市購(gòu)獲得，例如以天然蛋白 A 的形式(例如Protein A SEPHAROSE , GE Healthcare, Uppsala, Sweden),還可由重組蛋白A組成(例如rProtein A SEPHAROSE , GE Healthcare)。更具體地說,在市售的重組蛋白A產(chǎn)品中進(jìn)行的基因操作的目的在于促進(jìn)其附著至支持物。這些應(yīng)用，與其他親和色譜法應(yīng)用類似，需要充分注意一定要去除雜質(zhì)。這樣的雜質(zhì)可例如為色譜程序中吸附在固定相或基質(zhì)上的非洗脫分子，例如不期望的生物分子或微生物，包括例如蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、細(xì)菌和病毒。通常在所期望產(chǎn)品的第一次洗脫之后從基質(zhì)上去除這樣的雜質(zhì)，以便于在后續(xù)使用之前使基質(zhì)再生。這樣的去除通常涉及稱為原位清洗(cleaning-1n-place, CIP)的程序,其中使用能從固定相上洗脫雜質(zhì)的試劑。經(jīng)常使用的一類這樣的試劑為流過所述固定相的堿性溶液。目前最廣泛使用的清洗和清潔試劑為NaOH，其濃度范圍可為0.1M直到例如I M，這依賴于雜質(zhì)的程度和種類。這個(gè)策略涉及將基質(zhì)暴露于超過13的pH值中。對(duì)許多含有蛋白性質(zhì)的親和配體的親和色譜基質(zhì)來說，這樣的堿性環(huán)境為非?？量痰臈l件，因此由于配體對(duì)有關(guān)高PH的不穩(wěn)定性而導(dǎo)致能力下降。因此，廣泛的研究已集中在工程改造蛋白質(zhì)配體的研制上，所述蛋白質(zhì)配體顯示出耐受堿性pH值的能力提高。例如，Giilich等 (Susanne Giilich, Martin Linhult,Per-Ake Nygrenj Mathias Uhlenj Sophia Hoberj Journal of Biotechnology 80(2000), 169-178)提出了蛋白質(zhì)工程改造，以在堿性環(huán)境中提高葡萄球菌白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ABD)的穩(wěn)定性。GUlich等創(chuàng)建了 ABD的突變體，其中所有的4個(gè)天冬酰胺殘基被亮氨酸(I個(gè)殘基)、天冬氨酸(2個(gè)殘基)和賴氨酸(I個(gè)殘基)置換。此外，GUlich等報(bào)道了其突變體顯示類似于天然蛋白的靶蛋白結(jié)合特性，并且在重復(fù)暴露于堿性環(huán)境后，含有工程改造的配體的親和柱比用親本未改造的配體制備的親和柱顯示出更高的結(jié)合能力。因此，從中推斷出可置換所有的4個(gè)天冬酰胺殘基而對(duì)結(jié)構(gòu)和功能沒有任何明顯的影響。近期研究表明也可改變蛋白A (SpA)來影響類似的性質(zhì)。美國(guó)專利申請(qǐng)公布US2005/0143566公開了當(dāng)至少I個(gè)天冬酰胺殘基突變成非谷氨酰胺或天冬氨酸時(shí)，與親本SpA (例如SpA的B結(jié)構(gòu)域)或蛋白Z (源自SpA的B結(jié)構(gòu)域的合成構(gòu)建體(US 5，143，844))相比，該突變賦予了在高達(dá)約13-14的pH值下增加的化學(xué)穩(wěn)定性。作者證明當(dāng)這些突變的蛋白質(zhì)用作親和配體時(shí)，預(yù)想的分離介質(zhì)可更好地耐受使用堿性試劑的清洗程序。US2006/0194955顯示突變的配體可更好地耐受蛋白酶從而減少配體在分離過程中的漏失。另外一個(gè)公布US 2006/0194950顯示可進(jìn)一步修飾堿穩(wěn)定的SpA結(jié)構(gòu)域以使配體缺失對(duì)Fab的親和力但保留對(duì)Fe的親和力，例如通過G29A突變。在過去，含有5個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的天然蛋白A用于生產(chǎn)所有的蛋白A親和介質(zhì)。使用重組技術(shù)，已經(jīng)產(chǎn)生出許多蛋白A的構(gòu)建體，它們都含有4個(gè)或5個(gè)IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域。近期研究表明，與四聚體配體相比較，二聚體配體有類似或增加的結(jié)合能力(W02010/080065)。在該領(lǐng)域仍有需要獲得包含具有增加的結(jié)合能力的蛋白質(zhì)配體的分離基質(zhì)。發(fā)明概沭
