專利名稱：一種具有皮升級(jí)精度的自動(dòng)化微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的領(lǐng)域?yàn)楦咄亢Y選領(lǐng)域，特別涉及一種具有皮升級(jí)精度的自動(dòng)化微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法。
背景技術(shù)：
高通量篩選系統(tǒng)起源于藥物篩選的研究，它主要以96或者384孔板為陣列化反應(yīng)器，通過(guò)自動(dòng)化機(jī)器人進(jìn)行液體分配和試樣混合，采用高靈敏、高速的檢測(cè)裝置和數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和處理，實(shí)現(xiàn)每天至少10，000樣的篩選通量。由于其強(qiáng)大的篩選和分析功能，高通量篩選技術(shù)的應(yīng)用范圍已從藥物篩選擴(kuò)展到生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)等多個(gè)科學(xué)領(lǐng)域。然而，隨著新的靶標(biāo)和樣本量的迅速增加，基于多孔板的商品化高通量液體處理與篩選系統(tǒng)逐漸面臨巨大的挑戰(zhàn)。用于篩選的化合物主要來(lái)源于人工合成或從天然產(chǎn)物中分離純化得到，成本較高。目前，基于多孔板的高通量篩選系統(tǒng)的試樣消耗體積在1-100微升。如果能在皮升至納升級(jí)的水平上操縱液體，來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行篩選，則有可能將其成本降低1000-100000倍。因此，無(wú)論是在工業(yè)界還是在學(xué)術(shù)界，大量的研究均集中在高通量篩選系統(tǒng)的微型化。比如，英國(guó)Douglas公司研制OryxNano系列液體處理裝置的最小液體處理體積是 100 納升(http://www. douglas. co. uk/oryxnano. htm)。英國(guó) TTP LabTech 公司研制的Mosquito系列液體處理裝置的最小液體操縱體積達(dá)到25納升(www. ttplabtech. com/products/mosquito/)ο這些儀器的應(yīng)用顯著的降低了篩選和研發(fā)的成本。然而，目前仍然缺少可在幾個(gè)納升甚至皮升級(jí)體積上進(jìn)行液體操縱和高通量篩選的技術(shù)和裝置。皮升級(jí)高通量篩選的研究難點(diǎn)主要體現(xiàn)在1)現(xiàn)有儀器設(shè)備難以在皮升級(jí)進(jìn)行可靠的液體操縱，比如準(zhǔn)確液體量取、液體轉(zhuǎn)移、試樣混合等；2)隨著液體體積的縮小，蒸發(fā)效應(yīng)顯著增加。比如在典型實(shí)驗(yàn)室條件下，一個(gè)皮升級(jí)的水相液滴會(huì)在I秒內(nèi)完全揮發(fā)；3)微體系下的液體具有極大的比表面積，由于水/氣界面和水/固界面上的分子自組裝或者非特異性作用，容易引起生物活性分子的失活、損失以及交叉污染，從而導(dǎo)致篩選結(jié)果的假陽(yáng)性或者假陰性?；谝旱蔚奈⒘骺丶夹g(shù)是近年來(lái)高通量篩選微型化研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)之一。它通過(guò)微米級(jí)通道中多相流體的控制，實(shí)現(xiàn)大批量油包水或水包油型液滴微反應(yīng)器的生成、試樣混合、反應(yīng)、以及分析鑒定。液滴反應(yīng)器的尺寸可在飛升級(jí)至納升級(jí)靈活調(diào)節(jié)，從而可能實(shí)現(xiàn)超低消耗的高通量篩選。由于油相的包裹和保護(hù)作用，有效抑制了液滴反應(yīng)器的溶劑蒸發(fā)和稀釋作用，以及樣品間的交叉污染。利用生物兼容性表面活性劑分子的自組裝效應(yīng)，可以給生化篩選反應(yīng)提供一個(gè)溫和均一的微環(huán)境，有利于提高分析篩選的準(zhǔn)確性。同時(shí)，液滴反應(yīng)器微小的體積有利于加速物質(zhì)間的傳質(zhì)，提高反應(yīng)效率。