專利名稱：一種用于分離水溶性聚合物和蛋白用色譜填料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種色譜填料，特別涉及一種用于分離水溶性聚合物和蛋白用色譜填料及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著色譜技術(shù)的迅速發(fā)展，色譜填料也在不斷的更新和發(fā)展，人們已經(jīng)制備出各種不同種類的新型色譜填料來(lái)解決分離科學(xué)中存在的各種問(wèn)題。目前，分離化學(xué)中面臨的主要問(wèn)題是復(fù)雜生物樣品的分離比較困難。由于生物樣品的組成極其復(fù)雜，許多生物大分子在生物樣品中的含量極低，因而分離干擾大、分離純化步驟繁多、流程長(zhǎng)；并且，許多生物大分子在使用有機(jī)溶劑作為流動(dòng)相分離純化時(shí)極易失去活性；因此，生物大分子的分離純化技術(shù)需要以此為依據(jù)，而選擇合適的色譜分離填料是克服生物大分子在分離純化過(guò)程中存在上述問(wèn)題、獲得對(duì)其進(jìn)行高效分離純化的關(guān)鍵。體積排阻色譜技術(shù)是20世紀(jì)60年代初發(fā)展的一種快速而又簡(jiǎn)單的分離技術(shù)，又稱尺寸排阻色譜或凝膠色譜。所用的固定相是具有一定孔徑范圍的多孔性凝膠，是一種按目標(biāo)物分子大小進(jìn)行分離的色譜技術(shù)。它的分離并不依賴于流動(dòng)相和固定相間的作用力，按流動(dòng)相類型不同分為凝膠滲透色譜和凝膠過(guò)濾色譜。其常用的填料主要有硅膠或多聚體兩大類，由于硅膠的內(nèi)水體積更大，且孔徑更均一，硅膠比聚合物凝膠有更好的分辨力，常被用于分子量范圍在數(shù)千至近百萬(wàn)的蛋白質(zhì)、多肽和生物酶等生物樣品的分離。但傳統(tǒng)工藝制備分離蛋白、多肽和生物酶等生物大分子的體積排阻色譜填料存在親水性不夠，穩(wěn)定性較差等問(wèn)題。因此，提供一種具有較大孔隙容積、較低的疏水性、較高的理論塔板數(shù)和較大的峰容量的色譜填料，正成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種制備分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的方法，該方法制備的色譜填料能用作多種分離保留模式，能分別作為HILIC模式和體積排阻模式用于液相色譜的分離分析，特別適用于水溶性聚合物和蛋白、多肽、生物酶等生物樣品。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料的制備方法，包括如下步驟A硅膠活化，制得活化硅膠；B將所述活化硅膠進(jìn)行環(huán)氧基改性，制得環(huán)氧基改性硅膠；C在所述環(huán)氧基改性硅膠上引入親水性聚合物，制得親水性聚合物改性硅膠 '及D將所述親水性聚合物改性硅膠水解，制得所述用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料。
根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述A步驟包括將硅膠用蒸餾水清洗，然后用氫氟酸水溶液浸泡，隨后用蒸餾水洗滌至中性，最后用丙酮洗滌并干燥。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述B步驟包括以硼酸緩沖液作為溶劑，將所述活化硅膠與環(huán)氧基硅烷化試劑在攪拌和回流下進(jìn)行改性反應(yīng)，其中所述環(huán)氧基硅烷化試劑有選為Y-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙基二甲氧基娃燒。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述C步驟包括將所述環(huán)氧基改性硅膠與親水性聚合物在攪拌和回流下進(jìn)行改性反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，并依次用蒸餾水、四氫呋喃、乙腈進(jìn)行洗滌。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述D步驟包括將所述親水性聚合物改性硅膠與檸檬酸緩沖液進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，依次用蒸餾水和甲醇洗滌，真空干燥。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述氫氟酸水溶液的質(zhì)量濃度為O. 08%，且所述硅膠與氫氟酸水溶液的料液比為1:8-1:10。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述硅膠與環(huán)氧基硅烷化試劑的質(zhì)量比為1:2-1: 4，所述活化硅膠進(jìn)行環(huán)氧基改性的反應(yīng)時(shí)間為O. 5-2小時(shí)；反應(yīng)溫度為70-100° C。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述硼酸緩沖液的pH值為7. 