本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提供能結(jié)合免疫球蛋白的蛋白質(zhì)配體，所述免疫球蛋白例如IgG、IgA和/或IgM,優(yōu)選通過其Fe片段結(jié)合。這些配體具有在至少I個(gè)蛋白A的單體結(jié)構(gòu)域(E、D、A、B、C)或蛋白Z中第三個(gè)α螺旋后最接近C末端的脯氨酸殘基的取代，因此與沒有取代的配體相比較有更高的結(jié)合能力。配體優(yōu)選為多聚體，即含有超過一個(gè)選自蛋白A的單體結(jié)構(gòu)域(E、D、A、B、C)和蛋白Z。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供親和分離基質(zhì)，其包含能結(jié)合免疫球蛋白的配體，所述免疫球蛋白例如IgG、IgA和/或IgM，優(yōu)選通過其Fe片段結(jié)合，如上所述。本發(fā)明的又一目標(biāo)是提供用本發(fā)明親和基質(zhì)分離一種或多種含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的方法。通過使用具有取代的親和配體，出乎意料的是，本方法實(shí)現(xiàn)對(duì)靶分子的結(jié)合能力增加。因此，本發(fā)明提供了一種方法用以產(chǎn)生純化的產(chǎn)物，例如純化的免疫球蛋白分離物或除掉免疫球蛋白后剩余的液體，或者用以檢測(cè)樣本中免疫球蛋白的存在。本發(fā)明的配體顯示增加的能力，這使配體成為節(jié)省成本且大規(guī)模實(shí)施的有吸引力的候選。按所附權(quán)利要求所述可實(shí)現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)上述目標(biāo)。附圖簡(jiǎn)沭


圖1顯示蛋白Z的氨基酸序列，第57位的脯氨酸用粗體顯示(SEQ ID NO: 2)。圖2a顯示假設(shè)的四聚體配體結(jié)構(gòu)，每個(gè)單體是蛋白A的結(jié)構(gòu)域(E、D、A、B、C)或蛋白Z，由于每個(gè)單體中最接近C末端的脯氨酸的存在，因此在每個(gè)結(jié)構(gòu)域之間含有60°的轉(zhuǎn)角。

圖2b顯示配體和IgG之間的假設(shè)的結(jié)合，其中一個(gè)IgG結(jié)合兩個(gè)單體結(jié)構(gòu)域(兩個(gè)Fe鏈由圓環(huán)表示，分別結(jié)合一個(gè)單體結(jié)構(gòu)域)。圖2c顯示在單體結(jié)構(gòu)域之間假設(shè)的更線性和柔性的多聚體配體結(jié)構(gòu)，其歸因于在每個(gè)結(jié)構(gòu)域中最接近C末端的脯氨酸取代為其他氨基酸殘基。圖2d顯示蛋白A的5個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列的比對(duì)。圖3顯示動(dòng)力學(xué)結(jié)合能力試驗(yàn)的代表性色譜結(jié)果。發(fā)明詳沭 定義
術(shù)語“蛋白質(zhì)”在本文用以描述蛋白質(zhì)及其片段。因此，術(shù)語“蛋白質(zhì)”包括顯示三維結(jié)構(gòu)的任何氨基酸鏈，并且相應(yīng)地包括蛋白質(zhì)片段。術(shù)語蛋白質(zhì)的“功能性變體”在本文意指變體蛋白質(zhì)，其中與本發(fā)明所定義的親和力和穩(wěn)定性有關(guān)的功能被基本保留。因此與所述功能不相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可能被替換。術(shù)語“親本分子”在本文指在本發(fā)明的突變引入前形式的相應(yīng)蛋白質(zhì)。術(shù)語“結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性”指分子的三維形狀的完整性，而“化學(xué)穩(wěn)定性”指耐受化學(xué)降解的能力。術(shù)語“Fe片段結(jié)合”蛋白意指蛋白質(zhì)能夠結(jié)合免疫球蛋白的Fe片段。然而，并不排除Fe片段結(jié)合蛋白還能結(jié)合其他區(qū)域，例如免疫球蛋白的Fab區(qū)。在本說明書中，如果沒有通過其全稱提及氨基酸，那么用慣例的單字母符號(hào)表示 氨基酸。突變?cè)诒疚闹杏帽惶鎿Q的位置的編號(hào)來定義，野生型或非突變的氨基酸在前，突變的氨基酸在后。因此，例如在第23位上天冬酰胺突變成蘇氨酸表示為N23T。