因此，基于液滴的微流控技術(shù)因其優(yōu)異的特性有可能成為新一代的高通量篩選技術(shù)。目前，基于液滴的微流控篩選方法主要有三種，分別為液滴儲(chǔ)存器方法、滑動(dòng)芯片方法、以及液滴組裝方法。液滴儲(chǔ)存器是首先采用逐個(gè)抽取的方法將不同的待篩選樣品溶液裝載至毛細(xì)管中形成液滴，然后將該毛細(xì)管與微流控芯片通道連接，通過(guò)芯片上的T型接口將靶標(biāo)溶液注入到液滴中觸發(fā)反應(yīng)，最后將形成的液滴反應(yīng)器收集至另外一個(gè)毛細(xì)管中進(jìn)行孵育反應(yīng)和檢測(cè)(Zheng B. , Ismagilov R. F. Angew. Chem. , Int. Ed. , 2005,44，2520)?；瑒?dòng)芯片方法則首先在下片的陣列化微孔中裝入待篩選樣品形成液滴，然后滑動(dòng)上片使上片微通道中的靶標(biāo)試劑溶液與下片的液滴混合，進(jìn)行觸發(fā)反應(yīng)和篩選(Du W.B·, Li L. , Nichols K. P·, Ismagilov R. F. Lab Chip, 2009，9，2286)。然而，上述兩種方法均需要手動(dòng)的液滴裝載、毛細(xì)管和芯片通道的連接，以及精密的芯片滑動(dòng)操作，難以應(yīng)用于大規(guī)模樣品的篩選。液滴組裝方法利用自動(dòng)化的樣品管和試劑管的快速切換，在液滴形成的過(guò)程中完成待篩選樣品和試劑的混合，然后將液滴儲(chǔ)存至毛細(xì)管和芯片上進(jìn)行反應(yīng)和檢測(cè)(Du W. B·, Sun M. , Gu S. Q. , Zhu Y. , FangQ. Anal. Chem. , 2010，82，9941 ;方群，杜文斌，孫蒙，基于液滴順序組裝技術(shù)的微流控液滴生成系統(tǒng)及使用方法，中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)?201010250945. O)。盡管液滴順序組裝技術(shù)解決了液滴篩選的自動(dòng)化和大規(guī)模樣品篩選的難題，但是由于含有樣品和試劑的液滴的生成采用了逐個(gè)組裝方法，其篩選速度難以提高。另外，由于微型化帶來(lái)的尺寸效應(yīng)，上述幾種液滴篩選方法都難以在皮升級(jí)體積進(jìn)行生化篩選測(cè)定。在微流控液滴系統(tǒng)中，平行化的試劑加入方法主要可分為兩類。第一類采用一個(gè)T型分支通道將一相同試劑注入到主通道中的不同的液滴中(Zheng B.，Ismagilov R. F.Angew. Chem. , Int. Ed.，2005, 44，2520)。這類方法經(jīng)常與上述的液滴儲(chǔ)存器方法進(jìn)行聯(lián)用，用于基于液滴的微量篩選。然而，這類方法的主要問(wèn)題是在T型通道交叉口存在較大的液滴樣品殘留，從而引起液滴間的交叉污染。另外一類方法采用液滴融合技術(shù)進(jìn)行平行化的試劑加入。首先為微通道中生成互相配對(duì)的樣品和試劑的液滴，然后利用流體動(dòng)力輔助或者介電輔助的方法使配對(duì)好的液滴融合形成獨(dú)立的微反應(yīng)器(Teh S Y, Lin R. HungL. H. , LeeA. P. , Lab Chip, 2008，8:198)。然而此類方法結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，加工難度大，并且難以用于具有大量不同樣品的篩選系統(tǒng)中。并且，上述兩類方法的實(shí)現(xiàn)都需要復(fù)雜的液體流速調(diào)節(jié)、液滴頻率、液滴大小的控制、液滴位置的反饋等手動(dòng)調(diào)節(jié)手段，難以實(shí)現(xiàn)可靠的自動(dòng)化，在儀器產(chǎn)業(yè)化方面存在較大的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有皮升級(jí)分辨率的自動(dòng)化微陣列液滴篩選系統(tǒng)及其使用方法。該系統(tǒng)可進(jìn)行全自動(dòng)的皮升級(jí)液體的量取、不同樣品液滴陣列的形成、靶標(biāo)試劑的平行化定量加入、以及微量體積下的反應(yīng)測(cè)定。該系統(tǒng)既可用于高通量藥物篩選，也可用于催化劑篩選、酶動(dòng)力學(xué)分析、疾病診斷、以及單細(xì)胞和單分子分析中。本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下