0-9. 0，所述活化硅膠與硼酸緩沖液的料液比為1:8-1:10。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述親水性聚合物為可溶性粉、纖維素或葡聚糖。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述硅膠與可溶性淀粉的質(zhì)量比為1: 2-1: 4，所述環(huán)氧基改性硅膠進(jìn)行親水性聚合物改性的反應(yīng)時(shí)間為20-24小時(shí)；反應(yīng)溫度為70-100° C。根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思，所述檸檬酸鹽緩沖液的pH值為2. 0-4. 0，所述硅膠與檸檬酸鹽緩沖液的料液比為1:8-1:10，所述親水性聚合物改性硅膠進(jìn)行水解的反應(yīng)時(shí)間為1-3小時(shí)，反應(yīng)溫度為70-90° C。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明同時(shí)還提供了一種用于分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料，通過(guò)上述任一項(xiàng)所述的制備方法制得。在本發(fā)明中，各反應(yīng)步驟中所述的料液比為質(zhì)量與體積之比。本發(fā)明通過(guò)如下的措施來(lái)實(shí)現(xiàn)首先，通過(guò)硅膠表面活性硅羥基與Y-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷的反應(yīng)將環(huán)氧基團(tuán)鍵合到粒徑均一的多孔硅膠表面，形成環(huán)氧基改性硅膠，然后通過(guò)硅膠表面硅羥基與親水性聚合物(可溶性淀粉、纖維素以及葡聚糖等)的作用在其表面包覆一層聚合物，最后在酸性條件下使硅膠表面環(huán)氧基團(tuán)水解形成二醇基，獲得二醇基改性的分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料。該填料具有較大的孔體積，較低的疏水性，較高的理論塔板數(shù)和較大的峰容量。本發(fā)明采用分子自組裝方式將親水性聚合物包覆在硅膠微球表面，通過(guò)合成聚合物包覆的二醇基色譜填料，大大增強(qiáng)其穩(wěn)定性。使得水溶性聚合物、蛋白、生物酶、多肽等生物大分子的非特異性吸附極??；具有優(yōu)良的分辨能力。并且，優(yōu)越的鍵合相表面消除了其它的吸附作用，保持了樣品的生物活性，因而廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離。本發(fā)明制備的色譜填料與常規(guī)的色譜填料相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1.多孔硅膠表面包覆的親水性聚合物克服了填料存在親水性不夠理想的問(wèn)題，并且增強(qiáng)了其穩(wěn)定性。2.該填料對(duì)目標(biāo)物具有多重保留機(jī)理，可以用作HILIC和體積排阻兩種色譜分離模式，對(duì)水溶性聚合物以及蛋白、多肽、生物酶等生物樣品具有極為優(yōu)異的分離能力；3.該填料所用的流動(dòng)相幾乎為純水相，分離條件極為溫和，因而極大程度地保證了樣品在分離過(guò)程中具有高生物活性；4.相比常規(guī)聚合物基質(zhì)的色譜填料，硅膠基質(zhì)的分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料具有較大的孔體積、較低的疏水性、較高的理論塔板數(shù)和較大的峰容量。


圖1為本發(fā)明用于分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的合成示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所制備色譜填料分離頭孢米諾鈉及其相關(guān)物質(zhì)的效果示意圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所制備色譜填料分離頭孢西丁鈉及其相關(guān)物質(zhì)的效果示意圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例1所制備色譜填料分離頭孢地嗪鈉及其相關(guān)物質(zhì)的效果示意圖。圖5為本發(fā)明實(shí)施例2所制備色譜填料分離門冬酰胺酶的效果示意圖。圖6為本發(fā)明實(shí)施例3所制備色譜填料分離分析胰島素的效果示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。但本發(fā)明并不限于以下的實(shí)施例。本發(fā)明提供一種用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料的制備方法，包括如下步驟A硅膠活化，制得活化硅膠；B將所述活化硅膠進(jìn)行環(huán)氧基改性，制得環(huán)氧基改性硅膠；C在所述環(huán)氧基改性硅膠上引入親水性聚合物，制得親水性聚合物改性硅膠；及D將所述親水性聚合物改性硅膠水解，制得所述用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料。其中A步驟包括將硅膠用蒸餾水清洗,然后用氫氟酸水溶液浸泡，隨后用蒸餾水洗滌至中性，最后用丙酮洗滌并干燥。其中B步驟包括以硼酸緩沖液作為溶劑，將所述活化硅膠與環(huán)氧基硅烷化試劑在攪拌和回流下進(jìn)行改性反應(yīng)，其中所述環(huán)氧基硅烷化試劑有選為Y-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙
基二甲氧基娃燒。其中C步驟包括將所述環(huán)氧基改性硅膠與親水性聚合物在攪拌和回流下進(jìn)行改性反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，并依次用蒸餾水、四氫呋喃、乙腈進(jìn)行洗滌。其中D步驟包括將所述親水性聚合物改性硅膠與檸檬酸緩沖液進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，依次用蒸餾水和甲醇洗滌，真空干燥。具體合成步驟過(guò)程，如圖1所示。圖1為本發(fā)明用于分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的合成示意圖。以下為本發(fā)明制備用于分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的實(shí)施例，但本發(fā)明的構(gòu)思及其應(yīng)用原料/儀器并不限于。實(shí)施例1 :分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的制備(I)往500mL反應(yīng)容器中加入50g硅膠，并加入200mL蒸餾水?dāng)嚢?0分鐘、過(guò)濾，重復(fù)該步驟兩次。然后加入400mL質(zhì)量比為O. 08%氫氟酸水溶液,攪拌24小時(shí)后用蒸懼水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗滌、過(guò)濾，110° C干燥12小時(shí)，得到經(jīng)活化的硅膠；(2)往500mL反應(yīng)容器中(裝有冷凝器、機(jī)械攪拌器、溫度計(jì))中加入400mLpH=9. O的硼酸緩沖溶液(Tiidsol 緩沖液，購(gòu)于廣州華粵行儀器有限公司)、50g經(jīng)活化的娃月父和IOOmL Y -(2，3_環(huán)氧丙氧)丙基二甲氧基娃燒，80° C攬祥反應(yīng)30分鐘；得到環(huán)氧基團(tuán)改性硅膠；(3)向反應(yīng)容器中加入IOOg可溶性淀粉，于97° C下回流攪拌反應(yīng)20_22小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后冷卻回流一夜(12小時(shí)左右)；依次用200mL熱的蒸餾水、200mL熱的四氫呋喃和200mL熱的乙腈清洗制備好的填料，過(guò)濾，得到可溶性淀粉改性硅膠；(4)將該可溶性淀粉改性硅膠重新置于反應(yīng)容器中，加入500mL pH3. O檸檬酸緩
沖液(HydrionR緩沖液，購(gòu)于廣州和為有限公司)，于70° C下回流攪拌反應(yīng)I小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后用400mL蒸餾水、400mL甲醇清洗制備好的填料，過(guò)濾、并重復(fù)該步驟一次；將清洗好的填料自然晾干，然后在110° C真空干燥2小時(shí)，得到分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料。實(shí)施例2 :分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的制備(I)往500mL反應(yīng)容器中加入50g硅膠，并加入200mL蒸餾水?dāng)嚢?0分鐘、過(guò)濾，重復(fù)該步驟兩次。然后加入 400mL質(zhì)量比為O. 08%氫氟酸水溶液,攪拌24小時(shí)后用蒸懼水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗滌、過(guò)濾，110° C干燥12小時(shí)，得到經(jīng)活化的硅膠；(2)往500mL反應(yīng)容器中(裝有冷凝器、機(jī)械攪拌器、溫度計(jì))中加入450mLpH=9. O的硼酸緩沖溶液、50g活化的硅膠和150mL Y-(2, 3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，80° C攪拌反應(yīng)30分鐘；得到環(huán)氧基團(tuán)改性硅膠；(3)向反應(yīng)容器中加入150g葡聚糖，于97° C下回流攪拌反應(yīng)20-22小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后冷卻回流一夜(12小時(shí)左右)；依次用200mL熱的蒸餾水、200mL熱的四氫呋喃和200mL熱的乙腈清洗制備好的填料，過(guò)濾；得到葡聚糖改性硅膠；(4)將所得的葡聚糖改性硅膠重新置于反應(yīng)容器中中，加入400mL pH3. O檸檬酸緩沖液(HydHonk^沖溶液，購(gòu)于廣州和為有限公司)，于70° C下回流攪拌反應(yīng)I小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后用200mL蒸餾水、200mL甲醇清洗制備好的填料，過(guò)濾、并重復(fù)該步驟一次；將清洗好的填料自然晾干，然后110° C真空干燥2小時(shí)，得到分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料。