一方面，本發(fā)明涉及從液體中分離一種或多種含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括(a)使液體與含有固定在支持物上的配體的分離基質(zhì)接觸；(b)通過與配體相互作用使含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)吸附到基質(zhì)上；(c)清洗被吸附的含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的任選步驟；和(d)通過使基質(zhì)與釋放蛋白質(zhì)的洗脫液接觸以回收含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)。本方法通過使用配體提供配體對(duì)免疫球蛋白分子增加的結(jié)合能力，每個(gè)配體包含一個(gè)或多個(gè)葡萄球菌蛋白A (SpA) (E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性變體的結(jié)構(gòu)域(SP，單體)，其中在所述一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域中的至少一個(gè)中最接近C末端的脯氨酸被取代為其他氨基酸。免疫球蛋白結(jié)合蛋白(即，配體)可以是具有天然的免疫球蛋白結(jié)合能力的任何蛋白質(zhì)，例如葡萄球菌蛋白A (SpA)或葡萄球菌蛋白G (SpG)，或含有這些蛋白質(zhì)的IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重組蛋白質(zhì)。其他這樣的蛋白質(zhì)的綜述可參見例如Kronvall, G., Jonsson,K.Receptins: a novel term for an expanding spectrum of natural and engineeredmicrobial proteins with binding properties for mammalian proteins, J.MoLRecognit.1999 Jan-Feb; 12 (I): 38-44。配體可包含一個(gè)或多個(gè) SpA 的 E、D、A、B 和 C 結(jié)構(gòu)域。配體更優(yōu)選包含蛋白A的結(jié)構(gòu)域B或工程改造的蛋白Z。每一個(gè)蛋白Z或蛋白A結(jié)構(gòu)域包含靠近C末端的脯氨酸(P57)(參見例如圖1、圖2d和SEQ ID N0.1-8)。已知脯氨酸由于其結(jié)構(gòu)(即側(cè)鏈連接在α氮上)可在蛋白質(zhì)中提供轉(zhuǎn)角。這種連接限制為Φ =約60°的成鍵角度，因此在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生轉(zhuǎn)角。經(jīng)典實(shí)例可參見IgG的鉸鏈，其中可存在脯氨酸。因此，當(dāng)脯氨酸存在于C末端時(shí)，蛋白A的每個(gè)結(jié)構(gòu)域或蛋白Z以60°鍵角結(jié)束，在結(jié)構(gòu)域之間產(chǎn)生轉(zhuǎn)角(圖2a-2c)。最接近C末端的脯氨酸既不涉及Fe 結(jié)合(Graille 等，PNAS 2000, 97 (10): 5399-5404; Deisenhofer, Biochemistry1981，20 (9): 2361-2370)，也不是α螺旋的一部分(脯氨酸不可能形成α螺旋)。因此，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)限制，由每個(gè)結(jié)構(gòu)域中C末端脯氨酸的存在可導(dǎo)致蛋白A/蛋白Z配體的單體結(jié)構(gòu)域的利用率很低(在總過載下二中之一被使用)，即位阻現(xiàn)象。有可能在配體中兩個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合一個(gè)IgG分子，因此阻礙了 IgG接近所有其他的結(jié)構(gòu)域(圖2b)。這樣的結(jié)合還可暗示了 IgG與配體的結(jié)合更強(qiáng)。本發(fā)明的某些實(shí)施方案取代了在每個(gè)結(jié)構(gòu)域中最接近C末端的脯氨酸(SEQ ID NO:1或2的P57)，以實(shí)現(xiàn)每個(gè)結(jié)構(gòu)域的利用率更高從而增加的配體能力，這可能歸因于單體結(jié)構(gòu)域之間更線性和/或柔性的多聚配體結(jié)構(gòu)(圖2c)。如圖2d所示，蛋白A的5個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的序列高度相關(guān)。沒有缺失或插入，且許多取代是對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)或功能引起最小可能變化的保守改變。例如，在整個(gè)58個(gè)氨基酸的多肽內(nèi)在B結(jié)構(gòu)域和C結(jié)構(gòu)域之間只有4個(gè)改變。