本發(fā)明是具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，系統(tǒng)包括毛細(xì)管、液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、微孔陣列芯片、樣品/試劑儲(chǔ)存管和自動(dòng)平移臺(tái)，具體步驟為
1)將液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)和毛細(xì)管中充滿低熱膨脹系數(shù)的液體作為載流，并完全排空毛細(xì)管內(nèi)的氣泡；
2)將毛細(xì)管取樣端浸入與水相樣品不互溶的油相中抽取一段油相至毛細(xì)管中，用于隔離水相樣品和載流；
3)將毛細(xì)管取樣端浸入樣品/試劑儲(chǔ)存管中抽取一定體積的水相樣品溶液進(jìn)入毛細(xì)
管；
4)將毛細(xì)管取樣端移入微孔陣列芯片的微孔上方的油相中，將毛細(xì)管中的樣品溶液推出至微孔中形成樣品的液滴；
本發(fā)明所述的步驟4)后還包括如下具體步驟
a)在微孔陣列芯片上形成化學(xué)組成或者濃度不同的多個(gè)待篩選樣品的液滴； b)在毛細(xì)管中一次抽取大量的試劑，并將毛細(xì)管取樣端分別插入至每個(gè)樣品的液滴中，注入一定體積的試劑，形成液滴反應(yīng)器，完成樣品與試劑的混合、反應(yīng)、檢測(cè)和篩選。本發(fā)明所述的步驟4)后還包括如下具體步驟 m)在微孔陣列芯片上形成大量的試劑的液滴；
η)在每個(gè)試劑的液滴中分別注入待篩選的樣品溶液，形成液滴反應(yīng)器，完成試劑與樣品的混合、反應(yīng)、檢測(cè)和篩選。本發(fā)明所述的液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)具有數(shù)納升/分鐘的液體驅(qū)動(dòng)精度，其驅(qū)動(dòng)液體的流速范圍是I納升/分鐘至500納升/分鐘。本發(fā)明為了消除液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)換液體驅(qū)動(dòng)方向時(shí)，即從抽取轉(zhuǎn)換至推出或者從推出轉(zhuǎn)換至抽取這一期間所存在的機(jī)械回差，保證皮升級(jí)的液體量取精度，在抽取水相樣品或試劑溶液之前先抽取一定額外體積的油相進(jìn)入毛細(xì)管；在將樣品或試劑溶液推出毛細(xì)管時(shí),也將額外抽取的油相一并推出毛細(xì)管。本發(fā)明所述的液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)和毛細(xì)管中充滿低熱膨脹系數(shù)的液體作為載流，來(lái)防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度波動(dòng)對(duì)液體驅(qū)動(dòng)精度的影響，載流的熱膨脹系數(shù)范圍為O. 00001/攝氏度至O. 0005/攝氏度。本發(fā)明所述的毛細(xì)管采用較薄的管壁，有利于實(shí)現(xiàn)皮升級(jí)的液體量取以及降低液體在毛細(xì)管取樣端的殘留；毛細(xì)管的管壁厚度范圍是I微米至100微米。本發(fā)明所述的具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，在使用之前，對(duì)液體載流和油相進(jìn)行脫氣處理，防止在液體驅(qū)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生氣泡。本發(fā)明在使用時(shí)，微孔陣列芯片的微孔的上方，與樣品/試劑儲(chǔ)存管的上方均覆蓋一層與水相不互溶的油相，以防止微量液滴、樣品和試劑暴露在空氣中揮發(fā)或受到污染，油相的厚度范圍為O.1毫米至10毫米。