實(shí)施例3 :分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料的制備(I)往500mL反應(yīng)容器中加入50g硅膠，并加入200mL蒸餾水?dāng)嚢?0分鐘、過(guò)濾，重復(fù)該步驟兩次。然后加入400mL質(zhì)量比為O. 08%氫氟酸水溶液,攪拌24小時(shí)后用蒸懼水清洗至中性，最后加入200mL丙酮洗滌、過(guò)濾，110° C干燥12小時(shí)，得到經(jīng)活化的硅膠；(2)往500mL反應(yīng)容器中(裝有冷凝器、機(jī)械攪拌器、溫度計(jì))中加入450mLpH=9. O的硼酸緩沖溶液、50g活化的硅膠和150mL Y-(2, 3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，80° C攪拌反應(yīng)30分鐘；得到環(huán)氧基團(tuán)改性硅膠；(3)向反應(yīng)容器中加入150g纖維素，于97° C下回流攪拌反應(yīng)20_22小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后冷卻回流一夜(12小時(shí)左右)；依次用200mL熱的蒸餾水、200mL熱的四氫呋喃和200mL熱的乙腈清洗制備好的填料，過(guò)濾，得到纖維素改性硅膠；(4)將所得的維素改性硅膠重新置于反應(yīng)容器中中，加入400mL pH3. O檸檬酸緩沖液(Hydrionk緩沖溶液，購(gòu)于廣州和為有限公司)，于70° C下回流攪拌反應(yīng)I小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后用200mL蒸餾水、200mL甲醇清洗制備好的填料，過(guò)濾、并重復(fù)該步驟一次；將清洗好的填料自然晾干，然后110° C真空干燥2小時(shí)，得到分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料。實(shí)施例4 :分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料色譜柱體積排阻分離將實(shí)施例1中的分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料進(jìn)行裝柱，柱長(zhǎng)300mm,柱內(nèi)徑 7. 8_。以磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· O) [O. 005mol/L磷酸氫二鈉溶液-O. 005mol/L磷酸二氫鈉溶液(61:39)]-乙腈(95:5)為流動(dòng)相，流速為每分鐘O. 8mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，檢測(cè)頭孢米諾鈉及其相關(guān)物質(zhì)。如圖2所示，圖2為本發(fā)明實(shí)施例1所制備色譜填料分離頭孢米諾鈉及其相關(guān)物質(zhì)的效果示意圖。頭孢米諾鈉為頭孢類抗生素，分子量為667. 67，其色譜圖橫坐標(biāo)是保留時(shí)間，單位為min (分鐘)，縱坐標(biāo)是檢測(cè)信號(hào)的響應(yīng)值，單位為mV(毫伏)。由圖可以看出頭孢米諾鈉色譜峰與其雜質(zhì)色譜峰獲得了極大程度的分離，克服了采用常規(guī)的C18柱難于分離頭孢米諾鈉及其雜質(zhì)等眾多問(wèn)題，說(shuō)明了該填料具有優(yōu)異的分離性能。以磷酸鹽緩沖液[O. 01mol/L磷酸氫二鈉溶液-O. 01mol/L磷酸二氫鈉溶液(66:34)]-乙腈(95:5)為流動(dòng)相，流速為流速為每分鐘O. 8mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為232nm，測(cè)定頭孢西丁鈉及其相關(guān)物質(zhì)。如圖3所示，圖3為本發(fā)明實(shí)施例1所制備色譜填料分離頭孢西丁鈉及其相關(guān)物質(zhì)的效果 示意圖。頭孢西丁鈉為頭孢類抗生素，分子量為449. 43，其色譜圖橫坐標(biāo)是保留時(shí)間，單位為min (分鐘)，縱坐標(biāo)是檢測(cè)信號(hào)的響應(yīng)值，單位為10_3mV(毫伏)。根據(jù)色譜圖可以看出頭孢西丁鈉與其雜質(zhì)能夠獲得較好的分離，并且分離雜質(zhì)峰的靈敏度較高，充分證明了該填料具有優(yōu)異的色譜分離性能。以磷酸緩沖溶液(pH=7. O) [O. 005mol/L磷酸氫二鈉溶液-O. 005mol/L磷酸二氫鈉溶液(61:39)]-乙腈(95:5)作為流動(dòng)相，流速為每分鐘O. 8mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為231nm，測(cè)定頭孢地嗪鈉及其相關(guān)物質(zhì)。如圖4所示，圖4為本發(fā)明實(shí)施例1所制備色譜填料分離頭孢地嗪鈉及其相關(guān)物質(zhì)的效果示意圖。橫坐標(biāo)是保留時(shí)間，單位為min (分鐘)，縱坐標(biāo)是檢測(cè)信號(hào)的響應(yīng)值，單位為10_3mV(毫伏)。根據(jù)色譜圖可以看出頭孢地嗪鈉與其雜質(zhì)能夠獲得較好的分離，并且分離雜質(zhì)峰的靈敏度較高，完全滿足藥典所規(guī)定的分離參數(shù)。實(shí)施例5 :分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料色譜柱體積排阻分離將實(shí)施例2中的分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料進(jìn)行裝柱，柱長(zhǎng)300mm，柱內(nèi)徑7. 8mm。以O(shè). lmol/L磷酸鹽緩沖液(ρΗ6· 7)(磷酸二氫鈉6. Og,磷酸氫二鈉20. 2g，加水900mL，用磷酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至6. 7，加水至IOOOmL)為流動(dòng)相，流速為每分鐘0. 6mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，測(cè)定門冬酰胺酶。如圖5所示，圖5為本發(fā)明實(shí)施例2所制備色譜填料分離門冬酰胺酶的效果示意圖。橫坐標(biāo)是保留時(shí)間，單位為min (分鐘)，縱坐標(biāo)是檢測(cè)信號(hào)的響應(yīng)值，單位為10_3mV(毫伏)。由圖可以明顯看出該色譜柱能夠?qū)㈤T冬酰胺酶的雜質(zhì)峰分離，完全符合藥典的規(guī)定。實(shí)施例6 :分離球狀蛋白色譜用親水硅膠色譜填料色譜柱體積排阻分離將實(shí)施例3中的分離球狀蛋白色譜用親水硅膠色譜填料進(jìn)行裝柱，柱長(zhǎng)300_，柱內(nèi)徑7. 8mm。以乙腈三氟乙酸水=40:0. 1:60為流動(dòng)相，流速為每分鐘1. OmL，檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，測(cè)定胰島素及其相關(guān)高分子物質(zhì)。如圖6所示，圖6為本發(fā)明實(shí)施例3所制備色譜填料分離分析胰島素的效果示意圖。橫坐標(biāo)是保留時(shí)間，單位為min (分鐘)，縱坐標(biāo)是檢測(cè)信號(hào)的響應(yīng)值，單位為10_3mV(毫伏)。由圖可以看出使用該色譜柱能夠得到較好的胰島素峰型，并獲得較高的柱效。對(duì)比實(shí)施例分離球狀蛋白色譜用親水硅膠色譜填料色譜柱與其他類型的色譜柱對(duì)比效果。將實(shí)施例3中的分離球狀蛋白色譜用親水硅膠色譜填料進(jìn)行裝柱，柱長(zhǎng)300_，柱內(nèi)徑7. 8mm。以磷酸緩沖溶液(pH=7. O) [O. 005mol/L磷酸氫二鈉溶液-O. 005mol/L磷酸二氫鈉溶液(61:39)]-乙腈(95:5)作為流動(dòng)相，流速為每分鐘O. 8mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為231nm，測(cè)定頭孢地嗪鈉及其相關(guān)物質(zhì)。并將測(cè)定的結(jié)果與常規(guī)的C18柱、其他公司類似的色譜柱(例如賽分科技的SRT SEC-150)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)使用常規(guī)的C18柱無(wú)法將頭孢地嗪鈉和其相關(guān)雜質(zhì)分離開來(lái)，其分離度不超過(guò)1. 0，而使用賽分公司SRT SEC-150分離頭孢地嗪鈉和其相關(guān)雜質(zhì)時(shí)，其分離度仍然不夠理想，目標(biāo)物頭孢地嗪鈉與其雜質(zhì)不能達(dá)到基線分離，并且雜質(zhì)峰的響應(yīng)也不夠理想；而使用本方法制備的分離球狀蛋白色譜用親水硅膠色譜填料色譜柱最大的優(yōu)勢(shì)在于目標(biāo)物頭孢地嗪鈉與其相關(guān)雜質(zhì)的分離度均能達(dá)到基線分離，證明了該色譜填料相比常規(guī)的C18色譜柱和其它公司類似的色譜柱具有更為優(yōu)異的分離效果。全多孔硅膠基質(zhì)的體積排阻色譜填料具有較大孔隙容積、較低的疏水性、較高的理論塔板數(shù)和較大的峰容量。通過(guò)合成親水性聚合物涂層的二醇基色譜填料，可以大大增強(qiáng)了其穩(wěn)定性(B. Anspach, et al. J. Chromatogr. , 1988, 443, 45)。并且,分離中既不涉及太多的作用力，分離一般在水相條件下，極為溫和。