因此，在每個(gè)這些結(jié)構(gòu)域中C末端脯氨酸對(duì)蛋白A或含有所述結(jié)構(gòu)域的配體具有類似的結(jié)構(gòu)/功能貢獻(xiàn)。同樣地，脯氨酸的改變對(duì)含有這種改變的配體的結(jié)構(gòu)/功能產(chǎn)生類似的影響。在某些實(shí)施方案中，脯氨酸被取代為優(yōu)選形成β折疊的氨基酸。脯氨酸優(yōu)選被取代為大體積氨基酸或產(chǎn)生“剛性”的氨基酸，例如Y、W、F、M、1、V、T。取代更優(yōu)選為P57I。在另外的實(shí)施方案中，脯氨酸被取代為易于形成α螺旋的氨基酸，例如E、A、L、H、M、Q、K。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，親本分子包含由SEQ ID NO: 1_8所定義的序列或其任何功能性變體。在某些實(shí)施方案中，在多聚體配體的至少一個(gè)單體結(jié)構(gòu)域中最接近C末端的脯氨酸殘基被取代。在另外的實(shí)施方案中，在多聚體配體的所有單體結(jié)構(gòu)域中最接近C末端的脯氨酸殘基被取代。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體還呈現(xiàn)堿穩(wěn)定性，例如通過將SpA結(jié)構(gòu)域B或蛋白Z的至少一個(gè)單體結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)天冬酰胺殘基突變?yōu)榉枪劝滨０返陌被醽韺?shí)現(xiàn)。如早期所討論，US專利申請(qǐng)公布US 2005/0143566公開了當(dāng)至少一個(gè)天冬酰胺殘基被突變?yōu)榉枪劝滨０坊蛱於彼岬陌被釙r(shí)，該突變賦予配體在高PH下增加的化學(xué)穩(wěn)定性(例如，N23T)。此外，包含這些配體的親和介質(zhì)能更好地耐受使用堿性試劑的清洗程序。US 2006/0194955顯示突變的配體還能更好地耐受蛋白酶，從而減少在分離過程中的配體漏失。因此，這些申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過引用其整體而結(jié)合到本文中。在另一實(shí)施方案中，這樣制備的配體對(duì)抗體的Fab部分缺少任何顯著的親和力，而對(duì)Fe部分有親和力。因此，在某些實(shí)施方案中，配體的至少一個(gè)甘氨酸被丙氨酸取代。US2006/0194950顯示堿穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域可被進(jìn)一步修飾從而使配體缺少對(duì)Fab的親和力而保持Fe親和力，例如通過G29A突變來實(shí)現(xiàn)。因此，該申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過引用其整體而結(jié)合到本文中。本文所用的氨基酸編號(hào)方式為本領(lǐng)域常規(guī)使用的方式，以蛋白A的結(jié)構(gòu)域B上的位置為例，且本領(lǐng)域的技術(shù)人員可容易地識(shí)別每個(gè)E、D、A、B、C結(jié)構(gòu)域或蛋白Z的突變位置。

在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，配體被制成結(jié)構(gòu)域B的多聚體拷貝，并且通過將至少一個(gè)天冬酰胺殘基突變?yōu)榉枪劝滨０返陌被?例如N23T)以獲得結(jié)構(gòu)域B的堿穩(wěn)定性；并且含有在堿穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域B的第29位上的氨基酸殘基的突變，例如G29A突變。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將配體制成蛋白Z的多聚體拷貝，其中通過將至少一個(gè)天冬酰胺殘基突變?yōu)榉枪劝滨０返陌被嵋垣@得堿穩(wěn)定性。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，通過將至少第23位天冬酰胺殘基突變?yōu)榉枪劝滨０返陌被嵋垣@得堿穩(wěn)定性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解，可用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)以任何的次序進(jìn)行P57的取代、提供堿穩(wěn)定性的突變以及G到A的突變。此外，可用含有編碼突變的蛋白配體的核酸序列的載體表達(dá)配體。