本發(fā)明在使用時(shí)，為了消除篩選反應(yīng)過(guò)程中油相對(duì)微量生化反應(yīng)的干擾，在油相中添加生物兼容性的表面活性劑，利用表面活性劑分子在油水界面的自組裝效應(yīng)，來(lái)降低生物分子在界面的吸附和失活，表面活性劑的濃度為O. 01%至10%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)主要在于(1)液體的定量量取和液滴生成具有皮升級(jí)的體積精度，有效降低了高通量篩選中的樣品/試劑消耗，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本；(2)采用將毛細(xì)管插入待篩選樣品液滴中，分別連續(xù)注入試劑來(lái)完成樣品和試劑的混合、反應(yīng)檢測(cè)和篩選，有效提高了篩選的通量，并降低了產(chǎn)生交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)；(3)液體量取、推出、液滴生成、以及試劑注入等過(guò)程完全自動(dòng)化，有效降低了人為失誤和誤差，易于實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的產(chǎn)業(yè)化和廣泛普及。


圖1是具有皮升級(jí)精度的液滴陣列篩選系統(tǒng)及使用方法示意 圖2是采用毛細(xì)管插入液滴的方法，在待篩選樣品液滴中依次注入試劑的過(guò)程示意
圖3是利用液滴陣列篩選系統(tǒng)進(jìn)行Caspase-1酶抑制劑篩選的俯視熒光圖片；
圖4是對(duì)篩選得到的抑制劑28進(jìn)行半抑制濃度測(cè)定結(jié)果記錄圖。圖中1-毛細(xì)管，2-液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)，3-微孔陣列芯片，4-液體載流，5-水相樣品，6-油相，7-樣品/試劑儲(chǔ)存管，，8-微孔，9-樣品的液滴，10-試劑，11-液滴反應(yīng)器。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作詳細(xì)闡述
本發(fā)明涉及一種具有皮升級(jí)分辨率的微陣列液滴篩選系統(tǒng)，由毛細(xì)管、液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、微孔陣列芯片、液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)、樣品/試劑儲(chǔ)存管和自動(dòng)平移臺(tái)組成。液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)與毛細(xì)管相連用于微量液體的定量抽取和推出，樣品/試劑儲(chǔ)存管和微孔陣列芯片固定在可三維移動(dòng)的自動(dòng)平移臺(tái)上，樣品/試劑儲(chǔ)存管用于儲(chǔ)存實(shí)驗(yàn)所需的樣品和試劑，微孔陣列芯片用于微量液滴的儲(chǔ)存、反應(yīng)、檢測(cè)和篩選。根據(jù)本發(fā)明，所述的具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)，其特征的使用方法是首先將液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)和毛細(xì)管內(nèi)充滿低熱膨脹系數(shù)的液體作為載流，并完全排空毛細(xì)管內(nèi)的氣泡；然后將毛細(xì)管取樣端浸入與水相樣品不互溶的油相中抽取一段油相至毛細(xì)管中，用于隔離水相樣品和載流；再將毛細(xì)管取樣端浸入樣品/試劑儲(chǔ)存管中抽取一定體積的水相樣品溶液進(jìn)入毛細(xì)管；最后將毛細(xì)管取樣端移入微孔陣列芯片的微孔上方的油相中，將毛細(xì)管中的樣品溶液推出至微孔中形成樣品液滴。根據(jù)本發(fā)明，為了提高篩選的通量，首先在微孔陣列芯片上形成化學(xué)組成或者濃度不同的多個(gè)待篩選樣品液滴，然后在毛細(xì)管中一次抽取大量的試劑，并將毛細(xì)管取樣端分別插入至每個(gè)樣品液滴中，注入一定體積的試劑，形成液滴反應(yīng)器，完成樣品與試劑的混合、反應(yīng)、檢測(cè)和篩選。