另外，硅膠上包覆的親水性聚合物具有多種保留機(jī)理，其表面受二醇基官能團(tuán)保護(hù)而不與蛋白相互作用，色譜柱不會(huì)累積強(qiáng)烈吸附的目標(biāo)物，目標(biāo)物的回收率較高，不容易發(fā)生副反應(yīng)，使用壽命長(zhǎng)，多數(shù)蛋白在洗脫過(guò)程中的質(zhì)量回收率接近100%。另外，硅膠表面包覆的親水性聚合物保證了填料與目標(biāo)物充分的作用，具有更高的分辨率，能夠在更高的溫度下操作。以上所述的，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非用以限定本發(fā)明的范圍，即凡是依據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)的權(quán)利要求書及說(shuō)明書內(nèi)容所作的簡(jiǎn)單、等效變化與修飾，皆落入本發(fā)明專利的權(quán)利要求保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料的制備方法，包括如下步驟 A硅膠活化，制得活化硅膠； B將所述活化硅膠進(jìn)行環(huán)氧基改性，制得環(huán)氧基改性硅膠； C在所述環(huán)氧基改性硅膠上引入親水性聚合物,制得親水性聚合物改性硅膠；及 D將所述親水性聚合物改性硅膠水解，制得所述用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于， 所述A步驟包括 將硅膠用蒸餾水清洗，然后用氫氟酸水溶液浸泡，隨后用蒸餾水洗滌至中性，最后用丙酮洗滌并干燥； 所述B步驟包括 以硼酸緩沖液作為溶劑，將所述活化硅膠與環(huán)氧基硅烷化試劑在攪拌和回流下進(jìn)行改性反應(yīng)； 所述C步驟包括 將所述環(huán)氧基改性硅膠與親水性聚合物在攪拌和回流下進(jìn)行改性反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，并依次用蒸餾水、四氫呋喃、乙腈進(jìn)行洗滌； 所述D步驟包括 將所述親水性聚合物改性硅膠與檸檬酸緩沖液進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，抽濾，依次用蒸餾水和甲醇洗滌，真空干燥。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述氫氟酸水溶液的質(zhì)量濃度為O.08%,且所述娃膠與氫氟酸水溶液的料液比為1:8-1:10。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述環(huán)氧基硅烷化試劑為Y-(2，3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷。
5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述硅膠與環(huán)氧基硅烷化試劑的質(zhì)量比為1:2-1:4，所述活化硅膠進(jìn)行環(huán)氧基改性的反應(yīng)時(shí)間為O. 5-2小時(shí)；反應(yīng)溫度為70-100。 Co
6.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述硼酸緩沖液的pH值為7.0-9. 0，所述活化硅膠與硼酸緩沖液的料液比為1:8-1:10。
7.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述親水性聚合物為可溶性粉、纖維素或葡聚糖。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述硅膠與可溶性淀粉的質(zhì)量比為1:2-1:4，所述環(huán)氧基改性硅膠進(jìn)行親水性聚合物改性的反應(yīng)時(shí)間為20-24小時(shí)；反應(yīng)溫度為 70-100° C。
9.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述檸檬酸鹽緩沖液的pH值為2.0-4. 0，所述硅膠與檸檬酸鹽緩沖液的料液比為1:8-1:10，所述親水性聚合物改性硅膠進(jìn)行水解的反應(yīng)時(shí)間為1-3小時(shí)，反應(yīng)溫度為70-90° C。
10.一種用于分離水溶性聚合物和蛋白用親水硅膠色譜填料，通過(guò)如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的制備方法制得。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料及其制備方法。其制備方法包括A硅膠活化，制得活化硅膠；B將所述活化硅膠進(jìn)行環(huán)氧基改性，制得環(huán)氧基改性硅膠；C在所述環(huán)氧基改性硅膠上引入親水性聚合物，制得親水性聚合物改性硅膠；D將所述親水性聚合物改性硅膠水解，制得分離水溶性聚合物和蛋白的親水性硅膠色譜填料。該色譜填料具有較大孔隙容積、較低的疏水性、較高的理論塔板數(shù)和較大的峰容量。
文檔編號(hào)B01J20/30GK103055832SQ20121059450
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者趙岳星, 薛昆鵬, 姚立新 申請(qǐng)人:浙江月旭材料科技有限公司