或者，可通過蛋白質(zhì)合成技術(shù)制備配體。合成預(yù)先確定序列的肽和蛋白質(zhì)的方法為本領(lǐng)域所熟知且普遍可被使用。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語“葡萄球菌蛋白A的堿穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域B”意指基于SpA的結(jié)構(gòu)域B的堿穩(wěn)定蛋白質(zhì)，例如在US專利申請(qǐng)公布US 2005/0143566和US 2006/0194950中描述的突變蛋白質(zhì)；還指其他來源但具有功能上等效的氨基酸序列的其他堿穩(wěn)定蛋白質(zhì)。如技術(shù)人員所理解，表達(dá)的蛋白質(zhì)在固定到支持物上之前應(yīng)被純化到適當(dāng)?shù)某潭?。這樣的純化方法為本領(lǐng)域所熟知，且使用標(biāo)準(zhǔn)方法可容易地將基于蛋白質(zhì)的配體固定到支持物上。適當(dāng)?shù)姆椒ê椭С治飳⒃谙旅娓敿?xì)地討論。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的突變蛋白質(zhì)包含至少約75%，例如至少約80%或優(yōu)選至少約95%的SEQ ID NO:1或2所定義的序列，前提是在第21位沒有天冬酰胺突變。在本說明書中，SEQ ID NO:1定義了 SpA的B結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列:
Ala Asp Asn Lys Phc Asn Lys Glu Otn Gtn Asn Ala Phc Tyr Glu flc
Lcu His Lcu Pro` Asn Lcu Asn Glu Glu Gtn Arg Asn Cily Phc Jle Gln
Scr Lcu Lyh Asp Asp Pro Scr GIn Scr Aki Asii Lcu Leo Ak Glu Ala Ιλ% Lys Lcti Asn Αψ Ala Gln AIn Pai Lys。SEQ ID NO: 2定義了稱為蛋白Z的蛋白質(zhì):
VaI Asp Asn Ly.s Phe Asn Ly.s GIu GIn GIn Asn Ala Phe TyrGlu He Lcu Hw Leu Pro Asn Lcu A^rt Glti GIu Gtn Arg Asn Ala Phc He GIn
o
Scr Leu Lys Asp Α,ψ Pai Ser Gln Ser Ala Am L-cu 1-.cn Ah Glii Ala Lv*s L\rs Lcii Asn Asp Ala Ciln Ala Pro Lvs
f ' if ——- ' '' I'— ' ' 'a蛋白Z為源自SpA的B結(jié)構(gòu)域的合成構(gòu)建體，其中在第29位的甘氨酸被置換為丙氨酸，參見例如生物過程技術(shù)百科全書:發(fā)酵、生物催化和生物分離(The Encyclopediaof Bioprocess Technology: Fermentation, Biocatalysis and Bioseparation), M.C.Fleckinger 和 S.W.Drew 編輯，John Wiley and Sons Inc., New York, 8-22 中的Stihl等，1999:生物技術(shù)中的親和融合:聚焦蛋白A和蛋白G (Affinity fusions inbiotechnology: focus on protein A and protein G)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，上述突變蛋白質(zhì)包含SEQ ID NOs:1或2定義的氨基酸序列，或?yàn)槠渚哂蠵57取代的功能性變體。在另一實(shí)施方案中，上述突變蛋白質(zhì)包含SEQ ID NOs:4-8定義的氨基酸序列，或?yàn)槠渚哂蠵57取代的功能性變體。本文中所用的術(shù)語“功能性變體”包括任何類似的序列，其包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上的進(jìn)一步變異，所述變異不影響突變蛋白質(zhì)對(duì)免疫球蛋白的親和力，或不影響其在增加的PH值環(huán)境中所改進(jìn)的化學(xué)穩(wěn)定性。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中,本發(fā)明的P57取代選自大體積氨基酸或產(chǎn)生“剛性”的氨基酸，例如Y、W、F、M、1、V、T ;且其中親本分子包含由SEQ ID NO: 1_8定義的序列，或其任何功能性變體。在另一實(shí)施方案中，P57被易于形成α螺旋的氨基酸取代，例如E、A、L、