作為另外一種方案，也可首先在微孔陣列芯片上形成大量的相同化學(xué)組成和濃度的試劑液滴，然后在每個(gè)試劑的液滴中分別注入待篩選的不同化學(xué)組成和濃度的樣品溶液，形成液滴反應(yīng)器，完成試劑與樣品的混合、反應(yīng)、檢測(cè)和篩選。根據(jù)本發(fā)明，其特征在于，液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)具有正向推出和反向抽取的液體驅(qū)動(dòng)能力，流速為I皮升/分鐘至100微升/分鐘，量取液體的體積在I皮升至100微升。作為優(yōu)選，為完成皮升級(jí)液體的量取，所述的液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)具有數(shù)納升/分鐘的液體驅(qū)動(dòng)精度，其驅(qū)動(dòng)液體的流速范圍是I納升/分鐘至500納升/分鐘，量取液體的體積范圍在I皮升至1000皮升；
根據(jù)本發(fā)明，為了消除液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)在轉(zhuǎn)換液體驅(qū)動(dòng)方向時(shí)(從抽取轉(zhuǎn)換至推出狀態(tài)時(shí)或者從推出轉(zhuǎn)換至抽取狀態(tài)時(shí))存在的機(jī)械回差，保證皮升級(jí)的液體量取精度，在抽取水相樣品或試劑溶液之前先抽取一定額外體積的油相進(jìn)入毛細(xì)管；在將樣品或試劑溶液推出毛細(xì)管時(shí)，也將額外抽取的油相一并推出毛細(xì)管。根據(jù)本發(fā)明，液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)和毛細(xì)管中充滿低熱膨脹系數(shù)的液體作為載流，來(lái)防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度波動(dòng)對(duì)液體驅(qū)動(dòng)精度的影響，作為優(yōu)選，載流的熱膨脹系數(shù)范圍為O.00001/攝氏度至O. 0005/攝氏度。根據(jù)本發(fā)明，為實(shí)現(xiàn)皮升級(jí)的液體量取以及降低液體在毛細(xì)管取樣端的殘留，對(duì)毛細(xì)管的取樣端進(jìn)行拉尖處理來(lái)降低取樣端尖端的直徑和橫截面積，作為優(yōu)選，取樣端尖端的直徑范圍是I微米至100微米；同時(shí)對(duì)毛細(xì)管的內(nèi)壁和取樣端外壁進(jìn)行疏水化處理。根據(jù)本發(fā)明，采用管壁較薄的毛細(xì)管，有利于實(shí)現(xiàn)皮升級(jí)的液體量取以及降低液體在毛細(xì)管取樣端的殘留，減小量取不同液體時(shí)產(chǎn)生的交叉污染。作為優(yōu)選，毛細(xì)管的管壁厚度范圍是I微米至100微米。根據(jù)本發(fā)明，在使用之前，對(duì)液體載流和油相進(jìn)行(真空或者超聲)脫氣處理，防止在液體驅(qū)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生氣泡。氣泡的存在會(huì)顯著降低對(duì)微量皮升級(jí)液體的量取精度。根據(jù)本發(fā)明，在抽取樣品(或試劑)溶液之前，毛細(xì)管中預(yù)先抽取一段與樣品(或試齊U)溶液不互溶的油相來(lái)隔離樣品(或試劑)和低熱膨脹系數(shù)的液體載流；作為優(yōu)選，油相的長(zhǎng)度范圍為50微米至20毫米。根據(jù)本發(fā)明，微孔陣列芯片上加工多個(gè)用于盛載微量液體的小坑。每個(gè)小坑的體積范圍是I皮升至100微升。根據(jù)本發(fā)明，使用時(shí)，芯片上的微孔陣列與樣品/試劑儲(chǔ)存管的樣品/試劑管上覆蓋一層油相，以防止微量液滴和樣品暴露在空氣中揮發(fā)或受到污染，油膜的厚度為O.1毫米至10毫米。使用時(shí)，微孔陣列芯片上的微孔的上方，與試樣樣品/試劑儲(chǔ)存管的上方，均覆蓋一層與水相不互溶的油相，以防止微量液滴、樣品和試劑暴露在空氣中揮發(fā)或受到污染，作為優(yōu)選，油相的厚度范圍為O.1毫米至10毫米。根據(jù)本發(fā)明，作為一種優(yōu)選方案，為了消除篩選反應(yīng)過(guò)程中油相對(duì)生化反應(yīng)的干擾，在油相中添加生物兼容性的表面活性劑，利用表面活性劑分子在油水界面的自組裝效應(yīng)，來(lái)降低生物分子在界面的吸附和失活，作為優(yōu)選，表面活性劑的濃度范圍為O. 01%至10%。根據(jù)本發(fā)明，采用多個(gè)毛細(xì)管或者多個(gè)液體驅(qū)動(dòng)裝置，同時(shí)進(jìn)行多種液體樣品/試劑的量取、推出和液滴生成操作。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明
參照附圖，以下將詳細(xì)描述根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。圖1是具有皮升級(jí)精度的液滴陣列篩選系統(tǒng)及使用方法示意圖。其使用方法如下使用毛細(xì)管I作為取樣探針，將其尾部與液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)2相連。毛細(xì)管I和液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)2內(nèi)均充滿低熱膨脹系數(shù)的液體作為載流4，并在毛細(xì)管I的取樣端引入一段與水相不互溶的油相6來(lái)分隔水相樣品5和載流4。移動(dòng)毛細(xì)管I或者樣品/試劑儲(chǔ)存管7，使毛細(xì)管I取樣端浸入油相6中抽取一定額外體積的油相6進(jìn)入毛細(xì)管I取樣端；再將毛細(xì)管I取樣端浸入樣品5中定量抽取一定體積的樣品5進(jìn)入毛細(xì)管。然后再次移動(dòng)毛細(xì)管I或者微孔陣列芯片3，使毛細(xì)管I取樣端置于芯片3上微孔8上方的油相6中。啟動(dòng)液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)2將毛細(xì)管I中的微量液體樣品5和額外抽取的油相6推出至微孔8中，形成微量水相樣品5的液滴9。在利用該系統(tǒng)生成液滴陣列前，毛細(xì)管I的取樣端進(jìn)行拉尖處理，并對(duì)毛細(xì)管I的內(nèi)外壁、以及微孔陣列芯片3的表面進(jìn)行疏水化表面處理。對(duì)液體載流4和油相6進(jìn)行真空脫氣或者超聲脫氣處理，防止在液體驅(qū)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生氣泡。
圖2是采用毛細(xì)管插入液滴的方法，在待篩選樣品液滴中依次注入試劑的過(guò)程示意圖。根據(jù)圖1所述的方法，在微孔陣列芯片3上生成含有不同化學(xué)組成或濃度的樣品液滴9的陣列。在取樣毛細(xì)管I中抽取大量體積的試劑10，然后移動(dòng)毛細(xì)管I或者微孔陣列芯片3，使毛細(xì)管I取樣端插入樣品液滴9中，啟動(dòng)液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)2，推出一定體積的試劑10進(jìn)入樣品液滴9中，完成樣品/試劑的混合,形成液滴反應(yīng)器11。實(shí)施例1
圖3是根據(jù)圖1和圖2所述的液滴陣列篩選系統(tǒng)及使用方法，以32個(gè)小分子化學(xué)物作為待篩選樣品，以Caspase-1酶作為篩選靶標(biāo)進(jìn)行酶抑制劑篩選得到的熒光圖片。首先將100 μΜ的小分子化合物裝入樣 品/試劑儲(chǔ)存管中。采用圖1所述的液滴陣列生成方法在微孔陣列芯片上生成32個(gè)小分子化學(xué)物的液滴，每個(gè)液滴的體積為180皮升。然后按照?qǐng)D2所述的靶標(biāo)試劑注入方法，分別向每個(gè)液滴中注入180皮升的Caspase-1酶溶液(6 mU/μυ以及180皮升的底物(Z-YVAD-Rl 10)溶液(20 μΜ)來(lái)觸發(fā)反應(yīng)。將微孔陣列芯片在35攝氏度條件下孵育I個(gè)小時(shí)，采用熒光成像的方法獲取實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，化合物對(duì)Caspase-1酶的抑制能力越強(qiáng)，酶活性就弱，在相同反應(yīng)條件下，催化底物反應(yīng)的速度就低，對(duì)應(yīng)圖3中熒光信號(hào)就越弱。因此，編號(hào)為28、30、和32化合物為篩選鑒定出的抑制劑。實(shí)施例2