H、M、Q、K，且其中親本分子包含由SEQ ID NO: 1-8定義的序列，或其任何功能性變體。取代更優(yōu)選為P57I。如上所述，為獲得用作在堿性條件下具有長(zhǎng)時(shí)間的高度結(jié)合能力配體的突變蛋白質(zhì)，應(yīng)避免在第21位上的天冬酰胺殘基的突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第3位上的天冬酰胺殘基沒有突變。在某些實(shí)施方案中，在多聚體配體的至少一個(gè)單體中最接近C末端的脯氨酸殘基被取代。在另外的實(shí)施方案中，在多聚體配體的所有單體中最接近C末端的脯氨酸殘基被取代。 在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，位于亮氨酸殘基和谷氨酰胺殘基之間的天冬酰胺殘基還被突變?yōu)槔缣K氨酸殘基。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，由SEQ ID NO: 2定義的序列的第23位上的天冬酰胺殘基被突變?yōu)槔缣K氨酸殘基。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，由SEQ IDNO: 2定義的序列的第43位上的天冬酰胺殘基還被突變?yōu)槔绻劝彼?。在?3位氨基酸被突變的實(shí)施方案中，最有利的是與至少一個(gè)其他的突變聯(lián)合，例如N23T。因此，本發(fā)明包括以上論述的單體突變蛋白質(zhì)。然而，這樣的蛋白質(zhì)單體可組合成多聚體配體,例如二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體等。因此,本發(fā)明的另一方面為包含至少一個(gè)本發(fā)明的突變蛋白質(zhì)及一個(gè)或多個(gè)其他單元的多聚體，其他單元優(yōu)選同樣為本發(fā)明的突變蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明為例如由兩個(gè)重復(fù)單元組成的二聚體，或由四個(gè)重復(fù)單元組成的四聚體。在某些實(shí)施方案中，多聚配體包含兩個(gè)或更多個(gè)(例如2-4個(gè))拷貝的相同單體結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域來自蛋白A的結(jié)構(gòu)域E、D、A、B、C或蛋白Z或任何功能性變體。在另外的實(shí)施方案中，多聚體配體包含兩個(gè)或更多個(gè)(例如2-4個(gè))不同的單體結(jié)構(gòu)域，其選自蛋白A的結(jié)構(gòu)域E、D、A、B、C或蛋白Z或任何功能性變體
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多聚體包含連接有一段氨基酸(優(yōu)選長(zhǎng)度為0-15個(gè)氨基酸，例如0-10或5-10個(gè)氨基酸)的單體單元。這類連接物的性質(zhì)應(yīng)優(yōu)選不會(huì)蛋白質(zhì)單元的空間構(gòu)像不穩(wěn)定。此外，所述連接物還應(yīng)優(yōu)選為在堿性環(huán)境中足夠穩(wěn)定，不削弱突變的蛋白質(zhì)單元的性質(zhì)。在另一實(shí)施方案中， 本發(fā)明的二聚體配體包括SEQ ID NO: 3的序列:
權(quán)利要求
1.從液體中分離一種或多種含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括: (a)使所述液體與含有固定在支持物上的配體的分離基質(zhì)接觸； (b)通過與配體相互作用，使所述含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)吸附到基質(zhì)上； (c)洗滌被吸附的含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的任選步驟； (d)通過使基質(zhì)與釋放蛋白質(zhì)的洗脫液接觸回收所述含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)； 改進(jìn)之處在于每種所述的配體含有一個(gè)或多個(gè)葡萄球菌蛋白A (SpA)的結(jié)構(gòu)域(單體)(E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性變體，其中在至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域中最接近C末端的脯氨酸被取代為任何其他的氨基酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的一個(gè)或多個(gè)蛋白A的結(jié)構(gòu)域或蛋白Z為兩個(gè)或更多個(gè)來自相同結(jié)構(gòu)域E、D、A、B、C或蛋白Z的拷貝。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)蛋白A的結(jié)構(gòu)域或蛋白Z為兩個(gè)或更多個(gè)選自結(jié)構(gòu)域E、D、A、B、C或蛋白Z的結(jié)構(gòu)域。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)蛋白A的結(jié)構(gòu)域或蛋白Z選自結(jié)構(gòu)域B、結(jié)構(gòu)域C或蛋白Z。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在多聚體配體的至少一個(gè)單體中最接近C末端的脯氨酸被取代為其他的氨基酸。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在多聚體配體的所有單體中最接近C末端的脯氨酸被取代為其他的氨基酸 。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在至少一個(gè)單體中最接近C末端的脯氨酸被取代為選自Y、W、F、M、1、V、T的氨基酸。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在至少一個(gè)單體中最接近C末端的脯氨酸被取代為異亮氨酸。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中在至少一個(gè)單體中最接近C末端的脯氨酸被取代為選自E、A、L、H、M、Q、K的氨基酸。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體通過將至少一個(gè)天冬酰胺殘基突變成非谷氨酰胺的氨基酸而具有堿穩(wěn)定性。
11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體具有對(duì)免疫球蛋白的Fe部分的親和力，但缺乏對(duì)免疫球蛋白的Fab部分的親和力。
12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體的至少一個(gè)甘氨酸被取代為丙氨酸。
13.權(quán)利要求11或12的方法，其中對(duì)應(yīng)于蛋白A的B結(jié)構(gòu)域的第29位的甘氨酸殘基被替換為丙氨酸。
14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述配體為蛋白Z，其中通過將至少一個(gè)天冬酰胺殘基突變成非谷氨酰胺的氨基酸而獲得堿穩(wěn)定性。
15.權(quán)利要求14的方法，其中通過將至少第23位的天冬酰胺殘基突變成非谷氨酰胺的氣基酸而獲得蛋白Z的喊穩(wěn)定性。
16.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述多聚體為二聚體。
17.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述多聚體為四聚體。
18.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)為單克隆抗體。
19.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)為多克隆抗體。
20.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)的方法，其中所述含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)為含有與其他蛋白質(zhì)融合的免疫球蛋白Fe部分的融合蛋白。
21.用于分離含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的配體，所述配體包含一個(gè)或多個(gè)葡萄球菌蛋白A (SpA)的結(jié)構(gòu)域(單體)(E、D、A、B、C)或蛋白Z或其功能性變體，其中在至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域中最接近C末端的脯氨酸被取代為任何其他氨基酸。
22.權(quán)利要求21的配體，其中所述一個(gè)或多個(gè)蛋白A的結(jié)構(gòu)域或蛋白Z為兩個(gè)或更多個(gè)來自同樣的結(jié)構(gòu)域E、D、A、B、C或蛋白Z的拷貝。