圖4是對(duì)圖3所述的篩選實(shí)驗(yàn)得到的28號(hào)化合物進(jìn)行Caspase-1酶半抑制濃度測(cè)定結(jié)果記錄圖。首先在樣品/試劑儲(chǔ)存管中分別裝入濃度為O.1 nM、l nM、10 nMUOO ηΜ、1 μΜ、10 μΜ、以及100 μΜ的28號(hào)化合物溶液。根據(jù)圖1和圖2所述的液滴陣列篩選系統(tǒng)及使用方法，在微孔陣列芯片上生成含有不同濃度28號(hào)化合物溶液的液滴(180皮升)，再向每個(gè)液滴中注入180皮升的Caspase-1酶溶液(6 mU/μυ以及180皮升的底物(Z-YVAD-Rl 10)溶液(20 μΜ)來(lái)觸發(fā)反應(yīng)。按照實(shí)施例1的方法獲得結(jié)果熒光圖片，對(duì)熒光亮度值進(jìn)行提取并進(jìn)行歸一化處理。對(duì)化合物28的濃度進(jìn)行取對(duì)數(shù)處理，并將處理得到的結(jié)果與濃度對(duì)應(yīng)的歸一化熒光亮度值進(jìn)行作圖。利用數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)結(jié)果圖進(jìn)行Sigmoidal擬合，得到半抑制濃度為31. 6 ±3. 4 nM。
權(quán)利要求
1.一種具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，所述的系統(tǒng)包括毛細(xì)管(I)、液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)(2)、微孔陣列芯片(3)、樣品/試劑儲(chǔ)存管(7)和自動(dòng)平移臺(tái)，其特征在于，具體步驟為 1)將液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)(2)和毛細(xì)管(I)中充滿低熱膨脹系數(shù)的液體作為載流(4)，并完全排空毛細(xì)管(I)內(nèi)的氣泡； 2)將毛細(xì)管(I)取樣端浸入與水相樣品(5)不互溶的油相中(6)抽取一段油相(6)至毛細(xì)管(I)中，用于隔離水相樣品(5)和載流(4)； 3)將毛細(xì)管取樣端浸入樣品/試劑儲(chǔ)存管(7)中抽取一定體積的水相樣品(5)溶液進(jìn)入毛細(xì)管(I); 4)將毛細(xì)管(I)取樣端移入微孔陣列芯片(3)的微孔(8)上方的油相(6)中，將毛細(xì)管Cl)中的樣品(5)溶液推出至微孔(8)中形成樣品(5)的液滴(9)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，其特征在于，所述的步驟4)后還包括如下具體步驟 a)在微孔陣列芯片(3)上形成化學(xué)組成或者濃度不同的多個(gè)待篩選樣品的液滴(9)； b)在毛細(xì)管(I)中一次抽取大量的試劑(10)，并將毛細(xì)管(I)取樣端分別插入至每個(gè)樣品的液滴(9)中，注入一定體積的試劑(10)，形成液滴反應(yīng)器(11)，完成樣品(5)與試劑(10)的混合、反應(yīng)、檢測(cè)和篩選。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，其特征在于，所述的步驟4)后還包括如下具體步驟 m)在微孔陣列芯片(3)上形成大量的試劑(10)的液滴； η )在每個(gè)試劑(10)的液滴中分別注入待篩選的樣品(5)溶液，形成液滴反應(yīng)器(11)，完成試劑(10)與樣品(5)的混合、反應(yīng)、檢測(cè)和篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，其特征在于，所述的液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)(2)具有數(shù)納升/分鐘的液體驅(qū)動(dòng)精度，其驅(qū)動(dòng)液體的流速范圍是I納升/分鐘至500納升/分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，其特征在于，為了消除液