23.權(quán)利要求1的配體，其中所述一個(gè)或多個(gè)蛋白A的結(jié)構(gòu)域或蛋白Z為兩個(gè)或更多個(gè)選自結(jié)構(gòu)域E、D、A、B、C或蛋白Z的結(jié)構(gòu)域。
24.權(quán)利要求1的配體，其中所述一個(gè)或多個(gè)蛋白A的結(jié)構(gòu)域或蛋白Z選自結(jié)構(gòu)域B、結(jié)構(gòu)域C或蛋白Z。
25.權(quán)利要求21-24中任一項(xiàng)的配體，其中在多聚體配體的至少一個(gè)單體中最接近C末端的脯氨酸被取代成其他氨基酸。
26.權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的配體，其中在多聚體配體的所有單體中最接近C末端的脯氨酸被取代成其他氨基酸。
27.權(quán)利要求21-26中任一項(xiàng)的配體，其中在至少一個(gè)單體中最接近C末端的脯氨酸被取代為選自Y、W、F、M、1、V、T的氨基酸。
28.權(quán)利要求21-27中任一項(xiàng)的配體，其中在至少一個(gè)單體中最接近C末端的脯氨酸被取代成異亮氨酸。`
29.權(quán)利要求21-28中任一項(xiàng)的配體，其中在至少一個(gè)單體中最接近C末端的脯氨酸被取代為選自E、A、L、H、M、Q、K的氨基酸。
30.權(quán)利要求21-29中任一項(xiàng)的配體，其中所述配體通過將至少一個(gè)天冬酰胺殘基突變成非谷氨酰胺的氨基酸而具有堿穩(wěn)定性。
31.權(quán)利要求21-30中任一項(xiàng)的配體，其中所述配體具有對(duì)免疫球蛋白的Fe部分的親和力，而缺乏對(duì)免疫球蛋白的Fab部分的親和力。
32.權(quán)利要求21-31中任一項(xiàng)的配體，其中所述配體的至少一個(gè)甘氨酸被取代成丙氨酸。
33.權(quán)利要求31或32的配體，其中對(duì)應(yīng)于蛋白A的B結(jié)構(gòu)域的第29位的甘氨酸殘基被替換成丙氨酸。
34.權(quán)利要求21-33中任一項(xiàng)的配體，其中所述配體為蛋白Z，其中通過將至少一個(gè)天冬酰胺殘基突變成非谷氨酰胺的氨基酸而獲得堿穩(wěn)定性。
35.權(quán)利要求34的配體，其中通過將至少第23位的天冬酰胺殘基突變成非谷氨酰胺的氣基酸而獲得蛋白Z的喊穩(wěn)定性。
36.權(quán)利要求21-35中任一項(xiàng)的配體，其中所述多聚體為二聚體或四聚體。
37.包含至少一個(gè)權(quán)利要求21-36中任一項(xiàng)的配體的分離基質(zhì)，所述配體被偶聯(lián)在固體支持物上。
38.權(quán)利要求37的分離基質(zhì)，其中所述固體支持物包括多糖，例如瓊脂或瓊脂糖。
39.權(quán)利要求37-38中任一項(xiàng)的分離基質(zhì)，其中所述固體支持物是交聯(lián)的。
40.權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)的分離基質(zhì)，其中所述配體通過硫醚鍵偶聯(lián)。
41.權(quán)利要求37-40中任一項(xiàng)的分離基質(zhì)，其中所述基質(zhì)的配體含量為5-15mg/ml，例如 5-1 0 mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及從液體中分離一種或更多種含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的方法。本方法包括首先將液體與含有固定在支持物上的配體的分離基質(zhì)接觸；使含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)通過與配體相互作用吸附到基質(zhì)上；然后進(jìn)行洗滌被吸附的含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)的任選步驟；和通過使基質(zhì)與釋放蛋白質(zhì)的洗脫液接觸而回收所述的含有免疫球蛋白的蛋白質(zhì)。本方法改進(jìn)了以前的分離方法，其中每個(gè)配體包含一個(gè)或多個(gè)蛋白A結(jié)構(gòu)域(E，D，A，B，C)或蛋白Z或其功能性變體，其中至少一個(gè)單體具有第三個(gè)α-螺旋后最接近C末端的脯氨酸殘基的取代。
文檔編號(hào)B01D15/38GK103228328SQ201180056577
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月29日
發(fā)明者T.畢約克曼, G.羅德里戈 申請(qǐng)人:通用電氣健康護(hù)理生物科學(xué)股份公司