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)(2)在轉(zhuǎn)換液體驅(qū)動(dòng)方向時(shí)，即從抽取轉(zhuǎn)換至推出或者從推出轉(zhuǎn)換至抽取這一期間所存在的機(jī)械回差，保證皮升級(jí)的液體量取精度，在抽取水相樣品(5)或試劑(10)溶液之前先抽取一定額外體積的油相(6)進(jìn)入毛細(xì)管(I);在將樣品(5)或試劑(10)溶液推出毛細(xì)管(I)時(shí)，也將額外抽取的油相(6) —并推出毛細(xì)管(I)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，其特征在于，所述的液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)(2)和毛細(xì)管(I)中充滿低熱膨脹系數(shù)的液體作為載流(4)，來(lái)防止實(shí)驗(yàn)過(guò)程中溫度波動(dòng)對(duì)液體驅(qū)動(dòng)精度的影響，所述的載流(4)的熱膨脹系數(shù)范圍為O. 00001/攝氏度至O. 0005/攝氏度。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，其特征在于，所述的毛細(xì)管(I)采用管壁較薄，有利于實(shí)現(xiàn)皮升級(jí)的液體量取以及降低液體在毛細(xì)管(I)取樣端的殘留；所述的毛細(xì)管(I)的管壁厚度范圍是I微米至100微米。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，其特征在于，在使用之前，對(duì)液體載流(4)和油相(6)進(jìn)行脫氣處理，防止在液體驅(qū)動(dòng)過(guò)程中產(chǎn)生氣泡。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，其特征在于，使用時(shí)，微孔陣列芯片(3)的微孔(8)的上方，與樣品/試劑儲(chǔ)存管(7)的上方均覆蓋一層與水相不互溶的油相(6)，以防止微量液滴、樣品和試劑暴露在空氣中揮發(fā)或受到污染，所述的油相(6)的厚度范圍為O.1毫米至10毫米。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的具有皮升級(jí)精度的微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法，其特征在于，使用時(shí)，為了消除篩選反應(yīng)過(guò)程中油相(6)對(duì)微量生化反應(yīng)的干擾，在油相(6)中添加生物兼容性的表面活性劑，利用表面活性劑分子在油水界面的自組裝效應(yīng)，來(lái)降低生物分子在界面的吸附和失活，表面活性劑的濃度為O. 01%至10%。
全文摘要
本發(fā)明涉及的領(lǐng)域?yàn)楦咄亢Y選領(lǐng)域，特別涉及一種具有皮升級(jí)精度的自動(dòng)化微液滴陣列篩選系統(tǒng)的使用方法。本發(fā)明通過(guò)將液體驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)和毛細(xì)管中充滿低熱膨脹系數(shù)的液體作為載流，并完全排空毛細(xì)管內(nèi)的氣泡，然后將毛細(xì)管取樣端浸入與水相樣品不互溶的油相中抽取一段油相至毛細(xì)管中，用于隔離水相樣品和載流，再將毛細(xì)管取樣端浸入樣品/試劑儲(chǔ)存管中抽取一定體積的水相樣品溶液進(jìn)入毛細(xì)管，最后將毛細(xì)管取樣端移入微孔陣列芯片的微孔上方的油相中，將毛細(xì)管中的樣品溶液推出至微孔中形成樣品的液滴。本發(fā)明液體的定量量取和液滴生成具有皮升級(jí)的體積精度，有效降低了高通量篩選中的樣品/試劑消耗，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。
文檔編號(hào)B01L3/00GK103008037SQ20121058905
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者方群, ?，? 張?jiān)葡?申請(qǐng)人:浙江大學(xué)